Nghiên cứu tác dụng kháng ung thư đại tràng người của virus vaccine sởi và quai bị trên thực nghiệm

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ QUỐC PHÒNG HỌC VIỆN QUÂN Y LÊ DUY CƯƠNG NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG KHÁNG UNG THƯ ĐẠI TRÀNG NGƯỜI CỦA VIRUS VACCINE SỞI VÀ QUAI BỊ TRÊN THỰC NGHIỆM LUẬN ÁN TIẾN SỸ Y HỌC n ậ Lu án tiế n HÀ NỘI, NĂM 2019 sỹ Y c họ BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ QUỐC PHÒNG HỌC VIỆN QUÂN Y LÊ DUY CƯƠNG NGHIÊN CỨU TÁC DỤNG KHÁNG UNG THƯ ĐẠI TRÀNG NGƯỜI CỦA VIRUS VACCINE SỞI VÀ QUAI BỊ TRÊN THỰC NGHIỆM Chuyên ngành: Khoa học y sinh Mã số: 9720101 LUẬN ÁN TIẾN SỸ Y HỌC n ậ Lu NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS TS Nguyễn Lĩnh Toàn PGS.TS Hồ Anh Sơn án tiế n HÀ NỘI, NĂM 2019 sỹ Y c họ LỜI CẢM ƠN Với lịng kính trọng biết ơn sâu sắc! Tơi xin chân thành cảm ơn Đảng ủy, Ban Giám đốc Học Viện, Bộ môn Sinh lý bệnh, Viện nghiên cứu Y-Dược học quân sự, Phòng Sau đại học, Học viện Quân y tạo điều kiện, giúp đỡ q trình học tập nghiên cứu Tơi xin chân thành cảm ơn Bộ môn Sinh học tế bào, khoa Sinh học Phịng Thí nghiệm Trọng điểm cơng nghệ Enzym Protein (KLEPT), Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội tạo điều kiện thuận lợi, giúp đỡ tơi hồn thành luận án Tơi xin chân thành cảm ơn Khoa Hình thái, Viện 69, Bộ Tư Lệnh Lăng Chủ Tịch Hồ Chí Minh tạo điều kiện thuận lợi, giúp đỡ tơi hồn thành luận án Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn đến PGS.TS Nguyễn Lĩnh Toàn, PGS.TS Hồ Anh Sơn, người thầy tận tình trực tiếp dạy dỗ, dìu dắt, hướng dẫn tạo điều kiện cho tơi suốt q trình nghiên cứu hồn thành luận án Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn kính trọng đến thầy hội đồng chấm luận án dành nhiều thời gian công sức bảo, giúp đỡ tơi hồn thành luận án Tôi xin chân thành cảm ơn động viên, giúp đỡ vơ tư, tận tình anh chị trước, đồng nghiệp, bạn bè trình học tập ậ Lu Cuối cùng, tơi xin tỏ lịng biết ơn tới công ơn nuôi dạy cha mẹ tôi, n quan tâm giúp đỡ, động viên vợ, con, anh, chị, em bạn bè thân thiết án để tơi có ngày hơm n tiế Hà Nội, ngày tháng năm 2019 sỹ Lê Duy Cương Y c họ LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan số liệu đề tài luận án phần số liệu đề tài nghiên cứu có tên: “Nghiên cứu ứng dụng virus vaccine sởi quai bị gây ly giải tế bào điều trị ung thu gan đại trực tràng thực nghiệm” Kết đề tài thành nghiên cứu tập thể mà tơi thành viên Tơi Chủ nhiệm đề tài toàn thành viên nhóm nghiên cứu đồng ý cho phép sử dụng đề tài vào luận án để bảo vệ lấy tiến sĩ Các số liệu, kết nêu luận án trung thực chưa cơng bố cơng trình khác Tác giả luận án Lê Duy Cương n ậ Lu án n tiế sỹ Y c họ MỤC LỤC TRANG PHỤ BÌA LỜI CẢM ƠN LỜI CAM ĐOAN MỤC LỤC DANH MỤC CÁC CHỮ, KÝ HIỆU VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ DANH MỤC