ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Đối tượng nghiên cứu
Có 49 con chuột thiếu hụt miễn dịch (chuột nude) chủng BALB/c được nuôi trong phòng sạch, chăm sóc theo quy trình hướng dẫn nuôi chuột nude tại Viện nghiên cứu Y-Dược học Quân sự, Học viện Quân Y
2.1.2.1 Virus vaccine sởi và quai bị
Vaccine sởi chủng Edmonton và vaccine quai bị chủng Urabe được phát triển từ vaccine Priorix của GlaxosmithKline, Anh Các chủng virus này được nuôi cấy, bảo quản và duy trì tại phòng thí nghiệm nghiên cứu ung thư thuộc Bộ môn Sinh lý bệnh, Viện nghiên cứu Y-Dược học Quân sự, Học viện Quân y.
2.1.2.2 Dòng tế bào ung thư đại tràng người HT-29 và tế bào thận khỉ xanh Châu Phi (Vero)
Dòng tế bào Vero và HT-29, nguồn gốc từ American Type Culture Collection, đã được nuôi cấy và tăng sinh theo quy trình chuẩn tại trung tâm nghiên cứu ung thư thuộc Bộ môn Sinh lý bệnh, Viện nghiên cứu Y-Dược học Quân sự, Học viện Quân y.
2.1.3 Trang thiết bị sử dụng cho nghiên cứu
Để thực hiện nghiệm pháp MTT, chúng tôi sử dụng các thiết bị như thước kẹp đo U, máy camera, máy đo quang OD, kính hiển vi quang học và tủ ấm ở nhiệt độ 37°C với 5% CO2 Tất cả các máy đo phục vụ cho nghiên cứu đều được chuẩn hóa để đảm bảo độ chính xác và tin cậy trong kết quả.
Luận án tiến sỹ Y học
Hình 2.1 Các máy sử dụng cho nghiên cứu
(1) Kính hiển vi điện tử truyền qua; (2) Máy phân tích tế bào theo dòng chảy;
(3) Máy ly tâm; (4) Kính hiển vi; (5) Tủ ấm 37 0 C, 5% CO2;
2.1.3.2 Các dụng cụ thí nghiệm tiêu hao Đĩa nuôi cấy tế bào các kích cỡ khác nhau, các đĩa nuôi cấy tế bào đa giếng: 6, 12, 24, 96 giếng; pipet các kích cỡ; ống falcon 15ml và 50 ml; ống effendort 1,5ml và 2ml; các dụng cụ tiêu hao khác
Môi trường nuôi cấy DMEM có thêm 10% FBS (Foetal Bovine Serum) và 1% kháng sinh (penicillin và streptomycin) được lọc qua màng lọc vô trùng
Dung dịch đệm PBS, cồn 90 độ, Trypsin-EDTA 1X, dung dịch cố định tế bào, dung dịch dimethyl sulphoxide (DMSO)…
Bộ kit MTT đánh giá tỉ lệ tế bào sống; kit FITC Annexin V Apoptosis
Bộ phát hiện (BD) đánh giá tỷ lệ tế bào chết apoptosis, trong khi các kháng thể gắn chất phát huỳnh quang được sử dụng để phát hiện các tế bào miễn dịch trong lách chuột.
Luận án tiến sỹ Y học
Mouse CD11b-FITC, kháng thể Mouse CD49b/Pan-NK Cells FITC DX5, kháng thể Mouse CD11c APC HL3, Kháng thể Ms CD197 (CCR7) PerCP- Cy5.5 4B12
2.2.1 Phương pháp nuôi cấy và tăng sinh các dòng tế bào
- Tế bào Vero và dòng tế bào ung thư đại tràng người HT-29 lấy từ nguồn tế bào được bảo quản ở môi trường âm sâu (-
- Dung dịch PBS vô trùng
- Dung dịch môi trường nuôi cấy tế bào DMEM pha với 10% FBS, 1% kháng sinh (penicilline + streptomycine) và được lọc qua màng lọc vụ trựng đường kớnh lỗ 0,45àm
- Pipet, ống nghiệm vô trùng, đĩa nuôi cấy tế bào, máy ly tâm, buồng đếm tế bào, kính hiển vi quang học…
2.2.1.2 Nuôi cấy dòng tế bào ung thư đại tràng người HT-29 và Vero
Tế bào HT-29 và Vero được bảo quản ở nhiệt độ âm sâu (-80°C) và được rã đông nhanh chóng trong vòng một phút bằng cách xoay nhẹ ống nghiệm chứa tế bào trong nước 37°C.
