Nghiên cứu tác dụng kháng ung thư phổi của virus vaccine sởi trên thực nghiệm

Ungthưphổi

Tìnhhìnhungthưphổitrênthếgiới

Ung thư phổi( U T P ) l à n g u y ê n n h â n h à n g đ ầ u g â y t ử v o n g l i ê n q u a n đến ung thư ở Hoa Kỳ cho cả nam và nữ Trong năm 2018 có số lượng ngườiMỹ chết vì UTP vượt quá số lượng 3 loại ung thư phổ biến tiếp theo cộng lại(ung thư đại tràng, vú và tuyến tiền liệt) Tỷ lệ sống thêm chung trong 60tháng đối với bệnh UTP không tế bào nhỏ (Non- small cell lung carcinoma-NSCLC) vẫn thấp, từ 68% ở bệnh nhân bệnh giai đoạn IB xuống 0% đến 10%ởbệnhnhângiaiđoạnIVA-IVB 3 Ở Châu Âu, UTP là dạng ung thư được chẩn đoán phổ biến thứ hai sauung thư tuyến tiền liệt ở nam giới và là loại ung thư phổ biến thứ ba sau ungthư vú và ung thư đại trực tràng ở nữ giới Vào năm 2020, khoảng 320.000người ở các nước Châu Âu được chẩn đoán mới mắc UTP, và bệnh này đượcdựđoánsẽtiếptụclànguyênnhânhàngđầugâytửvongdoungthưvớihơn 257.000trườnghợptửvongtrêntoànChâu Âu 4 Cácyếutốnguycơchính của UTP là hút thuốc lá và yếu tố môi trường, đặc biệt là ô nhiễm không khí.Năm 2020, tỷ lệ mắc bệnh UTP ở nam giới nói chung ở Châu Âu là gần100/100.000 người, cao hơn gấp đôi tỷ lệ ở nữ giới (45/100.000n g ư ờ i ) Ở Đan Mạch và Thụy Điển, tỷ lệ mắc bệnh này gần như giống nhau ở nam vànữ, phản ánh khoảng cách giới về hút thuốc ngày càng thu hẹp trong nhữngthập kỷ gần đây Tỷ lệ tử vong do UTPvào năm 2020 là 54/100.000 dân ởChâu Âu nói chung Sự khác biệt về tỷ lệ tử vong do bệnh này giữa các quốcgia là hơn 3 lần đối với nam giới và hơn 4 lần đối với nữ giới Năm 2020,Hungary được dự đoán là quốc gia có tỷ lệ tử vong doU T P c a o n h ấ t đ ố i v ớ i cảnamvànữ.ỞcácnướcBắcÂunhưThụyĐiểnvàĐanMạchphảnánhsự khác biệt về tỷ lệ mắc bệnh, khoảngc á c h v ề t ỷ l ệ t ử v o n g t h e o g i ớ i t í n h l à nhỏ, ở một số nước Nam và Đông Âu (ví dụ: Hy Lạp và Estonia) lại lớn 5 Sovới ung thư vú và ung thư đại trực tràng,U T P v ẫ n l à u n g t h ư c ó k h ả n ă n g sống sau chẩn đoán tương đối thấp Theo thống kê 2010-2014, đối với nhữngbệnh nhân được chẩn đoán UTP trong các giai đoạn, xác suất tích lũy sốngthêm sau ít nhất 5 năm (sau khi điều chỉnh các nguyên nhân tử vong khác)trung bình là 15% ở các nước Châu Âu Xác suất này nằm trong khoảng từ10% trở xuống ở Croatia, Lithuania và Bulgaria đến 20% ở Áo, Thụy Điển,Iceland và Thụy Sĩ Điều này cho thấy sự khác biệt đáng kể trong việc chẩnđoán, tiếp cận kịp thời với thuốc và các phương pháp điều trị Nhiều loại dượcphẩm khác nhau đã đượccông nhận vàđược bảo hiểm chi trảchođiềut r ị UTP ở châu Âu rất khác nhau giữa các quốc gia 5 Trong khoảng thời gian từ2000-2004 đến 2010-2014, thời gian sống thêm 5 năm sau khi chẩn đoán UTPđãtăngtrungbìnhtừ11%lên15%ởcác nước ChâuÂu 5

Nhìn chung, tỷ lệ tử vong do UTP đã theo xu hướng giảm, tỷ lệ mắcbệnh với thời gian chẩn đoán muộn thì xác suất sống thêm vẫn tương đối thấpở tất cả các quốc gia Điều này một phần là do chưa có các chương trình tầmsoát UTP quy mô lớn nào ở các nước châu Âu, đặc biệt là đối với các nhómdân số có nguy cơ cao, vì vậy làm hạn chế khả năng phát hiện và điều trị UTPở giai đoạn đầu Hiệu quả điều trị UTP vẫn còn nhiều khó khăn do bệnhthường được phát hiện ở giai đoạn muộn, bệnh nhân lớn tuổi, sự không đồngnhất về đột biến gen, typ mô bệnh học Do đó, cách tiếp cận hứa hẹn nhất đểgiảm tỷ lệ tử vong do UTP là tăng cường phòng ngừa để giảm tỷ lệ mắc bệnhhơnn ữ a , đ ặ c b i ệ t l à t h ô n g q u a c á c c h í n h s á c h k i ể m soát t h u ố c l á v à c h í n h sách giảmô nhiễmkhôngkhí.

Tìnhhìnhung thưphổiởViệtNam

Năm 2019, GLOBOCAN cho thấy UTP là ung thư phổ biến và nguyênnhânt h ứ h a i g â y tửv o n g d o u n g t h ư ở n g ư ờ i V i ệ t N a m K ể t ừ n ă m

2 0 1 2 , người ta ước tính khoảng 26.262 trường hợp mắc và 25.272 trường hợp tửvong do ung thư vào năm 2020.Tỷ lệ tử vong doU T P đ ư ợ c c h u ẩ n h ó a t h e o độ tuổi tăng đều đặn từ năm 1990 đến năm 2019, với ước tính 26,11/100.000người vào năm 2019 Việt Nam ở vị trí thứ 37 về tỷ lệ tử vong do UTP trêntoàn thế giới 6 Tại Việt nam, UTP là bệnh ung thư được chẩn đoán phổ biếnnhất ở nam giới và là bệnh ung thư đứng hàng thứ tư ở phụ nữ Trên cơ sở dữliệu từ năm 2013 đến năm 2017 từ Hà Nội và Thành phố Hồ Chí Minh, tỷ lệmắc chuẩn theo tuổi là 32,03 /100.000 dân đối với nam và 10,48/100.000 đốivới nữ Tỷ lệ mắc bệnh theo độ tuổi trong năm 2013 đến năm 2017, ở mứcthấp đối với nhóm tuổi dưới 40 tuổi và tỷ lệ ung thư gia tăng theo tuổi, tỷ lệcao nhất ở nhóm 65 đến 79 tuổi ở cả nam và nữ Tuy nhiên, số ca UTP tuyệtđối được dự báo sẽ tiếp tục tăng ở cả hai thành phố, với dự báo 6.198 ca namvà 2.311 ca nữ vào năm 2025 do sự gia tăng dân số già hóa và tác động củathuốc lá và ô nhiễm môi trường Tỷ lệ sống thêm sau

5 năm của bệnh UTP ởViệtNamlà14,8% 7

Nguyênnhân vàcácyếu tốnguy cơungthưphổi

Hút thuốc lá là yếu tố nguy cơ quan trọng nhất đối với UTP Hút thuốclá chủ động hay thụ động ( bao gồm hút thuốc lá, xì gà và thuốc lào) đều làmtăng nguy cơ UTP Các nghiên cứu cũng cho thấy nguy cơ UTP do hút thuốclát ă n g t h e o s ố l ư ợ n g t h u ố c l á h ú t m ỗ i n g à y v à s ố n ă m h ú t t h u ố c N h ữ n g người hút thuốc có nguy cơ mắc UTP cao gấp 20-50 lần so với những ngườikhông hút thuốc.Nguy cơ UTP gia tăng cũng đã được chứng minh tùy theotừng khu vực và tiêu thụ các sản phẩm thuốc lá địa phương 8 Tỷ lệ UTP caohơn ở người Mỹ gốc Phi so với các nhóm dân tộc khác ở Hoa Kỳ có lẽ đượcgiải thích là dohọ tiêu thụ nhiều thuốc lá hơn Mặc dùc ó s ự k h á c b i ệ t v ề thành phần,hàm lượng các chất trong mỗi điếu thuốc lá của các sản phẩmthuốclátrênthịtrườngkhôngđượccôngbốrõràngđểcóthểsosánhvớicác sản phẩm thuốc lá truyền thống (cigar, thuốc lào) về mức độ nguy cơ gâyUTP Bên cạnh đó tính nhạy cảm di truyền cũng có thểđ ó n g v a i t r ò q u a n trọngtrong cơchếbệnhsinh củaUTPgiữacácchủngtộcngườikhácnhau 9

1.1.3.2 Ônhiễmkhôngkhí Ô nhiễm không khí trong nhà được coi là một yếu tố nguy cơ chính gâyUTP.Điềunàybaogồmđốtthantrongnhữngngôinhàthônggiókém,đ ốtcủi và các nhiên liệu rắn khác, cũng như khói từ quá trình nấu nướng ở nhiệtđộ cao sử dụng dầu thực vật chưa tinh chế như dầu hạt cải Các nghiên cứudịch tễ học cũng chứng mình được mối liên hệ chặt chẽ giữa việc tiếp xúc vớichất ô nhiễm không khí và bệnh UTP Trong một số nghiên cứu thuần tập, cácphép đo môi trường đối với các hạt mịn gợi ý về sự gia tăng nhẹ nguy cơ ởnhững người được xếp vào nhóm tiếp xúc nhiều nhất với ô nhiễm không khí.Cơquannghiêncứuungthưquốctếđãphânloạiônhiễmkhôngkhíngo àitrời nhưmộtchấtgâyUTPở người 10,11

Có bằng chứng từ các nghiên cứu bệnh chứng cho thấy chế độ ăn nhiềurauvà trái cây, đặc biệt là các loại rauhọ cải, cóthể tạor a m ộ t s ố t á c d ụ n g bảo vệ chống lại UTP Isothiocyanates trong bắp cải là một nhóm hoạt chất cóhoạt tính ngăn ngừa ung thưt r o n g đ ó c ó U T P Ă n n h i ề u t h ị t , đ ặ c b i ệ t l à t h ị t đỏ rán hoặc rán kỹ, có thể làm tăng nguy cơ UTP và điều này có thể liên quanđến việc hình thành chất nitrosamine gây ung thư trong quá trình nấu ăn Mộtphân tích tổng hợp của tám nghiên cứu thuần tập không cung cấp bằng chứngvề việc tăng nguy cơ UTP khi ăn nhiều chất béo tổng hoặc chất béo bão hòa 12 Nhiều nghiên cứu đã đề cập đến nguy cơ UTP theo lượng ước tính của β-carotene hoặc tổng số carotenoid (tương ứng với tổng của α- và β- carotene) 13 Trong một báo cáo từ nghiên cứu NIH-AARP, uống cà phê có liên quan đếnUTP (HR; 95% CI uống⩾6 cốc/ngày so với không uống: 4,56 (4,08–5,10)) 14 Cómộtsốbằngchứngvề tácdụngngănngừaUTPcủatràởnhữngngườihút thuốc, đặc biệt là trà xanh 15 Do mối tương quan chặt chẽ giữa việc uống rượuvà hút thuốc lá ở nhiều dân số, rất khó để làm sáng tỏ sự đóng góp của rượuvào quá trình bệnh sinh UTP trong khi kiểm soát đúng cách tác động gâynhiễu tiềm ẩn của thuốc lá, vì không có mối liên quan nhất quán nào đượcquansátthấyởnhững ngườiuống rượu mà khôngbaogiờhút thuốc.

