TỔNG QUAN
TỔNG QUAN VỀ CHI GYNOSTEMMA BLUME
1.1.1 Vị trí phân loại, đặc điểm thực vật và phân bố của chi Gynostemma Blume
1.1.1.1 Vị trí phân loại của chi Gynostemma Blume
Chi Gynostemma do nhà thực vật học Hà Lan gốc Đức Carl Ludwig Blume (1796 -
Năm 1825, nhà thực vật học Blume đã xác lập loài Gynostemma simplicifolium Blume, dựa trên mẫu vật số hiệu C L Blume 1493 (L.) thu thập tại Java, Indonesia Loài này được công bố trong tài liệu "Bijdr Flora Ned-Indonesia" số 23, 1825.
2 loài nhƣng chỉ đƣợc coi là đồng danh (synonyms) của Gynostemma Blume
Phạm Hoàng Hộ là người Việt Nam đầu tiên nghiên cứu về các loài thuộc chi Gynostemma Blume (họ Bí - Cucurbitaceae) Trong bộ sách "Cây cỏ Việt Nam" xuất bản năm 1999, ông đã ghi nhận hai loài thuộc chi này, trong đó có Gynostemma laxum.
(Wall.) Cogn và Gynostemma pentaphyllum (Thunb.) Makino) [7] Đến năm 2003, trong
Danh lục các loài thực vật Việt Nam ghi nhận rằng trong họ Cucurbitaceae, Nguyễn Hữu Hiến chỉ đề cập đến 2 loài thuộc chi Gynostemma Blume đã được các tác giả trước đó công bố tại Việt Nam.
Theo hệ thống phân loại thực vật của Takhtajan 2009 [11], có thể phân loại chi
Phân lớp Sổ (Dilleniidae) Liên bộ Hoa tím (Violanae)
Họ Bí (Cucurbitaceae) Phân họ Nhandiroboideae Tông Zanonieae
Luận án tiến sĩ Mới nhất
Một số nhà thực vật Việt Nam như Phạm Hoàng Hộ và Võ Văn Chi đã xếp chi Gynostemma Blume thuộc họ Bí (Cucurbitaceae), tương đồng với hệ thống phân loại của Takhtajan.
Chi Gynostemma Blume đƣợc chia thành hai phân chi (Subgenus), bao gồm:
(i) Subgenus Trirostellum với dạng quả nang, tự mở bằng 3 van và đƣợc chia thành 2 loại (Section) là:
(ii) Subgenus Gynostemma với dạng quả mọng, không tự mở
1.1.1.2 Đặc điểm thực vật của chi Gynostemma Blume
Theo một số tài liệu về phân loại thực vật, đặc điểm chung của các loài thuộc chi
Gynostemma Blume là một loại cây thảo lâu năm, thuộc dạng dây leo, có thể là nhẵn hoặc có lông Loài cây này thường phát triển lan rộng dưới tán cây, với rễ có thể có củ hoặc không Cành của cây Gynostemma Blume mảnh mai, có lông thưa hoặc lông mịn.
Cây có lá so le, thường có từ 3 đến 9 lá chét, hiếm khi chỉ có một lá chét, với phiến lá chét có hình trứng hoặc mác Tua cuốn của cây thường chẻ đôi và ít khi đơn Cây là đơn tính khác gốc, với hoa đơn tính được sắp xếp thành cụm hoa chùm hoặc chùy, nằm ở nách lá hoặc đầu cành Cuống hoa có khớp và lá bắc con xuất hiện ở gốc Hoa đực có ống đài ngắn.
Hoa có 5 thùy, với các mảnh hình mác hẹp và tràng màu xanh hoặc trắng, hình bánh xe Các thùy xẻ sâu, có hình mác hoặc trứng – mác, mép cuộn vào trong khi là nụ Nhị hoa có 5, đính vào gốc ống bao hoa, với chỉ nhị ngắn và hàn liền Bao phấn đứng, hình trứng, có 2 ô, nứt dọc, với hạt phấn hình cầu hoặc elip, có sọc hoặc nhẵn, tự mở bằng lỗ Nhụy hoa tiêu giảm hoàn toàn, hoa cái có đài và tràng giống hoa đực, nhị lép tồn tại Bầu hình cầu, có 2 – 5 ô, vòi nhụy thường có 3, hiếm khi 2, 4 hoặc 5, với núm nhụy 2 hoặc 1, hình lưỡi liềm hoặc xẻ răng cưa không đều Quả mọng hình cầu, giống đậu Hà Lan, hoặc quả nang có 3 thùy từ đỉnh, với đỉnh có u hoặc 3 vòi nhụy dài tồn tại Hạt có 2 hoặc 3, hình trứng rộng, dẹp, có nhú hoặc gai nhú.
Nghiên cứu về nhiễm sắc thể trong chi Gynostemma Blume cho thấy số nhiễm sắc cơ bản là 2n = 22, và có khả năng xuất hiện dạng đa bội, thường gặp là 2n = 22 và 2n = 44.
66 hoặc 88 Hiện tượng đa bội nhiễm sắc thể xuất hiện thường xuyên ở một số loài như G
Luận án tiến sĩ Mới nhất
4 longipes (2n = 22, 44), G cardiospermum (2n = 22, 66), G yixingerse (2n = 22, 88) và G pentaphyllum (2n = 22, 44, 66, 88) [14]
1.1.1.3 Phân bố của các loài thuộc chi Gynostemma Blume
Theo công bố mới nhất trên trang web [The Plant List](http://www.theplantlist.org) (15/4/2020), chi Gynostemma Blume có 19 loài được công nhận Các loài này chủ yếu phân bố ở vùng nhiệt đới châu Á và Đông Á, từ dãy Himalaya đến Nhật Bản, Malaysia và New Guinea Trung Quốc là quốc gia có nhiều loài Gynostemma nhất với 14 loài, trong đó 9 loài là đặc hữu tại miền tây nam Trung Quốc Loài G pentaphyllum (Thunb.) Makino là phổ biến nhất, phân bố rộng rãi ở nhiều quốc gia như Trung Quốc, Bangladesh, Ấn Độ, Indonesia, Nhật Bản, Hàn Quốc, Lào, Malaysia, Myanmar, Nepal, New Guinea, Sri Lanka, Thái Lan và Việt Nam.