Chuẩn dịch tế bào nồng độ 10 5 tế bào/ml bằng phương pháp đếm tế bào ở buồng đếm haemocytometer
Sau khi cho 10ml dung dịch tế bào vào đĩa nuôi cấy đáy rộng (20x150mm), hãy kiểm tra tế bào dưới kính hiển vi quang học sau 1 ngày gieo Nếu tế bào bám vào đáy đĩa nuôi cấy và phát triển, cần thay môi trường nuôi cấy tế bào (hình 2.2) Hàng ngày, tiếp tục theo dõi sự phát triển của tế bào cũng như tình trạng sức khỏe của chúng.
Hình 2.2 Nuôi cấy và tăng sinh tế bào trong phòng thí nghiệm
Luận án tiến sĩ Y học nghiên cứu trạng thái tế bào bị nhiễm vi sinh vật dưới kính hiển vi quang học Mỗi 2-3 ngày, môi trường nuôi cấy được thay mới để duy trì sự phát triển của tế bào Tế bào được bảo quản trong tủ ấm ở nhiệt độ 37 độ C với độ ẩm 5%.
2.2.1.3 Tăng sinh dòng tế bào ung thư đại tràng người HT-29 và Vero
Sau khoảng 7-10 ngày gieo tế bào, tế bào sẽ phát triển gần kín đáy đĩa nuôi cấy Để tiếp tục quá trình, cần tiến hành tách tế bào và gieo chúng vào nhiều đĩa nuôi cấy khác nhau theo các bước hướng dẫn cụ thể.
- Hút hết dịch môi trường cũ ở đĩa nuôi cấy tế bào, sau đó rửa sạch tế bào ở các đĩa nuôi cấy bằng dung dịch PBS (tiến hành 2-3 lần)
- Cho vào đĩa nuôi cấy tế bào 3 ml dung dịch trypsin-EDTA 1X, lắc đều rồi cho vào tủ ấm 37 0 C, CO2 khoảng 2-3 phút
Lấy các đĩa nuôi cấy tế bào từ tủ ấm và kiểm tra mức độ tế bào bong khỏi đáy đĩa dưới kính hiển vi quang học Khi tế bào đã bong ra, tách rời và lơ lửng trong môi trường nuôi cấy, tiến hành các bước tiếp theo.
Thêm 20 ml dung dịch môi trường nuôi cấy vào mỗi đĩa nuôi cấy tế bào đã bong hết Trộn đều dung dịch môi trường và tế bào bằng pipet, sau đó sử dụng pipet để hút toàn bộ dịch môi trường chứa tế bào vào ống fancol 50 ml.
- Đếm tế bào ở buồng đếm haemocytometer, chuẩn nồng độ dịch tế bào là 10 4 tế bào/ml
- Cho 10 ml dung dịch tế bào đã chuẩn nồng độ ở trên vào các đĩa nuôi cấy 20x150 mm mới (đã chuẩn bị)
Đặt các đĩa nuôi cấy tế bào mới vào tủ ấm ở nhiệt độ 37°C với 5% CO2 Theo dõi sự bám đáy và phát triển của tế bào hàng ngày, đồng thời loại bỏ ngay các đĩa nuôi cấy bị nhiễm nấm hoặc vi sinh vật khác trong quá trình nuôi cấy.
Khi tế bào phát triển gần kín đáy đĩa nuôi cấy, thu tế bào làm thí nghiệm hay làm nguồn tế bào bảo quản ở môi trường âm sâu (-80 0 C)
Luận án tiến sỹ Y học
(Chú ý: Cần tiến hành trong tủ cấy vô trùng, lấy tế bào ra khỏi tủ ấm
37 0 C, 5% CO 2 phải nhanh chóng không làm ảnh hưởng đến tế bào phát triển)
2.2.2 Phương pháp tăng sinh và chuẩn độ virus vaccine sởi và quai bị từ nguồn virus vaccine
2.2.2.1 Tăng sinh virus vaccine sởi và quai bị từ nguồn virus vaccine
Nhiễm virus MeV và MuV vào tế bào Vero được thực hiện bằng cách gieo tế bào Vero vào các đĩa nuôi cấy có kích thước 20x150 mm với nồng độ 10^5 tế bào/ml Quá trình này được tiến hành theo kỹ thuật nuôi cấy tế bào đã nêu ở mục 2.2.1 và được bảo quản trong tủ ấm ở nhiệt độ 37°C với 5% CO2.