Tiếp xúc nghề nghiệp đóng một vai trò quan trọng trong căn nguyênUTP, nguy cơ UTP tăng lên ở những người lao động làm việc trong một sốngành và nghề Hai nghiên cứu đã báo cáo ước tính tỷ lệ các trường hợp UTPdo tác nhân nghề nghiệp ở Anh là 14,5% nói chung 16 và 12,5% ở nam giới ởPháp 17 Các chất gây UTP do ảnh hưởng của nghề nghiệp quan trọng nhấtđược báo cáo là: amiăng, silica (một oxid của silic), radon, các kim loại nặngvà hydrocacbon thơm đa vòng Các hợp chất crom làm tăng nguy cơ UTP ởnhữngcôngnhânsảnxuất cromat, nhàsảnxuất sắctốcromat, đĩacrom vànhà sản xuất ferrochromium Không có nguy cơ nào như vậy được phát hiện ởnhững công nhân chỉ tiếp xúc với các hợp chất crom Các nghiên cứu về thợmỏ, lò luyện niken, công nhân điện phân và các nhà sản xuất hợp kim nikencao cho thấy nguy cơ UTP tăng lên Các bằng chứng hiện chưa có không mỗiliên hệ rõ ràng giữa các loại muối niken khác nhau mà công nhân tiếp xúc vớiUTP Hầuhếtcác nghiêncứuvề mốiliênquangiữa tiếp xúc vớikhít h ả i diesel và UTP cho thấy nguy cơ gia tăng ở mức khiêm tốn Tiếp xúc với dầudiesel tích lũy có liên quan đến tăng nguy cơ UTP với tỷ lệ chênh lệch là 1,31vàmốiquanhệgiữaphơinhiễmvà bệnhcó ýnghĩa (giátrịp1% CTLA-4 (protein

4 liên quan với tế bào lympho T gây độc tế bào) làmột phân tử khác biểu hiện trên tế bào lympho có chức năng điều chỉnh giảmhệ thống miễn dịch.Ipililumab, một chất ức chế CTLA-4, đã cho thấy kết quảđầy hứa hẹn ở thử nghiệm giai đoạn III của thuốc này kết hợp với các liệupháp chống ung thư toàn thân khác để điều trịNSCLC, như thử nghiệmcheckmate227,hiệnđangđượctiếnhành 48

Liệuphápvirusvaccinesởiđiều trịungthưphổingười

Sinhhọcvirussởi

VirussởilàmộtvirusRNAsợiđơn,âm,cóvỏbọcthuộcloàiMorbillivirusvàhọPa ramyxovirus.Bộgendài16kilobase,gồm15.894nucleotit,baogồm

6genmãhóa8proteincủavirus.Bộgencủavirusđượcbaobọcbởinucleoprotein (N), phosphoprotein (P) và protein lớn (L) tạo thành phức hợpribonucleoprotein(RNP),được bao quanh bởi matrix (M) protein.H a i t r o n g số các protein là protein không cấu trúc V và C, được biểu hiện từ một bảnphiên mã RNA thay thế của gen P Vai trò của chúng chủ yếu liên quan đếnviệc ngăn chặn các phản ứng miễn dịch do interferon (IFN) loại 1 gây ra. Cácglycoprotein vỏ MV, hemagglutinin (H) và protein dung hợp (F) làm trunggian chosựgắnkếtvàhòa hợpvirusvới màngtếbào(Hình1) 49

Nguồn:EngelandC.Evàcộngsự(2021) 49 (a) Virussởi;(b)bộgencủavirussởinucleoprotein(N),Proteinlớn(L),

Phosphoprotein (P), Matrix (M), protein Haemagglutinin (H), protein

Virusvaccinesởilâynhiễmđặchiệutếbàoung thưphổi

1.2.2.1 Tếbào UTPcó cácthụ thểđặchiệu vớivirus sởi

Ba thụ thể chính, CD150, CD46 và Nectin-4, được virus sởi sử dụng đểxâm nhập vào tế bào đích CD150 hay phân tử hoạt hóa tế bào lympho(SLAM) là thụ thể chính đối với các chủng virus sởi hoang dã Thụ thể nàyđược biểu hiện chủ yếu trên tế bào lympho B và T đã hoạt hóa, tế bào tuyếngiáp chưa trưởng thành, bạch cầu đơn nhân và tế bào đuôi gai (DC) Ngượclại, các chủng virus giảm độc lực thuộc dòng MV-Edm, lây nhiễm tế bào ungthư có chọn lọc sử dụng thụ thể CD46 thông qua sự thay thế axit amin duynhấtởvịtrí481trongproteinvirussởi-

H(asparaginthànhtyrosine).GlycoproteinxuyênmàngloạiI, CD46h o ạ t đ ộ n g n h ư m ộ t c h ấ t đ i ề u h ò a âm của quá trình ly giải qua trung gian bổ thể và được biểu hiện phổ biếntrongt ấ t c ả c á c t ế b à o c ó n h â n M ộ t t h ụ t h ể b i ể u m ô m ớ i đ ư ợ c x á c đ ị n h mớig ầ n đ â y , t ê n g ọ i l à N e c t i n - 4 , c ả c h ủ n g v i r u s h o a n g d ạ i v à c h ủ n g v i r u s đềusửsụngthụthểnàyđểtăngcườngchoviệcxâmnhậpvàot ế b à o đích 44 ,4 7Nectin-4 là một protein bám dính, một thành viên các thụ cảm thểbám dính của liên họ globulin miễn dịch nằm ở vị trí mà các tế bào biểu môdính với nhau, trong đó có cả tế bào UTP Ban đầu, chúng được mô tả làpoliovirus- giốngthụthể-4(PVRL-4), đóngm ộ t v a i t r ò q u a n t r ọ n g t r o n g quá trình sinh bệnh, giúp virus sởi bám dính vào biểu mô đường hô hấp gâynhiễmtrùng 49

Nhiều dữ liệu đã chứng minh rằng MeV như là một tác nhân điều trị cótiềm năng cho bệnh nhân UTP NSCLC Do các dòng tế bào NSCLC được thửnghiệm đều biểu hiện mạnh mẽ thụ thể đặc hiệu CD46 của MeV, có nhiềubằng chứng hóa mô miễn dịch cho thấy có tới 40% mẫu tế bào NSCLC ởngười biểu hiện mạnh mẽt h ụ t h ể C D 4 6 50 Thụ thể CD46 là rất cần thiết chosự xâm nhập của MeV, ngăn chặnb i ể u h i ệ n p h â n t ử C D 4 6 d ẫ n đ ế n v i ệ c ứ c chếgầnnhưhoàntoànsựlâynhiễmMeV-GFPtrongcáctếbàoUTP 51 Gần đây, người ta đã báo cáo rằng Nectin-4 biểu hiện cao, có chọn lọc trong nhiềuloại tế bào ung thư bao gồm cả UTP 52 ,53Do đó, Nectin-4 là mục tiêu tốt đốivới loại khối u này, do đó, MeV có thể là một công cụ và ứng cử viên tốt đểđiềutrịcác tếbàokhốiunàymột cáchcóchọnlọc.

* Mốiquanhệgiữa biểuhiệnthụthểđặchiệuvới lygiải tếbàoung thư

- Hầu hết các tế bào ung thư kể cả UTP thường biểu hiện quá mức thụthể CD46 để thoát khỏi sự gây độc tế bào Đây chính là cơ chếM e V l â y nhiễm chọn lọc tế bào ung thư biểu hiện quá mức thụ thể CD46 Người ta đãchứng minh hiệu quả kháng tế bàoU T P c ủ a M e V t ư ơ n g q u a n v ớ i m ứ c đ ộ biểu hiện thụ thể đặc hiệu với MeV (CD46 và Nectin-4) 51 Hơn nữa, cácnghiên cứu gần đây đã chứng minh rằng các chủng MV‐Edm có khả năng sửdụng phân tử SLAM như một thụ thể đặc hiệu Sự ly giải tế bào ung thưlympho trên mô hình động vật của MeV cho thấy MeV lây nhiễm qua thụ thểSLAMđộclậpvớimứcđộbiểuhiệnCD46 54

Ngoài ra, thụ thể Nectin-4 cũng được chứng minh là một thụ thể đặchiệu của MeV được biểu hiện ở mức độ thấp đến trung bình trong các tế bàobiểu mô đường hô hấp, nhưng một số nghiên cứu đã cho thấy sự biểu hiệnphong phú của nó trong ung thư biểu môt u y ế n p h ổ i , đ ạ i t r à n g , b u ồ n g t r ứ n g và vú, làm cho Nectin-4 trở thành một thụ thể khối u đặc hiệu tiềm năng vớiMeV 55 Hoạt động kháng u của MeV trong các tế bào ung thư biểu mô tuyếnngười tăng lên theo mức độ biểu hiện của Nectin-4, điều này cho thấy rằng sựbiểu hiện của Nectin-4 có tương quan vớimức độs ự l y g i ả i t ế b à o u n g t h ư củaMeV 56

Ngoài ái lực của MeV với các thụ thể tế bào đặc hiệu, có các cơ chếtiềm năng khác cũng góp phần vào khả năng ly giải chọn lọc tế bào u củaMeV.C á c k h i ế m k h u y ế t t r o n g c o n đ ư ờ n g đ á p ứ n g i n t e r f e r o n ( I

