ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Đối tượng nghiên cứu
- Thời gian nghiên cứu: Từ tháng 10/2021 đến tháng 07/2022
- Địa điểm nghiên cứu: Phòng thí nghiệm trọng điểm công nghệ enzyme và protein, Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội
2.1.1 Nghiên cứu xác định giới hạn phát hiện, độ nhạy, độ đặc hiệu, độ đúng, tỷ lệ dương tính giả, tỷ lệ âm tính giả:
- Đối tượng nghiên cứu: Quy trình LAMP (của TS Lê Huy Hoàng và cộng sự) phát hiện gen độc tố của vi khuẩn C botulinum type A, B
Mẫu thêm chuẩn (MMO, MPC, MP) đã được xác nhận âm tính ba lần với độc tố của vi khuẩn C botulinum type A và B Quy trình này được thực hiện thông qua nuôi cấy phân lập và PCR để phát hiện gen độc tố tại phòng Vi khuẩn kỵ khí, NIHE.
Mẫu plasmid tái tổ hợp mang đoạn gen đích của vi khuẩn C botulinum type
A, B đã được các thành viên của nhóm nghiên cứu hoàn thiện trước đó (Chi tiết quy trình tạo plasmid tái tổ hợp mang đoạn gen đích của vi khuẩn C botulinum type A, B được trình bày trong phụ lục VIII)
Chứng dương nội kiểm (plasmid tái tổ hợp mang đoạn gen đích của vi khuẩn
C botulinum type A, B nồng độ 1.0x10 6 copies/μl)
Chứng âm nội kiểm (nước cất khử inon dùng trong các xét nghiệm sinh học phân tử)
2.1.1 Nghiên cứu so sánh quy trình LAMP với quy trình nuôi cấy phân lập phát hiện gen độc tố của vi khuẩn C botulinum type A, B
- Đối tượng nghiên cứu: Quy trình LAMP (của TS Lê Huy Hoàng và cộng sự) phát hiện gen độc tố của vi khuẩn C botulinum type A, B
Mẫu thêm chuẩn (MMO, MPC, MP) đã được xác nhận âm tính ba lần với độc tố của vi khuẩn C botulinum type A và B thông qua quy trình nuôi cấy phân lập và PCR để phát hiện gen độc tố tại phòng Vi khuẩn kỵ khí, NIHE.
Chứng dương nội kiểm (plasmid tái tổ hợp mang đoạn gen đích của vi khuẩn
C botulinum type A, B nồng độ 1.0x10 6 copies/ μl)
Chứng âm nội kiểm (nước cất khử ion dùng trong các xét nghiệm sinh học phân tử).
Thiết kế và nội dung nghiên cứu
- Nghiên cứu thực nghiệm trong phòng thí nghiệm bao gồm các nội dung sau
2.3.1 Thiết kế thí nghiệm xác định giới hạn phát hiện, độ nhạy, độ đặc hiệu, độ đúng, tỷ lệ dương tính giả, tỷ lệ âm tính giả của quy trình LAMP phát hiện gen độc tố của vi khuẩn C botulinum type A, B
2.3.1.1 Thí nghiệm xác định giới hạn phát hiện trên nền mẫu: Để xác định giới hạn phát hiện của mồi ta tiến hành quy trình LAMP sử dụng trực tiếp plasmid tái tổ hợp mang đoạn gen đích của vi khuẩn C botulinum type A,
Bằng cách sử dụng dải nồng độ biết trước, ADN khuôn được áp dụng để đánh giá phản ứng LAMP mà không cần bước tách chiết Nhóm nghiên cứu đã hoàn thành giai đoạn đầu trong việc xác định giới hạn phát hiện của mồi sau khi tối ưu hóa các thành phần phản ứng.
Để xác định giới hạn phát hiện của nền mẫu, cần thực hiện nhiều bước hơn Đầu tiên, plasmid tái tổ hợp mang đoạn gen đích của vi khuẩn C botulinum type A, B cần được gây nhiễm ở các nồng độ đã biết trên từng nền mẫu Tiếp theo, tiến hành tách chiết ADN bằng bộ kit QIAmp ADN Mini kit (Qiagen, Đức) và áp dụng quy trình LAMP để xác định giới hạn phát hiện Thông thường, giới hạn phát hiện của nền mẫu thường cao hơn so với giới hạn phát hiện của mồi, do còn phụ thuộc vào hiệu suất tách chiết và ảnh hưởng của nền mẫu.
Theo hướng dẫn của CLIA (Vol 23, No 3) (30), TCVN/ISO 15189:2015(25); TCVN/ISO 17025: 2017(26) chúng tôi thiết kế thí nghiệm xác định giới hạn phát hiện như sau:
Bố trí thí nghiệm được thực hiện bằng cách tiến hành phản ứng LAMP trên từng mẫu nền (MMO, MPC, MP) đã được nhiễm plasmid tái tổ hợp chứa đoạn gen đích của vi khuẩn C botulinum type A, B Thử nghiệm được chia thành hai giai đoạn rõ ràng.
Để xác định điểm giới hạn phát hiện sơ cấp, quy trình LAMP đã được thực hiện với 5 nồng độ plasmid tái tổ hợp chứa đoạn gen đích của vi khuẩn C botulinum type A và B Mẫu thực phẩm (MMO, MPC) và lâm sàng (MP) đã được thử nghiệm với nồng độ pha loãng bậc 10 liên tiếp, từ 5.0 x10^4 đến 5.0 x10^0 copies/gam Thí nghiệm được lặp lại 3 lần cho mỗi nồng độ, và nồng độ thấp nhất có sản phẩm khuếch đại sau phản ứng LAMP chính là giới hạn phát hiện sơ cấp của mẫu cần tìm.