Sau 24 giờ, kiểm tra tế bào trên đĩa nuôi cấy dưới kính hiển vi, tế bào Vero bám đáy tốt, thay môi trường nuôi cấy Theo dõi tế bào Vero phát triển hàng ngày, 2-3 ngày thay môi trường nuôi cấy 1 lần Khi tế bào Vero phát triển gần kín đáy đĩa nuôi cấy (thường vào ngày thứ 5 hay 6), thay môi trường nuôi cấy đồng thời tiến hành nhiễm MeV, MuV vào các đĩa tế bào Vero với nồng độ 1-2 ml dịch stock virus/đĩa nuôi cấy, lưu vào tủ ấm 37 0 C, 5% CO2
Tăng sinh dòng tế bào HT-29, Vero, virus vaccine sởi và quai bị
3.1.1 Tăng sinh các dòng tế bào HT-29 và Vero
Hình 3.1 Tế bào HT-29 bám đáy và phát triển (A) ở vật kính 10X; (B) ở vật kính 20X; (C) ở vật kính 40X
Hình 3.2 Tế bào Vero bám đáy và phát triển (A) ở vật kính 10X; (B) ở vật kính 20X; (C) ở vật kính 40X
Tế bào HT-29 là loại tế bào biểu mô đại tràng phát triển đơn lớp, có hình dạng đa dạng từ bầu dục đến đa giác, với đường kính khoảng 20-40 µm Khi quan sát bằng kính hiển vi quang học, tế bào HT-29 có nhân lớn, chiếm phần lớn tế bào chất, và hình ảnh nhân có sự phân chia rõ rệt.
Luận án tiến sỹ Y học
Tế bào Vero, được quan sát qua kính hiển vi quang học, là loại tế bào biểu mô phát triển theo dạng đơn lớp với đường kính khoảng 17 micromet Chúng có nhiều hình dạng khác nhau trong môi trường nuôi cấy.
3.1.2 Tăng sinh virus vaccine sởi và quai bị từ nguồn virus vaccine
Tế bào Vero có hình ảnh nhiễm MeV, MuV hòa màng tạo hợp bào và tế bào hoại tử dưới kính hiển vi quang học (hình 3.3)
Hình 3.3 mô tả sự tiến triển của tế bào Vero nhiễm virus MeV và MuV qua các ngày Vào ngày thứ 3 và 4, các tế bào nhiễm virus co tròn lại và bong khỏi đáy Đến ngày thứ 5, tế bào Vero bắt đầu hòa màng và tạo thành hợp bào Vào ngày thứ 6 và 7, hiện tượng hòa màng tiếp tục lan rộng, dẫn đến sự hình thành hợp bào Đến ngày thứ 9, hợp bào chết và tạo ra xác tế bào, được chú thích bởi các mũi tên đen.
Luận án tiến sỹ Y học
Chuẩn độ virus vaccine sởi và quai bị theo phương pháp TCID 50
Nhiễm MeV, MuV vào các giếng có tế bào Vero trên đĩa 96 giếng Sau
5-6 ngày nhiễm virus, tiến hành nhuộm xanh methylen đánh giá màu sắc ở các giếng Kết quả thu được như hình 3.4
Chuẩn độ TCID50 của MuV Chuẩn độ TCID50 của MeV
Hình 3.4 Kết quả nhuộm xanh methylen chuẩn độ TCID50
Tính TCID 50 của MeV cho thấy ở nồng độ pha loãng 10^-7 của virus, có 7 giếng nhạt màu hơn so với nhóm chứng, chiếm tỷ lệ 7/10, vượt quá 50% Ngược lại, ở nồng độ pha loãng 10^-6, chỉ có 3 giếng nhạt màu, với tỷ lệ 3/10, không đạt 50%.
Khoảng tỉ lệ (PD)= (7/10-5/10): (7/10-3/10) = 0,5 Log của nồng độ pha loãng có CPE trên 50%: -log (10 -7 ) = 7 TCID50 của MeV= 10 7+0,5 /0,2 ml = 5x10 7,5 /ml
Tính TCID 50 của MuV cho thấy ở nồng độ pha loãng 10^-6, có 7 giếng nhạt màu hơn so với nhóm chứng, chiếm tỉ lệ 70% (7/10), vượt quá 50% Trong khi đó, ở nồng độ pha loãng 10^-5, chỉ có 2 giếng nhạt màu, với tỉ lệ 20% (2/10), thấp hơn 50%.