F N ) k h á n g virus thường gặp ở các tế bào khối u, khiến các tế bào ung thư dễ lây nhiễmvirush ơ n s o v ớ i c á c t ếb à o b ì n h t h ư ờ n g 4 9 Ở các t ế b à o b ì n h thườn g,n h ậ n diện RNA của virus bằng các thụ thể PRR, RIG-I và MDA-5 sẽ kích hoạt mộtloạt các con đường miễn dịch bẩm sinh, kích hoạt sản xuất interferon loại 1(IFNα/β) IFN sau đó gắn với thụ thểđặc hiệu trên tế bào, kích hoạtc o n đường tín hiệu JAK/STAT, dẫn đến hoạt hóaISGliên quan đến việc bảo vệchống virus và tín hiệuchết tế bào theo chương trình( a p o p t o s i s ) T r o n g t ế bào ung thư, con đường này thường bị ức chế hoạt động, dẫn đến tế bào ungthư thoát khỏi hệ thống miễn dịch của cơ thể Một nghiên cứu chứng minh vaitrò của interferon loại 1 với khả năng MeV lây nhiễm vào tế bào ung thư bằngcách điều trịcác dòng tế bào ung thưv ớ i I F N - β t r ư ớ c k h i n h i ễ m M e V , k ế t quả cho thấy IFN-β làm giảm khả năng MeV nhiễm và ly giải tế bào ung thư;điều này chứng minh MeV có khả năng lây nhiễm các loại tế bào ung thư ởmứcđộ khácnhauphụthuộcvào phảnứngmiễn dịchbẩmsinhcủacơthể 57

Cáccơchếvirusvaccinesởilygiảitếbàoungthưphổi

MeV có các protein F và protein H gắn vào thụ thể tham gia quá trìnhhợp màng Khi gắn vào thụ thể, protein H thay đổi cấu hình, sự thay đổi nàykích hoạt protein hợp màng gây ra quá trình thay đổi trong protein F Sự thayđổi này làm cho màng virus và tế bào sát lại rồi hợp nhất với nhau Cơ chếchính xác mà protein H kích hoạt protein F là chưa rõ ràng Các protein F củaMeV còn tham gia quá trình hợp nhất màng tế bào nhiễm virus với màng tếbào bình thường xung quanh, giốngn h ư s ự h ợ p n h ấ t g i ữ a m à n g v i r u s v à t ế bào (quá trình nhiễm trùng MeV) Sự hợp nhất giữa tế bào nhiễm virus và tếbào bình thường lân cận tạo thành hợp bào (một khối tế bào khổng lồ có nhiềunhân) Một tế bào bị nhiễm virus có thể hợp nhất 50-100 tế bào lân cận vớinhau tạo thành một hợp bào 58 Đây là một cơ chế lây lan virus mà không cầngiảiphóngcáchạtvirustrưởngthànhrakhỏitếbàoungthư.Quátrìnhhợ p nhất tế bào làm cho virus giảm tiếp xúc với kháng thể trung hòa của cơ thể vậtchủ, chúng lẩn tránh được sự kiểm soát của hệ miễn dịch dễ dàng lây lan vàphát triển Thông thường, các hợp bào tồn tại không quá 4-5 ngày Hợp bàochếtlàdohợpnhấthạtnhân,ngưngtụnhiễmsắcthểsớm,thoáihóaautophagy, kèm theo giải phóng các túi syncytiosome giống như exosomenhưngbiểuhiệnkhángnguyêntếbàoucao.Hợpbàochếttạorasyncytiosomen hiều hơn so với các tế bào chết do các nguyên nhân khác Syncytiosome làyếu tố làm cho các tế bào DC trưởng thành và trình diện kháng nguyên hiệuquảhơn sovớicác exosometừtế bào chếtdo các nguyên nhânkhác 59

MeV sử dụng protein hợp màng để hình thành hợp bào góp phần tănghiệu quả ly giải tế bào u Vì vậy, MeV có khả năng giết chết trực tiếp các tếbào ung thư thông qua hình thành các hợp bào, đây là một thuộc tính ly giải tếbào u quan trọng, khả năng MeV tạo hợp tương quan với tiềm năng ly giải tếbào ungthưcủa chúng.

- Mặc dù, sự thiếu hụt cảm ứng IFN có thể thúc đẩy sự nhân lên củaMeVtrongcáctếbàoáctính,NhiễmMeVkíchhoạthệmiễndịchbẩmsinhl y giải tế bào ung thư qua trung gian MeV đã được xác nhận trong nhiềunghiêncứu.ViệccảmnhậnMeV bằngcácthụthểnhậndạngmôhình, đặcbiệt là RIG-I, MDA-5 và TLR7, thúc đẩy trạng thái tiền viêm và kháng virus.Tuynhiên,nhiễmMeVgâyraphảnứngIFNloạiIđãđượcghinhậntro ngliệu pháp virus gây ly giải tế bào ung thư đối với các chủng MeV giảm độclực Rajaraman cà cộng sự gần đây đã báo cáo các tế bào u nguyên bào thầnkinh đệm người bị nhiễm MeV-Edm làm tăng phiên mã củaDDX58cảm biếnRNA bẩm sinh, cũng nhưIFN-β,STAT1và các gen được kích thích bởiinterferon có chức năng chống virus, bao gồmISG15,MX1, MX2,

MeVsẽkíchhoạthệ miễn dịch gây ly giải tế bào ung thư qua trung gian MeV Ngoài các khángnguyên liên quan đến khối u (TAA), chết tế bào khối u bị nhiễm MeV hoặcphá vỡ hợp bào còn giải phóng các mô hình phân tử nguy hiểm có nguồn gốctừ tác nhân gây bệnh (Pathogen- associated molecular pattern-PAMP) và môhình phân tử nguy hiểm có nguồn gốc từ tổ chức bị tổn thương (Danger- associated molecular pattern-DAMP), chúng kích hoạt phản ứng miễn dịch.Nghiên cứu của A Chen và cộng sự (2017) cho thấy các tế bào ung thư biểumô tế bào gan người chết sau khi nhiễm MeV-Edm đã thúc đẩy sự chuyển vịquamàngcủacalreticulincũngnhưgiảiphóngnănglượngtừphântửAdenosinetri phosphate(ATP)vàHMGB1 61

HMGB1l à m ộ t t í n h i ệ u n g u y h i ể m t á c đ ộ n g m ạ n h l ê n c á c t ế b à o đuôig a i ( D C ) t h ô n g q u a T L R 4 , đ â y l à y ế u t ố đ ư ợ c g i ả i p h ó n g b ở i c á c t ế bào u ác tính người bị nhiễm MeV-Edm Các tế bào ung thư trung biểu mômàng phổi ngườibị nhiễm chủng MeV-Schwarzt ạ o r a b i ể u h i ệ n H S P 7 0 mứcđ ộ c a o , m ộ t p h â n t ử c ó v a i t r ò t ă n g c ư ờ n g k h ả n ă n g t ế b à o D C t r ì n h diện chéo kháng nguyên Ngoài ra, việc nhận diện các phân tử PAMP saunhiễm MeV, chẳnghạnnhưdsRNA, kíchhoạtthay đổicácm ứ c I F N - α , IFN-β và IFN-λ, dẫnđếnsảnx u ấ t c á c c y t o k i n e g â y v i ê m , g ồ m I L - 6 v à I L -

8, cũng như chemokine RANTES Đáng chú ý, các phân tử này cũng có thểtạor a t r ạ n g t h á i c ơ t h ể k h á n g v i r u s , c ả n t r ở s ự l y g i ả i t ế b à o u n g t h ư t r ự c tiếphayquatrunggianMeV 62

*Vaitròtếbàotrình diện khángnguyên vàkhởiđộng tếbàoT

Ngoài vai trò chống virus, IFN-α còn thúc đẩy sự biểu hiện củaTRAIL,được mã hóa bởi một gen kích thích interferon trên các tế bào DC Trong mộtnghiên cứuin vitro,Achard et al đã chứng minh điều chỉnh TRAIL trên DCcần phải có sự hiện diện của virus (trong nghiên cứu này tác giả dùng chủngMeV-Schwarz) hoặc các tế bào khối u bị nhiễm virus, quá trình điều hòaTRAILkhôngxảyrakhinuôicấytế bàoDCvớicáctếbàokhốiuđượcchiếu xạ UV (tạo ra tế bào u chết apoptosis) 63 Nhiều tác giả khác cũng đã chứngminh điều hòa TRAIL qua trung gian MeV kích hoạt tế bào DC, dẫn đến giếtchết các tế bào lympho của người biểu hiện các thụ thể TRAIL bởi các tế bàobạch cầu lympho T Bên cạnh hoạt tính gây độc tế bào phụ thuộc vào

TRAIL,cáct ế b à o D C d ò n g m á u v à d ò n g t ủ y c ó t h ể t h ự c b à o t o à n b ộ c á c t ế b à o nhiễm MeV chết theo chương trình 62 Chuỗi RNA của MeV được nhận diệnbởiTLR7 trong các phasome của tế bào DC dòng máu cũng như các chấttrung gian sao chép MeV bao gồm dsRNA được phát hiện bởi các thụ thể tếbàoRIG-I và MDA-5 ở cả DC dòng máu và CD1c + DCs dòng tủy 62 MeVkích hoạt TLR7, RIG-I và MDA-5 gây ra một dòng tín hiệu lên đến đỉnh điểmtrong quá trình tế bào DC trưởng thành, được đặc trưng bởi điều hòa các dấuhiệu kích thích CD40, CD80,CD83, CD86 và HLA-DR, cũng như tiết ra cáctiền viêm và Th1 và các cytokine phân cực, chẳng hạn như IL-1β, IL-6, TNF-α, IFN-α và IL-12p70 ở mức độ thấp hơn 62 Tế bào DC trưởng thành thúc đẩytrình diện hiệu quả các kháng nguyên từ các tế bào bị nhiễm MeV bị thực bào,bao gồm cả kháng nguyên khối u,được trình diện chéo trên các phân tử MHClớp I đến các tế bào T CD8+ đặc hiệu với khối u 62 Việc kích hoạt chéo các tếbào T CD8+ thúc đẩy sự tăng sinh và hoạt hóa của chúng, dẫn đến giải phóngIFN-γ Đáng chú ý, trong môi trườngin vitrovới tế bào u ác tính ở người NY-ESO-1 + M18, Guillerme và cộng sự đã báo cáo cần phải có sự lây nhiễmvirus để kích hoạt tế bào T đặc hiệu NY-ESO-1, vì các tế bào DC dòng máutiếp xúc với các tế bào khối u được chiếu tia UV không thể tạo ra các tế bào Tđặc hiệu cho khối u 64 Như vậy, nhiễm MeV thúc đẩy chức năng tế bào trìnhdiện kháng nguyên và khởi động tế bào T kháng khối u hiệu quả Do đó, liệupháp virus ly giải tế bào ung thư có thể cung cấp kháng nguyên khối u, cácphân tử kích thích và các cytokine gây viêm, tức là các tín hiệu 1, 2 và 3 cầnthiết đểkíchhoạttế bàoT 62

