Tiểu luận môn nhập môn công nghệ sinh học test kit

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA CƠNG NGHỆ SINH HỌC VÀ KỸ THUẬT MƠI TRƯỜNG Ti ểu ận lu Cơ TIỂU LUẬN ng MÔN: NHẬP MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC Đề tài: Test Kit hệ ng Nhóm Chiều thứ 6, tiết 11-12 ực th GVHD: Trần Hoàng Ngâu ẩm ph Tp Hồ Chí Minh, tháng 11 năm 2016 DANH SÁCH THÀNH VIÊN VÀ PHÂN CÔNG NHIỆM VỤ Ti Họ tên Phan Thị Băng Trâm MSSV 2008130142 ểu 2008130116 Nguyễn Cao Thủy Tiên 2008140314 Vũ Thị Xuân Hiền 2008140083 ận lu Trần Hồi Nam Ghi Nhóm trưởng Hồn thành Hồn thành Hồn thành Hồn thành ng Cơ Nhiệm vụ -Tìm phần khái niệm phương pháp miễn dịch -Tổng hợp -Tìm phần phương pháp miễn dịch -Tìm phần phương pháp phân tử -Tìm phần phương pháp phân tử hệ ng ực th ẩm ph MỤC LỤC LỜI MỞ ĐẦU NỘI DUNG Khái niệm phân loại: Ti I III ểu II Sự phát triển test kit: Cơ chế chẩn đoán miễn dịch: lu Bản chất kết hợp kháng nguyên kháng thể: .7 Phương pháp ELISA: ận Phân loại ELISA: .10 Cô 3.1.Direct ELISA (ELISA trực tiếp) 10 3.2.ELISA gián tiếp 11 ng 3.3. Sandwich ELISA 12 3.3.1 Sandwich ELISA trực tiếp 13 ng 3.3.2 Sandwich ELISA gián tiếp 14 3.4 Phản ứng ức chế /cạnh tranh 14 hệ 3.4.1 Direct C-Elisa: Kiểm tra kháng nguyên 15 3.4.2. Direct C-Elisa: Kiểm tra kháng thể 17 th 4. Các yếu tố ảnh hưởng đến kết ELISA .17 IV ực  Kỹ thuật sắc kỹ miễn dịch .18 Cơ chế chẩn đoán phân tử: 20 ph Kỹ thuật PCR: 20 Quy trình kỹ thuật: 21 ẩm Phương pháp RT-PCR (PCR ngược) .21 Một số phương pháp chẩn đoán phân tử khác 23 Một số ứng dụng test kit 24 KẾT LUẬN 26 TÀI LIỆU THAM KHẢO .26 LỜI MỞ ĐẦU Ti Trong sống đại, việc bảo vệ sức khỏe vấn đề quan tâm Vì việc sử dụng cơng cụ để dễ dàng việc dự đoán bệnh hay vấn đề thường gặp cần thiết Test kit công cụ Thuật ngữ “test kit” không dùng phổ biến, nhắc tới sản phẩm lại quen thuộc Test kit dùng nhiều lĩnh vực cơng nghiệp hay nơng nghiệp Ngồi loại test kit gần gũi mà ta biết viết trình bày thêm số loại Hơn nữa, viết đề cập tới chế hoạt động chung số loại test kit - loại liên quan tới ngành công nghệ sinh học y dược ểu Khái niệm phân loại Sự phát triển test kit Cơ chế chẩn đoán miễn dịch ứng dụng Cơ chế chẩn đoán phân tử ứng dung ng Cô - ận lu Bài viết làm rõ số vấn đề liên quan tới test kit để ta hiểu rõ cơng dụng chế chúng Qua đó, chọn cho test phù hợp để sử dụng Bài viết bao gồm phần: Bài viết tham khảo nhiều tài liệu khác nên chắn có thiếu sót Mong nhận thơng cảm góp ý hệ NỘI DUNG ng Xin cảm ơn! ực th I Khái niệm phân loại: 1.Khái niệm: Test kit hiểu nôm na kiểm tra Nó cơng cụ để kiểm tra vấn đề cụ thể cách lấy lượng nhỏ mẫu chờ xem kết thời gian ngắn Tesst kit không sản phẩm nhỏ gọn