NUÔI cấy mô tế bào THỰC vật THÀNH tựu

NI CẤY MƠ TẾ BÀO THỰC VẬT THÀNH TỰU Nhóm KHÁI NIỆM Nuôi cấy mô tế bào thực vật kĩ thuật cho phép nuôi cấy dễ dàng tế bào thực vật hay mô phân sinh bệnh mơi trường nhân tạo thích hợp để tạo khối tế bào hay hoàn chỉnh ống nghiệm CƠ SỞ SINH LÍ CỦA CƠNG NGHỆ NI CẤY MƠ TẾ BÀO THỰC VẬT Tính tồn tế bào thực vật Sự phân chia, phân hóa, phản phân hóa tế bào Các đặc tính xác định dựa sở đặc điểm di truyền Nhưng thay đổi môi trường có ảnh hưởng trực tiếp đến đặc tính ĐIỀU KIỆN NUÔI CẤY ÁNH SÁNG VÀ VÔ TRÙNG Dụng cụ mơi trường NHIỆT ĐỘ Mẫu cấy VƠ TRÙNG DỤNG CỤ VÀ MÔI TRƯỜNG PHƯƠNG PHÁP KHỬ TRÙNG KHƠ Dùng cho dụng cụ có tính chịu nhiệt Dụng cụ trước đem sấy phải gói kín giấy nhơm Thiết bị sử dụng lò sấy Thời gian khử trùng khô với hầu hết dụng cụ sau: Thời gian khởi động khoãng 60p, để tất dụng cụ đạt O 180 C Thời gian trì nhấp 120p Thời gian giảm dần nhiệt độ VÔ TRÙNG MẪU CẤY Chọn mẫu cấy phải vào: trạng thái sinh lý hay tuổi mẫu, mẫu non trẻ có phản ứng với điều kiện nuôi cấy môi trường nuôi cấy nhanh Ngồi mơ non trẻ hình thành, sinh trưởng nhanh, mức độ nhiễm bệnh Kích thước vị trí mẫu cấy Chất lượng cho mẫu cấy Mục đích khả ni cấy VÔ TRÙNG MẪU CẤY Phương pháp phổ biến sử dụng hóa chất có khả tiêu diệt vi sinh vật Một số hóa chất lựa chọn cho q trình vơ trùng mẫu cấy phải đảm bảo thuộc tính: có khả tiêu diệt vi sinh vật tốt khơng có mức độ độc thấp mẫu thực vật VD: NaOCl Ca(OCl)2 Để tăng tính linh động hóa chất diệt khuẩn người ta dùng thêm chất làm giảm sức căng bề mặt Tween 20, Tween 80, fotoflo…hoặc xử lý với cồn 70% Có thể dùng thêm chất kháng sinh cho vô trùng mẫu cấy (gentamixin ampicilin) VƠ TRÙNG MẪU CẤY Hóa chất Nồng độ sử dụng Thời gian xử lý Hiệu (phút) Hypoclorit canxi 5-15%(W/v) 5-30 Rất tốt Hypoclorit natri 10-20%(V/v) 5-30 Rất tốt Oxy già 10-12%(V/v) 5-15 Tốt Clorua thủy ngân 0,1-1%(W/w) 2-10 Trung bình Nitrat bạc 1%(W/w) 5-10 Trung bình Chất kháng sinh 50-100mg/l 30-60 Khá tốt MƠI TRƯỜNG NI CẤY TÍNH THẨM pH Vô THÀNH PHẦN Hữu Nguồn Cacbon THẤU Chất điều hòa sinh trưởng khác THÀNH PHẦN HỮU CƠ Môi trường sử dụng loại vitamin (quan trọng vitamin nhóm B) Loại Vitamin Liều lượng (mg/l) Thiamin (B1) 0,1-5,0 Axit nicotinic (B3, PP, niacin) 01-5,0 Pyrydoxin (B6) 0,1-1,0 Biotin (H) 0,01-1,0 Axit folic (M) 0,1-5,0 Riboflavin (B2) 0,1-10,0 Axit ascobic (C) 1,0-100,0 Axit pantothenic (B5) 0,5-2,5 Tocopherol (E) 1,0-50,0 CÁC THÀNH PHẦN KHÁC Các chất tạo gel định trạng thái vật lý môi trường ni cấy Các mơi trường đặc có chứa hàm lượng chất tạo gel làm cho chúng đông