Bảng 1.1: Danh sách các loài thuộc chi Gynostemma Blume [15]
STT Tên loài Ghi chú
1 G aggregatum C Y Wu & S K Chen Đã đƣợc chấp nhận
2 G burmanicum King ex Chakrav Đã đƣợc chấp nhận
3 G cardiospermum Cogn ex Oliv Đã đƣợc chấp nhận
4 G caulopterum S Z He Đã đƣợc chấp nhận
G cissoides (Wall.) Benth & Hook f ex Franch & Sav
5 G compressum X X Chen & D R Liang Đã đƣợc chấp nhận
6 G guangxiense X X Chen & D H Qin Đã đƣợc chấp nhận
7 G intermedium W.J.de Wilde & Duyfjes Đã đƣợc chấp nhận
8 G laxiflorum C Y Wu & S K Chen Đã đƣợc chấp nhận
9 G laxum (Wall.) Cogn Đã đƣợc chấp nhận
Luận án tiến sĩ Mới nhất
STT Tên loài Ghi chú
10 G longipes C Y Wu Đã đƣợc chấp nhận
11 G microspermum C Y Wu & S K Chen Đã đƣợc chấp nhận
12 G pallidinerve Z Zhang Đã đƣợc chấp nhận
13 G papuanum W.J.de Wilde & Duyfjes Đã đƣợc chấp nhận
14 G pentagynum Z P Wang Đã đƣợc chấp nhận
15 G pentaphyllum (Thunb.) Makino Đã đƣợc chấp nhận
G pentaphyllum f dasycarpum (C Y Wu) W.J.de Wilde &
G pentaphyllum f fasciculare W.J.de Wilde & Duyfjes
G pentaphyllum f grandiflorum W.J.de Wilde & Duyfjes
G pentaphyllum f knemandrum W.J.de Wilde & Duyfjes
G pentaphyllum f pubescens (Gagnep.) W.J.de Wilde &
G pentaphyllum f simplicifolium (Blume) W.J.de Wilde &
16 G pubescens (Gagnep.) C Y Wu Đã đƣợc chấp nhận
17 G simplicifolium Blume Đã đƣợc chấp nhận
G wightianum (Arn.) Benth & Hook.f ex B D Jacks
18 G yixingense (Z P Wang & Q Z Xie) C Y Wu & S K Chen Đã đƣợc chấp nhận
19 G zhejiangense X J Xue Đã đƣợc chấp nhận
Bảng 1.2: Danh sách các loài Gynostemma ở Trung Quốc [16]
STT Tên loài STT Tên loài
1 G pentagynum Z P Wang 9a G burmanicum var burmanicum
3 G cardiospermum Cogn ex Oliv 10 G pentaphyllum (Thunb.) Makino
Luận án tiến sĩ Mới nhất
STT Tên loài STT Tên loài
6 G laxiflorum C Y Wu & S K Chen 11 G guangxiense X X Chen & D H Qin
8 G laxum (Wall.) Cogn 13 G longipes C Y Wu
9 G burmanicum King ex Chakrav 14 G caulopterum S Z He
Bảng 1.3: Danh sách các loài Gynostemma ở Thái Lan và Malaysia [14]
STT Tên loài STT Tên loài
2 G papuanum W.J.de Wilde & Duyfjes 4.d G pentaphyllum forma knemandrum
4 G pentaphyllum (Thunb.) Makino 4.f G pentaphyllum forma pubescens
(Gagnep.) W.J de Wilde & Duyfjes 4.a G pentaphyllum forma dasycarpum
Tại Việt Nam, theo các tác giả Phạm Hoàng Hộ [7] và Võ Văn Chi [12], chi
+ G pentaphyllum (Thunb.) Makino (cổ yếm, thƣ tràng 5 lá) phân bố nhiều ở các vùng rừng núi, lùm bụi có độ cao 1.000 - 2.000 m tại nhiều tỉnh Bắc, Trung và Nam [7]
+ G laxum (Wall.) Cogn (thư tràng, cổ yếm lá bóng) thường xuất hiện ở các rừng thƣa tại Lào Cai, Hòa Bình, Ninh Bình, Quảng Trị [7], [12]
+ G pedatum Blume phân bố ở Ba Vì, Lạng Sơn, Sapa, Ninh Bình, Hòa Bình [12]
Luận án tiến sĩ Mới nhất
Nhóm nghiên cứu của Trường Đại học Dược Hà Nội đã bổ sung thêm 4 loài là G longipes C Y Wu, G burmanicum King ex Chakrav., G compresum X X Chen & D R
Liang [3] và G guangxiense X X Chen & D H Qin [17] (Bảng 1.4)
Bảng 1.4: Danh sách các loài Gynostemma ở Việt Nam [6]
STT Tên loài STT Tên loài
1 G pentaphyllum (Thunb.) Makino 3 G longipes C Y Wu
1a G pentaphyllum var pentaphyllum 4 G burmanicum King ex Chakrav
2 G laxum (Wall.) Cogn 6 G guangxiense X X Chen & D H Qin
Ngoài ra, loài G pubescens mới đƣợc tìm thấy tại Lào Cai, Việt Nam năm 2019 bởi Suleman bid và cộng sự [164]
Có sự khác biệt trong việc phân loại các loài thuộc chi này giữa các nhà nghiên cứu Trong khi Chen Shu-kun và Charles Jeffrey thường tách biệt các loài thành những đơn vị riêng lẻ, W J J O de Wilde và B E E Duyfijes lại có xu hướng gộp một số loài thành các dạng (forma) của cùng một loài.
Theo nghiên cứu của Chen Shu-kun và Charles Jeffrey, hai loài G pallidinerve Z Zhang và G zhejiangense X J Xue đã được xem là đồng nghĩa với G pentaphyllum var pentaphyllum W J J O de Wilde và B E E Duyfjes cũng ghi nhận tại khu vực Thái Lan và Malaysia có bốn loài thuộc chi Gynostemma Blume Tuy nhiên, do điều kiện sinh thái khác nhau, loài G pentaphyllum (Thunb.) Makino đã được phân chia thành bảy dạng khác nhau.
G pentaphyllum forma dasycarpum (C.Y Wu in C.Y Wu & S.K Chen) W.J de Wilde
& Duyfjes, G pentaphyllum forma fasciculare W.J de Wilde & Duyfjes,
G pentaphyllum forma grandiflorum W.J de Wilde & Duyfjes, G pentaphyllum forma knemandrum W.J de Wilde & Duyfjes, G pentaphyllum forma pentaphyllum,
G pentaphyllum forma pubescens (Gagnep.) W.J de Wilde & Duyfjes và
G pentaphyllum forma simplicifolium (Blume) W.J de Wilde & Duyfjes [14]
G pentaphyllum (Thunb.) Makino là loài cây phổ biến nhất, phân bố rải rác tại nhiều quốc gia như Ấn Độ, Nepal, Bangladesh, Srilanca, Lào, Việt Nam, Myanmar, Hàn Quốc và Nhật Bản.
Luận án tiến sĩ Mới nhất
1.1.2 Thành phần hóa học của chi Gynostemma Blume
Các loài thuộc chi Gynostemma đã được nghiên cứu sâu về thành phần hóa học trên toàn thế giới, trong đó loài G pentaphyllum nổi bật với thành phần chính là saponin, đồng thời cũng chứa các nhóm chất khác quan trọng như flavonoid, polysaccharid, chlorophyll và chất béo.
1.1.2.1 Các hợp chất thuộc nhóm saponin
The saponins found in G pentaphyllum (Appendix III) feature a dammaran framework Dammarans are a class of tetracyclic triterpenoid saponins predominantly present in species belonging to the Panax L genus within the Araliaceae family Approximately 200 saponins are identified in this context.
Giảo cổ lam (gypenosid) đã đƣợc phát hiện và tất cả đều thuộc khung dammaran (Hình
Saponin trong G pentaphyllum thường có cấu trúc đường với 1 hoặc 2 mạch, rất hiếm khi có 3 mạch Mỗi mạch đường có thể chứa 1, 2 hoặc 3 đường đơn, gắn tại các vị trí C-3(β), C-12(β), C-20(β) và C-21 của phần genin Các saponin của Giảo cổ lam chủ yếu chứa 4 loại đường pyranose: β-ᴅ-glucopyranose, β-ᴅ-xylopyranose, α-ʟ-rhamnopyranose và α-ʟ-arabinopyranose.
Hình 1.1: Khung cấu trúc dammaran thuộc nhóm saponin triterpen tetracyclic
TỔNG QUAN VỀ LOÀI GIẢO CỔ LAM QUẢ DẸT
Loài Gynostemma compressum X.X.Chen & D.R.Liang do Chen Xin Xiang
G compressum, một loài mới được xác định bởi X.X Chen và D.R Liang, đã được công bố trong tạp chí Guihaia Yanshan vào năm 1991 Loài này được phát hiện tại vùng Long Châu, tỉnh Quảng Tây, nơi cây mọc ven những khu vực ẩm ướt của núi đá vôi, ở độ cao dưới 400 m Ngoài ra, G compressum còn được người dân địa phương sử dụng làm thuốc với tên gọi "Bian guo jiao gu lan" (Giảo cổ lam quả dẹt).