Quy trình gây nhiễm mẫu được thực hiện trên từng nền mẫu với các dải nồng độ nhỏ gần với giới hạn phát hiện sơ cấp, bao gồm các giá trị 1.0x10^1, 4.29x10^1, 7.15x10^1, 1.00x10^2 và 1.29x10^2 copies/gam Chi tiết về cách thực hiện quy trình này được trình bày trong phụ lục IV.
Để xác định giới hạn phát hiện với độ tin cậy 95% (LOD95), quy trình LAMP được thực hiện lặp lại 12 lần tại các nồng độ gần với giới hạn phát hiện sơ cấp của giai đoạn 1 Thí nghiệm được tiến hành trên từng nền mẫu gây nhiễm với plasmid tái tổ hợp mang đoạn gen đích của vi khuẩn C botulinum type A, B.
+ Ghi chép kết quả thí nghiệm theo biểu mẫu thu thập kết quả thí nghiệm xác định giới hạn phát hiện (Phụ lục 1)
Giới hạn phát hiện trong phản ứng LAMP được xác định là nồng độ ADN thấp nhất mà tại đó sản phẩm khuếch đại luôn xuất hiện Đối với quy trình phát hiện vi khuẩn C botulinum type A, B, giới hạn này được xác định thông qua phân tích hồi quy probit trên phần mềm Medcalc phiên bản 20.0.13, với 95% kết quả dương tính ở nồng độ thấp nhất Vì đây là giới hạn phát hiện của nền mẫu, chúng tôi đã biểu diễn nó dưới dạng nồng độ mẫu.
(ng/mL) và quy đổi thành số lượng bản sao ADN (copies/gam) với công thức tính như sau:
Số bản sao = (nồng độ ADN x 6.022x10 23 )/(chiều dài ADN tái tổ hợp x10 9 x650)
Chiều dài plasmid tái tổ hợp mang đoạn gen đích của vi khuẩn C botulinum type A và B trong nghiên cứu của chúng tôi lần lượt là 3250bp và 3240bp
2.3.1.2 Thí nghiệm xác định độ đặc hiệu, độ nhạy, độ đúng, tỷ lệ âm tính giả, tỷ lệ dương tính giả
Dựa trên hướng dẫn của Viện Tiêu chuẩn Lâm sàng và Phòng xét nghiệm (CLIA (Vol 23, No 3)), chúng tôi đã thiết kế thí nghiệm để xác định giới hạn phát hiện một cách chính xác.
+ Mỗi type độc tố được bố trí như sau:
Mỗi nền mẫu được chuẩn bị với 60 mẫu, trong đó 40 mẫu được gây nhiễm bằng plasmid tái tổ hợp chứa đoạn gen đích của vi khuẩn C botulinum type A và B với nồng độ lớn hơn 20% của giới hạn phát hiện Đồng thời, 20 mẫu âm tính không bị gây nhiễm được sử dụng để nghiên cứu Quy trình này khác biệt với nghiên cứu viên thực hiện quy trình LAMP để chuẩn bị mẫu.
Phân tích các mẫu theo quy trình LAMP nhằm phát hiện độc tố của vi khuẩn C botulinum type A, B Kết quả thí nghiệm được ghi chép theo biểu mẫu thu thập, xác định các chỉ số như độ đặc hiệu, độ nhạy, độ đúng, tỷ lệ âm tính giả và tỷ lệ dương tính giả (Phụ lục 2).
Xác định độ nhạy, độ đặc hiệu, độ đúng, tỷ lệ âm tính giả, tỷ lệ dương tính giả dựa vào bảng tính 2x2 và công thức
2.3.2 Thiết kế thí nghiệm so sánh quy trình LAMP với quy trình nuôi cấy phát hiện độc tố của vi khuẩn C botulinum type A, B
NIHE đang lưu giữ tổng cộng 90 mẫu thực phẩm và lâm sàng Các mẫu này đã được tiến hành xét nghiệm nuôi cấy phân lập nhằm phát hiện gen độc tố của vi khuẩn.
HUPH đã xác định được vi khuẩn C botulinum loại A và B, sau đó gửi mẫu đến phòng thí nghiệm công nghệ enzyme và protein tại Đại học Khoa học Tự nhiên, thuộc Đại học Quốc gia.
Tại Hà Nội, quy trình nuôi cấy phân lập được thực hiện với các mẫu được nhận và mã hóa thành mẫu mù, nhằm đảm bảo tính khách quan cho nghiên cứu Tất cả các mẫu được chạy ngẫu nhiên để giảm thiểu sai số do dương tính giả, bao gồm nhiễm chéo và nhiễm plasmid Các mẫu dương tính đều được kiểm tra lại ít nhất hai lần, kèm theo đánh giá khả năng nhiễm chéo Đặc biệt, máy LAMP Genine III cho phép hiển thị biểu đồ nhiệt độ nóng chảy, giúp xác định khả năng nhiễm chéo hoặc dương tính giả nếu có sự khác biệt về nhiệt độ so với mẫu chứng dương nội kiểm Để đảm bảo tính chính xác, tất cả các mẫu dương tính từ quy trình LAMP được tổng hợp và chạy lại cùng một lần để thu thập hình ảnh và số liệu cho kết quả nghiên cứu.
Cỡ mẫu
Dựa trên hướng dẫn CLIA (Vol 23, No 3), bài viết này mô tả quy trình xác định giới hạn phát hiện của độc tố vi khuẩn C botulinum type A và B Ba mẫu âm tính đã được chọn để thực hiện thí nghiệm, sử dụng phương pháp chia nhỏ mẫu và tiến hành quy trình nhiễm với các nồng độ mong muốn Để xác định độ nhạy, độ đặc hiệu, độ đúng, tỷ lệ âm tính giả và tỷ lệ dương tính giả, 60 mẫu nền đã được sử dụng, trong đó có 40 mẫu được gây nhiễm với plasmid tái tổ hợp chứa gen đích của vi khuẩn C botulinum type A và B ở nồng độ lớn hơn 20% LOD, cùng với 20 mẫu không gây nhiễm.