Các nghiên cứuin vivovề nhiễm MeV hoạt hóa hệ miễn dịch kháng uđầu tiên đã được tiến hành trên mô hình chuột thiếu hụt miễn dịch mang khốiung thư người Mặc dù các mô hình này đã ghi nhận tác dụng ly giải trực tiếptế bào u của MeV và kích hoạt các phản ứng miễn dịch bẩm sinh kháng u.Đánh giá vai trò MeV hoạt hóa miễn dịch thích ứng kháng u chỉ có thể đượcgiải quyết sau khi phát triển các mô hình chuột có hệ miễn dịch bình thường.Grossardt và cộng sự (2013) lần đầu tiên báo cáo sự xâm nhập của tế bào Tđặc hiệu ở rìa ngoài khối u sau 7 ngày điều trị bằng virus sởi trên mô hìnhchuột bị ung thư đại trực tràng MC38cea 65 Một nghiên cứu trên chuột có hệmiễn dịch bình thường mang ung thư biểu mô phổi dưới da cũng cho thấy cóthâm nhiễm tế bào lympho CD4+ và CD8+ nội u sau khi điều trị MeV 66 Hơnnữa,m ộ t s ố n g h i ê n c ứ u c h o t h ấ y t ă n g t ế b à o

T C D 8 + I F N - γ + n ộ i u v à c á c yếu tố tăng tỷ lệ tế bào T (CD8 +/FoxP3 +) trên mô hình chuột mang u ác tínhB16 sau khi điều trị bằng MeV Các nghiên cứu khác cũng cho thấy MeV giatăngthâmnhậptếbàoTvàokhốiu. Điều trị OV đã là tăng thâm nhập tế bào T vào khối u thông qua cơ chếcơ bản bao gồm OV làm tăng của các yếu tố hoạt hóa tế bào lympho thâmnhập vào khối u, cụ thể là CCL3, CCL4, CCL5 và CXCL10 Các chemokinenày tăng lên trong các mô hình động vật cấy ghép ung thư biểu mô tế bào ganngười được điều trị bằng MeV-Edm so với các khối u không được điều trị 61 Một số nghiên cứu cho thấy các tế bào u nguyên bào thần kinh đệm người tiếtra CCL5 và CXCL10 cao hơn sau khi nhiễm trùng MeV- Edmin vitro 60 Dođó, có thể khẳng định điều trị bằng MeV gây ra tăng biểu hiện của một số yếutốkíchthích tăng tỉlệtếbào lympho Tvàdi chuyển chúng đếnvịtríkhối u.

Khi đến khối u, các tế bào T CD8+ đặc hiệu với khối u trình diện khángnguyên khối u trên phân tử MHC lớp I, làm trung gian gây độc tế bào khối u.Đángchúý,nhiễmMeVvàotếbàounguyênbàothầnkinhđệmngườitrong ống nghiệm làm tăng mức mRNA của TAP, HLA-A và HLA-B, cũng nhưnhiều phối tử HLA, do đó tăng cường khả năng tế bào khối u trình diện khángnguyên khối u và tế bào u trở thành mục tiêu của tế bào T đặc hiệu khối u.Hiệu lực kháng u có thể được tăng cường hơn nữa bằng cách chuyển khángnguyên khối u vào nội bào khối u trong quá trình ly giải tế bào u qua trunggian MeV Delaunay và cộng sự (2017) đã nhiễm MeV ở các mô hìnhin vitrodòng tế bào u ác tính kháng nguyên NY-ESO-

1 + và NY-ESO-1 − tự thân vàcùngl o à i c ó n g u ồ n g ố c t ừ b ện h n h â n đ ểchứng m i n h h i ệ n t ư ợ n g n à y 6

7H ọ phát hiện ra rằng NY-ESO-1 được giải phóng ra từ các tế bào u bị ly giải donhiễmMeVđãđượccáctếbàokhốiukhácthunhậntrênHLAlớpII,xửlývà trình diện cho các tế bào T CD4+ Điều này chỉ ra rằng kháng nguyên khốiu được biểu hiện không đồng nhất, có thể lan truyền khắp khối u khi tế bào ubịlygiảiq ua t r u n g gi an Me V , l à m chonhiều t ế b à o kh ối u d ễb ị t ếb à o T nhận diện hơn Tuy nhiên, hiện tượng này vẫn chưa được xác nhận trên cơ thểngười Hai nghiên cứu sử dụng mô hình MC38cea đã báo cáo 40% sự thuyêngiảm khối u hoàn toàn và khả năng sống sót lâu dài sau liệu pháp OV sử dụngchủng MeV Schwarz biểu hiện IgG1-Fc Đáng chú ý, 75% - 100% chuột khỏihoàn toàn không thấy tái phát khối u ở một vị trí xa sau điều trị 4 và 6 thángđiềutrị 68,69

Sự tác động lẫn nhau giữa virus gây ly giải tế bào ung thư và hệ thốngmiễn dịch không chỉ giới hạn ở các tế bào DC và tế bào T, mà bao gồm cácquần thể tế bào miễn dịch khác nhau (Hình 1.2) Trong số này, bạch cầu trungtính đã được nghiên cứu trong liệu pháp MeV Chúng nhạy cảm với nhiễmtrùng MeV, điều này thúc đẩy quá trình hoạt hóa tế bào bạch cầu trung tính 62 Khi nhiễm MeV, bạch cầu trung tính được kích hoạt, chúng tiết ra IL-8, chiêumộ thêm nhiều bạch cầutrung tính vào vị trí khối u Bạchc ầ u t r u n g t í n h c ó tác dụng kháng u trực tiếp bằng cách giải phóng các phân tử gây độc tế bàonhư TNF-α hoặc TRAIL Chúng còn kháng khối u gián tiếp bằng cách tiết raMCP-1,chấtnàythuhútbạchcầuđơnnhânvàtếbàolymphoT.Tuynhiên, bạch cầu trung tính tiết ra IFN-α lại góp phần vào các đáp ứng miễn dịchchống virus Hầu hết những thay đổi này chỉ thấy ở bạch cầu trung tính bịnhiễm các chủng MeV và không xảy ra đối với chủng virus sởi hoang dã. Tuynhiên, vai trò của bạch cầu trung tính trong các khối u ác tính tế bào B dườngnhư thay đổi, tùy thuộc vào mức độ của ly giải tế bào ung thư trực tiếp, bạchcầu trung tính có vai trò hơn nữa trong các khối u ác tính có khả năng khángvớilygiảitếbàouquatrunggianMeVsovớinhữngtếbàounhạycảmvớily giải tế bào u qua trung gian MeV Do đó, điều quan trọng là phải khảo sátvai trò của bạch cầu trung tính trong liệu pháp ly giải tế bào u qua trung gianMeVtrêncácmôhình cấyghép u có hệ miễndịchbình thường.

CácđạithựcbàoliênquanđếnkhốiuthườngcókiểuhìnhM2vàdođó,t hú cđ ẩ y hìnht h à n h k h ố i u 62 T u y nhiên, v i ệ c t i ế p x ú c v ớ i v i r u s c ó t h ể kíc h hoạt sự tái phân cực của chúng Về vấn đề này, Tan và cộng sự (2016) đãchứng minh quá trình chuyển đại thực bào người M0 và M2 sang M1 khi tiếpxúc với các tế bào khối u nhiễm MeV Sự tái phân cực này được chứng minhbằng một số dấu ấn của kiểu hình M1, bao gồm tăng các phân tử đồng kíchthích như CD80, giải phóng cytokine tiền viêm (IL-1β, TNF-α, IL-6) và tiết racác chất hóa ứng động tế bào T là CXCL9 và CXCL10 70 Theo một số nhàkhoa học, tác dụng kháng khối u của đại thực bào trong liệu pháp MeV ly giảitế bào u mới chỉ được biếtin vitro Cần có các nghiên cứu tiền lâm sàng vàlâmsàngsâuhơnđểlàmsángtỏvấnđề này.

Rất ít nghiên cứuin vitrođánh giá vai trò của tế bào giết tự nhiên (NK)trong liệu pháp MeV ly giải tế bào ung thư Nhiều tác giả đã quan sát thấy,mặc dù điều trị MeV không dẫn đến tăng các phối tử tế bào NK như MICA/B,ULBP1, ULBP 2, ULBP 3, CD112, hoặc CD155, nhưng tăng khả năng giếtchết tế bào khối u trong đồng nuôi cấy tế bào bị nhiễm MeV và tế bào NKcùng với giải phóng granzyme, perforin và granulysin 71 Trong đồng nuôi cấytế bào u hắc tố nhiễm MeV với tế bào NK, người ta cũng thấy tăng các dấu ấnhoạt hóa CD69 và dấu ấn phân hủy CD107, trong khi mức độ biểu hiện củaCD16,CCR7,DNAM1vàNKG2Dkhôngthayđổi.Mộtnghiêncứugầnđây cho thấy kích hoạt tế bào DC là rất quan trọng đối với chức năng của tế bàoNK trong điều trị MeV Điều này làm nổi bật các tương tác phức tạp xảy ratrongvi môi trườngkhốiu,khi điều trị liệuphápvirus lygiảitếbàoungthư.

Dữ liệu về vai trò đóng góp của các tế bào miễn dịch khác, đặc biệt làvai trò của tế bào B trong liệu pháp MeV ly giải tế bào ung thư vẫn còn khanhiếm và chưa được nghiên cứu đầy đủ Một nghiên cứu gần đây đã phân tíchhiệu quả của tế bào T CD8+ NKG2D + giết tế bào ung thư biểu mô tế bào ganngười dưới hỗ trợ của cytokine (tế bào CIK) được điều trị bằng MeV-Edm 61 Trongi n v i t r o , tế bào CIK tăng phối tử Fas và các tế bào u bị nhiễm MeVtăng phối tử NKG2D MICA/B, sau đó các tế bào CIK tăng cường bài tiếtIFN-γ và do đó, tăng hoạt động kháng khối u của chúng Trong một mô hìnhchuột thiếu hụt miễn dịch, các tác giả đã chứng minh sự tăng cường hoạt hóatế bào CIK ở lách và khối u của những con chuột được điều trị bằng MeV sovới những con không được điều trị Ngoài ra, điều trị MeV tương quan vớităng cường thâm nhập tế bào CIK, tăng một số chemokine liên quan đến sự dichuyển củatếbào lympho nhưCCL3,CCL4,CCL5 vàCXCL10 nộiu.