Trong các tài liệu về thực vật học và cây thuốc Việt Nam trước năm 2004 [9], [10],
[7], [8] chƣa đề cập loài G compressum X.X.Chen & D.R.Liang Mãi cho đến năm 2015, trong quá trình điều tra, thu thập các loài có tên chung là Giảo cổ lam (thuộc chi
Gynostemma Blume, thuộc họ Cucurbitaceae, đã được các tác giả từ Trường Đại học Dược Hà Nội phát hiện và bổ sung vào hệ thực vật Việt Nam loài G compressum X.X Chen et al.
D.R.Liang Do đặc điểm hình thái quả của loài này dạng tam giác 3 ô, hơi dẹt theo chiều từ trên xuống nên đã gọi tên theo tiếng Việt là "Giảo cổ lam quả dẹt" [122]
1.2.1 Đặc điểm thực vật của Giảo cổ lam quả dẹt
Thân cây mảnh, có rãnh và nhẵn, với tua cuốn dạng chỉ có đỉnh thường chẻ thành hai Lá kép lông chim gồm 7 lá chét, cuống lá dài từ 5 đến 12 cm và nhẵn Mặt dưới lá chét có màu xanh lục xám, trong khi mặt trên là màu xanh lục, hình elip hoặc elip-trứng với gốc hình nêm Mép lá khía tai bèo nhỏ và đỉnh lá có mũi nhọn hoặc nhọn, mặt dưới lá rải rác lông dọc theo gân.
Luận án tiến sĩ Mới nhất
Cây có 33 lá chính và gân bên, với mặt trên phủ lông cứng Lá chét giữa có kích thước từ 3,6 - 6,5 x 2 - 2,25 cm, trong khi lá chét bên nhỏ hơn và có hình dạng không đối xứng ở phía ngoài Cuống lá chét dài từ 3 - 5 mm Cây thuộc loại đơn tính khác gốc Hoa đực xuất hiện trong cụm hoa dạng chuỳ, mọc ở nách lá, có kích thước từ 2 - 5 cm và cuống cụm hoa dạng chỉ dài 8 cm.
Hoa có kích thước 16 mm, nhẵn, với lá bắc hình giùi khoảng 1,5 mm Cuống hoa dài từ 2 - 5 mm, hoa có màu xanh lục nhạt và đường kính khoảng 1,5 mm Thuỳ đài hình tam giác có kích thước khoảng 0,8 x 0,5 mm, chỉ nhị rất ngắn và hợp sinh, bao phấn hình trứng Hoa cái thường xuất hiện đơn độc hoặc từng đôi ở nách lá, cuống cụm hoa dạng chỉ dài từ 5 - 9 mm, nhẵn; cuống hoa dài từ 5 - 10 mm Thuỳ đài có kích thước khoảng 1,3 x 0,4 mm, thuỳ tràng hình tuyến - mác dài 2 - 3 mm và rộng khoảng 0,4 mm, với đỉnh có đuôi nhọn; bầu hoa có 2 ô, mỗi ô chứa 1 noãn, vòi nhuỵ phát triển tốt.
Quả có hình dẹt, tam giác ngược, kích thước 5-8 x 5-7 mm, bề mặt nhẵn và có cuống dạng chỉ dài từ 1,3 đến 2,5 cm Hạt màu nâu nhạt, hình tam giác ngược với đường kính khoảng 3 mm và mép có khía tai bèo hoặc rãnh Thời gian ra hoa từ tháng 3 đến tháng 4, và quả xuất hiện từ tháng 3 đến tháng 5, có thể kéo dài đến tháng 9-10.
1.2.2 Sinh thái và phân bố của Giảo cổ lam quả dẹt
Nơi sống và sinh thái: Rừng, chân núi đá vôi ẩm; 350 – 1000 m [122]
Phân bố: Cao Bằng (Trà Lĩnh, Thông Nông, Bảo Lạc, Bảo Lâm) Có thể mở rộng vùng tìm kiếm loài này sang khu vực tỉnh Hà Giang, Lạng Sơn [122]
1.2.3 Thành phần hóa học của Giảo cổ lam quả dẹt
In 1993, Ding S L and Zhu Z Y isolated four new saponins named gycomosid I-IV from the above-ground parts of G compressum X.X Chen et D.R Liang The structures of these compounds were identified as follows: gycomosid I is characterized as 1β,3β,12β,20(S),26-pentahydroxydammar-24(25)-en-20(S)-O-β-ᴅ-glucopyranosyl-(1→6)-β-ᴅ-glucopyranosid; gycomosid II as 1β,3β,12β,20(S)-tetrahydroxydammar-24(25)-en-3-O-β-ᴅ-glucopyranosyl-20(S)-O-β-ᴅ-glucopyranosyl-(1→6)-β-ᴅ-glucopyranosid; gycomosid III as 1β,3β,12β,20(S),26-pentahydroxydammar-24(25)-en-20(S)-O-β-ᴅ-glucopyranosid; and gycomosid IV as 1β,3β,12β,20(S),26-pentahydroxydammar-24(25)-en-3-O-β-ᴅ-glucopyranosyl-20(S)-O-β-ᴅ-glucopyranosyl-(1→6)-β-ᴅ-glucopyranosid.
Luận án tiến sĩ Mới nhất
Hình 1.27: Các gypenosid phân lập từ loài G compressum
Luận án tiến sĩ Mới nhất
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU
Mẫu nghiên cứu này tập trung vào phần trên mặt đất của cây Giảo cổ lam quả dẹt, bao gồm các cao chiết và hợp chất tinh khiết được phân lập từ dược liệu Các mẫu cây này được thu hái tại Bắc Sơn, Lạng Sơn vào tháng 3, 4 và tháng 9, 10 năm 2018.
Năm 2019, mẫu nghiên cứu được lưu tại Khoa Hóa Thực vật – Viện Dược liệu với mã số tiêu bản NIMM0019225, cùng với Phòng Tiêu bản cây thuốc – Trường Đại học Dược Hà Nội, mang mã số HNIP/18590/19 và HNIP/18591/19 Các mẫu này được chuẩn bị một cách phù hợp để phục vụ cho từng nội dung nghiên cứu cụ thể.
Mẫu nghiên cứu thực vật: mẫu tươi, mang hoa và quả
Mẫu nghiên cứu thành phần hóa học được thực hiện từ phần trên mặt đất của cây Giảo cổ lam quả dẹt Sau khi thu hái, cây được cắt thành đoạn ngắn, phơi trong bóng râm và sấy khô ở nhiệt độ 50 o C Cuối cùng, mẫu được bảo quản trong túi PE và bao bì kín để đảm bảo chất lượng.
Mẫu nghiên cứu tác dụng sinh học: Cao chiết ethanol, nước, các cao chiết phân đoạn và một số hợp chất phân lập từ Giảo cổ lam quả dẹt
Chuột nhắt trắng chủng Swiss albino, cả 2 giống, khỏe mạnh, trọng lƣợng 22,0 ±
Chuột được nuôi theo tiêu chuẩn thí nghiệm của Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ƣơng, với trọng lượng 3,0 g Chúng được cho ăn thức ăn tiêu chuẩn và nuôi trong môi trường có nhiệt độ ổn định 25 ± 1 o C, cùng với độ ẩm, không khí và ánh sáng phù hợp Chuột có thể uống nước tự do theo nhu cầu và được nuôi trong điều kiện phòng trong 7 ngày trước khi bắt đầu nghiên cứu.