Khoảng tỉ lệ (PD)= (7/10-5/10): (7/10-2/10) = 0,4 Log của nồng độ pha loãng có CPE trên 50%: -log (10 -6 ) = 6 TCID50 của MuV= 10 6+0,4 /0,2 ml = 5x10 6,4 /ml
Luận án tiến sỹ Y học
BÀN LUẬN
Tăng sinh các dòng tế bào Vero và tế bào ung thư đại tràng người HT-29 in vitro
Trong quá trình nuôi cấy tế bào in vitro, việc duy trì vô trùng là rất quan trọng Chúng tôi bổ sung 1% kháng sinh (streptomycin và penicillin) vào môi trường nuôi cấy và kiểm tra tế bào định kỳ 1-2 ngày/lần để đánh giá sự phát triển và phát hiện kịp thời tế bào nhiễm vi sinh vật Mycoplasma là một trong những nguồn lây nhiễm phổ biến, do đó, việc làm việc trong tủ cấy là cần thiết để giảm nguy cơ nhiễm.
Để đảm bảo quy trình nuôi cấy tế bào an toàn, cần sử dụng hộp hút vô trùng, đảm bảo tất cả trang thiết bị và dung dịch tiếp xúc với tế bào đều được tiệt trùng Việc duy trì môi trường nuôi cấy với lượng kháng sinh thấp, phổ biến nhất là hỗn hợp penicillin/streptomycin, là cần thiết để giảm thiểu nguy cơ nhiễm vi sinh vật, đặc biệt là mycoplasma Trước khi bắt đầu nuôi cấy tế bào mới, cần thực hiện công tác khử trùng, đặc biệt là khi lấy nguồn tế bào từ môi trường âm sâu để tránh nhiễm khuẩn DMEM là môi trường nuôi cấy phổ biến, đã được sử dụng thành công để nuôi cấy tế bào Vero và HT-29.
4.1.1 Tăng sinh dòng tế bào Vero
Trong nghiên cứu này, chúng tôi đã sử dụng dòng tế bào Vero để tăng sinh và chuẩn độ virus MeV và MuV Tế bào Vero được nuôi cấy trong môi trường DMEM bổ sung 10% FBS và 1% kháng sinh (penicillin và streptomycin), và được lưu giữ trong tủ ấm ở nhiệt độ 37°C với 5% CO2.
Tế bào Vero có nguồn gốc từ thận khỉ xanh Châu phi (tên khoa học là Cercopithecus Aethiops) được 2 nhà khoa học Yasumura Y và Kawakita Y
Luận án tiến sỹ Y học
Đại học Chiba, Nhật Bản, được thành lập vào năm 1962, là nơi phát hiện ra dòng tế bào Vero, một trong những dòng tế bào động vật có vú phổ biến trong nghiên cứu virus Tại Mỹ và nhiều quốc gia, tế bào Vero đã được cấp phép để sản xuất các virus sống như rotavirus, đậu mùa, sởi và quai bị Các dòng tế bào Vero như Vero, Vero 76 và Vero E6 đều có nguồn gốc giống nhau, dẫn đến việc sử dụng chúng là tương tự Để bảo quản lâu dài, tế bào Vero được lưu trữ trong nitơ lỏng hoặc ở nhiệt độ -80°C Sau khi gieo tế bào từ nguồn lưu trữ vào đĩa nuôi cấy, thường mất 2-3 lần gieo để tế bào đạt tốc độ tăng trưởng bình thường, điều này rất quan trọng trong kế hoạch nghiên cứu Cần lưu ý rằng tế bào Vero là tế bào bám đáy và không thể phát triển trong hệ thống treo.
