fdsgdffffffffffffffffffffffffffffffffffffffffffffffffffffffffffffffffffffffffffffffffffffffffffffffffffffffffffffffffffffffffffffffffffffffffffffffffffffffffffffffffffffffffffffffffffffffffffffffffffffffffffffffffffffffffffffffffffffffffffffffffffffffffffffffffffffffffffffffffffffffffffffffffffffffffffffffffffffffffffffffffffffffffffffffffffffffffffffffffffffffffffffffffffffffffffffffffffffffffffffffffffffffffffffffffffffffffffffffffffffffffffffffffffffffffffffffffffffffffffffffffffffffffffffffffffffffffffffffffffffffffffff
Thành tựu nuôi cấy mô tế bào thực vật intro TĨM TẮT rễ bất định sâm Ngọc Linh (có nguồn gốc từ nuôi cấy mẫu in vitro) rễ tơ chuyển gen (được hình thành cách lây nhiễm mẫu mô sẹo in vitro với vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes chủng ATCC 15834) sử dụng để đánh giá khả sinh trưởng tích lũy saponin GIỚI THIỆU Sâm Ngọc Linh dược liệu quý chứa đầy đủ tác dụng dược lý chi nhân sâm Tuy nhiên, loài vùng sinh thái, thời gian sinh trưởng chậm, cần tới năm bắt đầu thu hoạch - 10 năm thu củ sâm chất lượng tốt việc khai thác bừa bãi khơng có phương pháp quản lý hiệu dẫn đến nguồn sâm tự nhiên trở nên khan xếp vào danh sách lồi có nguy tuyệt chủng nhiều năm gần đây, nhân giống vơ tính trồng sâm Ngọc Linh đạt thành, góp phần bảo tồn dược liệu quý này, không đủ đáp ứng nhu cầu cung cấp nguyên liệu cho ngành dược liệu, mỹ phẩm, việc ứng dụng công nghệ tế bào thực vật nuôi cấy sinh khối sâm Ngọc Linh cần thiết Trong đó, rễ tơ rễ bất định hai nguồn vật liệu thường sử dụng hệ thống nuôi cấy Rễ bất định rễ hình thành từ nhiều vùng khác thể thực vật thân, cành, lá… Sự hình thành rễ bất định điều hịa nhiều yếu tố mơi trường yếu tố nội, rễ bất định hình thành cách nuôi cấy mẫu quan khác lá, cuống củ sâm Ngọc Linh VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP Vật liệu Nguồn vật liệu thực vật sử dụng nghiên cứu rễ bất định rễ tơ chuyển gen sâm Ngọc Linh Rễ bất định sâm Ngọc Linh hình thành từ ni cấy mẫu in vitro Rễ tơ chuyển gen (rễ tơ) hình thành cách lây nhiễm mẫu mơ sẹo in vitro với vi khuẩn A Mật độ vi khuẩn OD = 0,5; thời gian lây nhiễm 20 phút thời gian đồng nuôi cấy ngày Sau đó, mẫu cấy chuyển qua mơi trường chọn lọc để chọn lọc dòng rễ tơ có khả sinh trưởng nhanh ổn định Đánh giá sinh trưởng rễ tơ rễ bất định Rễ bất định nhân nhanh môi trường Các mẫu rễ nuôi cấy chai thủy tinh Mỗi chai cấy mẫu, mẫu có khối lượng khoảng 10 mg Chỉ tiêu theo dõi tốc độ tăng sinh mẫu cấy thu sau khoảng thời gian nuôi cấy khác Tốc độ tăng sinh (lần) = Đánh giá khả tích lũy saponin rễ tơ rễ bất định sau tháng ni cấy thí nghiệm thu nhận sấy khơ đến khối lượng khơng đổi Sau đó, tiến hành định tính định lượng hàm lượng saponin có g chất khơ hàm lượng saponin tổng số tồn chất khơ thu khối lượng tươi mẫu rễ ban đầu Điều kiện thí nghiệm Tất mơi trường hấp khử trùng autoclave 121°C, atm 30 phút Các thí nghiệm ni cấy rễ đặt nhiệt độ phòng 22 ± 2o C, độ ẩm 55 - 60% nuôi cấy điều kiện tối Phương pháp xử lý thống kê Mỗi thí nghiệm lặp lại lần Như vậy, nuôi cấy nhân nhanh rễ bất định rễ sinh trưởng nhanh giai đoạn sau chậm dần ngừng sinh trưởng chết không cấy chuyền sang mơi trường Điều giải thích giai đoạn đầu ni cấy (1 - tháng), mơi trường ni cấy cịn auxin, nên rễ sinh trưởng nhanh tốc độ tăng sinh đạt cao rễ phân nhánh tạo rễ thứ cấp nhiều Các thời gian nuôi cấy tiếp theo, rễ sử dụng hết lượng auxin ngoại sinh mơi trường ni cấy, thêm vào nồng độ dinh dưỡng giảm dần theo thời gian nuôi cấy, nên rễ không tiếp tục sinh trưởng chết dần không cấy chuyền qua môi trường Như vậy, thời gian đầu trình nhân nhanh rễ, tốc độ tăng sinh rễ tơ chậm so với rễ bất định; giai đoạn sau tốc độ tăng sinh rễ tơ nhanh so với rễ bất định thời gian sinh trưởng rễ tơ kéo dài so với rễ bất định Nguyên nhân chất nguồn gốc hai loại rễ khác Trong đó, rễ tơ rễ có chứa gen tự tổng hợp auxin có khả sinh trưởng phân nhánh môi trường không bổ sung chất điều hịa sinh trưởng, nên q trình nhân nhanh, rễ tơ nuôi cấy môi trường không bổ sung auxin ngoại sinh, ngun nhân giải thích giai đoạn đầu ni cấy q trình nhân nhanh, rễ tơ tăng sinh chậm so với rễ bất định cần thời gian để tự cảm ứng sinh tổng hợp auxin kích hoạt gen liên quan đến hình thành rễ; giai đoạn nuôi cấy rễ tơ sinh trưởng nhanh, tốc độ sinh trưởng rễ bất định giảm dần ngừng sinh trưởng khoảng thời gian nuôi cấy sau sử dụng hết nguồn auxin ngoại sinh Tuy nhiên, tỷ lệ hàm lượng saponin thành phần lại có khác biệt hai loại rễ Sự khác biệt dẫn đến khác hoạt tính dược lý hai loại rễ Trong đó, rễ bất định hàm lượng lại cao so với rễ tơ rễ tơ nuôi cấy môi trường không bổ sung chất điều hồ sinh trưởng thực vật, nên khơng dẫn tới lo ngại tồn dư chất điều hoà sinh trưởng sinh khối rễ thu được, nguồn vật liệu thích hợp cho nuôi cấy sinh khối rễ quy mô bioreactor tích lớn KẾT LUẬN Ở giai đoạn đầu q trình ni cấy (2 tháng đầu), rễ tơ phát triển chậm rễ bất định; thời gian nuôi cấy rễ tơ lại phát triển nhanh mạnh nhiều so với rễ bất định Trong đó, hàm lượng ginsenoside định hoạt tính dược lý chủ yếu sâm Ngọc Linh Ngồi ra, rễ tơ sinh trưởng môi trường không bổ sung chất điều hịa sinh trưởng thực vật Vì vậy, rễ tơ nguồn ngun liệu thích hợp để ni cấy sinh khối rễ sâm