2.1.3 Thuốc thử, hóa chất, dung môi và tế bào
Hóa chất dùng trong tẩy nhuộm vi phẫu :
Javen (Công ty Cổ phần Bột giặt & Hóa chất Đức Giang, Hà Nội, Việt Nam Sản xuất theo tiểu chuẩn TCCS 96: 2009/HCĐG)
Acid acetic (Công ty Xilong Scientific, Guangdong, Trung Quốc Sản xuất theo tiêu chuẩn ISO 9001 – ISO 14001 – OHSAS 18001)
Luận án tiến sĩ Mới nhất
Xanh methylen (Công ty Shanghai Zhanyun Chemical, Shanghai, Trung Quốc Sản xuất theo tiểu chuẩn ISO 9001 – 2000)
Đỏ son phèn (Công ty Shanghai Zhanyun Chemical, Shanghai, Trung Quốc Sản xuất theo tiểu chuẩn ISO 9001 – 2000)
Hóa chất, dung môi và thuốc thử dùng trong nghiên cứu hóa học
Định tính: Ethanol (EtOH), nước cất, chì acetat 30%, chì acetat 10%, thuốc thử
The article lists various chemical reagents that meet the standards of the Vietnamese Pharmacopoeia V, including 3% Ninhydrin, Fehling's reagent A and B, Lugol's solution, 0.5% sodium nitroprusside, anhydrous sodium carbonate, sodium carbonate crystals, magnesium powder, acetic anhydride, 1% gelatin solution, chloroform, concentrated hydrochloric acid, concentrated ammonia, 5% ferric chloride solution, and 5% sodium hydroxide solution from China.
Chiết xuất và phân lập: Các dung môi công nghiệp được cất lại trước khi dùng nhƣ: EtOH, n-hexan, ethyl acetat (EtOAc), methanol (MeOH), dichloromethan
(DCM), aceton và n-butanol (BuOH) Dung dịch H2SO4 10% trong EtOH 96%
Dung môi đo phổ: CD3OD
Đường chuẩn: ᴅ-glucose, ᴅ-xylose và L-rhamnose đƣợc cung cấp bởi công ty
Sigma-Aldrich, St Louis, MO, Mỹ
Thuốc thử, hóa chất và tế bào dùng trong nghiên cứu tác dụng sinh học
Đánh giá tác dụng ức chế sự tích tụ lipid gây ra bởi acid oleic trên tế bào HepG2
The study utilized RPMI 1640 medium supplemented with fetal bovine serum (FBS, S0115, Biochrom, Germany), along with penicillin/streptomycin and trypsin (Invitrogen, USA) Key reagents included SRB (Sigma, USA), TCA, fenofibrate, oleic acid, and bovine serum albumin (BSA) Additionally, Oil Red O and 4% paraformaldehyde were used, along with isopropanol (Sigma, USA) for various experimental procedures.
Tế bào: Dòng tế bào gây ung thƣ gan HepG2 Đánh giá tác dụng hoạt hóa AMPK, ACC, ức chế FAS và SREBP–1c trên tế bào 3T3- L1
Môi trường DMEM, trypsin (Gibco BRL, Grand Island, NY, Mỹ), RPMI (1640, Invitrogen, Mỹ)
Huyết thanh bào thai bò (FBS, S0115, Biochrom, Đức)
Luận án tiến sĩ Mới nhất
Kháng thể p-AMPK, p-ACC, ACC, AMPK kháng thể thứ cấp chuột, kháng thể thứ cấp thỏ và β-actin (Cell Signaling Technology, Beverly, MA, Mỹ)
Chất đối chứng dương IC R (Cayman Chemical, Ann Arbor, MI, Mỹ)
Isopropanol, fenofibrat, acid oleic, BSA (Bovine Serum Albumin), paraformaldehyd (Sigma, Mỹ)
Tế bào mô mỡ 3T3-L1 được đặt mua từ trung tâm lưu trữ tế bào ở Mỹ (ATCC, Rockville, MD, Mỹ)
Các nguyên vật liệu và hoá chất khác đƣợc cung cấp bởi công ty Sigma (Mỹ)
Đánh giá tác dụng hạ glucose máu trên mô hình đái tháo đường typ 2 thực nghiệm
Streptozocin (STZ) lọ 1 g (Sigma-Aldrich, Singapore)
Diamicron (gliclazid) viên 30 mg (Servier, Pháp)
Các hoá chất xét nghiệm và làm tiêu bản mô bệnh học
2.1.4 Máy móc, thiết bị và dụng cụ nghiên cứu
Dùng trong nghiên cứu thực vật
Bộ rây, tủ sấy, kính hiển vi, kính lúp soi nổi, máy ảnh kỹ thuật số
Dùng trong nghiên cứu hóa học
Máy đo góc quay cực [α]D: JASCO P-2000 Polarimeter, cuvet có bề dày 1 cm và thể tích 1 ml (Tokyo, Nhật Bản)
The Q Exactive Orbitrap Mass Spectrometer from Thermo Fisher Scientific, located in Waltham, MA, USA, is a cutting-edge instrument used for mass spectrometry analysis This system is complemented by a high-performance liquid chromatography (HPLC) setup, which integrates a dual mass spectrometry (LC/MS/MS) system and a D D detector from Shimadzu, Japan, enhancing analytical capabilities for complex sample analysis.
Máy đo phổ cộng hưởng hạt nhân (NMR): Bruker M500 FT-NMR Spectrometer (Billerica, Massachusetts, Hoa Kỳ)
Máy siêu âm Power sonic 405 (Powersonic, Hàn Quốc)
Tủ sấy UFB 500 (Memmert, Đức), FD115 (Binder, Đức)
Máy cất quay Rotavapor R-220, Rotavapor R-200 (Buchi, Swichzerland, Thụy Sỹ)
Cân kĩ thuật Precisa BJ 610C, cân phân tích Precisa 262SM -FR (Precisa, Thụy Sỹ)
Luận án tiến sĩ Mới nhất
Đèn tử ngoại hai bước sóng 254 nm và 366 nm (Camag, Thụy Sỹ)
Silica gel pha thường (0,040 - 0,063 mm, Merck, Đức) và pha đảo RP-18 (30 - 50 μm, FuJisilisa Chemical Ltd)
Bản mỏng tráng sẵn DC-Alufolien 60G F254 (silica gel, 0,25 mm, Merck, Đức) và bản mỏng pha đảo RP-18 F254 (0,25 mm, Merck, Đức)
Các dụng cụ thủy tinh thiết yếu trong phòng thí nghiệm bao gồm cột sắc ký, bình gạn, bình nón, phễu lọc, cốc có mỏ, ống nghiệm, ống đong, pipet và kim tiêm Những dụng cụ này đóng vai trò quan trọng trong việc thực hiện các thí nghiệm và phân tích hóa học.
Dùng trong nghiên cứu độc tính và thử tác dụng sinh học
Cân phân tích Precisa 125 SCS (d = 0,1 mg, Thụy Sĩ) dùng để cân mẫu
Cân động vật Sartorius dùng để cân chuột
Chuồng nhốt chuột, bình uống nước, kim đầu tù, bơm tiêm, pank, kéo và các thiết bị cần thiết khác
Tủ nuôi cấy tế bào Shellab (Mỹ)
Box thao tác sinh học Bio-II (Tesla, Mỹ)
Kính hiển vi soi ngƣợc (Carl zeiss, Đức)
Máy ly tâm ngang (Bekman Counter, Mỹ)
Đĩa nuôi cấy tế bào 100 mm, đĩa 96 giếng, 24 giếng, falcon 15 ml và 50 ml, màng lọc 0,2 àm, ống 1,5 ml và đầu typ cỏc cỡ
Buồng đếm số lƣợng tế bào Thoma (Đức)
Pipet và đầu côn các kích cỡ
Máy đọc ELISA (BioTek, Đức)
Máy đo quang microplate reader (Varioskan, Thermo Electron Co., Mỹ)
Máy chụp Western blot (LAS 4000, Nhật Bản)
Máy thử glucose máu On Call EZII (ACON Biotech, Mỹ)
Kit định lƣợng glucose On Call Plus (ACON Biotech, Mỹ)
Bộ kit đo triglycerid, HDL-C, cholesterol huyết thanh (Erba, Đức)
Máy sinh hóa bán tự động (Erba, Đức)
Luận án tiến sĩ Mới nhất
ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU
2.2.1 Địa điểm nghiên cứu thực vật
Phòng Tiêu bản, Bộ môn Thực vật - Trường Đại học Dược Hà Nội
Trung tâm Tài nguyên dƣợc liệu - Viện Dƣợc liệu
2.2.2 Địa điểm nghiên cứu thành phần hóa học
Khoa Hóa Thực vật - Viện Dƣợc liệu
Trung tâm Phổ, Viện Hóa học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam
2.2.3 Địa điểm nghiên cứu độc tính và tác dụng sinh học
Khoa Dƣợc lý Sinh hóa - Viện Dƣợc liệu
Bộ môn Dƣợc lý - Đại học Y Hà Nội
Trung tâm Nghiên cứu và phát hiện sớm ung thƣ
Khoa: Khoa học Y khoa Thực nghiệm, Khoa Y, Đại học Lund, Thụy Điển.