4.1.2 Nuôi cấy, tăng sinh dòng tế bào ung thư đại tràng người HT-29 Để đánh giá khả năng kháng ung thư đại trực tràng người của MeV, MuV in vitro và khối u đại trực tràng người cấy ghép trên chuột nude, chúng tôi lựa chọn dòng tế bào ung thư đại tràng người HT-29 Dòng tế bào này được nuôi cấy và duy trì trong môi trường DMEM có thêm 10% FBS và 1% kháng sinh (penicillin và streptomycin), lưu trong tủ ấm 37 0 C và 5% CO2, 2 ngày thay môi trường nuôi cấy 1 lần, kiểm tra tế bào phát triển thường xuyên 1-2 ngày/lần, khoảng 6-7 ngày thu hoạch tế bào (nếu tế bào phát triển tốt) (hình 3.1) Các bước gieo, duy trì và thu hoạch tế bào chúng tôi làm đúng quy trình [70]
Tế bào ung thư đại tràng HT-29 được Fogh và Trempe phân lập từ khối u nguyên phát của một bệnh nhân nữ 44 tuổi người Caucasian vào năm 1964 Ban đầu, dòng tế bào HT-29 được sử dụng chủ yếu để nghiên cứu các khía cạnh khác nhau của sinh học ung thư ở người, nhưng sau đó đã mở rộng ứng dụng trong nhiều lĩnh vực nghiên cứu khác.
Luận án tiến sỹ Y học đã chỉ ra rằng tế bào ung thư đại tràng người có đầy đủ các đặc tính cần thiết, do đó được chọn cho các nghiên cứu về ung thư đại tràng cả in vitro và in vivo Hiện tại, tế bào HT-29 đang được sử dụng phổ biến trong các nghiên cứu để đánh giá hiệu quả kháng ung thư của nhiều hợp chất và thuốc khác nhau, cũng như để kiểm tra tác dụng của các virus ly giải tế bào ung thư đối với ung thư đại tràng người.
Tế bào HT-29 duy trì các thụ thể bề mặt tương tự như tế bào đại trực tràng bình thường, cho thấy sự biểu hiện ổn định của các thụ cảm thể Các thụ thể peptide, bao gồm peptide đường ruột, cũng được phát hiện trong dòng tế bào này Đặc biệt, tế bào HT-29 thể hiện cao các thụ cảm thể CD46 và Nectin-4, tương đồng với các tế bào đại trực tràng khỏe mạnh.
Tế bào HT-29 là đặc trưng quan trọng trong việc đánh giá hiệu quả của MeV và MuV đối với ung thư đại trực tràng ở người, đóng vai trò then chốt trong việc xác định khả năng lây nhiễm của các virus này vào tế bào CRC.
Các tế bào HT-29, mặc dù có nhiều ứng dụng trong nghiên cứu, nhưng cũng tồn tại một số hạn chế Đầu tiên, chúng là tế bào ác tính với tỷ lệ tiêu thụ glucose cao, tuy nhiên lại giảm khả năng chuyển hóa glucose trong môi trường nuôi cấy in vitro Thứ hai, mặc dù có nguồn gốc từ đại trực tràng, các tế bào này lại thể hiện đặc điểm giống tế bào ống tiêu hóa in vitro Cuối cùng, chúng không thể hoàn toàn giống với tế bào đại trực tràng bình thường, do khi nuôi cấy in vitro, chúng biểu hiện các enzyme hydrolase khác nhau và không có mặt đầy đủ các hydrolase như lactase và maltase-glucoamylase, cùng với các đặc tính vận chuyển ion khác biệt Ngoài ra, các tế bào này được cho là có hydrolase và nồng độ glycogen tích lũy tương tự như tế bào ruột của thai nhi.
Tăng sing virus vaccine sởi, quai bị và Chuẩn độ TCID 50
MeV và MuV được sản xuất từ virus vaccine Sau khi tăng sinh số lượng tế bào Vero, chúng tôi tiến hành nhiễm MeV và MuV vào các tế bào Vero để tiếp tục quá trình tăng sinh.
Vào những năm 1940, nghiên cứu về virus học đã chỉ ra rằng việc cấy truyền virus qua nhiều vật chủ có thể giúp giảm độc lực của chúng Đặc biệt, vào năm 1957, Fox J.P và các cộng sự đã phát triển vaccine virus polio gây bệnh dại qua đường miệng bằng cách cấy truyền trên phôi gà hoặc chuột.
Phương pháp nuôi cấy tế bào in vitro đã chứng minh hiệu quả trong việc tăng sinh virus vaccine, như virus sởi và quai bị, theo nghiên cứu của Enders J.F và cộng sự (1949) Nhiều loại virus vaccine, bao gồm virus sởi, dại, rubella và quai bị, đã được phát triển và chọn lọc bằng phương pháp này Cấy truyền tế bào in vitro là một cách hợp lý để tạo ra virus vaccine, giúp giảm thiểu khả năng gây bệnh do virus Các chủng virus giảm độc lực này thường mất hoặc giảm biểu hiện gen gây bệnh, do đó, chúng hầu như không gây bệnh khi được sử dụng trong tiêm chủng Môi trường thích hợp là yếu tố quan trọng để duy trì các chủng virus vaccine này.