Đápứng miễndịchvậtchủkhángMeV

Ngoài việc tăng cường đáp ứng miễn dịch kháng tế bào khối u, một sốchất điều hòa miễn dịch cũng tăng cường đáp ứng miễn dịch kháng virus.Nghiên cứu sau khi điều trị MeVmang genGM-CSFthì đáp ứng IFN-γ đặchiệu với MeV đã tăng lên so với điều trị MeV đối chứng ở mô hình chuộtmang khối u MC38cea, mặc dù không đáng kể 65 Trong dân số nói chung,miễn dịch kháng MeV phổ biến là đã có từ trước, do đã từng bị nhiễm trùngvirussởivàtiêmchủng.Cáckhángthểkhángvirussởiđãđượcchứngmi nhlà ngăn cản quá trình ly giải tế bào u qua trung gian MeV, kể cả tiêm MeV tạichỗ hay toàn thân Ngược lại, hiệu quả của MeVmang genB i T Eđược tiêmnội u dường như cao hơn một chút ở chuột đã được chủng ngừa trước MeVtrong mô hình chuột có miễn dịch bình thường mang khối u tế bào B16 Hơnnữa, như đã thảo luận ở trên, các tín hiệu chống virus bẩm sinh có thể là điềukiệntiênquyếtđểkhởiphátcácđápứngmiễndịchthíchứngkhánglạiliệ u pháp OV Các phản ứng kháng virus tự nhiên và thích ứng có thể hạn chế hoạtđộng gây phân giải trực tiếp tế vào ung thư của virus Các phản ứng miễn dịchnày lại cung cấp bổ sung về độ an toàn của phương pháp điều trị bằng OV, docách hạn chế sự nhân lên và ngăn chặn sự lây lan không kiểm soát được củavirus Hơn nữa, trong một số trường hợp, các đáp ứng kháng virus thích ứngthậm chí có thể có lợi cho liệu pháp OV Trong một nghiên cứu gần đây,Rajaraman và cộng sự (2018) đã xác định được một peptide virus mới, đượcxử lý từ proteinMeV L, trình diện trên các phân tử HLA-A*24 bởi các tế bàou nguyên bào thần kinh đệm nhiễm MeV Chúng có khả năng kích hoạt các tếbào T phù hợp với HLA, giải phóng IFN-γ 60 Một số nghiên cứu khác cũngcho thấy tế bào T kháng virus có thể được hoán đổi để trở thành tác nhânkháng tế bào khối u 60 Các kháng thể chống vi-rút cũng có thể làm tăng hiệuquả của thuốc phân giải Hiện tượng này đã được nghiên cứu chi tiết đối vớireovirus.Tương tự, người ta cũng đã báo cáo sự tăng cường thực bào MeVqua trung gian kháng thể của đại thực bào, mặc dù không phải trong môitrường tế bào ung thư Tóm lại, có một sự cân bằng phức tạp giữa khả năngmiễn dịch kháng virus và kháng khối u tuy nhiên, cần có nhiều thử nghiệmsâu rộnghơnđánhgiá vấnđềnày.

Cácthửnghiệmlâmsàng sửdụngMeV điều trịungthư

Sau đây là tóm tắt các thử nghiệm lâm sàng sử dụng liệu phápMeVđiều trị ung thư Các thử nghiệm lâm sàng sử dụng liệu pháp MeV đã hoànthành cho đến nay mới là giai đoạn đầu với các tiêu chí chính về tính an toànvà tính khả thi của điều trị bằng MeV ly giải tế bào ung thư Do đó,bằngchứng liên quan đến các tiêu chí miễn dịch học từ các thử nghiệm lâm sàngcòn hạn chế Tuy nhiên, trong các thử nghiệm lâm sàng ban đầu này cũng đãchothấytiềmnăngđầyhứahẹnliệuphápMeVđiềutrịungthư(Bảng1.1).

1/5 bệnh nhân thoái triểnhoàn toàn u bị tiêm, 3/5bệnh nhân thoái triển mộtphần ở u tiêm và 2/3 bệnhnhân này có thoái triển mộtphần các uở xa.

14/21 bệnh nhân có đápứng:thờigiansốngtrungbìn hlà1 năm;1bệnhnhâncóthờigiansốn g3,2năm.

NIS Truyền tĩnhmạc h Đa u tủy Giai đoạn

Sau truyền virus, quan sátthấy MV-NIS nhân lên cóchọnlọcởkhối u,thoái triển hoàn toàn u ác tính đã di cănở 1/2số bệnh nhân.

Giai đoạn 1(n) Thời gian sống trung bìnhcủabệnhnhânlà26,5thán g

10 6 -10 9 TCID 50 Đa u tủy Giai đoạn1

Không có giới hạn liều độctính Báo cáo ở 2 bệnhnhân:Giảmprotein M và phân giảitương bào tủyxương ở cả haibệnhnhân.Độphângiảihoà ntoàn×9thángởtấtcảcácvị tríbệnhcủa1bệnhnhân.

Tiêm mạch tĩnh 109TCID 50 Đa u tủy Giai đoạn

U thần kinhngoại biên Giai đoạn

U biểu môbuồng trứng haymàngb ụng

NIS Tiêm màng bụng 109TCID 50 , U biểu môbuồng trứng

Ung thư tếbào vảy đầuvàcổ hay ungthu vú

Đốitượngnghiêncứu

Động vật

Chuột thiếu hụt miễn dịch chủng BALB/c (nude mice, Foxn1 nu , chuộtnude) Chuột nude đột biến trên gen Foxn1, không có tuyến ức, không có tếbàol y m p h o T , c h u ộ t n u d e 6 - 8 t u ầ n t u ổ i , t r ọ n g l ư ợ n g t ừ 1 8 -

2 2 g , đ ủ t i ê u chuẩnthínghiệm, đượcnhập khẩu từCông tyCharlie-River(HoaKỳ).

Số lượng 20 chuột nude được nuôi trong phòng sạch Nuôi dưỡng vàchăm sóc theo quy trình hướng dẫn nuôi chuột nude tại Viện nghiên cứuY-DượchọcQuânsự,HọcviệnQuâny.

Vậtliệunghiêncứu

Virus vaccine sởi chủng Edmonton có nguồn gốc từ vaccine Priorix(GlaxosmithKline, Anh) 75 Chủng virus vaccine này được hoạt hóa, tăng sinh,bảo quản và duy trì ở phòng thí nghiệm nghiên cứu ung thư của Bộ môn Sinhlý bệnh,Học việnQuâny.

185 TM -ATCC)vàVero(CCL-81 TM -ATCC,tếbàothậnkhỉxanhChâuPhi)và có nguồn gốc từ trung tâm nuôi cấy các dòng tế bào Mỹ (American TypeCulture Collection, Mỹ).Chúng tôi nuôi cấy, tăng sinh các dòng tế bào nàytrong môi trường nuôi cấy đúng theo quy trình, sau đó, bảo quản và duy trì ởmôi trường âm sâu (-80 0 C) tại phòng thí nghiệm nghiên cứu ưng thư của Bộmôn Sinhlýbệnh,Học việnQuâny.

Trangthiếtbịsửdụng trongnghiên cứu

Các thiết bị sử dụng trong nghiên cứu bao gồm thước kẹp đo u, máycamera,m á y đ o q u a n g O D , k í n h h i ể n v i q u a n g h ọ c đ ả o n g ư ợ c t r u y ề n q u a , kínhh i ể n vi đ i ệ n tử truyềnq u a , h ệ t h ố n g p h â n t í c h t ế b ào t h e o dò n gc h ả y , máy ly tâm lạnh, tủ ấm CO2(37 0 C và 5% CO2) (hình 2.1) Các máy đo phụcvụ chonghiêncứuđều được chuẩnhóa.

(1) kính hiển vi điện tử truyền qua; (2) Hệ thống phân tích tế bào theo dòngchảy;(3)máylytâm;(4)kính hiển vi;(5)tủ nuôicấytếbào (37 0 C,5%CO2);

Vật tư tiêu hao gồm đĩan u ô i c ấ y t ế b à o đ a g i ế n g c á c k í c h c ỡ k h á c nhau: 6, 12, 24, 96 giếng; pipet các kích cỡ; ống falcon15ml và 50 ml; ốngeffendort1,5mlvà 2ml; các dụngcụtiêuhaokhác

Môi trường nuôi cấy tế bào DMEM có thêm 10% FBS (Foetal BovineSerum) và 1% kháng sinh (gồm penicillin và streptomycin) đã được lọc quamàng lọcvôtrùng.

Dung dịch đệm PBS, cồn 90 độ, Trypsin-EDTA 1X, dung dịch cố địnhtếbào,dungdịchdimethylsulphoxide(DMSO)….

Bộ kit MTT đánh giá tỉ lệ tế bào sống; kit FITC Annexin VApoptosisDetection kit (BD) đáng giá tỉ lệ tế bào chết apoptosis; các kháng thể gắn chấtphát huỳnh quang phát hiện các tế bào miễn dịch ở mô u chuột: kháng thểMouse CD11b-FITC, kháng thể Mouse CD49b/Pan-NK Cells FITC DX5,kháng thể MouseCD11c APC HL3, Kháng thể Ms CD197 (CCR7) PerCP-Cy5.54B12.

Phươngphápnghiêncứu

Nuôicấyvàtăngsinh cácdòng tếbào

- Tế bào dòng tế bào UTP người H460, A549 và Vero lấy từ tế bàodòngđượcbảoquảnởmôi trườngâmsâu(-80 0 C).

- Dung dịch PBS 1X vô trùng, dung dịch môi trường nuôi cấy tế bàoDMEMb ổ s u n g 1 0 % F B S , 1 % k h á n g s i n h ( p e n i c i l l i n + s t r e p t o m y c i n ) v à được lọc qua màng lọc vụ trựng đường kớnh lỗ 0,45àm Dung dịch trysin-EDTA1X.

- Pipet, ống nghiệm vô trùng, đĩa nuôi cấy tế bào đường kính 10 cm,máylytâm,buồngđếmtế bào,kínhhiểnviquanghọc…

8 0 o C)l ư u t r ữ t ế b à o , l ấ y r a m ỗ i l o ạ i m ộ t ố n g f a l c o n chứatếbàoH460,A54 9vàVerovàróđụngnhanhtrongbểổnnhiệt(37 o Cx1p h ỳ t ) H ỳ t 2 0 0 à l d u n g d ị c h t ế b à o c ó t r o n g m ỗ i ố n g t r ê n c h o v à o t ừ n g falconl o ạ i 1 5 m l c h ứ a 1 0 m l m ô i t r ư ờ n g n u ô i c ấ y t ế b à o r ồ i t r ộ n đ ề u H ú t dung dịch tế bào vừa trộn vào đĩa nuôi cấy đường kính 10 cm Kiểm tra tế bàotrên kính hiển vi, đánh giá đặc điểm hình thái và mật độ tế bào vừa gieo.Chuyểncácđĩa nuôitếbàovàotủấmnuôicấytếbào(37 o C và5%CO2).