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3.1 Phương pháp nghiên cứu thực vật
Phương pháp nghiên cứu đặc điểm hình thái bao gồm việc quan sát và mô tả các đặc điểm hình thái của thực vật tại thực địa, đồng thời chụp ảnh theo phương pháp mô tả hình thái thực vật.
The method for identifying scientific names of research samples involves comparing the morphological characteristics of the samples with those in various online herbarium collections, such as the Herbarium of National Taiwan University (T I), Muséum National d’Histoire Naturelle (P), Royal Botanic Gardens, Kew (K), New York Botanical Gardens (NY), Botanischer Garten und Botanisches Museum Berlin-Dahlem (B), and the Royal Botanic Garden Edinburgh Herbarium (RBGE), along with several specialized monographs.
Phương pháp nghiên cứu đặc điểm vi học bao gồm việc làm vi phẫu các bộ phận của cây thông qua phương pháp cắt ngang và nhuộm kép Quá trình này cũng bao gồm việc soi bột dược liệu, quan sát và chụp ảnh dưới kính hiển vi.
2.3.2 Phương pháp nghiên cứu thành phần hóa học
2.3.2.1 Phương pháp định tính các nhóm chất hữu cơ Định tính các nhóm chất hóa học chính trong các mẫu nghiên cứu bằng phản ứng hóa học theo phương pháp ghi trong tài liệu [126]
Luận án tiến sĩ Mới nhất
2.3.2.2 Phương pháp chiết xuất, phân lập và xác định cấu trúc
Dược liệu được chiết xuất bằng phương pháp chiết nóng với EtOH 80% ở nhiệt độ 70°C, theo tỉ lệ dược liệu/dung môi 1/10 (kg/l) Sau đó, dung môi được cất thu hồi dưới áp suất giảm để thu được cao tổng (GCT) Tiến hành chiết phân đoạn bằng các dung môi có độ phân cực tăng dần, bắt đầu từ phân tán cao tổng trong nước nóng và chiết lỏng - lỏng với n-hexan, EtOAc và BuOH theo tỷ lệ 1:1 Mỗi phân đoạn chiết được cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm, cho ra các cao tương ứng: n-hexan (GCH), EtOAc (GCE), BuOH (GCB) và cặn nước (GCW).
Phương pháp phân lập hợp chất sử dụng sắc ký cột với silica gel ở cả pha thường và pha đảo Các phân đoạn được theo dõi bằng sắc ký lớp mỏng ở hai pha này Để phát hiện chất, có thể sử dụng đèn tử ngoại hoặc thuốc thử (dung dịch H2SO4 10% / EtOH), sau đó sấy khô và hơ nóng cho đến khi xuất hiện màu sắc.
Phương pháp xác định cấu trúc hợp chất bao gồm việc phân tích các tính chất lý hóa và sử dụng dữ liệu từ phổ cộng hưởng từ hạt nhân, phổ khối Quá trình này cũng đòi hỏi so sánh với tài liệu tham khảo để đảm bảo tính chính xác trong việc xác định cấu trúc của các hợp chất phân lập.
Phương pháp thủy phân được sử dụng để cắt các hợp chất saponin mới thành đường, sau đó xác định sự hiện diện của các loại đường trong sản phẩm thủy phân thông qua kỹ thuật TLC và đo góc quay cực Quá trình này cũng bao gồm việc so sánh với các mẫu đường chuẩn để đảm bảo độ chính xác trong việc xác định cấu hình tuyệt đối của các đường.
Các hợp chất saponin mới (4,0 - 6,0 mg) được hòa tan trong 1 ml dung dịch HCl 1.0 N (H2O/dioxan, 1:1, v/v) và đun nóng ở 80°C trong 8 giờ Sau khi làm nguội, dung môi được loại bỏ bằng N2 và chiết lỏng - lỏng với CH2Cl2 và H2O (tỉ lệ 1:1, 3 lần) Các dịch chiết nước được gộp lại và cất dưới áp suất giảm để thu được monosaccharid Monosaccharid trong sản phẩm thủy phân được xác định bằng phân tích TLC với hệ dung môi CH2Cl2-MeOH-H2O (3/2/0,3, v/v/v) Tiếp theo, monosaccharid được phân tách bằng TLC, sau đó phun dung dịch H2SO4 10% trong 95% EtOH và hơ ở 100°C trong 2 phút để phát hiện các vết đường Cuối cùng, từng vết đường trên bản mỏng được cạo, lọc và rửa bằng hỗn hợp dung môi MeOH - H2O (1:1).
Luận án tiến sĩ Mới nhất
Sau khi thực hiện cất quay để thu hồi dung môi, hòa tan sản phẩm trong nước và tiến hành đo góc quay cực Kết quả góc quay cực thu được sẽ được so sánh với giá trị và chiều hướng của mẫu đường chuẩn tương ứng, được đo trong cùng điều kiện để đảm bảo tính chính xác và độ tin cậy của kết quả.
Luận án tiến sĩ Mới nhất
Góc quay cực riêng đƣợc tính theo công thức:
Công thức tính toán góc quay cực được biểu diễn bằng a/(l x c) x 1000, trong đó a đại diện cho góc quay cực đo được, l là chiều dài ống đo của phân cực kế (đơn vị tính bằng dm), và c là nồng độ của chất thử trong dung dịch (đơn vị tính bằng g/l).
2.3.3 Phương pháp nghiên cứu độc tính cấp
Chuẩn bị mẫu nghiên cứu độc tính cấp
Mẫu nghiên cứu trong nghiên cứu độc tính cấp được thực hiện bằng cách sử dụng cao chiết nước và cao chiết cồn từ phần trên mặt đất của Giảo cổ lam quả dẹt, được chế biến theo phương pháp cụ thể.
Cao nước: Dược liệu khô (250 g) được sắc với nước 3 lần rồi đem cô thành dạng cao đặc (tỷ lệ dược liệu/ nước 5:1) (50 g cao, hiệu suất 20%)
Cao chiết ethanol (GCT1): Phần trên mặt đất Giảo cổ lam quả dẹt (700 g, độ ẩm
Chiết xuất được thực hiện bằng cách sử dụng EtOH 80% với tỉ lệ dược liệu/dung môi là 1:6 kg/l, trong 3 lần chiết nóng mỗi lần 3 giờ ở nhiệt độ 70°C Sau khi lọc bỏ bã dược liệu và gộp các dịch chiết, dung môi được cất thu hồi dưới áp suất giảm, thu được 184,49 g cao EtOH 80% với độ ẩm 11% và hiệu suất đạt 28,56%.
Phương pháp nghiên cứu độc tính cấp
Nghiên cứu độc tính cấp của cao chiết từ cây Giảo cổ lam quả dẹt được thực hiện theo hướng dẫn trong tài liệu "Phương pháp xác định độc tính của thuốc" LD50 được xác định bằng phương pháp Behrens-Karber, với nguyên tắc tiến hành cụ thể.
Chuột được nuôi trong 3 ngày trước khi thí nghiệm để thích nghi với điều kiện môi trường và được cho ăn uống thoải mái Trước khi tiến hành thí nghiệm, chuột được nhịn đói qua đêm nhưng vẫn có nước uống theo nhu cầu Chuột sau đó được chia thành các lô thí nghiệm để phục vụ cho quá trình nghiên cứu.
