Một số lồi rầy thu thập trên vùng trồng sắn cĩ cây bị bệnh chổi phù thuỷ tại Đồng Nai năm 2012 114 Trang 14 TRÍCH YẾU LUẬN ÁN Tên tác giả: Nguyễn Đức Thành Tên luận án: Nghiên cứu bệnh
HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM LU NGUYỄN ĐỨC THÀNH ẬN ÁN NGHIÊN CỨU BỆNH DO PHYTOPLASMA HẠI SẮN TI ẾN (Manihot esculenta Crantz) TẠI MỘT SỐ TỈNH ĐÔNG NAM BỘ SĨ H N KI TẾ LUẬN ÁN TIẾN SĨ NHÀ XUẤT BẢN ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP, NĂM 2016 HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM NGUYỄN ĐỨC THÀNH LU ẬN NGHIÊN CỨU BỆNH DO PHYTOPLASMA HẠI SẮN ÁN (Manihot esculenta Crantz) TẠI MỘT SỐ TỈNH ĐÔNG NAM BỘ ẾN TI SĨ H N Mã số: 62 62 01 12 KI Chuyên ngành: BẢO VỆ THỰC VẬT TẾ Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: PGS.TS HÀ VIẾT CƢỜNG TS TRỊNH XUÂN HOẠT HÀ NỘI, NĂM 2016 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan kết nghiên cứu đƣợc trình bày luận án trung thực, khách quan chƣa dùng bảo vệ để lấy học vị Tôi xin cam đoan giúp đỡ cho việc thực luận án đƣợc cảm ơn, thơng tin trích dẫn luận án đƣợc rõ nguồn gốc Hà Nội, ngày tháng năm 2016 Tác giả luận án LU ẬN Nguyễn Đức Thành ÁN ẾN TI SĨ H N KI TẾ i LỜI CẢM ƠN Luận án có sử dụng phần kết đề tài “Nghiên cứu biện pháp phòng trừ bệnh chổi rồng bệnh thán thƣ hại sắn” Bộ Nơng nghiệp PTNT cấp kinh phí thực cho TS Trịnh Xuân Hoạt làm chủ nhiệm đề tài đƣợc cho phép sử dụng luận án Để hoàn thành luận án này, cố gắng thân, nhận đƣợc nhiều quan tâm, giúp đỡ nhiệt tình quý thầy, quý cô ngƣời thân Tôi xin đƣợc bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Hà Viết Cƣờng TS Trịnh Xuân Hoạt tận tình hƣớng dẫn, giúp đỡ tơi q trình thực hồn thành luận án LU ẬN Tơi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới Ban Giám đốc Học viện Nông nghiệp Việt Nam, Ban Giám đốc Viện Bảo vệ thực vật Tôi xin cảm ơn giúp đỡ nhiệt tình cán Viện Bảo vệ thực vật, Ban Quản lý đào tạo, Khoa Nông học, Trung tâm Nghiên cứu Bệnh nhiệt đới, Trung tâm Nghiên cứu thực nghiệm Nông nghiệp Hƣng Lộc ÁN ẾN TI Tôi xin trân trọng cảm ơn nhà khoa học nhiệt tình trao đổi, góp ý cho vấn đề, giải pháp, trình thực đề tài hồn thành luận án SĨ Tơi xin gửi lời cảm ơn tới cán kỹ thuật bà nông dân nhiều nơi tạo điều kiện thuận lợi cho thời gian thực đề tài Bên cạnh đó, tơi xin gửi lời tri ân tới tất ngƣời thân gia đình, ngƣời bên cạnh động viên, giúp đỡ trình học tập thực luận án N KI tháng H Hà Nội, ngày năm 2016 TẾ Tác giả luận án Nguyễn Đức Thành ii MỤC LỤC Lời cam đoan i Lời cảm ơn ii Mục lục iii Danh mục ký hiệu chữ viết tắt vi Danh mục bảng viii Danh mục hình x Trích yếu luận án xii Thesis abstract xiv PHẦN MỞ ĐẦU LU Tính cấp thiết đề tài 1.2 Mục tiêu đề tài 1.3 Đối tƣợng phạm vi nghiên cứu 1.4 Những đóng góp đề tài 1.5 Ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài ẬN 1.1 ÁN TI ẾN PHẦN TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Cây sắn 2.1.1 Lƣợc sử nguồn gốc phân loại sắn 2.1.2 Giá trị sử dụng giá trị dinh dƣỡng 2.1.3 Tình hình sản xuất sắn giới 2.1.4 Tình hình sản xuất sắn Việt Nam 2.2 Phytoplasma hại thực vật 2.2.1 Lịch sử phát phytoplasma 2.2.2 Phân loại phytoplasma 2.2.3 Tầm quan trọng phytoplasma 12 2.2.4 Đặc điểm hình thái phytoplasma 13 2.2.5 Triệu chứng bệnh phytoplasma gây 14 2.2.6 Cơ chế gây bệnh phytoplasma 14 2.2.7 Sự đa dạng phytoplasma 15 2.2.8 Lan truyền phytoplasma 16 2.2.9 Phƣơng pháp chẩn đoán phytoplasma 20 SĨ H N KI TẾ iii 5 2.2.10 Biện pháp phòng chống 26 2.3 Một số nghiên cứu bệnh phytoplasma hại sắn 27 2.4 Một số nghiên cứu bệnh phytoplasma hại thực vật Việt Nam 32 36 3.1 Vật liệu, địa điểm thời gian nghiên cứu 36 3.1.1 Vật liệu nghiên cứu 36 3.1.2 Địa điểm thời gian nghiên cứu 37 3.2 Nội