bán thị trường ẩm ph ta thấy mà kiểm tra/chẩn đốn bệnh viện hay phịng thí nghiệm gọi test kit 5 Hiện chúng thiết kế nhỏ gọn, dễ sử dụng, độ xác cao Những sản phẩm đưa thị trường nước ta phần nhỏ thông dụng que thử thai, đo pH, test nhóm máu, test nước, hóa chất thực phẩm… Nhưng nước phát triển cịn có loại test kit phát số bệnh tiểu đường, viêm gan B/C, test vi khuẩn, test DNA, thuốc…thậm chí test HIV Ti ểu ận lu Phân loại: Cơ ng Có nhiều phương pháp sử dụng test kit, phương pháp phổ biến sử dụng ngành công nghệ sinh học y dược ngành khác phương pháp chẩn đoán phân tử phương pháp chẩn đoán miễn dịch Tăng sinh vi sinh vật Bổ sung môi trường phù hợp Phân lập hệ Lấy mẫu máu, phân, nước tiểu, sinh thiết… ng Người bị nghi nhiễm bệnh Nhận dạng thông qua phụ thuộc tăng trương, miễn dịch hoăc phân tử Xết nghiệm phân tử: tìm gen gây nguồn bệnh chính,lai hóa nucleic acid, PCR ực Phương pháp phân tử miễn dịch th Xét nghiệm kháng thể: tìm kháng nguyên vi sinh vật/virus, sử dụng kháng thể huỳnh quang, EIA… ẩm ph  Phương pháp chẩn đốn miễn dịch, điển hình ELISA: Test kit ELISA giúp cung cấp kết xác, nhạy cảm quán Mỗi đầu dò protein nghiên cứu dụng cụ điều chỉnh để cung cấp đọ nhạy cảm mặt sinh lý có liên quan Ngoài ra, dụng cụ xác nhận sử dụng loại mẫu phổ biến, bao gồm huyết thanh, huyết tương dịch nuôi cấy tế bào Lysates (dịch phân giải) di động sử dụng để xác nhận dụng cụ phát protein truyền tín hiệu phosphoryl hóa Ưu điểm kit ELISA:  Dùng 800 đối tượng khác  Tối ưu hóa cho hiệu suất nhạy, xác quán  Kết có 2,5 - 4h  Xác định với nhiều loại mẫu  Phương pháp chẩn đốn phân tử, điển hình PCR RT-PCR: Ti Từ khuôn DNA nhỏ giot máu, sợi tóc hay tế báo… người ta khuếch đại xác, trật tự lớn lên đến hàng triệu nhằm phục vụ cho trình khảo sát phản ứng PCR ứng dụng rộng rãi y học : chẩn đoán bệnh ung thư (tìm HPV ung thư cổ tử cung, gen APC ung thư đại tràng, gen BRC1 – BRCA2 ung thư vú, gen TPMT bệnh bạch cầu trẻ em, gen NF-1,2 u xơ thần kinh…), nghiên cứu kháng nguyên bạch cầu người… Trong vi sinh vật PCR phương tiên hưu dụng để phát tác nhân gây bệnh ểu II Sự phát triển test kit: Phát nhiều dấu ấn sinh học xét nghiệm chẩn đoán bệnh mầm bệnh Xét nghiệm miễn dịch phát triển Những công ty dược bán mua cơng ty chẩn đốn, hơp thành đối thủ lớn Công nghệ PCR sử dụng nhiệt Tag polymerase enzyme để khuếch đại đoạn DNA, cơng cụ nghiên cứu cơng nghệ sinh học phát triển toàn giới Ra sản phẩm microarray FDA phê chuẩn việc bán thuốc thử cần phân tích cho phịng thí nghiệm ủy quyền Hồn thành cơng trình nghiên cứu gen người Phịng thí nghiệm tự động, cơng nghệ microaray tăng, thương mại hóa Khởi động đề án đồ haplotype (SNPs)(dự