lại nhiệt độ bình thường Than hoạt tính sử dụng với hàm lượng 0,2-0,3% (W/v) TÍNH THẨM THẤU CỦA MƠI TRƯỜNG Các thành phần ảnh hưởng đến nước môi trường:    Hàm lượng đường Hàm lượng agar Một số thành phần muối khoáng Tính thẩm thấu mơi trường đặc biệt quan trọng trong:    Nuôi cấy mô sẹo Nuôi cấy tế bào đơn huyền phù tế bào Dung hợp nuôi cấy tế bào trần CÁC BƯỚC TRONG KĨ THUẬT NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO THỰC VẬT Bước 1: Chọn lọc chuẩn bị mẹ (các cho mẫu ni cấy) Chọn mơi trường ni cấy thích hợp Bước 2: Nuôi cấy khởi động Bước 3: Nhân nhanh Bước 4: Tạo in vitro hoàn chỉnh Bước 5: Thích ứng in vitro ngồi điều kiện tự nhiên NUÔI CẤY BAO PHẤN THUỐC LÁ Nguyên liệu thiết bị: Nụ hoa thuốc Nước cất lần vô trùng Etanol 90% Dung dịch hypoclorit 10%(V/v) Thuốc nhuộm acetocacmin Agar Đĩa petri Mơi trường MS NN Kính hiển vi giải phẩu Dao, kéo, panh…dùng cho nuôi cấy Một số hóa chất để pha mơi trường Khử trùng bề mặt Tách bao phấn Loại bỏ nhị Nhuộm acetocacmin Cây đơn bội Nuôi cấy môi trường đặc Phát triễn phôi Nuôi cấy môi trường lỏng Quy trình ni cấy mơ keo lai Ngun liệu cách tiến hành - Chọn mẫu cành bánh tẻ từ có chồi phát triển đều, cân đối - Mẫu chọn rửa kỹ nước xà phòng lỗng, sau rửa lại vòi nước chảy, cho mẫu vào bình tam giác tráng qua cồn, rửa lại nước cất vô trùng tiến hành khử trùng mẫu Khử trùng mẫu - Khử trùng mẫu bằng dung dịch nước Javel (nồng độ 50%), sau đổ bỏ dung dịch khử trùng rửa lại mẫu nước vô trùng - Dùng dao cấy cắt mẫu khoảng 1,5 cm có mang đốt lá, sau cấy vào mơi trường vào mẫu - Môi trường vào mẫu môi trường MS (Murashige and skoog) có bổ sung đường 30g/l; agar 7g/l; BA; NAA Quy trình ni cấy mơ keo lai Quy trình tạo chồi in-vitro - Chọn mẫu sống khỏe, không bị nhiễm nấm, khuẩn sử dụng làm nguyên liệu để tạo chồi - Dùng dao cấy cắt bỏ hai đầu mẫu cấy, giữ lại đoạn mang chồi cấy vào môi trường tạo chồi - Môi trường tạo chồi môi trường MS có bổ sung đường 30g/l, agar 7g/l, BA, NAA 4.Quy trình tạo cụm chồi nhân nhanh cụm chồi - Mẫu cấy chồi in-vitro – tuần tuổi, phát triển tốt, không nhiễm nấm, khuẩn Dùng dao cấy tách cắt lấy chồi để nguyên chồi cấy vào môi trường tạo cụm chồi - Môi trường tạo cụm chồi môi trường MS có bổ sung đường 30g/l, agar 7g/l, BA, NAA, kinetin Quy trình ni cấy mơ keo lai 5.Quy trình tạo hồn chỉnh - Mẫu cấy chồi – tuần tuổi, phát triển tốt, không nhiễm nấm, khuẩn.Dùng dao cấy tách cắt lấy chồi cấy vào mơi trường tạo hồn chỉnh - Môi trường tạo cụm chồi môi trường MS có bổ sung đường 30g/l, agar 7g/l, IBA Quy trình ngồi đồng *Tiêu chuẩn