Trong bài viết này, chúng tôi so sánh hai quy trình LAMP và nuôi cấy phân lập để phát hiện độc tố trong 90 mẫu thực phẩm (MMO, MPC) và mẫu bệnh phẩm lâm sàng (MP) được gửi từ NIHE Quy trình LAMP cho thấy ưu điểm về tốc độ và độ nhạy cao trong phát hiện độc tố, trong khi nuôi cấy phân lập lại cung cấp thông tin chi tiết hơn về các chủng vi khuẩn gây bệnh Việc lựa chọn phương pháp phù hợp sẽ phụ thuộc vào mục tiêu nghiên cứu và yêu cầu cụ thể của từng trường hợp.
Phương pháp chọn mẫu
Mục tiêu 1: Chọn ngẫu nhiên các mẫu thêm chuẩn (MMO, MPC, MP) là mẫu đã được khẳng định 3 lần âm tính với độc tố của vi khuẩn C botulinum type A,
B bằng quy trình nuôi cấy phân lập và PCR phát hiện độc tố của phòng Vi khuẩn kỵ khí, NIHE
Mục tiêu 2 là áp dụng phương pháp chọn mẫu thuận tiện bằng cách chọn tất cả các mẫu thực phẩm (MMO, MPC) và lâm sàng (MP) lưu tại NIHE đã được xác định âm tính hoặc dương tính với độc tố của vi khuẩn C botulinum type A, B Quy trình nuôi cấy phân lập để phát hiện độc tố được thực hiện tại phòng Vi khuẩn kỵ khí của NIHE Các mẫu sau đó được gửi theo quy trình của NIHE đến phòng thí nghiệm trọng điểm công nghệ enzyme và protein, Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia, kèm theo kết quả nuôi cấy phân lập và phát hiện gen độc tố của vi khuẩn C botulinum type.
A, B để nghiên cứu viên tiến hành nghiên cứu.
Phương pháp thu thập số liệu
Nghiên cứu viên chính chịu trách nhiệm chuẩn bị thí nghiệm và ghi chép toàn bộ số liệu theo biểu mẫu nghiên cứu đã được thiết lập cho từng thí nghiệm.
HUPH nghiệm từ phần mềm Genie explorer v2.0.7.11 đi kèm với máy LAMP genie III của nhà sản xuất (hãng Optigene – Anh quốc).
Các biến số nghiên cứu
Bảng 2.1 Các biến số nghiên cứu
Biến số Định nghĩa Phân loại Phương pháp thu thập
Nồng độ nhỏ nhất có trong mẫu thử mà phương pháp xét nghiệm có thể phát hiện được
Ghi chép theo bộ công cụ thu thập số liệu của từng thí nghiệm Độ nhạy
Sự đo lường khả năng của một xét nghiệm trong việc xác định chính xác bệnh nhân mắc một bệnh cụ thể được gọi là tỷ lệ dương tính thật.
Biến định lượng Độ đặc hiệu
Khả năng của một xét nghiệm trong việc xác định chính xác tất cả các bệnh nhân không mắc bệnh được gọi là tỉ lệ âm tính thật Việc đo lường tỉ lệ này rất quan trọng để đánh giá độ tin cậy của xét nghiệm.
Biến định lượng Độ đúng Mức độ giống nhau gi a kết quả phân tích được với giá trị tham chiếu
Tỷ lệ âm tính giả
Tỷ lệ mẫu cho kết quả âm tính giả trong tổng số mẫu cho kết quả âm tính
Tỷ lệ dương tính giả
Tỷ lệ mẫu cho kết quả dương tính giả trong tổng số mẫu cho kết quả dương tính
Biến định lượng đặc điểm của bộ mẫu được xác định thông qua sự hiện diện hoặc vắng mặt của vi khuẩn C botulinum Quy trình nuôi cấy để phát hiện độc tố loại A và B được thực hiện tại phòng vi khuẩn kỵ khí của NIHE.
Một thống kê giúp đo đạc độ đồng thuận gi a các thành phần định tính
Các quy trình sử dụng trong nghiên cứu
2.8.1 Quy trình tạo mẫu gây nhi m thực nghiệm C botulinum
Sử dụng plasmid tái tổ hợp mang đoạn gen đích của vi khuẩn C botulinum type
A, B cho quá trình gây nhiễm Để đạt được nồng độ ống stock mong muốn, thêm từ từ 1 lượng plasmid tái tổ hợp mang đoạn gen đích của vi khuẩn C botulinum type
A, B vào ống stock, vortex đều ống Đo nồng độ ống stock trên máy nanodrop, tính nồng độ của stock theo công thức sau: Số bản sao = (nồng độ ADN x 6.022x10 23 )/(chiều dài ADN tái tổ hợp x10 9 x650) Với chiều dài plasmid tái tổ hợp mang đoạn gen đích của vi khuẩn C botulinum type A và B trong nghiên cứu của chỳng tụi lần lượt là 3250bp và 3240bp; 1 ng/àl = 10 -3 ng/mL; 1 copies/àl = 10 -3 copies/mL
Lấy 1.0mL dung dịch plasmid tái tổ hợp mang đoạn gen đích của vi khuẩn
C botulinum type A, B trong ống stock trộn với lần lượt 9.0 gam các ống chứa
MMO, MPC và MP đã được kiểm tra âm tính với độc tố của vi khuẩn C botulinum type A, B Quá trình vortex và đồng nhất mẫu được thực hiện trên máy đồng nhất mẫu Nồng độ ống thu được là 1/10 so với nồng độ ống ADN stock Quy trình gây nhiễm mẫu được mô tả chi tiết trong phụ lục IV.