Sau 24 giờ, lấy các đĩa nuôi cấy tế bào ra,t i ế n h à n h k i ể m t r a t ế b à o bằng kính hiển vi quang học, tế bào sống và bám đáy đĩa nuôi cấy, rửa tế bàobằng PBS 1X và thay môi trường nuôi cấy tế bào Duy trì đĩa nuôi cấy tế bàotrong tủ nuôi cấy (37 0 C, 5% CO2) Hàng ngày, dùng kính hiển vi quang họckiểm tra tế bào cũng như tình trạng nhiễm các vi sinh vật vào môi trường nuôicấy Thaymôitrườngnuôicấytế bào2-3ngày/lần 76,77

Gieo các tế bào sau 6-7 ngày, kiểm tra dưới kính hiển vi quang học thấytếb à o p h á t t r i ể n k h o ả n g 8 0 % đ á y đ ĩ a n u ô i c ấ y , t i ế n h à n h t ă n g s i n h t ế b à o bằng cáchtách vàgieotếbào vàonhiềuđĩanuôi cấytheocácbướcsau:

- Hút hết dịch môi trường cũ ở các đĩa nuôi cấy tế bào, sau đó, rửa sạchtếbào ởcácđĩanuôicấybằng dung dịch PBS1X(lặplạikhoảng 2lần).

- Cho 3 ml dung dịch trypsin-EDTA 1X vào các đĩa nuôi cấy tế bào, lắcđều rồilưutủấm37 0 C,CO2khoảng2-3phút.

- Lấy các đĩa nuôi cấy tế bào ra khỏi tủ ấm, kiểm tra mức độ tế bàobong khỏi đáy dưới kính hiển vi quang học Khi tế bào bong khỏi đáy đĩa nuôicấy,tách rờinhau,lơlửngtrong môi trườngnuôi cấy,thựchiệncácbướcsau:

+ Cho thêm 20 ml dung dịch môi trường nuôi cấy vào mỗi đĩa nuôi cấytế bào (đã bong hết), trộn đều dung dịch môi trường nuôi cấy và tế bào bằngpipet, dùng pipet hút toàn bộ dịch môi trường có chứa tế bào cho vào ốngfancol50ml.

+ Đếm tế bào ở buồng đếm Neubauer (Hình 2.2), chuẩn nồng độ dịch tếbào là10 4 tếbào/ml.

+ Cho 10 ml dung dịch tế bào đã chuẩn nồng độ ở trên vào các đĩa nuôicấy20x100mmmới(đã chuẩnbịsẵn).

+ Lưu các đĩa nuôi cấy tế bào mới gieo ở tủ ấm nuôi cấy tế bào

(37 0 C,5% CO2) Theo dõi tế bào bám đáy và phát triển hàng ngày, loại bỏ ngay đĩanuôi cấybịnhiễmnấmhayvi sinhvậtkháctrongquátrìnhtheodõi.

Khi tế bào phát triển tốt gần kín đáy đĩa nuôi cấy, thu tế bào làm thínghiệmhaylàmnguồntếbàobảoquảnởmôi trường-80 0 C.

- Nồng độ tế bào sau thu hoạch được chuẩn bằng cách sử dụng buồngđếmNeubauer(Hình2.2)vàkínhhiểnviquanghọc.

(a).Buồng đếmnhìnbằngmắt thường; (b).Buồng đếmnhìn trênkínhhiểnvi -CôngthứctínhmậtđộtếbàotrongmôitrườngbằngbuồngđếmNeubauer:

Tăngsinhvàchuẩnđộvirusvaccinesởi

Gieo tế bào Vero vào các đĩa nuôi cấy 20x100 mm với nồng độ

10 5 tếbào/ml theo kỹ thuật nuôi cấy tế bào (đã đề cập ở tiểu mục 2.2.1.2), lưu ở tủnuôi cấytếbào(37 0 C,5%CO2).

Sau 24 giờ, kiểm tra tế bào trên đĩa nuôi cấy bằng kính hiển vi quanghọc, tế bào Vero bám đáy tốt, thay môi trường nuôi cấy Theo dõi tế bào Verophát triển hàng ngày, thay môi trường nuôi cấy 2-3 ngày/1 lần Khi tế bàoVero phát triển gần kín đáy đĩa nuôi cấy (thường vào ngày thứ 5-6), thay môitrường nuôi cấy đồng thời tiến hành nhiễm MeV với nồng độ 1-2 ml dịchstock virus/đĩanuôi cấy,lưu vàotủ nuôicấytếbào (37 0 C,5%CO2).

Kiểm tra tế bào Vero nhiễm MeV ở các đĩa nuôi cấy hàng ngày dướikính hiển vi quang học Sau 7-8 ngày nhiễm virus, quan sát dưới kính hiển vithường, tế bào Vero nhiễm Mev ở các đĩa nuôi cấy có hình ảnh: tế bào hòamàng tạo hợp bào, hợp bào chết vỡ ra tạo thành mảnh vỡ tế bào Hút toàn bộdịch chứa tế bào nhiễm MeV chết ở các đĩa nuôi cấy vào ống falcon 50 ml, lytâm 5000 vòng/phút, trong 5 phút Sau đó, lấy phần dịch nổi, bỏ phần cặn bêndưới, tiếp tục lọc phần dịch nổi này bằng màng lọc vi sinh đường kính lỗ0,45m,tathuđượcdịch chứavirus.Bảoquảntrong môi trường-80 0 C.

Chuẩn độ virus bằng TCID50là phương pháp xác định liều nhiễm 50%nuôi cấy mô Đây là phương pháp thường sử dụng để chuẩn độ các virus gâyra hiệu ứng bệnh lý tế bào đặc trưngin vitro Chúng tôi lựa chọn phương phápchuẩn độ TCID50sử dụng tế bào Vero và dung dịch xanh methylen làm chấtbiểuhiện màu vàđánhgiáhiệu ứngbệnh lý tếbàonhiễmMeVởcácgiếng.

-Gieotếbào Vero vào cácgiếng trênđĩa96giếngtheo cácbướcsau:

+ Tăng sinh tế bào Vero đủ số lượng theo kỹ thuật tăng sinh tế bào đãnêu ởtrênvà thuđủsố lượngtếbàoVero.

+ Đếm tế bào Vero ở buồng đếm Neubauer, chuẩn bị dung dịch tế bàoVero nồngđộ5x10 4 tế bào/ml.

+ Cho 200l dung dịch tế bào Vero đã chuẩn nồng độ trên vào cácgiếng trên đĩa 96 giếng, ta có các giếng có nồng độ 10 4 tế bào/200l/1 giếng,duytrìtế bàotrênđĩa96giếngởtủ nuôicấytếbào(37 0 C,5%CO2).

- Nhiễm MeV vào các giếng trên đĩa 96 giếng với các nồng độ phaloãng từ 10 -3 đến 10 -8 theo các bước: Sau 24 giờ kiểm tra tế bào trên đĩa 96giếng dưới kính hiển vi quang học, tế bào Vero bám đáy và phát triển. Tiếnhành thay môi trường nuôi cấy và nhiễm MeV vào các giếng trên đĩa 96 giếngtheo hàng ngang B, C, D, E, F, G, tương ứng với nồng độ pha loãng stockvirustừ 10 -3 đến 10 -8 , hàngA, hàngH,cột11và12làcácgiếngc h ứ n g (khôngnhiễmvirus) (Hình2.3).

(5ml)vôtrùng,đánhsốốngnghiệmtừ1đến9,mỗiống có2,25mlmôitrườngnuôicấytế bào.

+Cho250lstockvirusvàoốngnghiệm1,trộnđềnđược2,5mldungdịchstoc kvirusđã pha loãng10 -1 (Hình2.4).

+Lấy250ldungdịchởốngnghiệm1ch ovàoốngnghiệm2,trộnđều tađược2,5mldungdịchvirusphaloãng10 -2 (Hình2.4).

+Lấy250ldungdịchởốngnghiệm2cho vàoốngnghiệm3,trộnđềutađược 2,5mldung dịchvirusphaloãng10 -3 (Hình 2.4).

+Lấy250ldịchvirusởống nghiệm3chovàoốngnghiệm4,trộnđều tađược 2,5ml dungdịchvirus phaloãng10 -4 (Hình2.4).

+ Cứnhư vậy,lặplại cácthaotác trêncho đếnốngnghiệm9, tađược9ống nghiệmchứa 2,5 mldungdịchcó nồngđộvirustừ10 -1 đến10 -9

Sửdụngcácốngchứadungdịchvirustừ2đến9tươngứngvớinồngđộpha loãngvirustừ10 -2 đến10 -9 chothửnghiệmnày.

Kiểm tra tế bào Vero nhiễm virus ở các giếng trên đĩa 96 giếng hàngngàydướikínhhiểnviquanghọc.

- Nhuộm xanh methylen: Sau 4-5 ngày nhiễm MeV, quan sát dưới kínhhiển vi thấy các giếng có hình ảnh nhiễm virus rõ Cho thêm 50l xanhmethylen 15% vào từng giếng trên đĩa 96 giếng Sau đó, cho đĩa 96 giếng vàotrong 1 túi nilon sạch rồi để ở nhiệt độ phòng 1-2 giờ Lấy đĩa 96 giếng ra rửanhẹ nhàng bằng nước sạch So sánh màu ở giếng chứng và giếng nhiễm virusđánhgiákếtquảvà tínhTCID50.

- Đọc kết quả sau nhuộm xanh methylen: Các tế bào còn sống bám đáyvà bắt màu xanh của chất nhuộm xanh methylen, các tế bào chết do nhiễmvirus bong ra và bị rửa trôi đi sau khi rửa nhẹ nhàng đĩa 96 giếng bằng nướcsạch Do vậy, giếng có màu xanh đậm hơn là giếng có số tế bào sống cao hơn,độ nhạt của màu xanh tỉ lệ thuận với số tế bào chết So sánh mức độ màu giữagiếng chứng vàgiếngnhiễmvirusxácđịnhgiếng cótế bàonhiễmMeV.

(%CPE ở nồngđộ phaloãngcó % CPE trên 50%) –(50%) (%CPEởnồngđộphaloãngcó%CPE>50%)–(%CPEởnồngđộphaloãngcó%CPE95% Tiếptheo,chuẩnnồngđộdịchtế bào10 6 tếbào.

Ly tâm dịch tế bào này ở 5000 vòng/phút trong 5 phút, hút bỏ dịch nổithaybằng1mldung dịch PBS,tathuđượcmẫu tế bào H460 của mô u. Đánh giá được thực hiện tại Bộ môn Sinh học tế bào, khoa Sinh họcTrường Đại học Khoa học Tựnhiên,Đại học Quốcgia HàNội.