Nhiệt độ bình thường trong tế bào người là 37°C Trong nghiên cứu và sản xuất vaccine, nhiều dòng tế bào được sử dụng để tăng sinh virus, trong đó tế bào Vero là một trong những dòng phổ biến nhất Tế bào Vero đóng vai trò quan trọng trong việc sản xuất các virus vaccine, bao gồm virus sởi và quai bị.
Chuẩn độ virus là một bước quan trọng trong nghiên cứu virus, đặc biệt khi cần xác định lượng virus chính xác cho các nghiên cứu hoặc kiểm tra hiệu quả thuốc kháng virus Phương pháp phổ biến nhất để định lượng virus là chuẩn độ tìm điểm kết thúc 50%, nơi 50% tế bào hoặc động vật thí nghiệm bị nhiễm bệnh chết, được gọi là liều nhiễm 50% mô nuôi cấy (TCID50) Ngoài ra, còn có các phương pháp khác như đếm trực tiếp các mảng tổn thương do virus gây ra trong tế bào.
Luận án tiến sĩ Y học nhiễm bệnh sử dụng các phương pháp phản ứng PCR và RT-PCR Việc lựa chọn phương pháp phù hợp phụ thuộc vào điều kiện cụ thể, đặc điểm của từng loại virus và loại tế bào.
Nghiệm pháp chuẩn độ virus TCID50 được Reed L.J và cộng sự mô tả lần đầu vào năm 1938, và sau đó được LaBarre D.D cùng cộng sự hoàn thiện vào năm 2001 với công thức tính chính xác cho TCID50 dựa trên các nồng độ pha loãng Tuy nhiên, kết quả của chuẩn độ virus TCID50 thường dựa vào quan sát hiệu ứng bệnh lý tế bào dưới kính hiển vi, dẫn đến các lỗi chủ quan như xác định sai hiệu ứng bệnh lý trong các nồng độ pha loãng khác nhau Ngoài ra, phương pháp TCID50 truyền thống không sử dụng hiệu ứng bệnh lý như một yếu tố định lượng virus, và một số tế bào nhiễm virus không thể hiện rõ hiệu ứng bệnh lý, làm hạn chế khả năng đánh giá kết quả Để cải thiện độ tin cậy của phương pháp này, nhiều tác giả đã đề xuất sử dụng các chất hiển thị màu nhằm tăng cường khả năng phát hiện hiệu ứng bệnh lý tế bào dưới kính hiển vi quang học và giảm thiểu các lỗi chủ quan.
Trong nghiên cứu này, chúng tôi áp dụng kỹ thuật chuẩn độ MeV và MuV thông qua nghiệm pháp TCID50, sử dụng xanh methylen làm chất hiện màu để đánh giá hiệu ứng bệnh lý tế bào của virus Mặc dù chưa có báo cáo nào về việc áp dụng xanh methylen cho chuẩn độ MeV và MuV, nhưng phương pháp này đã được công nhận trong việc nhuộm và phát hiện hiệu ứng bệnh lý tế bào của virus trong TCID50 Mục tiêu của chúng tôi là thiết lập một kỹ thuật nhanh chóng và chính xác hơn để xác định các chuẩn độ MeV và MuV, dựa trên thời gian nhiễm virus vào tế bào Vero trong các giếng trên đĩa 96 giếng.
Luận án tiến sỹ Y học của chúng tôi cho thấy rằng việc sử dụng xanh methylen trong thí nghiệm giúp phân biệt tế bào sống (không nhiễm virus) và tế bào nhiễm virus một cách rõ ràng hơn Tế bào sống sẽ bắt màu xanh, trong khi tế bào nhiễm virus sẽ nổi lên và không bắt màu xanh, giúp rửa trôi dễ dàng Tuy nhiên, cần lưu ý rằng quá trình nhuộm không nên kéo dài quá lâu để tránh tế bào sống bị chết do độc tính của dung dịch Để tăng độ chính xác của nghiệm pháp, chúng tôi lặp lại 10 giếng cho mỗi nồng độ virus và tăng số giếng chứng lên 24 Việc so sánh màu sắc giữa giếng nhiễm virus và giếng chứng giúp nâng cao độ chính xác và tính khách quan của kết quả Thực tế cho thấy, nghiệm pháp TCID50 có thể gặp sai số chủ quan do khó khăn trong việc quan sát tế bào bị tổn thương Việc rửa nhẹ nhàng bằng nước sạch giúp loại bỏ tế bào nhiễm virus khó quan sát, từ đó giảm thiểu lỗi quan sát Kết quả nghiên cứu cho thấy độ chính xác và khách quan trong việc chuẩn độ virus TCID50.