2.8.2 Quy trình LAMP với cặp mồi thiết kế đặc hiệu phát hiện gen độc tố của vi khuẩn C botulinum type A, B
Quy trình LAMP để phát hiện gen độc tố của vi khuẩn C botulinum type A và B bao gồm hai bước chính: tách chiết ADN trực tiếp từ mẫu thực phẩm và lâm sàng bằng bộ kit QIAmp ADN Mini kit (Qiagen, Đức) Chi tiết quy trình tách chiết được trình bày trong phụ lục V Sản phẩm ADN thu được sẽ được sử dụng làm khuôn cho phản ứng LAMP nhằm phát hiện gen độc tố của vi khuẩn C botulinum type A và B, như mô tả trong phụ lục VII.
Nghiên cứu của Sakuma và cộng sự (2009) đã thiết kế bộ mồi gồm 6 cặp mồi đặc hiệu để phát hiện gen độc tố type A và B của C botulinum Trình tự của các mồi này được trình bày chi tiết trong Bảng 2.2.
Bảng 2.2 Trình tự mồi đặc hiệu của phản ứng LAMP phát hiện gen độc tố type A, B của C botulinum
Gen đích Tên mồi Trình tự mồi 5' – 3 '
Kích thước sản phẩm LAMP (bp)
2.8.2.1 Thành phần phản ứng LAMP
- Mồi: 6 loại mồi (mô tả như bên dưới) dựa theo 6 đoạn riêng biệt trên đoạn gen quan tâm (Bảng 2.2):
+ FIP (Forward Inner Primer – Mồi xuôi trong): bao gồm đoạn F2 (ở đầu 3')
HUPH bổ sung cho đoạn F2c, và đoạn giống như đoạn F1c ở đầu 5'
+ F3 (Forward Outer Primer – Mồi xuôi ngoài): bao gồm đoạn F3 bổ sung cho đoạn F3c
+ BIP (Backward Inner Primer – Mồi ngược trong): bao gồm đoạn B2 (ở đầu 3’) bổ sung cho đoạn B2c và đoạn giống như B1c ở đầu 5’
+ B3 (Backward Outer Primer – Mồi ngược ngoài) bao gồm đoạn B3 bổ sung cho đoạn B3c
+ LF (Loop Forward) : Mồi loop xuôi
+ LB (Loop Backward): Mồi loop ngược
Enzyme Bst polymerase, được phân lập từ vi khuẩn Bacillus stearothermophilus, là enzyme phổ biến trong phản ứng LAMP Enzyme này có khả năng xúc tác tổng hợp ADN và tự tách chuỗi cao, hoạt động tối ưu ở nhiệt độ 65°C.
- dNTPs và đệm phản ứng: tương tự như quy trình PCR
- ADN khuôn: Không đòi hỏi mức độ tinh sạch cao, có thể sử dụng các phương pháp tách ADN đơn giản, để rút ngắn thời gian chuẩn bị
- Chất chỉ thị màu biểu hiện kết quả: Có thể sử dụng nhiều loại chất chỉ thị màu như Syber Green, Hydroxyl Naphthol Blue (HNB), Calcein, xanh malachite…
Chi tiết các thành phần của phản ứng LAMP sử dụng trong nghiên cứu được trình bày tại Bảng 2.3
Bảng 2.3 Thành phần phản ứng LAMP phát hiện gen độc tố type A, B của
STT Vi khuẩn C botulinum Thành phần master mix mồi BoNT A/B
Thể tích cho 01 phản ứng (àL)
OptiGene’s Isothermal Master Mixes ISO – 001 9.00
Các bước thực hiện phản ứng LAMP bao gồm: chuẩn bị mẫu, tách ADN theo hướng dẫn trong Phụ lục V, và tiến hành khuếch đại đẳng nhiệt LAMP trên máy Genie III ở nhiệt độ 65°C trong 30 phút để phát hiện sản phẩm.
Bước 1 Tách chiết ADN từ mẫu thu thập (Hình 2.2)
Hình 2.2 Hình ảnh tách chiết ADN từ mẫu thu thập
Bước 2 Thực hiện quy trình LAMP (Bảng 2.4)
Bảng 2.4 Các bước thực hiện quy trình LAMP
Nội dung tiến hành Hình ảnh thực hiện
1 Chuẩn bị hỗn hợp dung dịch phản ứng
3 Tiến hành phản ứng trên máy ủ nhiệt
Kết quả của phương pháp LAMP trong nghiên cứu được hiển thị trực tiếp trên màn hình nhỏ của máy LAMP Genie III hoặc thông qua phần mềm Genie Explorer 2.0.7.1.1 được cài đặt trên máy tính kết nối trực tiếp với máy LAMP Genie III.
Nội dung tiến hành Hình ảnh thực hiện
Kết quả chỉ được xem xét khi mẫu nội kiểm đạt yêu cầu, trong đó đối chứng âm không cho thấy sự khuếch đại của đoạn ADN đích, trong khi đối chứng dương thể hiện sự khuếch đại rõ ràng và tuyến tính của ADN đích.
- Các mẫu được xác định là dương tính khi: + Có xuất hiện đường tín hiệu tuyến tính trong thời gian phản ứng LAMP
+ Nhiệt độ nóng chảy của mồi phù hợp với nhiệt độ nóng chảy trên mẫu chứng
- Các mẫu được xác định là âm tính khi:
+ Không xuất hiện tín hiệu tuyến tính
+ Nhiệt độ nóng chảy của mồi phù hợp với nhiệt độ nóng chảy trên mẫu chứng
Hình 1 Kết quả quy trình LAMP trên máy LAMP Genie III
Phương pháp phân tích số liệu
Giới hạn phát hiện của quy trình LAMP đối với vi khuẩn C botulinum loại A và B được xác định qua phân tích hồi quy probit trên phần mềm Medcalc phiên bản 20.0.13, với 95% kết quả dương tính ở nồng độ thấp nhất Đánh giá các chỉ số như độ nhạy, độ đặc hiệu, độ đúng, tỷ lệ âm tính giả, tỷ lệ dương tính giả và hệ số kappa (K) được thực hiện dựa trên bảng tính 2x2 và công thức tính trên phần mềm Excel (Microsoft Office 2010) (Bảng 2.5).