dung nghiên cứu 37 3.2.1 Điều tra mức độ phổ biến bệnh chổi phù thuỷ hại sắn 37 3.2.2 Phát phytoplasma hại sắn kính hiển vi điện tử, nhuộm mô PCR 37 3.2.3 Định danh phân tử phân tích phả hệ phytoplasma hại sắn 38 3.2.4 Ứng dụng kỹ thuật LAMP-PCR để chẩn đoán phytoplasma nhóm 16SrII LU PHẦN VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 38 Xác định số đặc điểm sinh học bệnh chổi phù thuỷ hại sắn ÁN 3.2.5 ẬN hại sắn phytoplasma gây 38 Phƣơng pháp nghiên cứu 3.3.1 Phƣơng pháp điều tra mức độ phổ biến bệnh chổi phù thuỷ hại sắn 3.3.2 Phƣơng pháp phát phytoplasma hại sắn kính hiển vi điện tử, TI 3.3 39 ẾN SĨ nhuộm mô PCR 40 KI Phƣơng pháp định danh phân tử phân tích phả hệ 3.3.4 Ứng dụng kỹ thuật LAMP-PCR để chẩn đốn phytoplasma nhóm 16SrII H TẾ hại sắn 3.4 46 Phƣơng pháp xác định số đặc điểm sinh học bệnh chổi phù thuỷ hại sắn phytoplasma gây 47 Phƣơng pháp tính xử lý số liệu 49 PHẦN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 4.1 44 N 3.3.3 3.3.5 39 51 Mô tả triệu chứng điều tra mức độ phổ biến bệnh chổi phù thuỷ hại sắn 51 4.1.1 Mô tả triệu chứng bệnh 51 4.1.2 Mức độ phổ biến bệnh chổi phù thuỷ hại sắn 53 4.2 Phát phytoplasma hại sắn kính hiển vi điện tử, nhuộm mô PCR 54 4.2.1 Phát phytoplasma hại sắn kính hiển vi điện tử 54 iv 4.2.2 Phát phytoplasma hại sắn nhuộm mô 57 4.2.3 Phát phytoplasma hại sắn kỹ thuật PCR 59 4.3 Định danh phân tử phân tích phả hệ phytoplasma hại sắn 65 4.3.1 Kết định danh giải trình tự sản phẩm PCR 65 4.3.2 Kết định danh kỹ thuật RFLP 75 4.3.3 Kết định danh phân tích đồng trình tự nucleotide 84 4.3.4 Phân tích phả hệ phytoplasma dựa trình tự nucleotide 86 4.4 Ứng dụng kỹ thuật LAMP-PCR để chẩn đốn phytoplasma nhóm 16SrII 96 4.4.1 Thiết kế mồi LAMP đặc hiệu phytoplasma nhóm 16SrII 96 4.4.2 Đánh giá khả phát phytoplasma mồi LAMP 4.5 Xác định số đặc điểm sinh học bệnh chổi phù thuỷ hại sắn LU hại sắn 101 ẬN 104 4.5.1 Ảnh hƣởng đất hom giống đến khả lan truyền bệnh 104 4.5.2 Khả lan truyền bệnh chổi phù thuỷ hại sắn qua ghép 108 4.5.3 Khả lan truyền bệnh chổi phù thuỷ hại sắn qua tơ hồng 109 4.5.4 Khả lan truyền bệnh phytoplasma hại sắn qua số lồi trùng 112 ÁN phytoplasma gây ẾN TI Kết luận 5.2 Kiến nghị 120 KI 5.1 120 SĨ PHẦN KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 121 N H Danh mục cơng trình cơng bố TẾ Tài liệu tham khảo Phụ lục v 122 123 141 DANH MỤC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT Ký hiệu, chữ viết tắt Diễn giải ký hiệu, nghĩa tiếng Việt/tiếng Anh cs Cộng CT Cơng thức µl Microliter A laidlawii Acholeplasma laidlawii BIP Backward internal primer (Mồi ngƣợc dòng bên trong) BLAST Basic local alignment search tool (Công cụ tìm kiếm chuỗi tƣơng đồng cục bộ) LU bp Base pair (Cặp bazơ) ẬN Candidatus Phytoplasma CRD Completely randomized design (Thiết kế hoàn toàn ngẫu nhiên) ÁN Ca Phytoplasma Cetyl trimethyl ammonium bromide DAPI 4‟,6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride DNA Deoxy nucleic acid EDTA Ethylene diamine tetraacetic acid EtOH Ethanol FAO Food and agriculture organization ẾN TI CTAB SĨ N KI H (Tổ chức Nông nghiệp Lƣơng thực Liên hiệp Quốc) Forward internal primer (Mồi xi dịng bên trong) IRPCM International research project for comparative mycoplasmology TẾ FIP (Dự án Nghiên cứu Quốc tế Mycoplasma) kb Kilo base LAMP-PCR Loop mediated isothermal amplification - PCR (Kỹ thuật nhân gen đẳng nhiệt) M esculenta Manihot esculenta ml Mililiter nm Nanometer nts Nucleotides PCR Polymerase chain reaction (Phản ứng chuỗi trùng hợp) vi RFLP Restriction fragment length polymorphism (Đa hình chiều dài đoạn cắt giới hạn) rRNA ribosomal ribonucleic acid TAE Tris-acetate acid EDTA TEM Transmission electron microscopy (Kính