10 chuột), mỗi lô chuột đƣợc uống các mức liều khác nhau của mẫu thử
- Đường dùng thuốc: đường uống, cho chuột uống bằng cách dùng kim tiêm có kim đầu tù để đƣa mẫu thử một cách nhẹ nhàng vào dạ dày chuột
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VỀ THỰC VẬT
3.1.1 Đặc điểm hình thái thực vật loài Giảo cổ lam quả dẹt ( Gynostemma compressum X.X.Chen & D R Liang)
Dây leo Tua cuốn mọc ở nách lá, hình chỉ mảnh, dài khoảng 3 - 5 cm, thường chia
Cây có hai nhánh ở đầu, mỗi nhánh dài khoảng 5 - 7 mm, có thể không chia hoặc chia thành ba nhánh Thân cây nhẵn, có lông thưa ở mỗi đốt, mảnh mai, có rãnh và 5 cạnh, mọc bò lan trên mặt đất với rễ thường phát triển từ các đốt Lá mọc so le, mỏng, thường có 7 lá chét (đôi khi 5), cuống lá dài khoảng 5 cm, nhẵn và có rãnh ở mặt trên Phiến lá chét hình thoi hoặc trứng ngược, mép khía tai bèo, đỉnh nhọn ngắn, với mặt dưới có lông ở gân và mặt trên có lông rải rác Gân bên có 5 - 6 đôi, nổi rõ ở mặt dưới và lõm ở mặt trên; lá chét giữa có kích thước 3 - 4,7 cm x 1,3 - 2,2 cm, gốc nhọn, trong khi các lá chét bên nhỏ hơn và gốc lệch Cuống lá chét dài khoảng 5 mm.
Hình 3.1: Đặc điểm cơ quan sinh dƣỡng loài Giảo cổ lam quả dẹt a Cây trong tự nhiên; b Tua cuốn; c Lá; d Mặt dưới lá; e Mặt trên lá; f Mép lá
Luận án tiến sĩ Mới nhất
Cây đơn tính có hoa đực mọc thành chùm kép ở nách lá, với trục cụm hoa nhẵn và có sọc, dài từ 2 - 5 cm, chia thành 3 - 6 nhánh Hoa có màu trắng hơi xanh, thuộc mẫu 5, đôi khi mẫu 6, có đường kính khoảng 4,5 - 5 mm Lá bắc hình dải dài khoảng 1,5 mm, cuống hoa dạng sợi dài khoảng 5 mm Đài hoa thuôn, đỉnh nhọn, kích thước khoảng 0,6 x 0,5 mm; tràng hoa hình tam giác hẹp với mũi nhọn dài, kích thước khoảng 2 x 0,8 mm, mép xẻ răng cưa nhỏ Chỉ nhị rất ngắn, hàn liền, cao khoảng 0,3 mm, và bao phấn có hình trứng với 5 phần.
Cây Giảo cổ lam quả dẹt có những đặc điểm nổi bật của cơ quan sinh sản đực, bao gồm cây đực, thân mang cụm hoa, và cụm hoa đực Hình ảnh hoa đực được trình bày từ nhiều góc độ: nhìn từ mặt sau, mặt trước và cắt dọc, giúp người đọc hiểu rõ hơn về cấu trúc và hình dáng của hoa đực trong loài này.
Hoa cái thường mọc thành cụm từ 1 đến 6 hoa ở nách lá, chủ yếu theo mẫu 5, đôi khi là mẫu 4 hoặc 6 Trục cụm hoa nhẵn, có chiều dài từ rất ngắn đến 2,5 cm Lá bắc có hình dải, dài khoảng 1,2 – 1,5 mm Đài hoa hình thuôn với đỉnh nhọn, kích thước khoảng 0,7 x 0,6 mm Tràng hoa có hình tam giác hẹp và mũi nhọn dài.
Luận án tiến sĩ Mới nhất
Cây có hoa với kích thước khoảng 2 x 0,6 – 0,7 mm, mép xẻ răng cưa nhỏ, thường có 2 ô (ít khi 3 ô), đường kính khoảng 1,2 – 1,4 mm, mỗi ô chứa một noãn Số vòi nhụy thường bằng số ô (thường 2, ít khi 3), dài khoảng 0,6 mm với rãnh ở mặt trong; núm nhụy xẻ 3 ở đỉnh, dài khoảng 0,4 mm Quả có màu xanh, hình tam giác ngược, kích thước khoảng 5 x 7 mm, vỏ mỏng (dày khoảng 0,25 – 0,35 mm), khi chín tự vỡ để giải phóng hạt; cuống quả dạng sợi, dài 0,8 – 1,8 cm Hạt có hình tam giác ngược, kích thước khoảng 3 x 4 mm, dày khoảng 2 mm, bề mặt có nốt sần Hoa nở vào tháng 3-4 và quả chín vào tháng 4-5, có thể kéo dài đến tháng 9-10.
Hình 3.3 mô tả đặc điểm cơ quan sinh sản cái của loài Giảo cổ lam quả dẹt, bao gồm các phần như cây cái, thân mang cụm hoa đơn độc, cụm hoa cái, hoa cái (nhìn từ mặt trước và mặt sau), cụm quả, quả và hình ảnh quả cắt ngang và dọc.
3.1.2 Kết quả giám định tên khoa học của mẫu nghiên cứu
Mẫu nghiên cứu có tên khoa học là Gynostemma compressum X X Chen & D R Liang, thuộc họ Bí (Cucurbitaceae), được biết đến với tên thường gọi là Giảo cổ lam quả dẹt Tiêu bản thực vật khô của Giảo cổ lam quả dẹt hiện đang được lưu trữ tại Phòng Tiêu bản – Khoa Tài nguyên.
Luận án tiến sĩ Mới nhất
Viện Dược liệu sở hữu mã số tiêu bản NIMM0019225, trong khi Phòng Tiêu bản cây thuốc thuộc Trường Đại học Dược Hà Nội có các mã số tiêu bản HNIP/18590/19 và HNIP/18591/19.
3.1.3 Kết quả nghiên cứu đặc điểm vi học của mẫu nghiên cứu
3.1.3.1 Đặc điểm bột dược liệu
Bột lá và thân Giảo cổ lam có màu sắc đặc trưng, với bột lá màu xanh thẫm và bột thân màu vàng nâu, mang đến mùi thơm đặc biệt và vị hơi ngọt Khi quan sát dưới kính hiển vi, có thể nhận thấy các tế bào cứng, xuất hiện riêng lẻ hoặc tập trung thành mảng, với kích thước khoảng nhất định.
Các hạt tinh bột có kích thước hình tròn hoặc hình trứng, với đường kính khoảng 15 - 25 µm, thường được chứa trong các tế bào mủ mềm hoặc đứng riêng lẻ Trong tiêu bản bột dược liệu, có thể quan sát thấy các mảnh mang màu, mảnh mạch xoắn, mạch điểm, và đôi khi là sợi rải rác Hiếm khi có thể thấy mảnh biểu bì mang lỗ khí kiểu hỗn bào.
Hình 3.4: Đặc điểm bột dƣợc liệu
Luận án tiến sĩ Mới nhất
Tế bào cứng là thành phần quan trọng trong cấu trúc thực vật, đóng vai trò bảo vệ và hỗ trợ Lông che chở đa bào giúp bảo vệ bề mặt cây khỏi tác động bên ngoài Mảng mô mềm chứa tinh bột là nơi dự trữ năng lượng cho cây, trong khi hạt tinh bột là đơn vị cơ bản cung cấp dinh dưỡng Mảnh mang màu và mảnh mạch xoắn tạo nên các bộ phận chức năng của cây, hỗ trợ trong quá trình quang hợp và vận chuyển chất dinh dưỡng Mạnh điểm và biểu bì mang lỗ khí giúp điều tiết hơi nước và khí carbon dioxide, trong khi sợi cung cấp độ bền cho cấu trúc cây.