CÁC HÌNH ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu chung 1.2 Ung thư đại trực tràng 1.2.1 Tình hình ung thư đại trực tràng 1.2.2 Nguyên nhân ung thư đại trực tràng 1.2.3 Cơ chế bệnh sinh ung thư đại trực tràng 1.3 Liệu pháp virus vaccine sởi quai bị điều trị ung thư đại trực tràng người 22 1.3.1 Sinh học virus sởi quai bị 22 1.3.2 Virus vaccine sởi quai bị lây nhiễm đặc hiệu tế bào ung thư đại trực tràng 24 1.3.3 Các chế virus vaccine sởi quai bị ly giải tế bào ung thư đại trực tràng 27 ậ Lu 1.4 Các nghiên cứu virus vaccine sởi quai bị điều trị ung thư lâm n sàng 35 án CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 38 2.1 Đối tượng nghiên cứu 38 tiế 2.1.1 Động vật 38 n 2.1.2 Chất liệu nghiên cứu 38 sỹ Y c họ 2.1.3 Trang thiết bị sử dụng cho nghiên cứu 38 2.2 Phương pháp nghiên cứu 40 2.2.1 Phương pháp ni cấy tăng sinh dịng tế bào 40 2.2.2 Phương pháp tăng sinh chuẩn độ virus vaccine sởi quai bị từ nguồn virus vaccine 42 2.2.3 Phương pháp đánh giá virus vavccine sởi quai bị ly giải tế bào thử nghiệm 3- (4,5-Dimethylthiazol-2-yl) -2,5 diphenyl tetrazolium bromide 45 2.2.4 Chuẩn bị mẫu tế bào HT-29 nhiễm virus vaccine sởi quai bị đánh giá tỉ lệ tế bào chết theo chương trình tế bào hoại tử phương pháp dòng chảy 48 2.2.5 Đánh giá tỉ lệ tế bào ung thư đại tràng người HT-29 chết theo chương trình hoại tử phương pháp phân tích tế bào dòng chảy 51 2.2.6 Phương pháp nuôi chuột thiếu hụt miễn dịch (chuột nude) 54 2.2.7 Phương pháp tạo khối u dòng tế bào ung thư đại tràng người HT29 dùi chuột thiếu hụt miễn dịch tính kích thước khối u 55 2.2.8 Phương pháp điều trị chuột nude virus vaccine sởi quai bị 56 2.2.9 Phương pháp đánh giá đáp ứng điều trị virus vaccine sởi quai bị chuột thiếu hụt miễn dịch mang khối u tế bào HT-29 56 2.2.10 Phương pháp phẫu tích lấy mơ u lách chuột thiếu hụt miễn dịch mang khối u tế bào HT-29 sau điều trị virus vaccine sởi quai bị 57 ậ Lu 2.2.11 Đánh giá tỉ lệ tế bào miễn dịch lách chuột thiếu hụt miễn n dịch mang khối u tế bào HT-29 sau điều trị virus vaccine sởi quai bị án phương pháp phân tích tế bào dịng chảy 59 2.2.12 Phương pháp phân tích siêu cấu trúc tế bào u HT-29 sau điều trị tiế virus vaccine sởi quai bị 61 n 2.2.13 Phương pháp phân tích kết 62 sỹ Y c họ SƠ ĐỒ NGHIÊN CỨU 64 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 65 3.1 Tăng sinh dòng tế bào HT-29, Vero, virus vaccine sởi quai bị 65 3.1.1 Tăng sinh dòng tế bào HT-29 Vero 65 3.1.2 Tăng sinh virus vaccine sởi quai bị từ nguồn virus vaccine 66 3.2 Chuẩn độ virus vaccine sởi quai bị theo phương pháp TCID50 67 3.3 Virus vaccine sởi quai bị ly giải trực tiếp dòng tế bào ung thư đại tràng người HT-29 in vitro 68 3.3.1 Tế bào HT-29 nhiễm virus vaccine sởi quai bị tạo hợp bào in vitro 68 3.3.2 Kết đánh giá hiệu ly giải tế bào ung thư đại tràng người HT-29 virus