hiển vi điện tử truyền qua) UPGMA Unweighted pair group method with arithmetic mean (Phƣơng pháp ghép cặp mẫu dùng khoảng cách trung bình số học ngang bằng) LU ẬN ÁN ẾN TI SĨ H N KI TẾ vii DANH MỤC BẢNG STT Tên bảng Trang 2.1 Phân loại phytoplasma dựa phân tích gen 16S RNA ribosome 2.2 Thành phần nhóm trùng Hemiptera mơi giới truyền phytoplasma 17 2.3 Một số mồi PCR phát phytoplasma đƣợc công bố 23 2.4 Danh sách nhóm phytoplasma hại sắn đƣợc xác định dựa vào phân tích phân tử 32 3.1 Các cặp mồi đƣợc sử dụng để phát phytoplasma sắn 42 4.1 Mức độ phổ biến bệnh chổi phù thuỷ hại sắn điểm điều tra LU 53 4.2 Phát phytoplasma hại sắn kính hiển vi điện tử 55 4.3 Phát phytoplasma hại sắn nhuộm DAPI (năm 2014) 57 4.4 Kết PCR phát phytoplasma hại sắn dùng cặp mồi P1/P7- ẬN số tỉnh (năm 2011) ÁN Kết PCR phát phytoplasma hại sắn dùng cặp mồi P1/P7 R16mF2/R16mR1 Kết giải trình tự trực tiếp sản phẩm PCR lồng dùng cặp mồi H N Kết tìm kiếm BLAST trình tự đọc đƣợc sản phẩm PCR lồng dùng cặp mồi R16F2n/R16R2 R16mF2/R16mR1 4.9 70 Kết tìm kiếm BLAST trình tự đọc đƣợc sản phẩm PCR lồng dùng cặp mồi R16mF2/R16mR1 4.10 67 Kết giải trình tự trực tiếp sản phẩm PCR dùng cặp mồi TẾ 4.8 66 KI R16F2n/R16R2 4.7 63 SĨ 4.6 ẾN 4.5 60 TI R16F2n/R16R2 71 Danh sách mẫu phytoplasma hại sắn đƣợc đăng ký Ngân hàng Gen 74 4.11 Danh sách mẫu dùng phân tích RFLP mô 77 4.12 Mức tƣơng đồng di truyền dựa mơ hình cắt RFLP mơ vùng gen mã hóa 16S RNA ribosome mẫu phytoplasma hại sắn 4.13 83 So sánh mức đồng trình tự nucleotide vùng gen 16S RNA ribosome mẫu phytoplasma hại sắn 85 viii Đăk Tờre, Kon Rẫy, 23/02/2011 Kon Tum Chổi phù thuỷ (sắn)- Chờ thu hoạch KM94 KT-04 Đăk Tờre, Kon Rẫy, 23/02/2011 Kon Tum Đăk Tờre, Kon Rẫy, 23/02/2011 Kon Tum Sơn Nham,Sơn Hà, 24/02/2011 Quảng Ngãi Chổi phù thuỷ (sắn)- Chờ thu hoạch KM94 Chổi phù thuỷ (sắn)- Chờ thu hoạch KM94 Chổi phù thuỷ (sắn)- Chờ thu hoạch KM94 Sơn Nham,Sơn Hà, Quảng Ngãi Sơn Nham,Sơn Hà, Quảng Ngãi Sơn Nham,Sơn Hà, Quảng Ngãi Sơn Nham,Sơn Hà, Quảng Ngãi Sơn Nham,Sơn Hà, Quảng Ngãi Hƣng Thịnh, Trảng Bom, Đồng Nai Hƣng Thịnh, Trảng Bom, Đồng Nai Phú An, Bến Cát, Bình Dƣơng Phú An, Bến Cát, Bình Dƣơng Đồng Phú, Bình Phƣớc Chổi phù KM94 Chổi phù KM94 Chổi phù KM94 Chổi phù KM94 Chổi phù KM94 Chổi phù KM94 Chổi phù KM94 Chổi phù KM140 Chổi phù KM140 Chổi phù KM60 Chổi phù KM60 KT-17 QNg-01 BD-02 BP-01 BP-02 Đồng Phƣớc Phú, 03/4/2012 06/04/2012 06/04/2012 25/8/2012 Bình 25/8/2012 Trời nắng nóng Đất Củ sắn bị bệnh chổi đồi núi đá dốc Trồng phù thuỷ rải rác hộ nông Lá co nhỏ, biến vàng Thân dân Tự để hom giống gỗ màu đen Nhƣ thuỷ (sắn)- Chờ thu hoạch thuỷ (sắn)thuỷ (sắn)thuỷ (sắn)thuỷ (sắn)- Củ sắn bị bệnh chổi phù thuỷ Chờ thu hoạch Thân mọc nhiều chồi phụ Lá co nhỏ, biến vàng Chờ thu hoạch Thân mọc nhiều chồi phụ Lá co nhỏ, biến vàng Phát triển thân Lá co nhỏ, biến vàng Lõi thân có màu nâu nhạt Phátriển thân Nhƣ TẾ BD-01 03/4/2012 Lá co nhỏ, biến vàng Thân gỗ màu đen, lõi màu nâu nhạt Nhƣ H N ĐN-35 24/02/2011 thuỷ (sắn)- Chờ thu hoạch Nhƣ KI ĐN-34 24/02/2011 thuỷ (sắn)- Chờ thu hoạch Thân mọc nhiều chồi phụ Lá biến dạng, thùy lá, biến vàng Nhƣ SĨ QNg-04.1 24/02/2011 thuỷ (sắn)- Chờ thu hoạch ẾN 147 QNg-04 24/02/2011 thuỷ (sắn)- Chờ thu hoạch TI QNg-03 24/02/2011 ÁN QNg-02.1 ẬN QNg-02 LU KT-03 thuỷ (sắn)- Chờ thu hoạch Nhƣ thuỷ (sắn)- Chờ thu hoạch Nhƣ 147 Ruộng trồng sắn tập trung Không rõ nguồn gốc Không rõ nguồn hom giống sử dụng Trồng rải rác hộ nông dân Không rõ nguồn hom giống sử dụng Chổi phù thuỷ (sắn)- Chờ thu hoạch KM60 Chổi phù thuỷ (sắn)- Chờ thu hoạch KM94 07/12/2013 Chờ thu hoạch Không rõ Không rõ Chổi phù thuỷ (sắn)KM94 Chổi phù thuỷ (sắn)KM94 Chổi phù thuỷ (sắn)KM94 Chổi phù thuỷ (sắn)KM94 