3.1.3.2 Đặc điểm vi phẫu Đặc điểm vi phẫu cuống lá
Cuống lá có thiết diện hình 6 cạnh, đối xứng hai bên và hơi lõm ở mặt trên, bao gồm các phần chính: biểu bì dưới là hàng tế bào hình chữ nhật với lớp cutin màu xanh; mô dày dưới gồm 2 - 3 hàng tế bào hình trứng, kích thước không đều và có màu đỏ; mô mềm chứa các tế bào hình đa giác, thành mỏng và màu đỏ; bên trong mô mềm có 5 bó libe – gỗ xếp thành vòng cung; phần libe tạo thành vòng không liên tục bao quanh gỗ, tập trung ở hai đầu; phần gỗ bao gồm các mạch gỗ tròn nối tiếp, cách nhau bởi 1 – 2 hàng tế bào mô mềm gỗ; mô dày trên gồm 7 – 8 hàng tế bào tương tự như mô dày dưới; biểu bì trên giống biểu bì dưới.
Hình 3.5: Vi phẫu cuống lá mẫu nghiên cứu
1 Biểu bì dưới; 2 Mô dày dưới; 3 Mô mềm; 4 Libe; 5 Gỗ; 6 Mô dày trên; 7 Biểu bì trên
Luận án tiến sĩ Mới nhất
56 Đặc điểm vi phẫu lá
Phần gân lá : tiết diện bất đối xứng, phần gân trên nhú cao, nhọn, bề ngang khoảng
Cấu trúc vi phẫu của gân lá bao gồm nhiều thành phần quan trọng Biểu bì dưới được hình thành từ một hàng tế bào xếp sít nhau, có lớp cutin mỏng và lông che chở đa bào rải rác Mô dày dưới gồm 2-3 hàng tế bào hình trứng, với thành dày ở góc và bắt màu đỏ Mô mềm chứa các tế bào hình tròn hoặc đa giác, thành mỏng, cũng bắt màu đỏ, trong đó các bó libe-gỗ tập trung giữa gân Phần libe bao gồm nhiều tế bào nhỏ, tạo thành vòng không liên tục bao quanh phần gỗ Phần gỗ gồm các mạch gỗ tròn nối tiếp nhau, cách nhau bởi mô mềm gỗ Mô dày trên tương tự mô dày dưới với 5-6 hàng tế bào, trong khi biểu bì trên có cấu trúc tương tự biểu bì dưới nhưng không có lỗ khí.
Phiến lá có hình dạng nằm ngang, hơi hướng lên trên, với độ dày chỉ khoảng 1/3 so với bề dày của gân lá Cấu trúc của phiến lá từ dưới lên bao gồm: biểu bì dưới với một hàng tế bào xếp sít nhau, được phủ cutin tương tự như gân lá và có lỗ khí; mô mềm (hay mô khuyết) gồm các tế bào hình tròn hoặc đa giác, thành mỏng, kích thước không đồng đều và có màu đỏ; mô giậu với hàng tế bào hình chữ nhật (hoặc vuông), xếp sít nhau và vuông góc với bề mặt lá, cũng có màu đỏ; cuối cùng là biểu bì trên giống như biểu bì của gân lá.
Luận án tiến sĩ Mới nhất
Hình 3.6: Vi phẫu lá mẫu nghiên cứu
1 Mô dày dưới; 2 Mô mềm; 3 Libe; 4 Gỗ; 5 Biểu bì dưới; 6 Mô khuyết; 7 Mô giậu; 8
Mô dày trên; 9 Biểu bì trên; 10 Lỗ khí
Luận án tiến sĩ Mới nhất
58 Đặc điểm vi phẫu thân
Mặt cắt ngang thân cây có 5 cạnh, lồi lên ở các góc, một cạnh (trên cùng) hơi lõm
Cấu trúc của thân cây bao gồm nhiều lớp khác nhau Bên ngoài cùng là một hàng tế bào biểu bì, được phủ bởi lớp cutin Ngay sát lớp biểu bì ở các góc thân là lớp mô dày, gồm 3-4 hàng tế bào hình trứng với kích thước không đồng đều, thành dày lên và có màu đỏ Bên trong, lớp mô mềm vỏ chứa 2-3 hàng tế bào, nằm sát biểu bì, hoặc có thể có 1-2 hàng tế bào.
Chen & D R Liang)
4.2 Về thành phần hóa học
4.2.1 Về kết quả định tính các nhóm chất hữu cơ
Dịch chiết từ phần trên mặt đất của Giảo cổ lam quả dẹt chứa 7 nhóm chất quan trọng, bao gồm saponin, flavonoid, caroten, sterol, đường khử, acid amin và polysaccharid, được xác định thông qua các phản ứng hóa học đặc trưng.
Kết quả định tính cho thấy sự tương đồng giữa các nhóm chất trong loài G pentaphyllum, G guangxiense và G burmanicum Đồng thời, saponin được xác định là thành phần chính của Giảo cổ lam quả dẹt, tập trung chủ yếu trong cao BuOH Điều này khẳng định sự phù hợp về thành phần chính của loài này so với các loài khác trong chi Gynostemma.
Kết quả định tính từ dịch chiết dược liệu và các cao chiết phân đoạn trong Giảo cổ lam quả dẹt đã cung cấp hướng đi cho việc phân lập saponin trong cao chiết butanol, đồng thời hỗ trợ nghiên cứu tác dụng sinh học của cao chiết ethanol.
4.2.2 Về kết quả phân lập các hợp chất
Nghiên cứu thành phần hóa học của loài Giảo cổ lam quả dẹt cho thấy saponin là thành phần chính, dựa trên tổng quan về thành phần hóa học của chi Gynostemma Blume Kết quả định tính các chất hữu cơ trong Giảo cổ lam quả dẹt và đánh giá tác dụng ức chế sự tích tụ lipid do acid oleic của cao chiết các phân đoạn đã định hướng cho việc phân lập các hợp chất trong loài này.
Luận án tiến sĩ Mới nhất
141 dẹt với mục tiêu tìm kiếm hợp chất có hoạt tính sinh học từ phân đoạn tiềm năng đƣợc lựa chọn
Kết quả định tính cao chiết cho thấy saponin tập trung chủ yếu trong cao BuOH Cao chiết BuOH (GCB, 20 μg/ml) đã tăng cường hoạt hóa p-CC và p-AMPK mạnh nhất so với các mẫu khác, gần tương đương với chứng dương IC R (2 mM) trên biểu hiện p-AMPK Ở nồng độ 100 μg/ml, cao BuOH cũng cho thấy tác dụng ức chế sự tích tụ lipid trên tế bào HepG2 với tỷ lệ ức chế đạt 19,73 ± 3,71% Do đó, cao phân đoạn BuOH đã được lựa chọn để phân lập các hợp chất mới và các chất có tác dụng sinh học.
Bằng cách áp dụng phương pháp sắc ký cột pha thường và pha đảo RP-C18 với các dung môi rửa giải khác nhau, nghiên cứu đã thành công trong việc phân lập 17 hợp chất Các hợp chất này được xác định thông qua việc sử dụng phổ khối (ESI-MS), cho phép phân tích chính xác cấu trúc và thành phần của chúng.
Phân tích bằng phương pháp MS, HR-ESI-MS và phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1 chiều và 2 chiều (1H-NMR, 13C-NMR, DEP, HMBC, HSQC, COSY, NOESY) đã cho phép xác định cấu trúc hóa học của 17 hợp chất được phân lập từ cao chiết BuOH của Giảo cổ lam quả dẹt.