Bảng 2.5 Công thức tính độ nhạy , độ đặc hiệu độ đúng, tỷ lệ âm tính giả, tỷ lệ dương tính giả lý thuyết của quy trình LAMP
Kết quả xét nghiệm LAMP
Mẫu gây nhiễm thực nghiệm
Dương tính Dương tính thật (a) Dương tính giả (b) Âm tính Âm tính giả (c) Âm tính thật (d)
Công thức tính độ nhạy
Công thức tính độ đặc hiệu
Công thức tính độ đúng
Công thức tính tỷ lệ dương tính giả
Công thức tính tỷ lệ âm tính giả
Quy trình nuôi cấy phát hiện độc tố được sử dụng làm tiêu chuẩn so sánh trong nghiên cứu này Một mẫu được coi là dương tính thật khi quy trình nuôi cấy phát hiện gen độc tố cho kết quả dương tính, và âm tính thật khi kết quả là âm tính Dựa trên tiêu chí này, chúng tôi đã đánh giá các chỉ số như độ nhạy, độ đặc hiệu, độ đúng, tỷ lệ âm tính giả, tỷ lệ dương tính giả và hệ số kappa (K) của quy trình LAMP so với quy trình nuôi cấy phát hiện độc tố type A và B của vi khuẩn C botulinum, sử dụng bảng tính 2x2 và công thức trên phần mềm Excel (Microsoft Office 2010) (Bảng 2.6).
Bảng 2.6 Công thức tính độ nhạy , độ đặc hiệu, độ đúng, tỷ lệ âm tính giả, tỷ lệ dương tính giả và hệ số kappa (K) theo công thức
Kết quả xét nghiệm nuôi cấy phát hiện gen độc tố
Dương tính Dương tính thật (a) Dương tính giả (b) Âm tính Âm tính giả (c) Âm tính thật (d)
Công thức tính độ nhạy
Công thức tính độ đặc hiệu
Công thức tính độ đúng
Công thức tính tỷ lệ dương tính giả
Công thức tính tỷ lệ âm tính giả
Công thức tính hệ số
- Đánh giá kết quả độ phù hợp của xét nghiệm dựa trên giá trị Kappa được đánh giá như sau (33):
0.0 – 0.2 Mức độ phù hợp ít
0.2 – 0.4 Mức độ phù hợp nhẹ
0.4 – 0.6 Mức độ phù hợp trung bình
0.6 – 0.8 Mức độ phù hợp chặt ch
0.8 – 1.0 Mức độ phù hợp gần như hoàn toàn
Vấn đề đạo đức của nghiên cứu
Nghiên cứu này nằm trong khuôn khổ đề tài “Nghiên cứu sản xuất bộ kít LAMP phát hiện nhanh gen độc tố của Clostridium botulinum gây bệnh ngộ độc
Nghiên cứu "HUPH thịt" mã số 02/2021/ĐX, được Quỹ Khoa học và công nghệ Quốc Gia tài trợ, tuân thủ đầy đủ các quy định về đạo đức trong nghiên cứu Y sinh học theo Bộ Y tế Nghiên cứu này đã được Hội đồng đạo đức của NIHE phê duyệt với mã số HĐĐĐ – 40/2021 vào ngày 31 tháng 12 năm 2021.
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
Xác định giá trị sử dụng của quy trình LAMP phát hiện gen độc tố của vi khuẩn C botulinum type A, B
Kết quả xác định giới hạn phát hiện sơ cấp của quy trình LAMP cho thấy khả năng phát hiện gen độc tố của vi khuẩn C botulinum type A trong mẫu thực phẩm (MMO) với dãy 5 nồng độ plasmid tái tổ hợp được pha loãng bậc 10 (từ 5.0x10^0 đến 5.0x10^4 copies/gam) Thí nghiệm cho thấy tín hiệu huỳnh quang tuyến tính tại các nồng độ pha loãng từ cao đến thấp, minh chứng cho hiệu quả của phương pháp này trong việc phát hiện vi khuẩn C botulinum type A.
Hình 3 1 Xác định giới hạn phát hiện bằng quy trình LAMP phát hiện gen độc tố của vi khuẩn C botulinum type A trên mẫu thực phẩm (MMO)
Hình 3.2 Xác định giới hạn phát hiện sơ cấp bằng quy trình LAMP phát hiện gen độc tố của vi khuẩn C botulinum type B trên mẫu thực phẩm (MMO)
Lặp lại thí nghiệm ba lần để xác định giới hạn phát hiện sơ cấp của quy trình LAMP trong việc phát hiện gen độc tố của vi khuẩn C botulinum type A và B trên mẫu thực phẩm.
(MMO) là 5.0x10 1 copies/gam (với 3/3 (100%) lần lặp cho kết quả dương tính (Bảng 3.1)
Bảng 3.1 Kết quả xác định giới hạn phát hiện sơ cấp bằng quy trình LAMP phát hiện gen độc tố của vi khuẩn C botulinum type A, B trên mẫu thực phẩm
Nồng độ gây nhiễm của mẫu
Lần 1 Lần 2 Lần 3 Lần 1 Lần 2 Lần 3
Ghi chú : (+): Dương tính/ (-): Âm tính
Giới hạn phát hiện sơ cấp trên nền mẫu MMO của quy trình LAMP được xác định là 1.75x10^-4 ng/gam, tương đương với 5.0x10^1 copies/gam Để khảo sát giới hạn phát hiện, chúng tôi đã gây nhiễm các dãy nồng độ tiệm cận tiếp theo là (1.00x10^1; 4.29x10^1; 7.15x10^1; 1.00x10^2; 1.29x10^2 copies/gam) Kết quả thí nghiệm cho thấy quy trình LAMP có khả năng phát hiện gen độc tố của vi khuẩn C botulinum type A và type B.