Luận án tiến sỹ Y học này sử dụng phương pháp chuẩn độ virus thông qua việc tính toán TCID50, nhằm cung cấp thông tin chính xác về số lượng virus cần thiết cho quá trình nghiên cứu.
Sophie S.J và cộng sự (2013) đã so sánh nghiệm pháp chuẩn độ virus TCID50 với nghiệm pháp mảng và phát hiện rằng TCID50 có hiệu suất cao gấp mười lần so với nghiệm pháp mảng trong mọi điều kiện thí nghiệm Nghiệm pháp TCID50 cho kết quả hiệu giá cao hơn và chỉ cần một tuần để hoàn thành, trong khi nghiệm pháp mảng bám mất đến hai tuần Thử nghiệm TCID50 được thực hiện trên đĩa 96 giếng, cho phép đánh giá chín nồng độ pha loãng của virus cùng lúc Nghiệm pháp TCID50 được cho là tiêu chuẩn hóa hơn với kết quả định lượng và khách quan, nhưng có thể bị ảnh hưởng bởi số lượng tế bào, độ pha loãng của virus và chất lượng nhuộm màu phát hiện hiệu ứng gây độc tế bào.
4.3 Virus vaccine sởi và quai bị ly giải tế bào ung thư đại tràng người HT-29 in vitro
4.3.1 Virus vaccine sởi và quai bị ly giải trực tiếp tế bào ung thư đại tràng người HT-29 bằng cách tạo hợp bào in vitro
MuV và MeV lây nhiễm đặc hiệu tế bào ung thư đại trực tràng (CRC) nhờ vào sự biểu hiện cao của các thụ cảm thể đặc hiệu trên bề mặt tế bào này MuV chủng Urabe sử dụng các sialoglycoprotein chứa acid sialic làm thụ cảm thể, trong khi MeV chủng Edmonton tương tác với thụ cảm thể CD46, một yếu tố điều hòa hoạt hóa bổ thể thường biểu hiện quá mức ở tế bào CRC Gần đây, Nectin-4 cũng được xác định là thụ cảm thể đặc hiệu của MeV, góp phần làm tăng khả năng lây nhiễm của virus vào tế bào ung thư.
Luận án tiến sĩ Y học nghiên cứu về các thụ cảm thể bám dính của liên họ globulin miễn dịch, đóng vai trò quan trọng trong việc kết nối các tế bào biểu mô Ngoài ra, chu trình nhân lên của virus có vỏ bọc như MuV và MeV yêu cầu sự tham gia của các protease để phân cắt glycoprotein, từ đó tạo điều kiện thuận lợi cho virus xâm nhập hiệu quả vào tế bào.
[85] Các protease thích hợp với virus được biểu hiện nhiều ở các tế bào CRC
Nghiên cứu của chúng tôi cho thấy virus vaccine MeV và MuV có khả năng gây độc tế bào HT-29, với hiệu ứng bệnh lý rõ ràng nhất vào ngày thứ 4 và 5 sau khi nhiễm virus Hiệu ứng độc tế bào bắt đầu khi protein bám dính H và HN tương tác với thụ cảm thể trên tế bào đích, dẫn đến sự thay đổi hình dạng trong protein hợp bào của virus Sự tương tác này thúc đẩy quá trình hợp nhất màng tế bào và màng virus, cho phép virus xâm nhập vào tế bào Khi protein H, HN và protein hợp màng được biểu hiện nhiều hơn, tế bào nhiễm virus sẽ hợp nhất với các tế bào u xung quanh, tạo thành tế bào khổng lồ gọi là hợp bào, thường chết sau vài ngày.
Kết quả từ tế bào HT-29 nhiễm virus MeV và MuV cho thấy quá trình hình thành hợp bào rõ rệt, điều này thể hiện khả năng ly giải tế bào ung thư của virus MeV.