vaccine sởi quai bị nghiệm pháp 3- (4,5Dimethylthiazol-2-yl) -2,5 diphenyl tetrazolium bromide 69 3.3.3 Đánh giá tỉ lệ tế bào ung thư đại tràng người HT-29 chết theo chương trình hoại tử sau nhiễm virus vaccine sởi quai bị in vitro.73 3.4 Virus vaccine sởi quai bị kháng u dòng tế bào ung thư đại tràng người HT-29 cấy ghép chuột thiếu hụt miễn dịch 90 3.4.1 Kết ghép u dòng tế bào ung thư đại tràng người HT-29 90 3.4.2 Kết điều trị chuột nude mang khối u tế bào ung thư đại tràng người HT-29 virus vaccine sởi quai bị 91 3.4.3 Tỉ lệ tế bào miễn dịch lách chuột thiếu hụt miễn dịch nhóm nghiên cứu sau điều trị virus vaccine sởi quai bị 96 3.4.4 Hình ảnh siêu cấu trúc tế bào u đại tràng người HT-29 sau điều trị virus vaccine sởi quai bị 99 ậ Lu CHƯƠNG 4: BÀN LUẬN 101 n 4.1 Tăng sinh dòng tế bào Vero tế bào ung thư đại tràng người án HT-29 in vitro 101 4.1.1 Tăng sinh dòng tế bào Vero 101 tiế 4.1.2 Ni cấy, tăng sinh dịng tế bào ung thư đại tràng người HT-29 102 n 4.2 Tăng sing virus vaccine sởi, quai bị Chuẩn độ TCID50 103 sỹ Y c họ 4.3 Virus vaccine sởi quai bị ly giải tế bào ung thư đại tràng người HT-29 in vitro 107 4.3.1 Virus vaccine sởi quai bị ly giải trực tiếp tế bào ung thư đại tràng người HT-29 cách tạo hợp bào in vitro 107 4.3.2 Đánh giá khả ly giải tế bào HT-29 virus vaccine sởi quai bị nghiệm pháp - (4,5-Dimethylthiazol-2-yl) - 2,5 diphenyl tetrazolium bromide 109 4.3.3 Virus vaccine sởi quai bị ly giải tế bào HT-29 thông qua kích hoạt đường tế bào chết theo chương trình in vitro 112 4.4 Virus vaccine sởi quai bị kháng u tế bào ung thư đại tràng người HT-29 chuột thiếu hụt miễn dịch 123 4.4.1 Đánh giá độc tính virus vaccine sởi quai bị chuột thiếu hụt miễn dịch mang khối u tế bào ung thư đại tràng người HT-29 123 4.4.2 Virus vaccine sởi quai bị kháng u tế bào ung thư đại tràng người HT-29 chuột thiếu hụt miễn dịch 125 4.4.3 Virus vaccine sởi quai bị kích thích miễn dịch đặc hiệu kháng u tế bào ung thư đại tràng người HT-29 chuột thiếu hụt miễn dịch.128 4.4.4 Kết siêu cấu trúc tế bào u đại tràng người HT-29 ghép chuột thiếu hụt miễn dịch sau điều trị virus vaccine sởi quai bị 134 KẾT LUẬN 140 Phối hợp virus vaccine sởi quai bị có hiệu ly giải trực tiếp kích hoạt đường chết tế bào apoptosis in vitro dòng tế bào ung thư đại tràng người HT-29 140 ậ Lu Phối hợp virus vaccine sởi quai bị có hiệu kháng u dòng tế bào n ung thư đại tràng người HT-29 cấy ghép chuột nude 139 án KHUYẾN NGHỊ 142 DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH CÔNG BỐ KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU tiế CỦA ĐỀ TÀI, LUẬN ÁN 143 n TÀI LIỆU THAM KHẢO 144 sỹ Y c họ ĐẶT VẤN ĐỀ Ung thư đại trực tràng (colorectal cancer-CRC) trình bệnh lý phát sinh từ đại trực tràng, gây nên tăng bất thường tế bào có khả xâm lấn hay lan rộng vào phận khác thể Là trình bệnh lý phát triển qua nhiều giai đoạn, hậu từ tích lũy tăng dần đột biến gen, đột biến gen kết bất thường đường tín hiệu nội bào Wnt Số bệnh nhân bị CRC số ca tử vong CRC tăng theo thời gian Những năm gần đây, có nhiều phương pháp mới, tiến áp dụng điều trị CRC như: liệu pháp miễn dịch, gen trị liệu, điều trị đích, liệu pháp sử dụng hạt nano, … Mặc dù có phương pháp điều trị với nhiều hứa hẹn, kết kéo dài thời gian sống cho bệnh nhân, tiên lượng bệnh nhân CRC di sống năm 20% Sự phát triển sinh học phân tử cho hiểu biết chế bệnh ung thư virus Các nhà khoa học tạo chủng virus có khả lây nhiễm ly giải chọn lọc tế bào ung thư, kích thích đáp ứng miễn dịch đặc hiệu kháng ung thư Sử dụng virus ly giải tế bào u (OV) điều trị ung thư phương thức biến chép virus thành vũ khí tiêu diệt tế bào ung thư khơng ảnh hưởng đến tế bào lành OV có nhiều lợi so với phương pháp điều trị ung thư truyền thống như: giảm độc tính tác dụng phụ, có khả áp dụng rộng rãi cho nhiều loại ung thư, phương thức tự khuếch đại hoạt động kháng u cách virus ậ Lu tự nhân lên ly giải tế bào u lan rộng Hiện nay, với phát triển sinh học n phân tử, nhà khoa học thiết kế gen virus nhằm tăng khả án lây nhiễm ly giải tế bào ung thư đặc hiệu kiểm soát tiế mức độ virus nhân lên thể n Liệu pháp sử dụng chủng virus vaccine sởi (MeV) virus vaccine sỹ quai bị (MuV) sống, giảm độc lực điều trị ung thư người chứng minh Y c họ có hiệu Nhiều thử nghiệm lâm sàng sử dụng virus đường khác nhau: tiêm nội u, tiêm tĩnh mạch, tiêm phúc mạc… điều trị nhiều loại ung thư như: u lympho tế bào T da, ung thư đại trực tràng, ung thư buồng trứng, u nguyên bào đệm đa dạng… báo cáo có kết khả quan (bảng 1.1) Trong nhiều năm qua, chương trình tiêm chủng mở rộng với quy mơ tồn cầu MeV MuV sống, giảm độc lực thành công, thiết lập hồ sơ an toàn rộng khắp giới Các chủng MeV MuV khó gây bệnh trở lại hầu hết người chủng ngừa Bên cạch đó, hầu hết nghiên cứu lâm sàng tiền lâm sàng chứng minh sử dụng MeV, MuV điều trị ung thư an toàn tác dụng phụ Sử dụng MeV MuV điều trị ung thư liệu pháp có tiềm quan tâm nghiên cứu nhiều nước phát triển Nhưng chưa có nghiên cứu sâu đánh giá hiệu sử dụng phối hợp MeV MuV điều trị ung thư đại tràng người Nghiên cứu phối hợp MeV với MuV kháng ung thư đại tràng người thực nghệm mở đầu cho việc sâu nghiên cứu, áp dụng phương pháp điều trị ung thư đại tràng người Vì vậy, tiến hành đề tài “nghiên cứu tác dụng kháng ung thư đại tràng người virus vaccine sởi quai bị thực nghiệm” với mục tiêu sau: Đánh giá khả gây độc tế bào chết tế bào theo chương trình (apoptosis) phối hợp virus vaccine sởi quai bị dòng tế bào ung ậ Lu thư đại tràng người HT-29 in vitro n Đánh giá hiệu kháng u phối hợp virus vaccine sởi quai bị án mơ hình chuột thiếu hụt miễn dịch (chuột nude) mang khối u dòng tế bào n tiế ung thư đại trực tràng người HT-29 sỹ Y c họ