án HAPMAP) FDA tổng hợp hướng dẫn để sử dụng markers sinh học thử nghiệm lâm sàng ận lu 1960s and earlier 1980’s to 1990’s ực th 2003 hệ 2002 ng 2000 ng 1991 1997 Cô 1983 ẩm ph Biểu đồ phát triển thị trường chẩn đốn ống nghiệm (IDV) tồn cầu năm 2012, tỉ lệ nhu cầu cầu chẩn đoán (theo Genetic Engineering News) Ti ểu ận lu ng Cô hệ ng th ực Top 10 công ty IVD (in vitro diagnostics) có doanh thu lớn năm 2007(theo top 10 Global In-vitro Diagnostics Business Insights) ẩm ph III Cơ chế chẩn đoán miễn dịch: Bản chất kết hợp kháng nguyên kháng thể: Sự kết hợp kháng nguyên kháng thể phụ thuộc vào cấu trúc bề mặt kháng nguyên kháng thể Sự kết hợp xảy phần giwois hạn phần tử kháng nguyên (nhóm định) phần giới hạn phần tử kháng thể (trung tâm hoạt động) Theo Pauling, phẩn tử kháng thể thường hóa tri hai, nghĩa lúc kết hợp với hai phần tử kháng nguyên Cịn kháng ngun đa hóa trị nên lúc kết hợp với nhiều phần tử kháng thể Cho nên kháng nguyên kháng thể kết hợp với tạo thành phức hợp hình mạng lưới khong gian ba chiều Vì kích thước q lớn nên phức hợp kết tủa ngưng kết Kháng nguyên kháng thể kết hợp với theo tỉ lệ phản ứng yếu thừa hoăc thiếu kháng nguyên kháng thể Phản ứng rõ rệt lúc số phân tử kháng nguyên tương đương với phân tử kháng thể 8 Ti ểu ận lu ng Cô Sự kết hợp phần tử kháng nguyên kháng thể xảy nhờ lực như: lực liên kết ion nguyên tử nhóm hóa học mang điện tích trái dấu; lực liên kết cầu nối hydro nguyên tử hydro mang điện tích dương với nguyên tử mang điện tích âm, lực Van der Walls hai phân tử phụ thuôc vào tương tác đám mây điện tử mặt lực ố thủy diện tiếp xúc phía kháng nguyên kháng thể có acid amine ố thủy kháng nguyên kháng thể kết hợp, nước bị đẩy tạo nên lưc gắn kết acid amine ố thủy đó, kết hợp khơng phải phản ứng hóa học Phản ứng kết hợp kháng nguyên kháng thể đặc hiệu Một kháng nguyên kết hợp với kháng thể kích thích thể tạo thành Do phản ứng kết hợp kháng nguyên kháng thể sử dụng để xác định kháng nguyên kháng thể hai phân tử biết Hiệu giá kháng thể huyết thành người động vật xác định nhờ kháng nguyên biết cho biết tiếp xúc trước với kháng nguyên Ngược lại nhờ kháng thể biết kháng nguyên khác vi sinh vật nhận mặt Mặt khác hiểu biết cấu tạo kháng nguyên cho phép lựa chọn thích đáng vi sinh vật dùng để làm vaccine phòng ngừa bệnh nhiễm trùng hệ ng ực th ẩm ph Phương pháp ELISA: ELISA (Enzyme – Linked ImmunoSorbent Assay) kỹ thuật sinh hóa dùng để phát kháng thể hay kháng nguyên mẫ cần phân tích Hiện ELISA sử dụng rộng rãi nhiều lĩnh vực nghiên cứu y học, nơng nghiệp đặc biệt quy trình kiểm tra an toàn chất lượng sản phẩm thực phẩm Nguyên tắc: Phương pháp ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay- xét nghiệm hấp thụ miễn dịch liên kết với enzyme) có nhiều dạng mà đặc điểm chung dựa kết hợp đặc hiệu kháng nguyên kháng thể, kháng thể gắn với enzyme Khi cho thêm chất thích hợp (thường nitrophenol phosphate) vào phản ứng, enzyme thủy phân chất thành chất có màu Sự xuất màu chứng tỏ xảy phản ứng đặc hiệu kháng thể với kháng nguyên thông qua cường độ màu mà biết nồng độ kháng nguyên hay kháng thể cần phát Phương pháp thiết kế cho việc phát định lượng vật chất peptides, protein, antibodies, hormone,… Đơi cịn gọi tên gọi khác EIA (Enzyme ImmunoAssay) Ti Kĩ thuật nhạy đơn giản, cho phép ta xác định kháng nguyên kháng thể nồng độ thấp (khoảng 0,1 ng/ml) So với kĩ thuật miễn dịch phóng xạ (RIA- Radio Immuno Assay) kĩ thuật rẻ tiền an tồn mà đảm bảo độ xác ELISA dùng để xác định nhiều tác nhân gây bệnh virus, vi khuẩn, nấm, kí sinh ểu lu ận Kĩ thuật ELISA gồm ba thành phần tham gia phản ứng là: kháng nguyên, kháng thể chất tạo màu; thực qua hai bước: ng Cô - Phản ứng miễn dịch học: Là kết hợp kháng ngun kháng thể - Phản ứng hóa học: Thơng qua hoạt tính xúc tác enzyme làm giải phóng oxy nguyên tử [O] từ H2O2 để oxy hóa chất thị màu, làm thay đổi màu hỗn hợp dung dịch thí nghiệm   hệ ng ực th ẩm ph (Trích  từ Chemicon International) 10 Phân loại ELISA: 3.1 Direct ELISA (ELISA trực tiếp)  Direct ELISA: Đây dạng đơn giản phương pháp ELISA Trong đó, kháng nguyên cần phát gắn trực tiếp lên bề mặt giá thể phát kháng thể (kháng thể gắn enzyme) Ti ểu ận lu ng Cơ hệ ng Sơ đồ: Tiến trình thực phản ứng ELISA trực tiếp ực th - Ưu điểm: Đơn giản - Nhược điểm: + Độ đặc hiệu bị giới hạn thường kháng ngun có epitope (trình diện kháng nguyên) mà phương pháp sử dụng kháng thể gắn vào epitope + Phải đánh dấu cho kháng thể chuyên biệt với đối tượng 3.2 ELISA gián tiếp ph ẩm  Indirect ELISA: Phương pháp khác Direct ELISA chỗ kháng thể bắt kháng nguyên không gắn enzyme mà mục tiêu gắn đặc hiệu kháng thể khác (kháng thể kháng thể gắn với enzyme)    11 Ti ểu ận lu Sơ đồ : Tiến trình thực phản ứng ELISA gián tiếp Cô ng - Ưu điểm: Kháng thể gắn enzyme sử dụng để đánh dấu cho nhiều loại kháng nguyên nên tiện lợi kinh tế hơn, dễ dàng thương mại hóa - Nhược điểm: Độ đặc hiệu kháng huyết khác Điều dẫn đến kết khác thí nghiệm cần phải thử nghiệm với nhiều kháng huyết khác để kết tin tưởng hệ ng 3.3. Sandwich ELISA ực th Đây dạng ELISA sử dụng phổ biến thực tiễn cho phản ứng mạnh nhạy Được gọi “sandwich” kết thí nghiệm đánh giá thơng qua kết hợp hai loại kháng thể kháng thể bắt (capture antibodies) kháng thể phát (detection antibodies).  