Virus vaccine sởi và quai bị kháng u tế bào ung thư đại tràng người HT-29 trên chuột thiếu hụt miễn dịch
4.4.1 Đánh giá độc tính của virus vaccine sởi và quai bị trên chuột thiếu hụt miễn dịch mang khối u tế bào ung thư đại tràng người HT-29
Chúng tôi đã tiến hành theo dõi độc tính của MeV và MuV trên chuột nude mang khối u sau khi tiêm, với đánh giá dựa trên sự thay đổi trọng lượng cơ thể và các chỉ số sức khỏe (bảng 3.2) Kết quả cho thấy chuột trong các nhóm nghiên cứu hầu như không có sự thay đổi trọng lượng đáng kể, chỉ giảm nhẹ sau 2-3 tuần tiêm, trong khi nhóm chứng có biến đổi nhiều hơn (không có ý nghĩa thống kê với p>0,05) Các chỉ số sức khỏe của chuột đều nằm trong giới hạn bình thường Nghiên cứu sử dụng liều lên đến 10^7 PFU của MeV và MuV, gấp 10^3 lần so với liều thông thường (10^3 đến 10^4 PFU) dùng trong tiêm chủng, và kết quả cho thấy cả MeV và MuV không gây độc toàn thân ở chuột nude mang khối u tế bào HT-29.
Luận án tiến sỹ Y học
29 Ngoài ra, một vấn đề cần quan tâm là qua theo dõi sức khỏe chuột trong quá trình điều trị, chúng tôi đã loại trừ được các nguyên nhân bệnh lý khác gây chết chuột Điều này làm kết quả tính toán, đánh giá hiệu quả điều trị bằng MuV và MeV thông qua chỉ số tỉ lệ chuột sống, chết và số ngày sống của chuột ở các nhóm có độ tin cậy cao hơn
Các chương trình tiêm chủng quy mô lớn với virus sởi và quai bị sống giảm độc lực đã chứng minh sự thành công vượt trội và thiết lập hồ sơ an toàn toàn cầu trong nhiều năm Nghiên cứu lâm sàng và tiền lâm sàng trước đây sử dụng MeV chủng Edmonston và MuV chủng Urabe trong điều trị ung thư đã cho thấy tính an toàn cao Các thử nghiệm lâm sàng này, thông qua tiêm nội u hoặc tiêm tĩnh mạch, đã điều trị hiệu quả cho bệnh nhân mắc u lympho tế bào T dưới da và ung thư buồng trứng.
Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng liều cao virus MeV và MuV (từ 10^7 đến 10^9 PFU) không gây độc tính đáng kể, mặc dù liều tiêm chủng thông thường chỉ từ 10^3 đến 10^4 PFU Chủng Edmonston của MeV và chủng Urabe của MuV khó gây bệnh trở lại do tỷ lệ tiêm chủng cao Dữ liệu lâm sàng và tiền lâm sàng cho thấy tiềm năng, nhưng các thử nghiệm MuV trên người vẫn chưa được thực hiện rộng rãi do lo ngại về độ an toàn Chủng Urabe có thể gây biến chứng viêm não và viêm màng não khi tiêm vào não khỉ đuôi sóc Dù đã có nhiều kinh nghiệm với vaccine bệnh sởi và quai bị, cần thực hiện các nghiên cứu lớn hơn để đánh giá tác dụng phụ và độc tính của virus này khi sử dụng liều cao trong điều trị ung thư ở người.
Luận án tiến sỹ Y học
4.4.2 Virus vaccine sởi và quai bị kháng u tế bào ung thư đại tràng người HT-29 trên chuột thiếu hụt miễn dịch
Những tiến bộ trong công nghệ sinh học và hiểu biết về virus ly giải tế bào ung thư đã thúc đẩy nghiên cứu về các chủng virus kháng ung thư hiệu quả Nghiên cứu này nhằm đánh giá hiệu quả phối hợp giữa MeV và MuV trong việc ly giải tế bào ung thư đại tràng người dòng HT-29 in vivo Chúng tôi đã thực hiện ghép u tế bào HT-29 dưới da đùi chuột nude, tạo điều kiện thuận lợi cho liệu pháp điều trị tiêm virus oncolytic, từ đó tăng cường khả năng virus tiếp xúc và xâm nhập vào khối u.
Nghiên cứu của chúng tôi cho thấy MeV và MuV có khả năng làm chậm sự phát triển của khối u HT-29 trên chuột nude, với thời gian sống trung bình ở các nhóm điều trị bằng OV dài hơn và số chuột sống nhiều hơn có ý nghĩa thống kê (p