Chổi phù thuỷ (sắn) Chổi phù thuỷ (sắn)KM140 Chổi phù thuỷ (sắn) Chổi phù thuỷ (sắn) 9/2012 Chổi phù thuỷ (sắn) Chờ thu hoạch 2011 SCWL-01 Hƣng Lộc, Thống Nhất, Đồng Nai Hƣng Lộc, Thống Nhất, Đồng Nai Hƣng Lộc, Thống Nhất, Đồng Nai Hƣng Lộc, Thống Nhất, Đồng Nai Quảng Ngãi Phú An, Bến Cát, Bình Dƣơng Tây Ninh Tân Thành, Bà RịaVùng Tàu Cổ Tiết, Tam Nông, Phú Thọ Mậu A, Văn Yên, Yên Bái Mậu A, Văn Yên, Yên Bái Hƣng Thịnh, Trảng Bom, Đồng Nai Hƣng Thịnh, Trảng Bom, Đồng Nai Định Quán, Đồng Nai 2011 Chổi phù thuỷ (sắn)KM94 Chổi phù thuỷ (sắn)KM94 Chổi phù thuỷ đậu tƣơng Chổi phù thuỷ đậu tƣơng Trắng mía SCWL-02 Định Quán, Đồng Nai 2011 Biến vàng T7-ĐN T8-ĐN ĐT-02 2011 2011 hộ rõ sử đỏ Không rõ Không rõ DNA tổng số lƣu lại Phát triển thân Lá co nhỏ, biến vàng Lõi thân có màu nâu nhạt Khơng rõ Không rõ DNA tổng số lƣu lại Không rõ Không rõ DNA tổng số lƣu lại Lá co nhỏ, biến vàng Thân gỗ màu đen Chờ thu hoạch Lá co nhỏ, biến vàng Thân gỗ màu đen Chờ thu hoạch Lá co nhỏ, biến vàng Thân gỗ màu đen Cây hoa-đậu Cây phát búi dạng chổi phù thuỷ Lá biến dạng Cây hoa-đậu Nhƣ Cây Lá có màu trắng kem sữa Cây thấp lùn xuống Cây vƣơn lóng Gân, thịt biên vàng 148 TẾ ĐT-01 2011 Nhƣ H N YB-02 Chờ thu hoạch Chờ thu hoạch KI YB-01 Chờ thu hoạch Cây phát búi Lá co nhỏ, biến vàng Thân gỗ màu đen, lõi màu nâu nhạt Nhƣ Trồng rải rác nông dân Không Nhƣ nguồn hom giống dụng Vùng đất bazan Nhƣ SĨ T19-BRVT PhT-01 Không rõ 06/04/2012 Nhƣ ẾN 148 T17-BD T18-TN 07/12/2013 TI T20-ĐN T11-QNg 07/12/2013 ÁN T15-ĐN 07/12/2013 ẬN T14-ĐN LU Đồng Phú, Bình 25/8/2012 Phƣớc Hƣng Lộc, Thống 07/12/2013 Nhất, Đồng Nai BP-03 Không rõ nguồn hom giống sử dụng Không rõ nguồn hom giống sử dụng Không rõ nguồn hom giống sử dụng Trồng rải rác hộ nông dân Trồng rải rác hộ nông dân Trồng rải rác hộ nông dân Trồng rải rác PHỤ LỤC Một số cặp mồi sử dụng phản ứng PCR trực tiếp nhằm phát phytoplasma gây hại sắn P1/P7 M 2000 bp 1000 bp Hình Kết điện di sản phẩm PCR dùng cặp mồi P1/P7 LU M: Thang DNA 1kb (Fermentas); Từ đến 7: mẫu thử nghiệm gồm QNg-01: chổi phù thuỷ sắn Sơn Hà - Quảng Ngãi; KT-01: Kon Rẫy- Kon Tum; ĐN-01: chổi phù thuỷ sắn Trảng Bom - Đồng Nai; BD-01 chổi phù thuỷ sắn Bến Cát - Bình Dƣơng; YB-01: chổi phù thuỷ sắn Văn Yên - Yên Bái; ĐT-01: chổi phù thuỷ đậu tƣơng Trảng Bom - Đồng Nai; Sắn khỏe: Trảng Bom - Đồng Nai ẬN ÁN M SN910601/SN011119 1,8 kb ẾN TI SĨ Hình Kết điện di sản phẩm PCR dùng cặp mồi SN910601/SN011119 H N KI M: Thang DNA 1kb (Fermentas); Từ đến 7: mẫu thử nghiệm gồm QNg-01: chổi phù thuỷ sắn Sơn Hà - Quảng Ngãi; KT-01: Kon Rẫy- Kon Tum; ĐN-01: chổi phù thuỷ sắn Trảng Bom - Đồng Nai; BD-01 chổi phù thuỷ sắn Bến Cát - Bình Dƣơng; YB-01: chổi phù thuỷ sắn Văn Yên - Yên Bái; Sắn khỏe: Trảng Bom - Đồng Nai; ĐT-01: chổi phù thuỷ đậu tƣơng Trảng Bom - Đồng Nai TẾ Hình Kết điện di sản phẩm PCR dùng cặp mồi A) Phy1F/SN011119 B) P1/SN011119 M: Thang DNA 1kb (Fermentas); Từ đến 7: mẫu thử nghiệm gồm QNg-01: chổi phù thuỷ sắn Sơn Hà - Quảng Ngãi; KT-01: Kon Rẫy- Kon Tum; ĐN-01: chổi phù thuỷ sắn Trảng Bom - Đồng Nai; BD-01 chổi phù thuỷ sắn Bến Cát - Bình Dƣơng; YB-01: chổi phù thuỷ sắn Văn Yên - Yên Bái; ĐT-01: chổi phù thuỷ đậu tƣơng Trảng Bom - Đồng Nai; Sắn khỏe: Trảng Bom - Đồng Nai 149 Phy1F/P7 M 1,8 kb Hình Kết điện di sản phẩm PCR dùng cặp mồi Phy1F/P7 M: Thang DNA 1kb (Fermentas); Từ đến 7: mẫu thử nghiệm gồm QNg-01: chổi phù thuỷ sắn Sơn Hà - Quảng Ngãi; KT-01: Kon Rẫy- Kon Tum; ĐN-01: chổi phù thuỷ sắn Trảng Bom - Đồng Nai; BD-01 chổi phù thuỷ sắn Bến Cát - Bình Dƣơng; YB-01: chổi phù thuỷ sắn Văn Yên - Yên Bái; SCWL-02: biến vàng mía Định Quán- Đồng Nai; Sắn khỏe: Trảng Bom - Đồng Nai LU ẬN ÁN ẾN TI SĨ Hình Kết điện di sản phẩm