(Luận văn thạc sĩ) khảo sát đặc điểm và vai trò của chủng xạ khuẩn streptomyces dicklowii

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP HỒ CHÍ MINH -Nguyễn Hồng Minh Huy KHẢO SÁT ĐẶC ĐIỂM VÀ VAI TRÒ CỦA CHỦNG XẠ KHUẨN Streptomyces dicklowii CHUYÊN NGÀNH VI SINH VẬT LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẨN KHOA HỌC: TS TRẦN THỊ THANH Tp HCM, 2006 LỜI CÁM ƠN Trên hết, xin chân thành biết ơn sâu sắc đến Tiến sĩ TRẦN THỊ THANH, người tận tình hướng dẫn, động viên, giúp đỡ suốt thời gian làm đề tài; với tất tinh thần tình thương trách nhiệm giúp tơi hồn thành luận văn, bên cạnh tơi học hỏi nhiều kiến thức q báu nơi phương pháp nghiên cứu khoa học Tôi chân thành cám ơn thầy khoa sinh, khoa hóa - trường đại học sư phạm HCM, thầy cô môn sinh hóa - trường đại học khoa học tự nhiên, tận tình giúp đỡ tơi thời gian thực đề tài luận văn thầy cô công tác phịng thí nghiệm vi sinh - sinh hóa, phịng thí nghiệm sinh lý thực - trường đại học sư phạm HCM giúp đỡ, động viên tạo điều kiện thuận lợi suốt thời gian làm đề tài Tp HCM, tháng năm 2006 NGUYỄN HOÀNG MINH HUY MỤC LỤC Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Xạ khuẩn chất kháng sinh từ xạ khuẩn: 1.1.1 Đặc điểm hình thái sinh lý sinh hóa xạ khuẩn: 1.1.1.1 Đặc điểm hình thái 1.1.1.2 Đặc điểm sinh lý sinh hóa xạ khuẩn 1.1.2 Khả sinh chất kháng sinh xạ khuẩn: 1.1.2.1 Khái niệm chất kháng sinh 1.1.2.2 Những nghiên cứu giới nước ta kháng sinh 1.1.2.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến sinh tổng hợp chất kháng sinh 1.1.2.4 Sự hình thành đường sinh tổng hợp chất kháng sinh 1.1.2.5 Cơ chế tác động chất kháng sinh 1.1.3 Tách chiết tinh chế chất kháng sinh 1.1.3.1 Tách chiết kháng sinh từ sinh khối 1.1.3.2 Tách chiết kháng sinh từ dịch lọc 1.1.3.3 Tinh chất kháng sinh 1.2 Các nhóm chất kháng sinh có nguồn gốc từ xạ khuẩn: 1.2.1 Phân loại chất kháng sinh từ xạ khuẩn 1.2.2 Chất kháng sinh chống nấm từ xạ khuẩn 1.3 Vai trò xạ khuẩn chất kháng sinh phòng chống nấm bệnh tuyến trùng hại trồng: 1.3.1 Thực trạng bệnh hại trồng 1.3.2 Vai trò xạ khuẩn, chất kháng sinh phòng chống bệnh tuyến trùng hại trồng Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1 Vật liệu: 2.2 Phương pháp: 2.2.1 Phương pháp vi sinh vật 2.2.1.1 Phương pháp làm phòng ẩm quan sát hình thái vi thể xạ khuẩn 2.2.1.2 Phương pháp xác định hoạt tính kháng sinh – phương pháp khuếch tán thạch 2.2.1.3 Phương pháp xác định sinh khối vi sinh vật 2.2.2 Phương pháp hóa sinh 2.2.2.1 Phương pháp xác định khả phân giải hợp chất cao phân tử xạ khuẩn 2.2.2.2 Phương pháp xác định khả sinh chất kích Trang 3 3 10 10 11 13 15 16 19 21 21 22 22 22 30 31 31 40 47 52 52 52 53 53 54 54 thích sinh trưởng thực vật 2.2.3 Phương pháp hóa lý 2.2.3.1 Phương pháp khảo sát khả bền nhiệt chất kháng sinh 2.2.3.2 Phương pháp tách chiết tinh kháng sinh 2.2.3.3 Phương pháp xác định nhóm chức cấu trúc hóa học chất kháng sinh 2.2.3.4 Phương pháp xác định khả hoà tan dung môi chất kháng sinh 2.2.4 Phương pháp khác 2.2.4.1 Phương pháp tách tuyến trùng nốt sưng từ rể bị nhiễm bệnh 2.2.4.2 Phương pháp tách tuyến trùng nốt sưng khỏi đất 2.2.4.3 Phương pháp khảo sát ảnh hưởng dịch nuôi cấy xạ khuẩn lên khả nảy mầm hạt 2.2.4.4 Phương pháp khảo sát ảnh hưởng dịch nuôi cấy xạ khuẩn lên phát triển Chương 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 3.1 Nghiên cứu đặc điểm sinh học chủng xạ khuẩn Streptomyces dicklowii 3.1.1 Đặc điểm hình thái xạ khuẩn 3.1.2 Đặc điểm sinh trưởng phát triển môi trường nuôi cấy khác 3.1.3 Đặc điểm sinh lý sinh hóa xạ khuẩn 3.2 Nghiên cứu khả sinh kháng sinh chủng xạ khuẩn Streptomyces dicklowii 3.2.1 Thử họat tính kháng sinh 3.2.2 Lựa chọn mơi trường thích hợp cho việc tạo kháng sinh chủng xạ khuẩn Streptomyces dicklowii 3.3 Nghiên cứu điều kiện ảnh hưởng đến sinh tổng hợp chất kháng sinh chủng xạ khuẩn Streptomyces dicklowii 3.3.1 Ảnh hưởng pH ban đầu: 3.3.2 Ảnh hưởng chế độ thơng khí: 3.3.3 Xác định thời gian sinh kháng sinh tối ưu: 3.3.4 Ảnh hưởng nguồn hydratcacbon: 3.3.5 Ảnh hưởng nguồn nitơ: 3.4 Tách chiết tinh chất kháng sinh chủng xạ khuẩn Streptomyces dicklowii 3.4.1 Lựa chọn dung mơi thích hợp 3.4.2 Tách chiết tinh kháng sinh: 3.4.3 Tìm hiểu tính chất chất kháng sinh từ chủng xạ khuẩn Streptomyces dicklowii 55 57 57 57 60 61 61 61 62 62 62 63 63 64 66 72 72 73 76 76 78 80 83 85 89 89 92 95 3.5 Khảo sát ảnh hưởng dịch nuôi cấy chủng Streptomyces dicklowii lên tác nhân gây hại trồng 3.5.1 Khảo sát khả ức chế chất kháng sinh lên nấm bệnh hại trồng: 3.5.2 Khảo sát khả ức chế chất kháng sinh lên tuyến trùng hại trồng 3.6 Khảo sát ảnh hưởng dịch nuôi cấy chủng Streptomyces dicklowii đến hoạt động sinh lý trồng 3.6.1 Ảnh hưởng dịch nuôi cấy lên khả nảy mầm hạt: 3.6.2 Ảnh hưởng dịch nuôi cấy lên phát triển con: Chương 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 98 98 101 107 107 108 111 Ở ĐẦU Thiệt hại kinh tế bệnh điều thấy rõ: làm giảm suất trồng, giảm phẩm chất nông sản thu hoạch bảo quản, ảnh hưởng xấu đến đất trồng cấu trồng Từ kỷ 18 Anton De Bary đặt móng mơn khoa học bệnh (1853) Để khắc phục thiệt hại bệnh gây ra, người ta sử dụng nhiều biện pháp như: kỹ thuật canh tác, thuốc hóa học, … sử dụng thuốc hóa học để phòng ngừa ngăn chặn bệnh hại trồng nhiều người ưa chuộng tính dễ sử dụng, hiệu cao kết hợp với biện pháp canh tác việc phịng bệnh cho đạt hiệu lớn Tuy nhiên, sau thời gian dài sử dụng thuốc hóa học phân hóa học người ta nhận thấy chúng ảnh hưởng đến môi trường sống lớn Chúng tác động xấu đến cân sinh thái, gây ô nhiễm môi trường đất, nước làm cho người gia súc bị ngộ độc Đáng ngại hơn, số thuốc trừ sâu chậm phân hủy lưu tồn lâu đất (DDT lưu tồn 25 năm) lưu tồn lâu đất chất hoá học làm nồng độ chúng tăng dần theo thời gian Đồng thời việc sử dụng tuỳ tiện liều lượng, thời gian phun thuốc hóa học tạo nên dư lượng lớn không cho phép rau màu lương thực, gây nên vụ ngộ độc thực phẩm lớn mà người mà biết thời gian qua Để khắc phục nhược điểm thuốc hóa học bảo vệ mơi sinh, người ta tìm kiếm biện pháp phát vai trò vi sinh vật việc điều chỉnh cân sinh học hệ sinh thái Bằng biện pháp khống chế sinh học, người ta bước sản xuất nhiều chế phẩm vi sinh vật qui mô lớn sử dụng công tác phòng trừ sâu bệnh Càng ngày người ta sử dụng rộng rãi chế phẩm kháng sinh từ chủng xạ khuẩn đối kháng, mà đặc tính chất kháng sinh thoả mãn tính chất cần thiết để sử dụng bảo vệ thực vật, như: - Không gây ảnh hưởng xấu đến sinh trưởng phát triển Ở số nồng độ thích hợp chúng cịn kích thích khả nảy mầm hạt sinh trưởng - Không gây hại cho người gia súc - Có hiệu lực thời gian định ngồi mơi trường tự nhiên - Có tác dụng tiêu diệt cách có chọn lọc vi khuẩn gram dương, vi khuẩn gram âm, kháng nấm mạnh Dicklow.M.B cộng vào năm 1996 công bố patent số 5549889 lồi Streptomyces dicklowii, lồi có khả kháng nấm tuyến trùng hại trồng, thích hợp sử dụng làm vi sinh vật khống chế sinh học nông nghiệp Chúng nhận chủng Streptomyces dicklowii từ phịng thí nghiệm vi sinh trường Đại học sư phạm Tp Hồ Chí Minh, chủng xạ khuẩn nhập từ Mỹ Để tiến tới sử dụng có hiệu chủng xạ khuẩn điều kiện môi trường Việt Nam, tiến hành thực đề tài: “KHẢO SÁT ĐẶC ĐIỂM VÀ VAI TRÒ CỦA CHỦNG XẠ KHUẨN Streptomyces dicklowii” Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Xạ khuẩn chất kháng sinh từ xạ khuẩn: 1.1.1 Đặc điểm hình thái sinh lý sinh hóa xạ khuẩn: 1.1.1.1 Đặc điểm hình thái: Xạ khuẩn sống phổ biến tự nhiên đất, chúng có nhiều đặc điểm giống vi khuẩn khác với nấm mốc kích thước tế bào nhỏ, thành tế bào không chứa cenllulose hay kitin, phân chia tế bào theo kiểu vô ti (Amytoz), không phân biệt giới tính; nhiên, xạ khuẩn có đặc điểm giống nấm mốc có hệ sợi khuẩn ty phân nhánh, xạ khuẩn hệ sợi vách ngăn Sự phân hố khuẩn ty khí sinh mấu lồi xuất bề mặt sợi khuẩn ty sau mấu lồi lớn lên thành chồi, chồi phát triển dài thành sợi, cuối tạo thành hệ sợi dầy đặc Đường kính sợi khuẩn ty 0,5µm – 1,5µm (R.E Buchanan, 1998) Khuẩn ty khí sinh xạ khuẩn phát triển bên ngồi khơng khí bề mặt mơi trường rắn tạo thành khuẩn lạc xạ khuẩn; khuẩn lạc xạ khuẩn dạng hình trịn khuẩn ty phát triển theo hình phóng xạ tạo thành nhiều vịng trịn đồng tâm (xem hình 1.1), khác với khuẩn lạc nấm men, nấm mốc vi khuẩn, khuẩn lạc xạ khuẩn thường chắc, xù xì, bề mặt có mấu lồi, có nếp nhăn sần sùi Theo Procofieva Bengopxkaia (1936), cho khuẩn lạc xạ khuẩn có lớp: lớp gồm sợi bện chặt lại với nhau, lớp tương đối xốp hơn, lớp có cấu trúc tổ ong Khuẩn lạc xạ khuẩn mang màu sắc khác như: màu đỏ, màu lam, màu xám, màu tím Hình 1.1: Các dạng khuẩn lạc xạ khuẩn Các khuẩn ty mọc phía khuẩn lạc cắm sâu vào môi trường khuẩn ty chất, khuẩn ty chất có nhiệm vụ hút chất dinh dưỡng để cung cấp dinh dưỡng cho tồn thể nên cịn gọi khuẩn ty dinh dưỡng Đường kính khuẩn ty chất thay đổi từ 0,2μm – 0,3μm, khuẩn ty khơng có vách ngăn khơng bị đứt đoạn Tuỳ loại mơi trường mà khuẩn ty chất tiết môi trường số loại sắc tố có sắc tố hịa tan nước có sắc tố hịa tan dung mơi hữu Sau thời gian phát triển, đầu sợi khuẩn ty khí sinh hình thành nên sợi phân hóa gọi cuống sinh bào tử; tuỳ theo loài mà cuống sinh bào tử thẳng hay uốn cong, xoắn lị so hay xoắn ốc; chúng mọc đơn, mọc đối, mọc vòng, mọc thành chùm, số vòng xoắn cuống sinh bào tử từ – 10 vịng, đường kính vịng xoắn thay đổi từ – 7nm (xem hình 1.2) Hình 1.2: Các dạng cuống sinh bào tử xạ khuẩn Bào tử xạ khuẩn hình thành từ cuống sinh bào tử, thường có hình cầu, hình ovan, hình que … bề mặt bào tử có dạng như: dạng nhẵn (hình 1.4), dạng xù xì, dạng gai (hình 1.3), dạng tóc