Kết quả trình bày trong Bảng 3.2 cho thấy nồng độ thấp nhất 1.00x10^2 copies/gam đạt được 100% kết quả dương tính (12/12 lần lặp lại) cho cả loại A và B Tỷ lệ phát hiện tại mỗi nồng độ được xử lý bằng thống kê Probit, với giới hạn phát hiện (LOD95) của quy trình LAMP cho gen độc tố vi khuẩn C botulinum type A và type B trên mẫu thực phẩm (MMO) là 1.0x10^2 copies/gam Khoảng tin cậy 95% cho LOD95 lần lượt là 0.82x10^2 đến 1.43x10^2 copies/gam và 0.85x10^2 đến 1.40x10^2 copies/gam.
Bảng 3.2 Kết quả xác định giới hạn phát hiện bằng quy trình LAMP phát hiện gen độc tố của vi khuẩn C botulinum type A, B trên mẫu thực phẩm (MMO)
Nồng độ gây nhiễm của mẫu MMO
Số lần lặp lại thí nghiệm (lần)
Số lần cho kết quả dương tính
Tỷ lệ % kết quả dương tính
Số lần cho kết quả dương tính
Tỷ lệ % kết quả dương tính
Quy trình LAMP được thực hiện để phát hiện gen độc tố của vi khuẩn C botulinum type A và B trên mẫu thực phẩm (MMO), sử dụng bộ mẫu thử nghiệm bao gồm mẫu dương tính (mẫu nhiễm với plasmid tái tổ hợp mang gen đích của vi khuẩn C botulinum type A, B với nồng độ 1.2x10^2 copies/gam) và mẫu âm tính (mẫu không nhiễm vi khuẩn C botulinum type A, B) Kết quả cho thấy độ đặc hiệu, độ nhạy và độ đúng của quy trình LAMP đạt 100%, với tỷ lệ âm tính giả và dương tính giả đều là 0% (Bảng 3.3).
Bảng 3.3 trình bày kết quả xác định độ đặc hiệu, độ nhạy, độ đúng, tỷ lệ âm tính giả và tỷ lệ dương tính giả của phương pháp LAMP trong việc phát hiện gen độc tố của vi khuẩn C botulinum type.
A, B trên mẫu thực phẩm (MMO)
Kết quả quy trình LAMP xác định gen độc tố của vi khuẩn
Kết quả quy trình LAMP xác định gen độc tố của vi khuẩn
Dương tính Âm tính Tổng Dương tính Âm tính Tổng Mẫu thử nghiệm
Tổng 40 20 60 40 20 60 Độ nhạy (%) 100% 100% Độ đặc hiệu (%) 100% 100% Độ đúng (%) 100% 100%
Tỷ lệ dương tính giả (%) 0% 0%
Tỷ lệ âm tính giả (%) 0% 0%
Kết quả xác định giới hạn phát hiện sơ cấp của quy trình LAMP cho thấy khả năng phát hiện gen độc tố của vi khuẩn C botulinum type A trên mẫu thực phẩm với dãy 5 nồng độ plasmid tái tổ hợp được pha loãng bậc 10 từ 5.0x10^0 đến 5.0x10^4 copies/gam Thí nghiệm cho thấy tín hiệu huỳnh quang tuyến tính tại các nồng độ pha loãng từ cao đến thấp.
Hình 3.3 Kết quả xác định giới hạn phát hiện bằng quy trình LAMP phát hiện gen độc tố của vi khuẩn C botulinum type A trên mẫu thực phẩm (MPC)
Kết quả xác định giới hạn phát hiện giai đoạn một bằng quy trình LAMP cho thấy khả năng phát hiện gen độc tố của vi khuẩn C botulinum type B trên mẫu thực phẩm (MPC).
Thí nghiệm được lặp lại ba lần để xác định giới hạn phát hiện sơ cấp của quy trình LAMP trong việc phát hiện gen độc tố của vi khuẩn C botulinum type A và B trên mẫu thực phẩm.
(MPC) là 5.0x10 1 copies/gam (với 3/3 (100%) lần lặp cho kết quả dương tính Bảng 3.4)
Kết quả xác định giới hạn phát hiện sơ cấp bằng quy trình LAMP cho thấy khả năng phát hiện gen độc tố của vi khuẩn C botulinum type A trong mẫu thực phẩm (MPC).
Nồng độ gây nhiễm của mẫu
Lần 1 Lần 2 Lần 3 Lần 1 Lần 2 Lần 3
Ghi chú : (+): Dương tính/ (-): Âm tính
Giới hạn phát hiện sơ cấp trên nền mẫu MPC của quy trình LAMP được xác định là 1.75x10^-4 ng/gam, tương đương với 5.0x10^1 copies/gam Để khảo sát giới hạn phát hiện, các dãy nồng độ tiệm cận được gây nhiễm là (1.00x10^1; 4.29x10^1; 7.15x10^1; 1.00x10^2; 1.29x10^2 copies/gam) Kết quả thí nghiệm cho thấy quy trình LAMP có khả năng phát hiện gen độc tố của vi khuẩn C botulinum type A và type B.
Nồng độ thấp nhất cho kết quả dương tính 100% với cả hai loại A và B là 1.00x10^2 copies/gam, theo Bảng 3.5 Tỷ lệ phát hiện tại mỗi nồng độ được phân tích bằng thống kê Probit, cho thấy giới hạn phát hiện với độ tin cậy 95% (LOD95) của quy trình LAMP phát hiện gen độc tố vi khuẩn C botulinum type A và type B trên mẫu thực phẩm là 1.0x10^2 copies/gam, với khoảng tin cậy 95% lần lượt là (95% CI: 0.84x10^2 đến 1.41x10^2 và 95% CI: 0.85x10^2 đến 1.40x10^2).