PCR dùng cặp mồi Phy1F/Spacer1R H N KI M: Thang DNA 1kb (Fermentas); Từ đến 7: mẫu thử nghiệm gồm QNg-01: chổi phù thuỷ sắn Sơn Hà - Quảng Ngãi; KT-01: Kon Rẫy- Kon Tum; ĐN-01: chổi phù thuỷ sắn Trảng Bom - Đồng Nai; BD-01 chổi phù thuỷ sắn Bến Cát - Bình Dƣơng; YB-01: chổi phù thuỷ sắn Văn Yên - Yên Bái; SCWL-01: trắng mía Định Quán- Đồng Nai; Sắn khỏe: Trảng Bom - Đồng Nai TẾ Bảng Khả lan truyền bệnh chổi phù thuỷ hại sắn qua tiếp xúc học (Đồng Nai, 2013) STT Cây thí nghiệm Sắn KM94 Sắn KM937-26 Thầu dầu Dừa cạn Tỷ lệ phát bệnh (%) 0,0 0,0 0,0 0,0 Thời kỳ tiềm dục 0 0 Ghi chú: n 30 cây; (–) tức phản ứng PCR âm tính 150 Kiểm tra PCR – – – – PHỤ LỤC Danh sách mẫu phytoplasma dùng để lựa chọn vùng gen thiết kế mồi LAMP đặc hiệu nhóm 16SrII LU Bảng Danh sách 92 mẫu trình tự 16S RNA ribosome dùng để lựa chọn vùng gen thiết kế mồi LAMP đặc hiệu nhóm 16SrII STT Nhóm Mẫu* Số mẫu 16SrI I-Y-EF199549; I-D-AY265206-PaWB; I-B-M3079013 MAY; I-N-AY265205-IoWB; I-B-NC005303-OY-M; IM-AY265209-AVUT; I-L-AY180957-AV2192; I-EAY265213-BBS3; I-A-NC007716-AYWB; I-FAY265211-A-AY; I-C-AF222065-CPh; I-A-L33760-BB; I-P-AF503568-PopAY 16SrII II-A-L33765-PnWB; II-KM280680-CWBT11.QNg; II16 KM280681-CWBT18.TN; II-C-X83432-FBP; II-BU15442-WBDL; II-D-Y10096-PpM; II-KM280682CWBT19.BRVT; II-KM280679-CWBT7.DN; IIKC295285-CWB.BR02; II-KM360172-CWB.BR9.1; IIKM360171-CWB.BR7.2; II-KM360170-CWB.BR5; IIKM360169-CWB.QNg19.2; II-JQ957931-Alp4; II-FEF186827-CoP; II-E-Y16393-PEY 16SrIII III-L-EU346761-CFSD; III-J-AF147706-ChWBIII; III-P9 AF370119-DanV; III-V-GU292082-PassWB-Br4; III-MFJ226074-PPT-MT117; III-F-AF510724-MW1; III-BAF173558-CYE; III-N-GU004365-PPT-AK6; III-AJQ044393-PX11Ct1 16SrIV IV-A-AF498307-LYJ-C8; IV-B-MOU18753-LDY; IV-C3 X80117-LDT 16SrV V-C-X76560-FDC; V-D-AJ548787-FD1487; V-F6 AB689678-BltWB; V-B-AB052876-JWBG1; V-AAY197655-EY; V-E-AY197648-RusS 16SrVI VI-D-AF228053-PLLBd; VI-E-AY270156-CSVI; VI-A7 AY390261-CP; VI-B-AF190224-MC; VI-C-AF409069EY-Il1; VI-F-EF186819-CPS; VI-I-GU292081-PassWB 16SrVII VII-B-AY034608-ErWB; VII-A-AF092209-AshY; VII-C3 AY147038-ArAWB 16SrVIII VIII-A-AF086621-LufWB; VIII-A-AF086621-LufWB 16SrIX IX-C-HQ589191-NAXOS: IX-A-AF248957-PPWB; IX4 B-AF515636-CPPA4; IX-D-AF515637-AlWB 16SrX X-D-X92869-SpaWB; X-E-X76431-BAWB; X-A3 AJ542541-AP15 10 16SrXI XI-B-X76432-SCWL; XI-A-AB052873-RYD; XI-C3 X76429-BVK 11 16SrXII XII-A-AF248959-STOL11; XII-C-AJ243045-StrawLY; XII-H-JN833705-BYS57; XII-D-AB010425-JHP 12 16SrXIII XIII-A-AF248960-MPV 13 16SrXIV XIV-A-AJ550984-BGWL-C1; XIV-B-EF4444852 F.BGWL ẬN ÁN ẾN TI SĨ H N KI TẾ 151 STT Mẫu* 16SrXV 16SrXVI 16SrXVII 16SrXVIII 16SrXIX 16SrXX 16SrXXI 16SrXXII 16SrXXIII 16SrXXV 16SrXXVIII 16SrXXX 16SrXXXI 16SrXXXII Tổng XV-A-AF147708-HibWB; XV-B-HQ258882-GWB XVI-A-AY725228-SYLS XVII-A-AY725234-PBT XVIII-A-DQ174122-APPTW XIX-A-AB054986-CPC XX-JQ868449-RhCa XXI-A-AJ310849-PinP; XXI-A-AJ310849-PinP XXII-A-KF751387-LYDM178; XXII-B-JQ868442-CLYP XXIII-A-AY083605-BVGY XXV-A-AF521672-WTTW XXVIII-A-AY744945-DP XXX-A-FJ432664-SaCW XXXI-A-HQ225630SST1 XXXII-A-EU371934-MaPV LU 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 Nhóm ẬN Số mẫu 1 1 2 1 1 1 92 ÁN Các mẫu đƣợc trình bày theo thứ tự Nhóm – Nhóm phụ - Mã truy cập Ngân hàng gen-Mẫu ẾN TI SĨ H N KI TẾ 152 PHỤ LỤC Đề xuất quy trình chẩn đốn, giám định phytoplasma hại sắn LU Thu thập bảo quản mẫu bệnh a Thu thập mẫu bệnh Thu thập, chụp ảnh, mô tả triệu chứng sắn nghi ngờ nhiễm bệnh có biểu triệu chứng đặc trƣng nhƣ mọc nhiều chồi chồi thân phần thân chính; nhỏ lại, biến màu vàng nhạt, tím nhạt thô cứng, đốt thân ngắn lại, thân sắn ngả mầu thâm đen, phần lõi có màu nâu nhạt, chồi bị chết khô, nhiều bị thấp lùn lại b Xử lý bảo