Kỹ thuật phân làm hai dạng Direct sandwich ELISA (DAS-ELISA - Double antibody sandwich) Indirect sandwich ELISA (TAS-ELISA – Triple antibody sandwich) ph ẩm DAS ELISA gồm dính thụ động kháng thể vào pha rắn (đáy giếng) Những kháng thể sau kết hợp với kháng nguyên thêm vào Những kháng nguyên pha loãng blocking buffer nhằm ngăn dính khơng chun biệt chúng vào pha rắn Ở đây, phần blocking buffer không nên chứa kháng nguyên mà kết hợp với kháng thể bắt Sau ủ rửa, phức hợp kháng nguyên - kháng thể dính vào pha rắn  Kháng thể bắt sau thêm vào Do vậy, kết hợp trực tiếp với kháng nguyên đích kháng thể bắt Kháng thể thứ hai giống kháng thể khác nguồn động vật hay loài động vật sản xuất kháng thể Sau ủ, rửa, thêm chất vào đọc máy đo quang phổ Vì sử dụng kháng thể gắn kết với enzyme nên hệ thống bị giới hạn tính chuyên biệt thành phần gắn liền với kháng thể chuyên biệt Điều giới 12 hạn linh hoạt phương pháp, ví dụ kháng thể sử dụng phải đánh dấu riêng (cho kháng nguyên khác nhau) Theo cách này, direct ELISA bị giới hạn chuẩn bị kháng thể Hệ thống bị giới hạn chỗ kháng ngun phải có hai epitope hai kháng thể bắt phát kết hợp trực tiếp với kháng nguyên Ti Kháng thể bắt pha rắn kháng thể phát chống lại epitope khác phức hợp kháng nguyên Do đó, thuận lợi khảo sát khác biệt nhỏ kháng nguyên sử dụng kháng thể phát kháng thể bắt khác Việc sử dụng kháng thể bắt phát dẫn đến vấn đề có giới hạn vị trí gắn kết sẵn có cho phát Kích thước mối quan hệ khơng gian epitope kháng nguyên đích quan trọng ảnh hưởng mạnh đến thử nghiệm ểu lu Sandwich ELISA chia làm hai hệ thống: ận 3.3.1 Sandwich ELISA trực tiếp ng Cô hệ ng ực th ph Sơ đồ :Tiến trình thực ELISA Sandwich trực tiếp ẩm - Ưu điểm: Có thể phát khác biệt nhỏ kháng nguyên sử dụng kháng thể bắt kháng thể phát khác - Vì phương pháp có ưu điểm hẳn phương pháp khác mà chọn phương pháp để chẩn đoán bệnh virus nghiên cứu Chú ý: sử dụng kháng thể bắt kháng thể phát giống dẫn đến vấn đề có giới hạn vị trí kết hợp sẵn có để phát Mối quan hệ kích thước vị trí khơng gian epitope có ảnh hưởng đến thử nghiệm 13 3.3.2 Sandwich ELISA gián tiếp   Ti ểu ận lu ng Cô Sơ đồ: Tiến trình thực phản ứng ELISA Sandwich gián tiếp hệ 3.4 Phản ứng ức chế /cạnh tranh ng Chuyên biệt Direct sanwich ELISA antispecies kháng thể gắn enzyme không phản ứng với kháng thể bắt kháng nguyên ực th Phản ứng cạnh tranh mang nghĩa hai chất tham gia phản ứng lực bắt cặp với chất thứ ba Phản ứng cạnh tranh đắn hai chất cạnh tranh phải đưa vào đồng thời ẩm ph Sự khác biệt ức chế cạnh tranh Cả hai phản ứng có tham gia hai kháng thể phản ứng với kháng nguyên Nếu kháng thể ủ trước phản ứng gọi ức chế (blocking/ inhibition assays) Phản ứng cạnh tranh mang nghĩa hai kháng thể thêm