Bảng 3.5 Kết quả xác định giới hạn phát hiện bằng LAMP phát hiện gen độc tố của vi khuẩn C botulinum type A, B trên mẫu thực phẩm (MPC)
Nồng độ gây nhiễm của mẫu MPC
Số lần lặp lại thí nghiệm (lần)
Số lần cho kết quả dương tính
Tỷ lệ % kết quả dương tính
Số lần cho kết quả dương tính
Tỷ lệ % kết quả dương tính
Quy trình LAMP được thực hiện để phát hiện gen độc tố của vi khuẩn C botulinum type A và B trong mẫu thực phẩm (MPC), sử dụng bộ mẫu thử nghiệm bao gồm mẫu dương tính với plasmid tái tổ hợp mang đoạn gen đích ở nồng độ 1.2x10^2 copies/gam và mẫu âm tính không chứa vi khuẩn Kết quả cho thấy độ đặc hiệu, độ nhạy và độ đúng của quy trình LAMP đạt 100%, với tỷ lệ âm tính giả và dương tính giả đều là 0% (Bảng 3.6).
Bảng 3.6 trình bày kết quả xác định độ đặc hiệu, độ nhạy, độ đúng, tỷ lệ âm tính giả và tỷ lệ dương tính giả khi sử dụng phương pháp LAMP để phát hiện gen độc tố của vi khuẩn C botulinum type.
A, B trên mẫu thực phẩm (MPC)
Kết quả quy trình LAMP xác định gen độc tố của vi khuẩn
Kết quả quy trình LAMP xác định gen độc tố của vi khuẩn
Dương tính Âm tính Tổng Dương tính Âm tính Tổng Mẫu thử nghiệm
Tổng 40 20 60 40 20 60 Độ nhạy (%) 100% 100% Độ đặc hiệu (%) 100% 100% Độ đúng (%) 100% 100%
Tỷ lệ dương tính giả (%) 0% 0%
Tỷ lệ âm tính giả (%) 0% 0%
Kết quả xác định giới hạn phát hiện sơ cấp của quy trình LAMP cho thấy khả năng phát hiện gen độc tố của vi khuẩn C botulinum type A trong mẫu thực phẩm với dãy 5 nồng độ plasmid tái tổ hợp được pha loãng bậc 10 liên tiếp (từ 5.0x10^0 đến 5.0x10^4 copies/gam) Thí nghiệm cho thấy tín hiệu huỳnh quang tuyến tính tại các dải nồng độ pha loãng từ cao đến thấp, chứng minh tính hiệu quả của phương pháp này trong việc phát hiện vi khuẩn C botulinum type A.
Hình 3.5 Kết quả xác định giới hạn phát hiện bằng quy trình LAMP phát hiện gen độc tố của vi khuẩn C botulinum type A trên mẫu lâm sàng (MP)
Hình 3.6 Kết quả xác định giới hạn phát hiện bằng quy trình LAMP phát hiện gen độc tố của vi khuẩn C botulinum type B trên mẫu lâm sàng (MP)
BÀN LUẬN
botulinum type A, B
Chứng âm nội kiểm (nước cất khử inon dùng trong các xét nghiệm sinh học phân tử)
2.1.1 Nghiên cứu so sánh quy trình LAMP với quy trình nuôi cấy phân lập phát hiện gen độc tố của vi khuẩn C botulinum type A, B
- Đối tượng nghiên cứu: Quy trình LAMP (của TS Lê Huy Hoàng và cộng sự) phát hiện gen độc tố của vi khuẩn C botulinum type A, B
Mẫu thêm chuẩn (MMO, MPC, MP) đã được xác nhận âm tính ba lần với độc tố của vi khuẩn C botulinum type A, B thông qua quy trình nuôi cấy phân lập và kỹ thuật PCR để phát hiện gen độc tố tại phòng Vi khuẩn kỵ khí, NIHE.
Chứng dương nội kiểm (plasmid tái tổ hợp mang đoạn gen đích của vi khuẩn
C botulinum type A, B nồng độ 1.0x10 6 copies/ μl)
Chứng âm nội kiểm (nước cất khử ion dùng trong các xét nghiệm sinh học phân tử)
2.3 Thiết kế và nội dung nghiên cứu
- Nghiên cứu thực nghiệm trong phòng thí nghiệm bao gồm các nội dung sau
2.3.1 Thiết kế thí nghiệm xác định giới hạn phát hiện, độ nhạy, độ đặc hiệu, độ đúng, tỷ lệ dương tính giả, tỷ lệ âm tính giả của quy trình LAMP phát hiện gen độc tố của vi khuẩn C botulinum type A, B
2.3.1.1 Thí nghiệm xác định giới hạn phát hiện trên nền mẫu: Để xác định giới hạn phát hiện của mồi ta tiến hành quy trình LAMP sử dụng trực tiếp plasmid tái tổ hợp mang đoạn gen đích của vi khuẩn C botulinum type A,
Bằng cách sử dụng dải nồng độ biết trước, ADN khuôn được áp dụng để đánh giá phản ứng LAMP mà không cần bước tách chiết Nhóm nghiên cứu đã hoàn thành giai đoạn đầu trong việc xác định giới hạn phát hiện của mồi sau khi tối ưu hóa các thành phần trong phản ứng.