quản mẫu Đối với cách bảo quản tƣơi: chọn phận (lá, thân cành) có biểu triệu chứng điển hình bệnh chổi phù thuỷ đƣợc giữ ẩm giấy thấm ƣớt bọc giấy báo, bọc vải ẩm đựng vào thùng xốp Đối với cách bảo quản khô: chọn phận (lá, gân lá, thân cành) cho vào túi nilon có chứa hạt silicagel tự thị Thay hạt silicagel tự thị mẫu bảo quản khơ, giịn đƣợc Cất giữ bảo quản mẫu nhiệt độ phòng tủ lạnh sâu –20oC Chẩn đoán, giám định bệnh a Chẩn đốn Chẩn đốn bệnh kỹ thuật nhuộm mơ với DAPI (4‟,6-diamidino-2phenylindole dihydrochloride) phƣơng pháp kính hiển vi điện tử Chẩn đoán bệnh kỹ thuật LAMP-PCR b Giám định bệnh Áp dụng kỹ thuật PCR lồng cặp mồi P1/P7, R16mF2/R16mR1 R16F2n/R16R2 Phân tích kỹ thuật phân tích đa hình thơng thƣờng (RFLP) sản phẩm PCR, phân tích đa hình RFLP thực mơ trình tự nucleotide chƣơng trình pDRAW32 c Giải trình tự phân tích phả hệ Tinh sản phẩm PCR Kit theo hƣớng dẫn nhà sản xuất Gửi đọc trình tự mẫu phân tích sở nƣớc nƣớc ngồi Trình tự nucleotide đƣợc so sánh mức độ tƣơng đồng với chƣơng trình tin sinh học ClustalW2, BioEdit 7.0.0, dùng chƣơng trình trực tuyến BLAST để tìm kiếm chuỗi nucleotide tƣơng đồng có sẵn Ngân hàng Gen NCBI địa http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi Cây phả hệ đƣợc xây dựng theo phƣơng pháp Neighbor-Joining (N-J) với khoảng cách di truyền chuỗi đƣợc xác định dựa mơ hình thay Kimura tham số, giá trị thống kê kỹ thuật bootstrap (%) với 1.000 lần lặp lại MEGA 5.0 Sau đó, xác định danh tính lồi phytolasma gây hại sắn bị bệnh ẬN ÁN ẾN TI SĨ H N KI TẾ 153 PHỤ LỤC Kết xử lý thống kê 1) Tỷ lệ bệnh sắn bị bệnh chổi phù thuỷ (%) - thí nghiệm xác định khả lan truyền qua hom chậu vại, Hƣng Thịnh - Trảng Bom - Đồng Nai, năm 2012 BALANCED ANOVA FOR VARIATE TLB FILE THANHF1 19/12/** 9:07 PAGE Anh huong cua dat den kha nang lan truyen cua benh choi rong hai san - thi nghiem chau vai nha luoi (Dong Nai, nam 2012) VARIATE V003 TLB LN aye Cu chuoi ah SOURCE OF VARIATION DF LU SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= CT$ 7769.34 2589.78 181.23 0.000 * RESIDUAL 114.320 14.2900 * TOTAL (CORRECTED) 11 7883.66 716.696 TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE THANHF1 19/12/** 9:07 PAGE Anh huong cua dat den kha nang lan truyen cua benh choi rong hai san - thi nghiem chau vai nha luoi (Dong Nai, nam 2012) ẬN ÁN MEANS FOR EFFECT CT$ TLB 43.3000 0.000000 56.7000 0.000000 ẾN NOS 3 3 TI CT$ CT1 CT2 CT3 CT4 SĨ N KI SE(N= 3) 2.18251 5%LSD 8DF 7.11693 - H ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE THANHF1 19/12/** 9:07 PAGE Anh huong cua dat den kha nang lan truyen cua benh choi rong hai san - thi nghiem chau vai nha luoi (Dong Nai, nam 2012) TẾ F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL SECTION - VARIATE TLB GRAND MEAN (N= 12) NO OBS 12 25.000 STANDARD DEVIATION C OF V |CT$ SD/MEAN | BASED ON BASED ON % | TOTAL SS RESID SS | 26.771 3.7802 15.1 0.0000 154 | | | | 2) Thí nghiệm xác định khả lan truyền bệnh chổi phù thuỷ hại sắn qua tơ hồng (Đồng Nai, năm 2012) BALANCED ANOVA FOR VARIATE TLB FILE NDT 19/12/** 15:19 PAGE Kha nang lan truyen cua benh choi phu thuy hai san qua to hong(%) VARIATE V003 TLB LN ndthanhf SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= CT$ 1077.74 538.870 273.54 0.000 * RESIDUAL 11.8201 1.97001 * TOTAL (CORRECTED) 1089.56 136.195 TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE NDT 19/12/** 15:19 PAGE Kha nang lan truyen cua benh choi phu thuy hai san qua to hong(%) LU CT$ NOS 3 TLB 11.3000 26.7000 0.000000 ÁN CT1 CT2 CT3 ẬN MEANS FOR EFFECT CT$ - ẾN TI SE(N= 3) 0.810352 5%LSD 6DF 2.80314 - SĨ ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE NDT 19/12/** 15:19 PAGE Kha nang lan truyen cua