giống Cây bình ni cấy qua huấn luyện, khơng bị nhiễm nấm, vi khuẩn, không cong queo, không cụt ngọn, chiều cao từ: 3-5 cm, số rễ: 3-4 rễ *Hỗn hợp bầu đất ươm Chuẩn bị ruột bầu đất ươm cây: trộn đất tầng B cám dừa theo tỉ lệ 7:3 Sau đóng ruột bầu vào túi PE có kích thước x 12cm, xếp đứng bầu đất theo luống đểtiện việc chăm sóc sau Quy trình ni cấy mơ keo lai *Xử lý mầm bầu đất trước ươm - Trước cấy vào bầu đất, phải xử lí bầu cách tưới đẫm dung dich Viben C nồng độ 0,3% trước 24 - Cây mầm sau rửa sạch, cắt bớt rễ cấy vào bầu đất Cây cấy thường vào lúc chiều tối để tránh ánh nắng chiếu trực tiếp vào luống cấy *Điều kiện nuôi ươm - Che luống cấy lớp nilon để trì độ ẩm phủ bên ngồi lớp nilon lưới đen để giảm cường độ ánh sáng cho - Hai ngày sau cấy phun dung dịch Viben-C nồng độ 0,3% để diệt nấm - Nhiệt độ 30-350C, ánh sáng che phủ 50%, độ ẩm 80-85% KẾT QUẢ CỦA NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO Nhân giống nhanh với số lượng lớn Có thể tiến hành số lồi TV mà phương pháp nhân giống bình thường không thực Tạo giống bệnh tương đối đồng mặt di truyền Có thể cho giống quanh năm Có thể sử dụng nhân giống từ phương pháp nuôi cấy mô để làm mẹ cho phương pháp khác Hiệu kinh tế cao người mua nuôi cấy mơ sản xuất kinh doanh Ý NGHĨA CỦA NI CẤY MƠ TẾ BÀO Giúp cho nghành nơng nghiệp trở nên chủ động vấn đề giống đảm bảo phát triển bền vững Thúc đẩy thực vật sinh sản nhanh gấp nhiều lần tốc độ vốn có tự nhiên.Nhờ đó, tạo hàng loạt cá thể giữ nguyên tính trạng di truyền thể mẹ làm rút ngắn thời gian đưa giống Duy trì bảo đảm nhiều giống trồng quý nuôi cấy mô tế bào thực vật Các tồn nhân giống trồng ni cấy mơ tế bào  Tính bất định mặt di truyền (genetic instability)  Sự nhiễm mẫu đất  Sản sinh chất độc từ mơ ni cấy  Hiện tượng thủy tinh hóa Những công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật  Công nghệ vi nhân giống quang tự dưỡng  Bioreactor THÀNH TỰU NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO THỰC VẬT ... cấy tế bào đơn huyền phù tế bào Dung hợp nuôi cấy tế bào trần CÁC BƯỚC TRONG KĨ THUẬT NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO THỰC VẬT Bước 1: Chọn lọc chuẩn bị mẹ (các cho mẫu nuôi cấy) Chọn môi trường ni cấy thích...KHÁI NIỆM Nuôi cấy mô tế bào thực vật kĩ thuật cho phép nuôi cấy dễ dàng tế bào thực vật hay mô phân sinh bệnh mơi trường nhân tạo thích hợp để tạo khối tế bào hay hoàn chỉnh ống... Hiện tượng thủy tinh hóa Những cơng nghệ nuôi cấy mô tế bào thực vật  Công nghệ vi nhân giống quang tự dưỡng  Bioreactor THÀNH TỰU NUÔI CẤY MÔ TẾ BÀO THỰC VẬT