vàođồng thời với (hình 1) 14 Ti ểu ận lu ng Cô ng hệ Sự khác biệt ức chế cạnh tranh 3.4.1 Direct C-Elisa: Kiểm tra kháng nguyên ực th Trong hệ thống trực tiếp, lượng kháng nguyên bề mặt đĩa lượng kháng thể gắn enzyme chuẩn độ để tối ưu Kháng nguyên kháng thể gắn enzyme thêm vào đĩa lúc để tạo ưu cạnh tranh ẩm ph Nếu kháng nguyên tương tự kháng nguyên gắn đĩa kháng thể gắn enzyme gắn lên kháng nguyên Khi nồng độ kháng nguyên cạnh tranh cao ngăn cản kết hợp kháng thể gắn enzyme với kháng nguyên bề mặt đĩa (cạnh tranh 100%) Nếu nồng độ kháng nguyên cạnh tranh giảm (ví dụ : pha loãng) cạnh tranh giảm Như nồng độ kháng nguyên cạnh tranh cao độ hấp thu màu giảm Kháng nguyên cạnh tranh thêm trực tiếp vào đĩa pha loãng blocking buffer trước thêm kháng thể gắn enzyme Mức độ cạnh tranh theo thời gian phụ thuộc vào mối tương quan nồng độ phân tử cần kiểm tra kháng nguyên bề mặt đĩa (và mức độ tương đồng kháng nguyên) 15 Sau ủ rửa, lượng kháng thể đánh dấu định lượng sau thêm chất khơng có kháng ngun mẫu kiểm tra hay khơng có tương đồng kháng ngun khơng có gắn kết với kháng nguyên đánh dấu khơng có cạnh tranh với kháng ngun Kết mẫu có chứa kháng ngun cạnh tranh làm giảm cường độ màu đối chứng âm khơng Ti ểu ận lu ng Cơ hệ ng ực th ẩm ph Sơ đồ : Direct C-ELISA kiểm tra kháng nguyên 16 3.4.2. Direct C-Elisa: Kiểm tra kháng thể Direct C-ELISA kiểm tra kháng thể tương tự với Direct C-ELISA kiểm tra kháng thể Sự cạnh tranh kháng thể mẫu kháng thể đánh với vị trí kháng nguyên đĩa Mẫu kháng thể đánh dấu trộn với trước thêm vào đĩa Ti ểu ận lu ng Cô hệ ng ực th ẩm ph Sơ đồ : Direct C-ELISA kiểm tra kháng thể 4. Các yếu tố ảnh hưởng đến kết ELISA   Nếu đối chứng âm cho kết dương tính nhiễm từ chất tạo màu từ kháng thể đánh dấu đối chứng bị nhiễm 17     Nếu màu không xuất đối chứng dương mẫu phải kiểm tra lại tất hố chất bao gồm: hạn sử dụng, nồng độ, điều kiện bảo quản Nếu màu xuất thấp đối chứng dương mẫu kiểm tra phải kiểm tra lại kháng thể gắn enzyme nồng độ chất tạo màu Nếu có tạo màu mẫu khơng tạo màu với đối chứng dương kiểm tra lại nguồn gốc đối chứng, hạn sử dụng điều kiện bảo quản Khi chạy lại thử nghiệm điều kiện gặp cố nên thay đổi yếu tố thí nghiệm Ti ểu  Kỹ thuật sắc kỹ miễn dịch: nhiều test kit bệnh dấu hiệu người hều hết phương pháp Nguyên tắc: Phức hợp kháng kháng thể (KKT) gắn chất màu phân bố giấy sắc ký Kháng nguyên (KN) đặc thù vi sinh vật gắn cố định “vạch phản ứng” Khi nhỏ huyết cần xác định kháng thể (KT) lên sắc ký, KT đặc hiệu (nếu có) huyết kết hợp với KKT gắn màu, phức hợp miễn dịch KT-KKT gắn màu di chuyển giấy sắc ký bị giữ lại “vạch phản ứng” KT kết hợp với KN vi sinh vật, kết “vạch phản ứng” màu Nếu huyết khơng có KT đặc hiệu, “vạch phản ứng” KN giữ KKT gắn màu, khơng màu Giới thiệu test kit xét nghiệm chẩn đoán viêm gan B (HbsAg) phương pháp sắc ký miễn dịch: + Nguyên lý: Kit thử chẩn đoán Viêm gan B (HBsAg) dụng cụ xét nghiệm sắc ký miễn dịch định tính phương pháp dòng chảy chiều để phát có mặt kháng nguyên vi rút Viêm gan B huyết huyết tương Màng kit thử phủ lớp kháng thể kháng HBsAg vùng kết Trong trình làm xét nghiệm, mẫu huyết huyết tương phản ứng với phần tử mang theo kháng thể kháng HBsAg Hỗn hợp tạo thành thấm theo màng di chuyển hướng lên nhờ mao dẫn, gặp phản ứng kết tủa màu với kháng thể kháng HBsAg lớp màng tạo vạch màu Sự có mặt vạch màu vùng kết kit thử cho biết kết dương tính, ngược lại trường hợp khơng có vạch màu kết âm tính Nhằm mục đích kiểm tra quy trình thao tác xét nghiệm, vạch màu ln ln xuất vùng chứng (gọi vạch chứng) để khẳng định lượng mẫu đủ lớp màng thấm tốt ận lu ng Cô hệ ng ực th ph ẩm + Kết quả:  Dương tính: xuất hai vạch đỏ rõ rệt: vùng chứng gọi là vạch chứng (C), vạch vùng kết gọi là vạch kết quả (T) Lưu ý: độ đậm màu đỏ của vạch kết quả (T) khác phụ thuộc vào nồng độ HBsAg có mẫu phẩm Vì vậy, độ mờ vạch kết quả (T) coi dương tính 18 Ti  Âm tính: xuất một vạch chứng (C) Không thấy xuất hiện vạch kết quả (T) dù đậm hay mờ  Kết qủa khơng có giá trị: khơng thấy xuất hiện vạch chứng (C) Nguyên nhân thường gặp lượng mẫu phẩm không đủ thao tác xét nghiệm sai Đọc lại hướng dẫn làm lại xét nghiệm kit thử khác Nếu tình trạng cũ, liên lạc với đại lý phân phối để giải đáp  Giới thiệu test kit chẩn đoán HIV : + Nguyên lý: dựa nguyên tắc thử nghiệm sắc ký miễn dịch in vitro để xác định định tính kháng thể kháng HIV tuýp huyết thanh, huyết tương máu toàn phần người Khi thêm mẫu thử mẫu pha loãng vào “sample pad”, mẫu di chuyển đến “conjugate pad” tái hỗn dịch với phức hợp kháng nguyên HIV tuýp - vàng cộng hợp làm khô “conjugate pad” Hỗn hợp di chuyển dọc theo màng tượng mao dẫn phản ứng với kháng nguyên HIV tuýp giữ cố định vùng phản ứng (ký hiệu T) Nếu kháng thể kháng HIV có mặt đủ mẫu thử, vạch màu vùng T xuất Nếu khơng có kháng thể kháng HIV không đủ mẫu thử vùng T khơng màu Mẫu thử tiếp tục di chuyển đến vùng chứng (ký hiệu C) tạo thành vạch có màu đỏ tím, cho thấy thử nghiệm tiến hành đúng, thích hợp kết có giá trị.  ểu ận lu ng Cô hệ ng ực th ẩm ph + Kết quả: âm tính: Nếu có vạch xuất vùng C Dương tính: Nếu xuất vạch vùng C vùng T (1 2) chứng tỏ thử nghiệm dương tính 19 Khơng có giá trị chẩn đốn: Vùng C khơng xuất vạch cửa sổ kết sau tiến hành thử nghiệm, thử nghiệm xem khơng có giá trị Ngun nhân bước tiến hành khơng que thử bị hư Khuyến cáo thử nghiệm lại mẫu que thử IV Cơ chế chẩn đoán phân tử: Kỹ thuật PCR: Ti ểu ận lu ng Cô hệ ng Phương pháp PCR (polymerase chain reaction) phương pháp khuếch đai nhanh nhiều đoạn DNA mà khơng qua tạo dịng Phương pháp thực eppendoff thời gian ngắn ta có thê thu nhiều DNA Kỹ thuật ứng dụng nhiều lĩnh vực : chẩn đoán, xét nghiệm tác nhân vi sinh gây bệnh, giải mã di truyền, tạo giống đột biến định hướng, nghiên cứu tiến hóa sinh vật mức độ phân tử… Nói đến chẩn đốn bệnh, kỹ thuật chủ yếu dùng phịng xét nghiệm chưa thơng dụng thị trường ực th Nguyên tắc kỹ thuật PCR: tạo lượng lớn đoạn DNA đặc thù từ DNA khuôn dựa sở hoạt động DNA-polymerase để tổng hợp sợi bổ sung ph Các yếu tố để thực phản ứng PCR bao gồm: ẩm - Sợi khuôn DNA cần biết trình tự nucleotide đoạn nhỏ nằm cạnh đoạn cần nhân để thiết kế hai mồi oligonucleotide - Hai đoạn mồi ngắn để xác định điểm bắt đầu tổng hợp DNA Là tín hiệu hướng (5’ → 3’) enzyme DNA-polymerase Mồi dài khoảng 20 nucleotide nucleotide hai đầu mồi không tự kết hợp với theo nguyên tắc bổ sung - Có đầy đủ loại nucleotide dATP, dTTP, dGTP, dCTP - Môi trường đệm cung cấp ion Mg nước tinh khiết khơng có enzyme RNase DNase - Enzyme chịu nhiệt Thermus aquaticus (Taq) 20 Dung tích tổng số cho phản ứng PCR khoảng từ 20 µl đến 50µl Đặc điểm phản ứng PCR chọn lọc, nhạy nhanh Ti ểu ận lu ng Cô Quy trình kỹ thuật: Bước - Thực qúa trình biến tính DNA nhiệt hệ ng Đưa DNA vào dung dịch phản ứng (gồm thành phần cần thiết cho chép), tăng nhiệt độ dung dịch lên tới 90÷98°C, thời gian lưu tương ứng khoảng từ 30s÷1 phút Tại nhiệt độ này, phân tử DNA mạch kép bị tách (do liên kết hydrô bị đứt), tạo nên sợi đơn dùng để làm khuôn tổng hợp sợi Bước - Thực phản ứng lai th ực Sau bước 1, nhiệt độ hạ xuống từ từ nhỏ nhiệt độ Tm mồi, vào khoảng 37÷68°C thời gian lưu 30s÷1 phút Bổ sung mồi để mồi bắt cặp với sợi khn Mồi tổng hợp hóa học, có mồi ngược xi Người ta cịn dựa vào trình tự nucleotide đầu 3’ khn để tổng hợp mồi Sau bổ sung DNApolymerase để kéo dài mồi ph Bước - Tổng hợp mạch hay gọi kéo dài (extension) ẩm - Nâng nhiệt phản ứng lên 72°C vài chục giây đến phút để DNApolymerase tổng hợp sợi Trong thực tế, thời gian nhiệt độ phản ứng phụ thuộc vào sợi DNA cần khuếch đại - Kết thúc chu kỳ từ DNA kép mẹ tổng hợp sợi DNA kép Cứ vậy, phản ứng xảy 25 đến 40 chu kỳ Sau chu kỳ cuối, nhiệt độ trì 72°C khoảng từ đến 10 phút cho tất sợi đơn xoắn lại tạo nên sản phẩm PCR Sau hạ xuống 4°C để bảo quản sản phẩm - Sản phẩm PCR kiểm tra cách chạy điện di gel agarose nồng độ từ 0,8%÷2% để phát đa hình đoạn DNA đặc thù, đoạn DNA bị thay đổi tác nhân (đột biến, tái tổ hợp) Phương pháp RT-PCR (PCR ngược)