2.2.11.2 Dùngkhángthểđặchiệu đánhgiátỉ lệtếbào miễndịch ởởmô u

Chuẩnbị4ốngchứa10 6 tếbàomôu,mỗiốngđượcửriêngvớitừngloạikhán gthểdướiđây:

- Đánh giá tỉlệđại thực bào chuột bằng khángthể khángCD11b cógắnhuỳnhquangFluorescein isothiocyanate (FITC).

- Đánh giá tỉ lệ tế bào DC trưởng thành chuột bằng kháng thể khángCD11cgắnhuỳnh quangAllophycocyanin(APC) kếthợp vớikhángt h ể kháng CD197(CCR7)gắnhuỳnh quangPerCP-Cy5-5.

- Sử dụng máy FACS Canto II (BD) để đánh giá tỉ lệ các tế bào sau khiủ vớicác loạikhángthể.

- Phânloạitếbàotheo cáctín hiệu huỳnhquang quacácbướcsau:

+ Đầu tiên, chúng tôi chuẩn các thông số cho máy trên phần mềm BDFACSD i v a b ằ n g c á c h c h ạ y m ẫ u đ ố i c h ứ n g đ ể x á c đ ị n h c á c t h ô n g s ố X á c định vùng P1 là vị trí phân bố của các tế bào đơn độc (màu đỏ) có tín hiệuhuỳn quang là vùng tế bào cần khảo sát (Hình 2.9) Các đối tượng có tín hiệuhuỳnh quang không nằm trong vùng này sẽ không được khảo sát tiếp Do đó,tất cả các tín hiệu huỳnh quang (FITC, APC, PerCP-Cy5-5) được khảo sát đềunằm ở vùng này Như vậy, sau khi ủ với kháng thể,t í n h i ệ u h u ỳ n h q u a n g FITC ở vùng này sẽ xác định các tế bào có biểu hiện CD11b hoặc CD49b, tínhiệu huỳnh quangA P C ở v ù n g n à y s ẽ x á c đ ị n h c á c t ế b à o c ó b i ể u h i ệ n CD11c, có cả tín hiệu huỳnh quang APC và PerCP-Cy5-5 ở vùng này sẽ xácđịnh các tế bào cóbiểuhiện CD197(CCR7).

Hình 2.9 Xác định thông số chuẩn cho máy bằng phần mềmBDFACS Diva

+ Tiếp theo, chúng ta chạy mẫu tế bào đã ủ với các kháng thể khángCD11b,C D 4 9 b , C D 1 1 c , C D 1 9 7 ( C C R 7 ) c ủ a c h u ộ t K ế t q u ả c h o t h ấ y x u ấ t hiện các tế bào có giá trị huỳnh quang xuất hiện ở vùng dương tính với cáckháng thể CD nêu trên Tỉ lệ tế bào dương tính với các kháng thể CD đại điệncho số lượng các tế bào miễn dịch tương ứng có trong quần thể tế bào đượcphântích.

2.2.11.3 Chuẩn bị mẫu tế bào mô u tế bào H460 cho đánh giá chết tế bàotheo chươngtrình

Chuẩn bị dung dịch tế bào mô u tế bào H460 (theo quy trình ở mục2.2.11.1) Sau đó, chuyển dung dịch tế bào này vào 12 ống ependorft 2ml vôtrùng (đã chuẩn bị), trong đó có 6 ống nhóm chứng và 6 ống nhóm điều trịbằng MeV, các nhóm đánh ký hiệu theo nhóm để nhận biết Ly tâm ở5000vòng/phút, trong 5 phút, hút bỏ dịch nổi thay bằng 1ml dung dịchPBS1 X , thuđượcmẫu tếbào H460 củamô uđểđánhgiátỉ lệtếbào chết apoptosis.

ĐánhgiásiêucấutrúcmôutếbàoH460trênchuộtnudesauđiềutrịbằng MeV

Phẫu tích 6 mẫu ung thư từ mô khối u tế bào H460 trên chuột nude ởnhóm điều trị MeV và nhóm chứng Tiến hành làm tiêu bản siêu cấu trúc theocác bướcsau:

- Cốđị nh mẫuun gthư bằngdungd ịc hglutaraldehyte2% trongđ ệm cacodylate(pH=7,3)vớitỉlệthểtíchlà1mẫu/10dungdịch,duytrì2-3ngày.

- Cốđịnhcácmảnhnhỏlạibằngacidosmic1%trongđệmcacodylate(p H=7,3) trong1giờ.Sauđó,rửa 2-3lầnbằngđệmcacodylate(pH= 7,3).

- Sau khi khử nước, mẫu được chuyển qua dung dịch cồn propylene +ethylenevớitỉlệ1:1,trong 10 phút,chuyểnquapropylenetrong 10phút.

- Tiếp tục chuyển mẫu qua hỗn hợp propylene + epon 812 với tỷ lệ thểtích là 1:1, trong 15 phút, hỗn hợp propylene + epon 812 tỉ lệ 1:2 trong 30phút.Cuốicùng chomẫu vàoepon812,trong30phút.

- Lưu hóaở nhiệtđộ37 0 Ctrong 24giờ.

- Sau khi đã hóa cứng hoàn toàn các block, gọt mẫu, cắt lát mỏng,nhuộm bằng xanh toluidine, xác định vị trí đánh giá, gọt mẫu và cắt bằng máysiêu cắt(sảnxuấttại Đức) độdàylátcắt:50nm.

- Nhuộm các lát cắt này bằng uranyl acetate 2% trong 5 phút, rồi rửa 2lầnbằngnước cất.

- Nhuộmbằng chìcitrate5%trong5phút,dùngnướccất rửa2 lần.

- Đánh giá cấu trúc mô, tế bào ung thư trên kính hiển vi điện tử truyềnqua JEM 1400, JEOL, Nhật Bản (Khoa Hình thái - Viện 69, Bộ tư lệnhLăngChủ tịchHồChíMinh).

PhântíchgiảiphẫubệnhmôutếbàoH460cấyghéptrênchuộtnude

Phẫu tích 3 mẫu u từ mô UTP dòng tế bào H460 ghép trên chuột nude ởnhóm điều trị MeV và nhóm chứng.Cố định mẫumôu n g t h ư n g a y s a u k h i lấy ra khỏi cơ thể chuột nude trong formol trung tính 10% với tỉ lệ thể tích 1bệnh phẩm/20 - 30 dung dịch Sau đó bệnh phẩm được gửi tới khoa giải phẫubệnh,Bệnh việnQuân y103đểphântíchtheo cácbướcsau:

- Nguyên lý: Đưa bệnh phẩm qua các hóa chất khác nhau để có thể cắtbệnh phẩm bằng máy dễ dàng mà không làm biến dạng cấu trúc của chúng vàcó thểbảoquảnbệnhphẩmđược lâudài.

+Bệnh phẩmđượcđưaquababình formol 10%vớithời gian 4giờ.

+Tiếptheo,bệnhphảmlầnlượtđượcđưaquacácbìnhđựngcồnởcácnồngđộkh ácnhautừcồn80 0 đếncồn100 0 trongthờigian2,5giờ.

+Sauđó,bệnhphẩmđược đưaqua3bìnhXylenvớithờigian1,5 giờ.

+T i ế p t h e o , b ện h p h ẩ m đượcđ ư a q u a 2 b ì n h p a r a ff i n 6 0 0 t r o n g t h ờ i gian3,5giờ.

- Nguyên lý: Qui trình đúc khối parafin là làm cho parafin ở xungquanh cũng như ở bên trong bệnh phẩm đặc lại thành một khối thuần nhất vànhằmgiữ miếngbệnhphẩmtronglòngcassete.

+ Tháo bỏ nắp cassette chứa bệnh phẩm sau quá trình chuyển mẫu ra,gắp bệnh phẩm vào khuôn đúc bằng kim loại có kích thước phù hợp với kíchthướccủamảnhbệnhphẩm.Đặt bệ nh phẩmvàovịtr ígiữakhuôn,nằ msátmặt đáy, đúng chiều và đúng mặt phẳng bệnh phẩm sao cho lấy được đủ diệncắt cầnđểchẩnđoán.

+ Đặt khuôn trên mặt phẳng ngang ngay dưới vòi rót parafin, bơmparafin nóng chảy vào khuôn đúc đến khoảng 1/2 thể tích khuôn Gắn, giữkhuôn nhựa của cassette vào khuôn đúc kim loại rồi bơm tiếp parafin cho đầykhuônđúc.

+Đểkhuônrabànlàmlạnhchođếnkhiphầnđáykhuônrắnlạidầncó màu trắng đụcgiúp giữđược chiềuvàvị trí ởgiữacủa bệnhphẩm.

- Nguyên lý: Bệnh phẩm sau khi chuyển đúc xong được cắt mỏng thànhlỏt(cúđộdàytừ1àmđếnvàichụcàm)bằngnhữngmỏycắtmỏng(microtome) khác nhau để ánh sáng có thể đi qua được, kết hợp nhuộm màunênquan sát đượchìnhdạng cấutrúccủatếbàohoặcmôdưới kính hiển vi.

+Lamkínhđượcđưaquacácbểnhuộmchứacáchóachấtkhácnhauđểnhu ộmmàu nhânvàbàotươngcùng cácthành phầnkhácngoàitếbào.

+Saukhinhuộmxongsoitrênkínhhiểnviquanghọcnhântếbàobắtmàu xanh, bàotươngbắtmàuhồngđỏ là đạtyêu cầu.

Phương pháp phântíchkếtquả

Chúng tôi dùng các thuật toán thống kê ở phần mềm SPSS.20 và vẽ đồthị bằngphầnmềmGraphPadPrism.

Các số liệu được trình bày bằng giá trị trungbình (X), độ lệch chuẩn(SD)v à t r u n g v ị ( M e ) S ử d ụ n g p h é p k i ể m đ ị n h T T e s t đ ể s o s á n h g i á t r ị trung bình giữa 2 nhóm, phép kiểm định One-Way ANOVA để kiểm định sựkhác nhau của giá trị trung bình khi so sánh nhiều hơn 2 nhóm, phép kiểmđịnh trung vị independent-samples median test sử dụng kiểm định Mann-WhitneyUtestgiá trịtrung vịgiữa cácnhóm.

Sử dụng phương pháp Kaplan-Meier để phân tích thời gian sống, tỉ lệchuột chếtsauđiều trịbằngMeV ở cácnhómnghiên cứu.

Đạođứctrongnghiên cứu

Nghiên cứu được thông qua bởi Hội đồng khoa học chấm đề cươngnghiên cứu sinh của Trường đại học Y Hà Nội Nghiên cứu tuân thủ cácnguyên tắc đối xử nhân đạo đối với động vật Đảm bảo hạn chế đến mức tốithiểu việc gây tổn thương, đau đớn cả về thể xác lẫn tinh thần cho các độngvậtthínghiệm.

Hạnchếcủanghiên cứu

Mặc dùcác nghiên cứu gần đây đã chứng minh rõ ràngt i ề m n ă n g khángtếbàoungthưcủaOVnóichungvàMeVnóiriêng.Tuynhiê n,vẫncònn h i ề u h ạ n c h ế c ầ n đ ư ợ c g i ả i q u y ế t đ ể c ả i t h i ệ n h i ệ u q uả c ủ a l i ệ u ph áp OV Những yếu tố này bao gồm: tình trạng nhiễm virus, khả năng đưa virusvượt qua các rào cản của cơ thể đến tổ chức ung thư, phân bố virus trong tổchức ung thư, chiến lược dùng thuốc hỗ trợ, khả năng miễn dịch của cơ thểkháng virus,và khảnăngviruslygiảitế bào ungthư.

Trong nghiên cứu này, chúng tôi đánh giá hiệu quả kháng UTP ngườicủa MeV trên dòng tế bào UTP người H460, A549 nuôi cấy trong phòng thínghiệm và mô hình cấy ghép khối u tế bào H460 trên chuột thiếu hụt miễndịch Chúng tôi dùng phương pháp tiêm trực tiếp MeV vào khối u, nhằm tăngkhả năng virus tập trung vào khối u, hạn chế các rào cản của cơ thể đối vớivirus Do đó, Nghiên cứu chưa đánh giá được đầy đủ ảnh hưởng của một loạtcác rào cản trên cơ thể sống hoàn chỉnh mà OV phải vượt qua để có được hiệuquảlygiảitếbàoungthư như:

(1) mạnglướibạchhuyếtbất thườngvàsựtăng cường mạch máu bên trong khối u và chất nền ngoại bào dày đặc (ECM)của khối u rắn dẫn đến tăng huyết áp mô kẽ có thể làm giảm sự xâm nhập củavirus; (2) Hơn nữa, nghiên cứu trên chuột thiếu hụt miễn dịch nên chưa đánhgiá hết được mức độ đáp ứng miễn dịch kháng MeV mạnh mẽ của cơ thể,MeV có khả năng bị hệ thống miễn dịch của vật chủ loại bỏ và rất khó đảmbảođ ủ s ố l ư ợ n g g â y l y g i ả i t ế b à o k h ố i u h i ệ u q u ả , d o s ự t ư ơ n g t á c g i ữ a chúng với các tế bào trình diện kháng nguyên, các kháng thể sẵn có lưu hànhtrong máu và các yếu tố như yếu tố đông máu FIX, FX và protein bổ thểC4BP 82 (3)Tiếpđó, là sốlượnglớncácràocảnriênglẻ trongvim ô i trường ức chế miễn dịch của các khối u rắn Nhờ có biến đổi vi môi trường ứcchế miễn dịch ở khối u, tế bào khối u có thể thoát khỏi sự giám sát miễn dịch,tăngsinhnhanhchóngvàdicăn.Cáckhốiurắncóthểtiếtrachemokinevà cytokine như interleukin (IL) -10, tố tăng trưởng chuyển dạng β (TGF- β) vàarginase-1, 83 ngăn cản quần thể tế bào miễn dịch và chiêu mộ các tế bào ứcchế miễn dịch bao gồm: tế bào điều hòa T, tế bào ức chế dòng tủy, đại thựcbào liên quan khối u, nguyên bào sợi liên quan khối u và bạch cầu trung tính.Những yếu tố này có thể bảo vệ khối u khỏi các phản ứng miễn dịch kháng u.Do đó, các tín hiệu ứcc h ế v à c á c t h ụ t h ể đ i ể m k i ể m s o á t m i ễ n d ị c h , c h ẳ n g hạn như: PD-1, CTLA-4, TIM-3 và LAG-3, được điều chỉnh theo tế bàolymphoxâm nhập khốiu, góp phần tạo ramôitrườngkhối uứcchếm i ễ n dịch Ngoài ra, tổ chức và cấu trúc bất thường của mạchmáuk h ố i u c ó t h ể làm giảm nguồncung cấpmáu 84 Tình trạng thiếu oxy cục bộ và vim ô i trường pH thấp có thể ức chế quá trình chết theo chương trình của tế bào khốiu, thúc đẩy hình thành mạch, điều chỉnh các yếu tố phát triển khối u và làmcho tế bào khối u kháng thuốc hơn với các phương pháp điều trị chuẩn như xạtrị, thuốc độc tế bào và liệu pháp miễn dịch Như vậy, một khi MeV đến vị tríkhối u, điều quan trọng là chúng phải duy trì các chức năng của mình trong vimôi trường khối u ức chế miễn dịch Hơn nữa, nghiên cứu mới chỉ đánh giáhiệu quả của MeV kháng dòng tế bào UTP người trên thực nghiệm mà chưađánhgiáđượcđộctínhliềuMeVtrêncơthểhoàn chỉnh.

Nuôicấytếbàou ng thư phổiH460vàA54

Tăng sinh vàchuẩn độTCID 50 Me V

1 :Đánh giáhiệu quảMeV ly giảitế bào

H460và A549 invitro NhiễmMeVvàotế bào H460 vàA549 invitro

Ghép u tế bàoH460 dưới da đùichuộtnudevàđiề utrịbằng MeV

Mục tiêu 2:Đánhgiá hiệu quả MeVkháng u tế bàoH460 trên chuộtnude

Tỉ lệ tế bàoapoptosisở các nhómNC

Sứckhỏechuột,trọng lượng chuột,kích thước u, thờigians ố n g v à c h ế t ởcácnhómNC.

Hìnhảnh siêu cấutrúc tếbào uH460

- Đạithựcbào,NK,DCvà DCtrưởngthành. -Tếbàochếtapoptosis.

KẾTQUẢNGHIÊNCỨU Đánh giá hiệu quả kháng u tế bào

Nhóm điều trị MeV(10con)

Nuôicấy,tăngsinhdòngtếbàoH460A549,Verovàvirusvaccinesởi

Nuôicấy,tăngsinh cácdòng tếbàoH460,A549vàVero

Hình3.1.Tếbào ungthưphổi dòng H460 bámđáyvà pháttriển

(A) ỞVật kính1 0 X ; (B)ởvậtkính20X;(C) ởvật kính40X

Hình3.2.Tếbào ung thưphổi dòngA549 bámđáyvà pháttriển

Hình3.3.Tế bào Vero bámđáy vàpháttriển

Nhận xét:Quan sát dưới kính hiển vi quang học, tế bào ung thư phổidòng H460 và A549 là các loại tế bào bám đáy, phát triển đơn lớp, có nhiềuhìnhd ạ n g k h á c n h a u t ừ h ì n h b ầ u d ụ c c h o đ ế n h ì n h đ a g i á c , đ ư ờ n g k ớ n h khoảng 20-40àm, cú nhõn tế bào to chiếm gần hết phần tế bào chất, hỡnh ảnhnhânq u á i , n hâ n c h i a (H ì n h 3 1 ; 3 2 ) T ế b à o V e r o l à t ế b à o d ạ n g b á m đỏyphỏttriểnđơnlớp,đườngkớnhkhoảng17àm(Hỡnh3.3).

Tăngsinh virusvaccinesởi

(A), Nhiễm MeV ngày thứ 3; (B) nhiễm MeV ngày thứ 4; (C), nhiễm virusngàythứ5-6;(D) nhiễmMeVngàythứ7

Nhận xét:Tế bào Veron h i ễ m M e V ở n g à y t h ứ 3 , c á c t ế b à o n h i ễ m virus co tròn lại bong khỏi đáy; ở ngày nhiễm thứ 4, tế bào Vero nhiễm virushòamàng tạo hợpbào; ở ngày nhiễm thứ 5-6,tế bàoVeron h i ễ m v i r u s t ạ o hợp bào lan rộng; ở ngày thứ 7 nhiễm virus, tế bào nhiễm virus hoại tử vỡ ratạo ra xác tếbào(Hình3.4).

Chuẩnđộ TCID 50của virusvaccinesởi

Nhiễm MeV ngày thứ 5, tiến hành nhuộm xanh methylene các giếng tếbào VeronhiễmMeV trênđĩa96giếng.Kếtquả thu đượcnhưhình3.5.

Hình3.5.Kếtquả chuẩnđộ TCID 50sử dụngthuốcnhuộmxanhmethylen

-TCID 50 của MeV: hàng tương ứng với nồng độ pha loãng virus là 10 -6 có

7 giếng nhạt màu hơn (giếng có tế bào nhiễm virus) so với nhóm chứngchiếmtỉlệ7/10>50%.Ởhàngtươngứngvớinồngđộphaloãng10 -

Log của nồng độ pha loãng có CPE trên 50%: -log (10 -6 ) 6TCID50củaMeV= 10 6+0,5 /0,2ml=5x10 6,5 /ml

Lygiải trựctiếpt ế bàoungthư phổingườidòngH460và A549của Vi rusvaccinesởiinvitro

TếbàoH460vàA549nhiễmvirusvaccinesởitạohợpbàoinvitro

Hình3.6.Hìnhảnhtếbào H460 và A549 nhiễmMeVtạo hợpbào invitro

Nhận xét:Từ ngày thứ 3 nhiễm MeV, hình ảnh tế bào H460 và

A549nhiễm virus thay đổi về hình thái dưới kính hiển vi thường, nhiều tế bào cotròn, nhỏ lại, bongrakhỏi đáy đĩanuôi cấy, lơlửng( h ì n h 3 6 A ) Đ ế n n g à y thứ 4 nhiễm MeV, tế bào H460 và A549 nhiễm virus hòa màng với nhau tạohình ảnh hợp bào (tế bào khổng lồ có nhiều nhân, nổi lên trên) (hình 3.6B).Ngày thứ 5 nhiễm MeV, các tế bào nhiễm virus hình ảnh hợp bào nhiều và tohơnnổilêntrên,cáchợpbàocóxuthếphânhủyđểlạihìnhảnhtếbàochếtvàcácmảnhvỡ tếbào(Hình3.6C,DvàE).

Hiệuquảlygiải tếbàoungthưphổingườiH460vàA549bằng thử nghiệmMTTcủavirusvaccinesởi

Bảng3.1.Tỉ lệtếbào H460 và A549sống ở ngày thứ3 nhiễmMeV

-TỉlệtếbàoH460sốngởhainhómnhiễmMeV(nhómnhiễmMeVliều1 MOI và 0.1 MOI) đều thấp hơn có ý nghĩa thống kê (p < 0,05) so với nhómchứng(Biểuđồ3.1,Bảng3.1).

- Tỉ lệ tế bào A549 sống ở hai nhóm điều trị (nhóm nhiễm MeV liều 1MOI và 0.1 MOI) đều thấp hơn so với nhóm chứng Nhưng chỉ có khác biệt ởnhóm điều trị MeV liều 1 MOI so với nhóm chứng là có ý nghĩa thống kê(p