benh choi phu thuy hai san qua to hong(%) KI VARIATE STANDARD DEVIATION C OF V |CT$ SD/MEAN | BASED ON BASED ON % | TOTAL SS RESID SS | 11.670 1.4036 11.1 0.0000 TẾ TLB GRAND MEAN (N= 9) NO OBS 12.667 H N F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL SECTION - 155 | | | | 3) Tỷ lệ bệnh chổi phù thuỷ sắn (%) thời điểm thu hoạch, Hƣng Thịnh - Trảng Bom Đồng Nai, tháng 12 năm 2013 BALANCED ANOVA FOR VARIATE TLB FILE THANHF7 4/12/** 9:39 PAGE Ty le benh choi rong san (%) tren 04 giong thi nghiem tai thoi diem thu hoach Hung Thinh - Trang Bom - Dong Nai thang 12/2013 VARIATE V003 TLB LN aye, Cu chuoi ah SOURCE OF VARIATION DF LU SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= GIONG$ 580.301 193.434 78.71 0.000 * RESIDUAL 19.6608 2.45760 * TOTAL (CORRECTED) 11 599.962 54.5420 TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE THANHF7 4/12/** 9:39 PAGE Ty le benh choi rong san (%) tren 04 giong thi nghiem tai thoi diem thu hoach Hung Thinh - Trang Bom - Dong Nai thang 12/2013 ẬN MEANS FOR EFFECT GIONG$ NOS 3 TLB 7.36000 19.2000 6.08000 ÁN GIONG$ KM94 KM419 SM937-26 TI ẾN SE(N= 3) 0.905097 5%LSD 8DF 2.95143 - SĨ ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE THANHF7 4/12/** 9:39 PAGE Ty le benh choi rong san (%) tren 04 giong thi nghiem tai thoi diem thu hoach Hung Thinh - Trang Bom - Dong Nai thang 12/2013 N KI H F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL SECTION - TLB GRAND MEAN (N= 12) NO OBS 12 8.1600 STANDARD DEVIATION C OF V |GIONG$ SD/MEAN | BASED ON BASED ON % | TOTAL SS RESID SS | 7.3853 1.5677 19.2 0.0000 TẾ VARIATE 156 | | | | 4) Ảnh hƣởng bệnh chổi phù thuỷ sắn đến chiều cao thời điểm thu hoạch, Hƣng Thịnh - Trảng Bom - Đồng Nai, tháng 12 năm 2013 BALANCED ANOVA FOR VARIATE CCC FILE THANHF 4/12/** 9:39 PAGE Anh huong cua benh choi rong san den chieu cao cay cua 04 giong san thi nghiem tai thoi diem thu hoach, Hung Thinh - Trang Bom - Dong Nai thang 12/2013 VARIATE V003 CCC LN aye, cu chuoi ah SOURCE OF VARIATION DF LU SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= GIONG$ 37.7048 12.5683 124.12 0.000 * RESIDUAL 116 11.7464 101262 * TOTAL (CORRECTED) 119 49.4513 415557 TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE THANHF 4/12/** 9:39 PAGE Anh huong cua benh choi rong san den chieu cao cay cua 04 giong san thi nghiem tai thoi diem thu hoach, Hung Thinh - Trang Bom - Dong Nai thang 12/2013 ẬN MEANS FOR EFFECT GIONG$ CCC 3.33067 1.78567 2.75933 2.84533 ẾN TI NOS 30 30 30 30 ÁN GIONG$ KM94 KM419 SM937-26 HL-S11 SĨ SE(N= 30) 0.580983E-01 5%LSD 116DF 0.162717 - H N KI ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE THANHF 4/12/** 9:39 PAGE Anh huong cua benh choi rong san den chieu cao cay cua 04 giong san thi nghiem tai thoi diem thu hoach, Hung Thinh - Trang Bom - Dong Nai thang 12/2013 VARIATE CCC GRAND MEAN (N= 120) NO OBS 120 2.6802 TẾ F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL SECTION - STANDARD DEVIATION C OF V |GIONG$ SD/MEAN | BASED ON BASED ON % | TOTAL SS RESID SS | 0.64464 0.31822 11.9 0.0000 157 | | | | 5) Năng suất, số thu hoạch hàm lƣợng tinh bột giống sắn thời điểm thu hoạch (Hƣng Thịnh - Trảng Bom - Đồng Nai, tháng 12 năm 2013) BALANCED ANOVA FOR VARIATE NSTL FILE TFK 7/12/** 9:34 PAGE Nang suat, ham luong tinh bot va chi so thu hoach cua 04 giong san tai thoi diem thu hoach (Hung Thinh-Trang Bom-Dong Nai, thang 12 nam 2013) VARIATE V003 NSTL anh nho em nhieu ndt LN SOURCE OF VARIATION DF LU SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= NLAI 2.16365 1.08182 0.25 0.786 CT$ 805.085 268.362 62.58 0.000 * RESIDUAL 25.7294 4.28823 * TOTAL (CORRECTED) 11 832.978 75.7253 BALANCED ANOVA FOR VARIATE NSCT FILE TFK 7/12/** 9:34 PAGE Nang suat, ham luong tinh bot va chi so thu hoach cua 04 giong san tai thoi diem thu hoach (Hung Thinh-Trang Bom-Dong Nai, thang 12 nam 2013) ẬN VARIATE V004 NSCT cu chuoi SOURCE OF VARIATION SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= NLAI 127.042 63.5212 4.12 0.075 CT$ 845.280 281.760 18.28 0.003 * RESIDUAL 92.4868 15.4145 * TOTAL (CORRECTED) 11 1064.81 96.8009 BALANCED ANOVA FOR VARIATE NSTB FILE TFK 7/12/** 9:34 PAGE Nang suat, ham luong tinh bot va chi so thu hoach cua 04 giong san tai thoi diem thu hoach (Hung Thinh-Trang Bom-Dong Nai, thang 12 nam 2013) ÁN LN DF ẾN TI SĨ LN SOURCE OF VARIATION DF H N KI VARIATE V005 NSTB ndt TẾ SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= NLAI 8.23852 4.11926 3.84 0.084 CT$ 90.7119 30.2373 28.17 0.001 * RESIDUAL 6.44142 1.07357 * TOTAL (CORRECTED) 11 105.392 9.58108 BALANCED ANOVA FOR VARIATE HLTB FILE TFK 7/12/** 9:34 PAGE Nang suat, ham luong tinh bot va chi so thu hoach cua 04 giong san tai thoi diem thu hoach (Hung Thinh-Trang Bom-Dong Nai, thang 12 nam 2013) VARIATE V006 HLTB aye, Cu Chuoi LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= NLAI 1.82000 910000 0.46 0.656 CT$ 32.9767 10.9922 5.53 0.037 * RESIDUAL 11.9333 1.98889 - 158 * TOTAL (CORRECTED) 11 46.7300 4.24818 BALANCED ANOVA FOR VARIATE CSTH FILE TFK 7/12/** 9:34 PAGE Nang suat, ham luong tinh bot va chi so thu hoach cua 04 giong san tai thoi diem thu hoach (Hung Thinh-Trang Bom-Dong Nai, thang 12 nam 2013) VARIATE V007 CSTH ndthtt7879 LN SOURCE OF VARIATION DF LU SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= NLAI 65.0964 32.5482 8.38 0.019 CT$ 135.067 45.0222 11.59 0.007 * RESIDUAL 23.3076 3.88461 * TOTAL (CORRECTED) 11 223.471 20.3155 TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE TFK 7/12/** 9:34 PAGE Nang suat, ham luong tinh bot va chi so thu hoach cua 04 giong san tai thoi diem thu hoach (Hung Thinh-Trang Bom-Dong Nai, thang 12 nam 2013) NLAI 4) 6DF NLAI NSTB 8.68750 7.40000 9.40250 HLTB 26.2000 25.8000 25.2500 1.96306 6.79055 0.518066 1.79207 0.705140 2.43919 1.03540 3.58162 CSTH 54.9700 52.1475 57.8525 SĨ NOS 4 NSCT 32.5650 28.5950 36.5650 ẾN SE(N= 5%LSD NSTL 26.8125 26.1875 27.2200 ÁN NOS 4 TI ẬN MEANS FOR EFFECT NLAI - KI H N SE(N= 4) 0.985470 5%LSD 6DF 3.40890 MEANS FOR EFFECT CT$ CT$ NOS NSTL NSCT NSTB HLTB KM94 24.8333 34.9633 8.83000 25.2667 KM419 18.2100 25.3333 6.42333 25.5000 SM937-26 23.6667 24.7100 5.88000 23.8333 HL-S11 40.2500 45.2933 12.8533 28.4000 TẾ SE(N= 5%LSD 3) 6DF CT$ KM94 KM419 SM937-26 HL-S11 1.19558 4.13570 NOS 3 3 2.26675 7.84105 0.598211 2.06931 0.814225 2.81654 CSTH 58.4867 58.0533 50.7367 52.6833 SE(N= 3) 1.13792 5%LSD 6DF 3.93626 ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE TFK 7/12/** 9:34 PAGE 159 Nang suat, ham luong tinh bot va chi so thu hoach cua 04 giong san tai thoi diem thu hoach (Hung Thinh-Trang Bom-Dong Nai, thang 12 nam 2013) F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL SECTION - VARIATE NSTL NSCT NSTB HLTB CSTH GRAND MEAN (N= 12) NO OBS 12 26.740 12 32.575 12 8.4967 12 25.750 12 54.990 STANDARD DEVIATION C OF V |NLAI SD/MEAN | BASED ON BASED ON % | TOTAL SS RESID SS | 8.7020 2.0708 7.7 0.7862 9.8387 3.9261 12.1 0.0747 3.0953 1.0361 12.2 0.0843 2.0611 1.4103 5.5 0.6564 4.5073 1.9709 3.6 0.0189 LU ẬN ÁN ẾN TI SĨ H N KI TẾ 160 |CT$ | | | 0.0002 0.0026 0.0010 0.0373 0.0073 | | | | PHỤ LỤC Một số hình ảnh thí nghiệm Điều tra, thu thập mẫu sắn bị bệnh chổi phù thuỷ đồng LU Theo dõi, thu thập rầy ruộng trồng sắn bẫy ánh sáng ẬN ÁN ẾN TI SĨ N KI Cây dừa cạn bệnh mọc từ hạt Máy điện di gel agarose Nồi hấp khử trùng đất thí nghiệm H Cây sắn bệnh mọc từ hạt TẾ 161