Để xác định giới hạn phát hiện của nền mẫu, cần thực hiện nhiều bước hơn Đầu tiên, cần gây nhiễm plasmid tái tổ hợp mang đoạn gen đích của vi khuẩn C botulinum type A, B ở các nồng độ đã biết trên từng nền mẫu Sau đó, tiến hành tách chiết ADN bằng bộ kit QIAmp ADN Mini kit (Qiagen, Đức) và thực hiện quy trình LAMP để xác định giới hạn phát hiện Thông thường, giới hạn phát hiện của nền mẫu cao hơn giới hạn phát hiện của mồi, do phụ thuộc vào hiệu suất tách chiết và ảnh hưởng của nền mẫu.
Theo hướng dẫn của CLIA (Vol 23, No 3) (30), TCVN/ISO 15189:2015(25); TCVN/ISO 17025: 2017(26) chúng tôi thiết kế thí nghiệm xác định giới hạn phát hiện như sau:
Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã thực hiện phản ứng LAMP trên từng nền mẫu MMO, MPC và MP, được gây nhiễm plasmid tái tổ hợp mang đoạn gen đích của vi khuẩn C botulinum type A và B Thí nghiệm được chia thành hai giai đoạn để đảm bảo tính chính xác và hiệu quả của phản ứng.
Để xác định điểm giới hạn phát hiện sơ cấp, quy trình LAMP được thực hiện với 5 nồng độ plasmid tái tổ hợp chứa gen đích của vi khuẩn C botulinum type A, B Các mẫu thực phẩm (MMO, MPC) và lâm sàng (MP) được gây nhiễm với nồng độ pha loãng bậc 10 liên tiếp từ 5.0 x10^4 đến 5.0 x10^0 copies/gam Thử nghiệm được lặp lại 3 lần cho mỗi nồng độ Nồng độ thấp nhất có sản phẩm khuếch đại sau phản ứng LAMP chính là giới hạn phát hiện sơ cấp của mẫu cần tìm.
Trên từng nền mẫu, quy trình gây nhiễm mẫu được thực hiện tại các dải nồng độ nhỏ gần với giới hạn phát hiện sơ cấp, bao gồm các mức nồng độ 1.0x10¹, 4.29x10¹, 7.15x10¹, 1.00x10² và 1.29x10² copies/gam Chi tiết về các phương pháp thực hiện quy trình này được trình bày trong phụ lục IV.
Để xác định giới hạn phát hiện với độ tin cậy 95% (LOD95), quy trình LAMP được lặp lại 12 lần ở các nồng độ gần với giới hạn phát hiện sơ cấp của giai đoạn 1 trên từng nền mẫu nhiễm Phân tích này sử dụng plasmid tái tổ hợp mang đoạn gen đích của vi khuẩn C botulinum type A, B.
+ Ghi chép kết quả thí nghiệm theo biểu mẫu thu thập kết quả thí nghiệm xác định giới hạn phát hiện (Phụ lục 1)
Giới hạn phát hiện của phản ứng LAMP được xác định là nồng độ ADN thấp nhất có sản phẩm khuếch đại, cụ thể cho vi khuẩn C botulinum type A, B Phân tích hồi quy probit trên phần mềm Medcalc phiên bản 20.0.13 cho thấy giới hạn phát hiện này đạt 95% kết quả dương tính ở nồng độ thấp nhất Vì đây là giới hạn phát hiện của nền mẫu, nên nó được biểu diễn dưới dạng nồng độ mẫu.
(ng/mL) và quy đổi thành số lượng bản sao ADN (copies/gam) với công thức tính như sau:
Số bản sao = (nồng độ ADN x 6.022x10 23 )/(chiều dài ADN tái tổ hợp x10 9 x650)
Chiều dài plasmid tái tổ hợp mang đoạn gen đích của vi khuẩn C botulinum type A và B trong nghiên cứu của chúng tôi lần lượt là 3250bp và 3240bp
2.3.1.2 Thí nghiệm xác định độ đặc hiệu, độ nhạy, độ đúng, tỷ lệ âm tính giả, tỷ lệ dương tính giả
Dựa trên hướng dẫn của Viện Tiêu chuẩn Lâm sàng và Phòng xét nghiệm (CLIA (Vol 23, No 3)), chúng tôi đã thiết kế một thí nghiệm nhằm xác định giới hạn phát hiện.
+ Mỗi type độc tố được bố trí như sau:
Mỗi nền mẫu được chuẩn bị 60 mẫu, trong đó 40 mẫu được gây nhiễm với plasmid tái tổ hợp chứa đoạn gen đích của vi khuẩn C botulinum type A, B ở nồng độ lớn hơn 20% của giới hạn phát hiện Đồng thời, 20 mẫu còn lại là mẫu âm tính không bị nhiễm Nghiên cứu viên thực hiện quy trình gây nhiễm mẫu khác với quy trình LAMP.
Tiến hành phân tích các mẫu theo quy trình LAMP để phát hiện độc tố của vi khuẩn C botulinum type A, B, đồng thời ghi chép kết quả thí nghiệm theo biểu mẫu thu thập nhằm xác định độ đặc hiệu, độ nhạy, độ đúng, tỷ lệ âm tính giả và tỷ lệ dương tính giả.
Xác định độ nhạy, độ đặc hiệu, độ đúng, tỷ lệ âm tính giả, tỷ lệ dương tính giả dựa vào bảng tính 2x2 và công thức
2.3.2 Thiết kế thí nghiệm so sánh quy trình LAMP với quy trình nuôi cấy phát hiện độc tố của vi khuẩn C botulinum type A, B
Tại NIHE, tổng cộng có 90 mẫu thực phẩm và lâm sàng được lưu trữ Các mẫu này đã trải qua quy trình xét nghiệm nuôi cấy phân lập nhằm phát hiện gen độc tố của vi khuẩn.
HUPH đã phân lập được khuẩn C botulinum type A và B, sau đó gửi mẫu đến phòng thí nghiệm trọng điểm công nghệ enzyme và protein thuộc Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia.