Đối tượng và phạm vi áp dụng
Nguyên liệu để thu dịch chiết polyphenol: hoa hồi khô Lạng Sơn, lá bạc hà, lá chè già được trồng tại xã Hòa Phước, huyện Hòa Vang, Đà Nẵng
Da cá ngừ đại dương được thu mua tại công ty TNHH Bắc Đẩu - Đà Nẵng
Phạm vi áp dụng: Sản xuất và biến tính gelatin từ da cá ngừ đại dương ở quy mô phòng thí nghiệm.
Phương pháp nghiên cứu
- Xác định nồng độ chất khô
- Xác định độ bền gel
- Xác định khả năng tạo liên kết ngang
- Xác định hàm lượng polyphenol tổng số
- Xác định hàm lượng protein
- Xác định hàm lượng lipit
- Xử lý số liệu bằng phương pháp thống kê
Phương pháp thu nhận gelatin da cá ngừ đại dương
Phương pháp thu nhận bột thô polyphenol từ dịch chiết lá chè già bằng ethanol
Luận văn thạc sĩ Kĩ thuật Nghiên cứu
Phương pháp biến tính gelatin
Sơ đồ bố trí thí nghiệm
Bố cục của đề tài
Luận văn gồm những chương mục sau:
Chương 2: Đối tượng và phương pháp nghiên cứu Chương 3: Kết quả và thảo luận
Kết luận và kiến nghị
Luận văn thạc sĩ Kĩ thuật Nghiên cứu
TỔNG QUAN
TỔNG QUAN VỀ GELATIN
Gelatin, có nguồn gốc từ tiếng Latinh "gelatus" nghĩa là màng hay chất làm đông, đã trở nên phổ biến từ những năm 1700 Hiện nay, có nhiều cách khác nhau để định nghĩa gelatin.
Theo Ramachandran (1967), gelatin là một polypeptide có khối lượng phân tử lớn, được chiết xuất từ collagen, loại protein chính trong tế bào động vật, tồn tại trong xương, da và nội tạng.
Theo Rose (1987) cho biết, mặc dù thuật ngữ gelatin có thể được sử dụng để chỉ nhiều loại gel khác nhau, nhưng nó chủ yếu đề cập đến các hợp chất protein được chiết xuất từ collagen.
Gelatin, theo Bailey và Paul (1998), là một loại protein tinh khiết được sử dụng trong thực phẩm, được chiết xuất từ collagen đã bị phân hủy do nhiệt, có cấu trúc tương tự như protein động vật.
Theo tổ chức y khoa của Mĩ (USP - United States Pharmacopeia ,
1990), gelatin được định nghĩa như là một sản phẩm của quá trình thủy phân collagen có nguồn gốc từ da, xương của động vật [6]
Năm 1973, WHO đã đưa ra tiêu chuẩn nhận biết và độ tinh sạch của gelatin thực phẩm và xem gelatin như là một loại thực phẩm Tương tự, EC
- European Community cũng đã xếp gelatin vào thực phẩm chứ không phải là phụ gia nên gelatin không có số đăng kí của phụ gia ‘E’ [6]
Gelatin là sản phẩm được tạo ra từ collagen thông qua quá trình thủy phân bằng acid hoặc kiềm Do đó, các tính chất của gelatin phụ thuộc vào nguồn gốc, độ tuổi và loại collagen được sử dụng làm nguyên liệu.
Luận văn thạc sĩ Kĩ thuật Nghiên cứu
Phân tử gelatin bao gồm 85-90% protein, 0,5-2% muối khoáng, 8-13% nước [28]
Gelatin chứa thành phần protein với hầu hết các loại axit amin, trừ tryptophan và cystein, thường chỉ xuất hiện ở dạng vết Tỉ lệ các axit amin trong gelatin có thể thay đổi tùy thuộc vào nguyên liệu và quy trình sản xuất Các axit amin này liên kết với nhau qua liên kết peptide để tạo thành phân tử gelatin Mặc dù gelatin gần như có đầy đủ axit amin, nhưng nó không phải là một hệ protein hoàn chỉnh So với protein từ trứng hoặc sữa, gelatin được xem là một hệ protein không hoàn chỉnh và thiếu sự cân bằng.
Cấu trúc phân tử của gelatin bao gồm 18 acid amin khác nhau liên kết theo một trật tự xác định, tạo thành chuỗi polypeptide dài khoảng 1000 acid amin, hình thành cấu trúc bậc 1 Chuỗi polypeptide có chiều dài khác nhau tùy thuộc vào nguồn nguyên liệu, với một đầu là nhóm amin và đầu kia là nhóm cacboxyl Cấu trúc thường gặp của gelatin là Gly - X - Y, trong đó X chủ yếu là proline và Y là hydroxyproline Cấu trúc cơ bản của chuỗi gelatin bao gồm các acid amin như Ala, Gly, Pro, Arg, Gly và Glu.
Hình 1.1.Cấu trúc cơ bản của gelatin [41]
Luận văn thạc sĩ Kĩ thuật Nghiên cứu
Cứ 3 chuỗi polypeptide xoắn lại theo hình xoắn ốc tạo nên cấu trúc bậc 2 Cấu trúc bậc 3 được tạo thành do chuỗi xoắn đó tự xoắn quanh nó
Gelatin có cấu trúc không gian với các liên kết peptide kiểu "cộng hóa trị" tương tự như trong collagen, nhưng chưa có bằng chứng rõ ràng về sự sắp xếp lại của các thành phần hóa học khi collagen chuyển thành gelatin Phân tích nhiễu xạ tia X cho thấy gelatin có một số cấu trúc giống dạng sợi, nhưng không thể so sánh với cấu trúc dạng màng chặt chẽ của collagen.
Gelatin có thể được phân loại theo nhiều tiêu chí khác nhau, bao gồm phương pháp sản xuất, nguyên liệu và đặc tính của sản phẩm Một trong những cách phân loại cơ bản là dựa trên nguyên liệu sản xuất.
Nguyên liệu chính để sản xuất gelatin là collagen, vì vậy nguồn gốc collagen có ảnh hưởng lớn đến tính chất của sản phẩm gelatin Dựa trên nguồn gốc collagen, gelatin có thể được phân loại thành nhiều loại khác nhau.
- Gelatin có nguồn gốc động vật trên cạn
Collagen từ da và xương động vật là nguyên liệu chính để sản xuất gelatin Gelatin có chỉ số Bloom dao động từ 50-300, và chất lượng của nó phụ thuộc vào phương pháp sản xuất cũng như nguồn nguyên liệu sử dụng.
- Gelatin có nguồn gốc từ cá
Trong những năm gần đây, nguồn collagen từ cá đã thu hút sự chú ý đáng kể Mặc dù nhiều loại cá đã được nghiên cứu, chất lượng gelatin thu được vẫn chưa ổn định và đồng nhất Thành phần của gelatin có sự khác biệt nhỏ tùy thuộc vào nguồn nguyên liệu từ da và xương cá So với gelatin từ động vật, gelatin từ cá vẫn chưa đạt được chất lượng tương tự và còn hạn chế về số lượng.
Luận văn thạc sĩ Kĩ thuật Nghiên cứu ứng dụng trong sản xuất cho thấy rằng gelatin từ cá có hàm lượng proline và hydroxyproline thấp, dẫn đến nhiệt độ tạo gel thấp do số lượng liên kết hydro hình thành cũng giảm.
Bảng 1.1 Tỉ lệ và thành phần các acid amin trong gelatin cá và gelatin động vật [28]
Acid amin Tỉ lệ trên 1000 acid amin
Gelatin cá Gelatin động vật
Luận văn thạc sĩ Kĩ thuật Nghiên cứu
- Gelatin có nguồn gốc thực vật
Thực vật là nguồn nguyên liệu mới chưa được nghiên cứu nhiều như gelatin từ động vật Gelatin thực vật khác biệt hoàn toàn với gelatin động vật, vì chúng không chứa cấu trúc protein mà chủ yếu là polysaccharide có khả năng tạo gel và nhớt, dẫn đến độ bền gel thấp hơn Agar, một loại gelatin thực vật phổ biến, được sản xuất từ tảo ở Malaysia Phân loại gelatin cũng có thể dựa trên phương pháp sản xuất.
Quá trình xử lí collagen trong sản xuất gelatin có nhiều phương pháp
Xử lý nguyên liệu bằng axit với gelatin loại A giữ hàm lượng axit amin glutamic và aspartic không thay đổi so với nguyên liệu ban đầu Gelatin loại A có điểm đằng điện trong khoảng 8-9.
TỔNG QUAN TÍNH HÌNH NGHIÊN CỨU VÀ BIẾN TÍNH GELATIN
1.2.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới
Trong những năm gần đây, sự phát triển của khoa học đã thúc đẩy nghiên cứu về tính chất, đặc điểm, điều kiện thu nhận, biến tính và khả năng ứng dụng của gelatin ngày càng được chú trọng.
Năm 2003, Ilona Kołodziejska và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu biến tính gelatin từ da cá tuyết bằng enzyme transglutaminase Nghiên cứu được thực hiện với dung dịch gelatin 5%, nồng độ transglutaminase từ 0,15-0,7 mgenzymeprotein/ml, ở nhiệt độ 4-5 độ C và thời gian phản ứng là 24 giờ Gelatin thu được sau quá trình biến tính không tan chảy sau 30 phút khi đun nóng trong nước sôi.
Hình 1.3 Phản ứng giữa axit phenolic với nhóm amin phân nhánh của chuỗi polypeptide [13]
Luận văn thạc sĩ Kĩ thuật Nghiên cứu
Năm 2004, George Strauss và Suzanne M Gibson đã nghiên cứu việc biến tính gelatin bằng cách sử dụng hợp chất phenolic từ thực vật như cà phê và nước ép nho Kết quả cho thấy gelatin thu được có độ bền cơ học và khả năng chịu nhiệt cao hơn, đồng thời giảm thiểu khả năng thấm hơi nước.
Năm 2004, R.A de Carvalho và C.R.F Grosso đã nghiên cứu sự thay đổi tính chất của màng phim gelatin sau khi biến tính bằng transglutaminase, glyoxal và formaldehit Kết quả cho thấy, sau khi biến tính bằng transglutaminase, độ hòa tan của gelatin giảm và nhiệt độ nóng chảy tăng Ngoài ra, độ bền kéo của gel gelatin cũng tăng lên, trong khi sự thấm nước và độ hòa tan giảm khi gelatin được biến tính bằng formaldehit.
Năm 2007, Na Cao và cộng sự đã nghiên cứu biến tính màng phim gelatin bằng axit ferulic và axit tannic, cho thấy độ bền cơ học tối đa đạt được ở pH = 7 với axit ferulic và pH = 9 với axit tannic Sau khi biến tính, tỷ lệ phồng nở của màng phim giảm, nhưng không ảnh hưởng rõ rệt đến khả năng thấm hơi nước Đặc biệt, tính chất của màng phim biến tính bằng axit tannic cải thiện sau 90 ngày lưu trữ, trong khi màng phim biến tính bằng axit ferulic ít bị ảnh hưởng bởi thời gian lưu trữ.
Năm 2009, Tanong Aewsiri và cộng sự đã phát hiện ra rằng tính kháng oxy hóa của gelatin tăng lên, trong khi tính kỵ nước bề mặt giảm khi gelatin được biến tính bằng các hợp chất axit phenolic oxy hóa Nghiên cứu quang phổ hồng ngoại cho thấy sự xuất hiện của vòng thơm và nhóm hydroxyl trong gelatin sau khi tiến hành biến tính.
Năm 2010, Shantha Lakshmi Kosaraju và các cộng sự đã nghiên cứu quá trình biến tính gelatin bằng axit cafeic Nghiên cứu được thực hiện ở nhiệt độ 60°C, pH 9, trong thời gian 20 phút với nồng độ axit cafeic 1,5% Kết quả cho thấy sản phẩm gelatin thu được có nhiệt độ nóng chảy cao hơn và độ bền gel tốt hơn.
Năm 2010, Mingyan Yan, Bafang Li và cộng sự đã nghiên cứu tính chất
Luận văn thạc sĩ nghiên cứu về hóa lý của gel gelatin biến tính từ da cá walleye Pollock cho thấy việc sử dụng rutin và axit gallic đã cải thiện đáng kể các tính chất hóa lý của gel gelatin Cụ thể, rutin với nồng độ 8mg/g gelatin khô mang lại độ bền gel tối ưu, nâng cao khả năng ổn nhiệt và giảm thiểu sự trương nở của gelatin Trong khi đó, axit gallic không tạo ra sự thay đổi đáng kể về khả năng ổn nhiệt và trương nở của gelatin Tuy nhiên, cả hai axit này đều không ảnh hưởng nhiều đến điểm nóng chảy và khả năng tạo gel của gelatin.
Năm 2012, Hanna Staroszczyk và cộng sự đã phát hiện ra sự thay đổi cấu trúc và đặc điểm phân tử của màng phim gelatin cá tuyết khi được biến tính bằng 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC) và transglutaminase (TGase) Việc biến tính bằng EDC và TGase tạo ra các liên kết ngang trong màng phim gelatin, khiến cho cấu trúc có trật tự của nó khó khôi phục Đặc biệt, sự hình thành các liên kết cộng hóa trị từ EDC và TGase đã góp phần làm tăng nhiệt độ nóng chảy của gelatin sau khi biến tính.
Vào năm 2013, Nor Fazliyana Mohtar, Conrad O Perera và Yacine Hemar đã nghiên cứu sự biến tính hóa học của gelatin da mực và tính chất của gelatin biến tính bằng glutaraldehyde, genipin và caffeic acid Kết quả cho thấy caffeic acid mang lại hiệu quả tốt hơn genipin với độc tính thấp, đồng thời tạo ra độ bền gel cao Tuy nhiên, glutaraldehyde lại cho kết quả tốt nhất trong nghiên cứu này.
Và nhiều công trình nghiên cứu khác về gelatin cũng được công bố trong những năm gần đây
1.2.2 Tình hình nghiên cứu trong nước Ở Việt Nam, rất ít thông tin về vấn đề nghiên cứu biến tính gelatin nói chung và bằng các hợp chất phenolic nói riêng
Kết luận: Việc nghiên cứu và ứng dụng gelatin từ da cá đang thu hút sự chú ý và đầu tư cả trong nước và quốc tế, nhằm dần thay thế các nguồn gelatin truyền thống.
Luận văn thạc sĩ Kĩ thuật nghiên cứu gelatin từ heo và bò nhấn mạnh những lợi ích thiết thực của nó, trong khi gelatin từ da cá có tính chất kém hơn Điều này đã thúc đẩy nghiên cứu về biến tính gelatin da cá để cải thiện chất lượng Mặc dù quá trình biến tính gelatin chưa được nghiên cứu nhiều trong nước, nhưng trên thế giới, nghiên cứu này đã bắt đầu từ sớm với các tác nhân biến tính là hợp chất phenolic hoặc enzyme Để đa dạng hóa tác nhân biến tính và tìm kiếm nguồn tự nhiên an toàn cho thực phẩm, hợp chất polyphenol từ dịch chiết thảo mộc đang được đưa vào nghiên cứu.
TỔNG QUAN NGUYÊN LIỆU THẢO MỘC DÙNG ĐỂ CHIẾT
Cây chè, với tên khoa học là Camellia sinensis (L.) Kuntze, đã được biết đến và sử dụng từ lâu đời Nguồn gốc của chè xuất phát từ các nước Đông Nam Á, nhưng hiện nay, cây chè được trồng rộng rãi ở nhiều nơi trên thế giới.
Hình 1.4 Búp chè và lá chè già [42]
Lá chè chứa nhiều loại polyphenol, trong đó catechin là nhóm hợp chất chính và phong phú nhất Hàm lượng chất khô của các thành phần polyphenol trong lá chè được thể hiện rõ trong bảng 1.9.
Luận văn thạc sĩ Kĩ thuật Nghiên cứu
Bảng 1.5 Thành phần polyphenol trong lá chè [6]
Cây Bạc hà tên khoa học: Mentha arvensis L.; Mentha piperita L Họ:
Cây bạc hà (Lamiaceae) đã được con người sử dụng từ lâu đời Trong ngành công nghiệp, lá bạc hà là nguyên liệu quan trọng trong sản xuất bánh kẹo, rượu bia, nước giải khát, kem đánh răng và hương liệu thuốc lá Sau quá trình chưng cất, bạc hà chứa 18-24% protein thô, 8-10% đường, 49,55% lipit thô cùng với một số axit amin không thay thế, được sử dụng làm thức ăn gia súc, sản xuất nấm và làm phân bón.
Luận văn thạc sĩ Kĩ thuật Nghiên cứu
Hình 1.5 Lá bạc hà tươi và khô
Cây hồi, hay còn gọi là đại hồi, đại hồi hương, và bát giác hồi hương, có tên khoa học là Illicium verum thuộc họ hồi (Illiaceae) Quả hồi thường được nhầm lẫn với hoa hồi, có hình sao với 6-8 cánh, đôi khi nhiều hơn, đường kính trung bình từ 2,5 đến 3cm Khi tươi, quả hồi có màu xanh, nhưng khi chín sẽ chuyển sang màu nâu hồng và trở nên khô cứng Hạt bên trong quả hồi nhỏ, hình trứng, màu nâu nhạt và bóng, nằm ở giữa mỗi cánh khi quả nứt ra.
Quả hồi là một nguyên liệu quan trọng trong ẩm thực, được sử dụng để chế biến rượu khai vị và làm hương liệu cho kem đánh răng Nó không thể thiếu trong các gia vị như bột cà-ri và bột nêm ngũ vị hương, đồng thời là thành phần thiết yếu trong món phở truyền thống.
Hình 1.6 Quả hồi (hoa hồi) Luận văn thạc sĩ Kĩ thuật Nghiên cứu
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Dụng cụ và thiết bị
Dụng cụ thủy tinh trong phòng thí nghiệm bao gồm ống nghiệm, cốc thủy tinh, bình tam giác, bình định mức và ống đong Bên cạnh đó, còn có các dụng cụ hỗ trợ khác như đĩa nhôm, cốc sấy, khăn và giấy lọc.
- Nhớt kế quay (Brookfield DV-E Viscometer, Mỹ) với thang đo
Luận văn thạc sĩ Kĩ thuật Nghiên cứu
1–2×10 6 cP sử dụng để đo độ nhớt của dịch gelatin
- Tủ sấy (Memmert, Đức) dùng sấy khô dịch gelatin sau trích ly và dịch gelatin sau biến tính
Máy đo pH để bàn Mettler Toledo Inlab Expert Pro-ISM, sản xuất tại Thụy Sĩ, được sử dụng để xác định độ pH của dung dịch nước rửa da sau khi ngâm, cũng như dung dịch gelatin thành phẩm Thiết bị này còn hỗ trợ điều chỉnh pH của gelatin và polyphenol trước khi tiến hành biến tính.
- Máy đo ẩm bằng hồng ngoại (AND MX-50, Nhật) sử dụng để xác định nhanh độ ẩm của gelatin thành phẩm
- Lò nung (Barnstead Thermolyne 48000 Furnace, Mỹ), sử dụng để xác định độ tro của gelatin thành phẩm
- Xuyên kế (Sun Rheo Tex SD-700, Nhật) đểđo độ bền gel của gelatin thành phẩm
- Nhiệt kế cầm tay (Extech EA11, Mỹ)
- Máy lắc ngang (Trung Quốc)
- Tủ đông sử dụng để bảo quản da cá
- Cân điện tử (Ohaus, Mỹ)
- Bể ổn nhiệt (Trung Quốc)sử dụng để ổn định nhiệt trích ly gelatin từ da cá và nhiệt độ phản ứng
- Bộ cô quay chân không xuất xứ Thụy Sĩ dùng để cô đặc dịch gelatin nguyên liệu và dịch chiết polyphenol trước khi sấy
- Máy đo quang phổ UV – Vis Cary 60 để xác định liên kết ngang của gelatin với polyphenol
Tất cả các thiết bị và dụng cụ liên quan đều được thực hiện tại phòng thí nghiệm của Trung tâm Nghiên cứu và Chuyển giao Công nghệ thuộc Trường Cao đẳng Lương thực Thực phẩm.
Luận văn thạc sĩ Kĩ thuật Nghiên cứu
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.1 Phương pháp vật lý a Xác định độ ẩm [10]
Sử dụng máy đo ẩm bằng hồng ngoại (AND MX-50, Nhật)
Nguyên tắc: Sử dụng nhiệt để làm bay hơi nước có trong thực phẩm cho đến khi đạt được khối lượng không đổi Bằng cách cân trọng lượng thực phẩm trước và sau quá trình sấy khô, ta có thể tính toán phần trăm nước có trong thực phẩm một cách chính xác.
Tiến hành sấy mẫu đến khối lượng không đổi ở nhiệt độ 105 0 C b Xác định nồng độ chất khô [10]
Nồng độ chất khô được xác định bằng Bx kế c Xác định độ nhớt bằng nhớt kế quay
Lực cản của dung dịch nhớt tác động lên đầu trục quay ngập trong dung dịch tạo ra độ lệch cho lò xo hiệu chỉnh kết nối trục quay với bộ phận xử lý số liệu Độ nhớt của dung dịch gelatin được đo ở nhiệt độ 60°C sau khi trích ly.
Mức độ tăng độ nhớt được xác định theo công thức 2.1
(Độ nhớt gelatin sau biến tính Độ nhớt gelatin trước biến tính- 1)×100 (%) (2.1) d Xác định độ bền gel [11]
Để tiến hành, chuẩn bị dung dịch gelatin với nồng độ 6,67% bằng cách hòa gelatin vào nước cất một lần ở nhiệt độ thường trong 1 giờ, giúp gelatin hấp thụ nước và trương lên, đồng thời lắc bằng máy lắc ngang Tiếp theo, làm nóng dung dịch gelatin bằng bể cách thủy ở nhiệt độ 65°C trong một khoảng thời gian nhất định.
Trong quá trình chế biến gel, cần lắc liên tục trong 25 phút để gelatin tan hoàn toàn Sau đó, đổ dịch vào túi nilon hình trụ để tạo mẫu gel có đường kính 3 cm và để nguội ở nhiệt độ phòng trong 15 phút Tiếp theo, cho vào tủ lạnh ở nhiệt độ 10°C trong 16-18 giờ để hình thành cấu trúc gel Độ bền của gel sẽ được xác định ở nhiệt độ 10°C bằng máy Rheo Tex.
Luận văn thạc sĩ nghiên cứu về piston có đường kính 12,7 mm di chuyển với tốc độ 0,5 mm/s trên bề mặt gel Kết quả nghiên cứu xác định độ bền của gel thông qua trọng lượng cần thiết để piston xuyên qua bề mặt gel, với đơn vị tính là gam (g).
2.2.2 Phương pháp hóa lý a Xác định độ tro[10]
Tro là thành phần còn lại của thực phẩm sau khi nung cháy hết các chất hữu cơ
Hàm lượng tro ở trong mẫu được xác định bằng lò nung Barnstead Thermolyne 48000 Furnace, Mỹ
Nguyên tắc xác định phần trăm khối lượng tro trong thực phẩm là nung cháy hoàn toàn các chất hữu cơ ở nhiệt độ 550-600 độ C Sau khi nung, phần còn lại được cân để tính toán tỷ lệ phần trăm khối lượng tro Đồng thời, cần xác định độ pH của mẫu thực phẩm.
Để xác định độ pH của dung dịch, nguyên tắc sử dụng máy đo pH để bàn Mettler Toledo Inlab Expert Pro-ISM thông qua điện cực đầu thủy tinh là rất quan trọng Quá trình này đảm bảo độ chính xác và tin cậy trong việc đo lường pH.
Để xác định pH của da sau khi rửa, hãy nhúng đầu dò thủy tinh vào dung dịch nước rửa đã ngâm và bấm phím call Chờ cho đến khi số hiển thị dừng lại và tiến hành rửa, đo nhiều lần cho đến khi pH của dung dịch nước rửa đạt bằng pH của nước máy.
Để xác định độ pH của mẫu gelatin, chuẩn bị dung dịch gelatin 6,67% và đặt trong bể cách thủy ở nhiệt độ 60°C cho đến khi gelatin hoàn toàn tan Sau đó, để mẫu nguội đến nhiệt độ phòng trước khi tiến hành đo độ pH Đồng thời, xác định khả năng tạo liên kết ngang của gelatin.
Khả năng tạo liên kết ngang được xác định bằng cách đo hàm lượng nhóm amin tự do còn lại sau quá trình biến tính, theo phương pháp của Benjakul và Morrissey (1997).
Luận văn thạc sĩ Kĩ thuật Nghiên cứu
Nguyên tắc của phương pháp này là nhóm amin tự do trong dung dịch phản ứng với chất chỉ thị TNBS, tạo ra hợp chất có màu Cơ chế phản ứng được mô tả trong hình 2.1 Để xác định lượng liên kết ngang hình thành trong quá trình biến tính, cường độ màu của dung dịch được đo trước và sau khi phản ứng với TNBS bằng quang phổ kế UV-VIS tại bước sóng 420nm.
Để tiến hành thí nghiệm, 125 mẫu cần đo được pha loãng với 2 ml đệm phosphat 0.2125 M, pH 8.2, và thêm 1 ml dung dịch TNBS 0.01% Dung dịch này được trộn đều và đặt trong bể ổn nhiệt ở 50°C trong 30 phút trong bóng tối Phản ứng được kết thúc bằng cách thêm 2 ml dung dịch natri sunfit 0.1 M.
Hỗn hợp được làm nguội ở nhiệt độ phòng trong 15 ph, độ hấp thụ được đọc ở bước sóng 420 nm
Mức độ tạo liên kết ngang tính theo phần trăm được tính theo công thức 2.2
(1 − Độ hấp thụ quang của gelatin sau khi biến tính Độ hấp thụ quang của gelatin trước khi biến tính)× 100 (%) (2.2) d Xác định hàm lượng polyphenol tổng số [45]
Hàm lượng polyphenol tổng số được xác định bằng phương pháp đo màu sử dụng thuốc thử Folin-Ciocalteu
Hình 2.1 Phản ứng giữa TNBS và nhóm amin
Luận văn thạc sĩ Kĩ thuật Nghiên cứu
Thuốc thử Folin-Ciocalteu chứa axit photpho-vonframic, hoạt động như một chất oxi hóa, phản ứng với các nhóm hydroxyl phenol để tạo ra màu xanh của vonfarm và molypden Cường độ màu được đo tại bước sóng hấp thụ cực đại 765 nm, với axit galic được sử dụng làm chất chuẩn (Thông tin chi tiết về đường chuẩn axit galic có thể tham khảo ở phụ lục…)
Để thực hiện quá trình chiết xuất, cân 2 g chất khô nguyên liệu và hòa tan với 40 ml dung môi ethanol 72,5% theo tỉ lệ 1:20 Dịch chiết thu được cần được pha loãng đến nồng độ thích hợp Tiếp theo, trộn 1 ml dịch chiết đã pha loãng với 5 ml thuốc thử Folin-Ciocalteu và để yên trong khoảng 3-8 phút Sau đó, thêm 4 ml Na2CO3, đậy nắp và lắc đều, để ở nhiệt độ phòng trong 60 phút trước khi đo độ hấp thụ tại bước sóng 765 nm.
Hàm lượng polyphenol tổng số được tính theo phần trăm khối lượng chất khô theo công thức 2.3
𝑚 𝑐𝑘 ∗ 100% (2.3) Trong đó: w: hàm lượng polyphenol tổng số (%) mg: khối lượng polyphenol theo phương trỡnh đường chuẩn (àg/ml)
V: thể tích dịch chiết (ml) d: độ pha loãng mck: khối lượng chất khô của nguyên liệu (g)
2.2.3 Phương pháp hóa sinh a Xác định hàm lượng protein [22]
Phương pháp xác định hàm lượng Nitơ tổng số và protein thô trong thực phẩm được thực hiện theo phương pháp Kjeldahl
Chỉ tiêu protein của gelatin thành phẩm được gửi mẫu thực hiện tại Viện năng suất chất lượng Deming – Phương pháp thử theo TCVN 3705-90
Luận văn thạc sĩ Kĩ thuật Nghiên cứu b Xác định hàm lượng lipit [23]
Phương pháp xác định hàm lượng chất béo tổng số trong thực phẩm được thực hiện theo phương pháp chiết Soxhlet
Nguyên tắc: Mẫu được xử lý với axit HCl 8M và sau đó thêm ethanol 95% vào, chất béo giải phóng được trích ly bởi hỗn hợp Diethyl eter và
Petroleum ether Làm bay hơi dung môi và lượng chất béo còn lại được xác định bằng cách cân
Chỉ tiêu lipit tổng số của gelatin thành phẩm được gửi mẫu thực hiện tại Viện năng suất chất lượng Deming – Phương pháp thử theo TCVN 3703 :
Xử lý số liệu bằng phương pháp thống kê
Thống kê số liệu và biểu diễn số liệu thống kê bằng công cụ Microsoft Office Excel
2.2.5 Phương pháp thu nhận gelatin da cá ngừ đại dương
Gelatin da cá ngừ đại dương được thu nhận bằng phương pháp kết hợp kiềm loãng và axit [2]
Sơ đồ thu nhận được trình bày ở hình 2.2 Luận văn thạc sĩ Kĩ thuật Nghiên cứu
Hình 2.2 Sơ đồ sản xuất gelatin da cá ngừ đại dương bằng phương pháp kết hợp
Da cá ngừ đại dương
Trích ly bằng nước (tỉ lệ w/v=1:3; 8h)
Lọc Luận văn thạc sĩ Kĩ thuật Nghiên cứu
Hình 2.3 Da cá Ngừ Đại Dương
Da cá sau khi thu mua được rửa sạch bằng nước đá lạnh để loại bỏ tạp chất, sau đó nhúng qua clorine Ca(OCl)2 50 ppm và đưa vào tủ cấp đông ở nhiệt độ -30 đến -20 độ C Khi cần sử dụng, lấy ra một lượng da cá vừa đủ để rã đông ở điều kiện môi trường Tiến hành loại bỏ thịt thừa, vảy, vây và xương còn sót lại bằng dao, sau đó rửa sạch bằng nước đá lạnh để giữ chất lượng da Cuối cùng, da cá được cắt thành miếng nhỏ 2-3 cm², vắt khô và chia thành các mẫu có khối lượng 250 gram mỗi mẫu.