Luận án tiến sĩ Mới nhất
Gycomosid VN9 (GC6) Glc =O Glc(1→6)-[Rham(1→2)]Glc H
Gycomosid VN10 (GC7) Xyl =O H OH
Gycomosid VN1 (GC9) H OH Glc H
Gycomosid VN4 (GC10) H OH Glc-6ʹ-Ac H
Gycomosid VN2 (GC11) H OH Glc(1→6)Glc(1→2)Glc H
Gycomosid II (GC12) Glc OH Glc(1→6)Glc H
Gycomosid VN3 (GC13) Glc OH Glc(1→6)Glc(1→2)Glc H
Gycomol VN1 (GC14) H OH H OH
Hình 4.2 Cấu trúc của các hợp chất phân lập từ Giảo cổ lam quả dẹt
Trong nghiên cứu về Giảo cổ lam quả dẹt (Gynostemma compressum) tại Việt Nam, 17 chất đã được phân lập, trong đó có 14 chất mới và 3 hợp chất đã biết: corchionol C (GC1), hydroxymethylfurfural (GC2) và gycomosid II (GC12) Corchionol C (GC1) được phát hiện từ loài Euonymus alatus vào năm 2013 Hydroxymethylfurfural (GC2) đã được phân lập từ nhiều loài thực vật khác nhau như Curculigo orchioides, Angelica polymorpha và Polygonum perfoliatum, cũng như trong dầu cọ và đồ uống cola Hợp chất này nổi bật với khả năng ức chế tạo mỡ, tăng cường sự biệt hóa tế bào gốc trung mô xương, chống oxy hóa và chống ung thư, đồng thời làm tăng biểu hiện gen BCL-2 và giảm biểu hiện gen NF-κβ Gycomosid II (GC12) cũng đã được nghiên cứu, góp phần vào hiểu biết về các hợp chất có lợi từ Giảo cổ lam.
S L và Zhu Z Y công bố phân lập từ loài Giảo cổ lam quả dẹt vào năm 1993 [123]
Các hợp chất mới được phân lập từ cao BuOH của phần trên mặt đất của Giảo cổ lam quả dẹt có cấu trúc 1β,3β-dihydroxydammar-24-en Điểm khác biệt nổi bật so với các triterpenoid và saponin trong chi Gynostemma là vị trí C-1 bị hydroxyl hóa, trong khi các vị trí khác tương đồng với các hợp chất đã được công bố từ các loài Giảo cổ lam trong chi.
Gynostemma Trong số 14 chất mới có 4 triterpenoid mới đƣợc đề nghị gọi tên là:
- Gycomol VN1 (GC14): 1β,3β,12β,20(S),26-Pentahydroxydammar-24E-en
Luận án tiến sĩ Mới nhất
- Gycomol VN2 (GC15): 1β,3β,12β,26-Tetrahydroxydammar-20E(22),24E-dien
- Gycomol VN3 (GC3): 1β,3β,20(S)-Trihydroxydammar-24-en-12-on
- Gycomol VN4 (GC8): 1β,3β,12β,20(S)-Tetrahydroxydammar-24-en và 10 saponin mới đề nghị gọi tên là:
- Gycomosid VN1 (GC9): 1β,3β,12β,20(S)-Tetrahydroxydammar-24-en-20-O-β-
- Gycomosid VN2 (GC11): 1β,3β,12β,20(S)-Tetrahydroxydammar-24-en-20-O-β-
- Gycomosid VN3 (GC13): 1β,3β,12β,20(S)-Tetrahydroxydammar-24-en-3-O-β-
- Gycomosid VN4 (GC10): 1β,3β,12β,20(S)-Tetrahydroxydammar-24-en-20-O- (6ʹ-O-acetyl)-β-D-glucopyranosid
- Gycomosid VN5 (GC17): 1β,3β,20β-Trihydroxy-12β,23β-epoxy-dammar-24-en- 20-O-β- D -glucopyranosid
- Gycomosid VN6 (GC16): 1β,3β,12β-Trihydroxydammar-20(21),24-dien-3-O-β-
- Gycomosid VN7 (GC4): 1β,3β,20(S)-Trihydroxydammar-24-en-12-on-20-O-β-ᴅ- glucopyranosid
- Gycomosid VN8 (GC5): 1β,3β,20(S)-Trihydroxydammar-24-en-12-on-3-O-β-ᴅ- glucopyranosid
- Gycomosid VN9 (GC6): 1β,3β,20(S)-Trihydroxydammar-24-en-12-on-3-O-β-ᴅ- glucopyranosyl-20-O-β-ᴅ-glucopyranosyl-(1→6)-[α-ʟ-rhamnopyranosyl-(1→2)]-β-ᴅ- glucopyranosid
- Gycomosid VN10 (GC7): 1β,3β,20(S),26-Tetrahydroxydammar-24-en-12-on-3-
Saponin có cấu trúc gồm 1 đến 2 mạch đường, mỗi mạch chứa từ 1 đến 3 đường đơn, gắn tại các vị trí C-3(β) và C-20(β) của genin Trong các saponin được phân lập từ Giảo cổ lam quả dẹt, ba loại đường chính thuộc dạng pyranose là β-ᴅ-glucopyranose, β-ᴅ-xylopyranose và α-ʟ-rhamnopyranose.
Luận án tiến sĩ Mới nhất
144 dammaran đƣợc phân loại ở phần tổng quan có thể chia 14 hợp chất mới thuộc 2 cấu trúc chính:
- Cấu trúc không bị biến đổi ở C-17 (các triterpen và saponin có cấu trúc chung là 1β,3β-dihydroxydammar-24-en hay mạch nhánh tại C-17 không bị biến đổi):
Cấu trúc 1β,3β,20(S)-trihydroxydammar-24-en-12-on: Gycomol VN3 (GC3), gycomosid VN7 (GC4), gycomosid VN8 (GC5) và gycomosid VN9 (GC6)
Cấu trúc 1β,3β,12β,20(S)-tetrahydroxydammar-24-en: Gycomol VN4 (GC8), gycomosid VN1 (GC9), gycomosid VN4 (GC10), gycomosid VN2 (GC11) và gycomosid VN3 (GC13)
- Cấu trúc biến đổi ở C-17 (mạch nhánh tại C-17 của các hợp chất bị oxy hóa, hình thành nối đôi hay đóng vòng):
Hydroxyl hóa tại C-26: Gycomosid VN10 (GC7) và gycomol VN1 (GC14)
Hydroxyl hóa tại C-26 và dehydrat hóa tại vị trí C-20 hình thành nối đôi ở 20(22): Gycomol VN2 (GC15)
Dehydrat hóa tại vị trí C-20 hình thành nối đôi ở 20(21): Gycomosid VN6 (GC16)
Vòng kép 12,23-epoxydammaran: Gycomosid VN5 (GC17)
Saponin là thành phần chính trong cao chiết phân đoạn BuOH của Giảo cổ lam quả dẹt, phù hợp với các nghiên cứu về thành phần hóa học của chi Gynostemma Các saponin của loài này có nhóm 1β-OH và 20S tương tự như gycomosid I-IV đã được công bố bởi Ding S L và Zhu Z Y Sự hiện diện của nhóm 1β-OH tạo ra sự khác biệt cho aglycon và saponin trong Giảo cổ lam quả dẹt so với các loài khác trong chi Gynostemma Blume.
Trong số 20 hợp chất phân lập từ Giảo cổ lam quả dẹt, các hợp chất như GC3, GC11, GC14 và GC13 chỉ tồn tại ở dạng "S", đây là cấu hình phổ biến của các hợp chất triterpen và saponin triterpen trong chi Gynostemma Blume Một số ít hợp chất lại có cấu hình 20R.
Luận án tiến sĩ Mới nhất
145 gypenosid LIII (59), gypenosid XXXIX (60), gypenosid XL (61) và gypenosid LI (73)
4.3 Về độc tính cấp Đánh giá độc tính cấp là thông tin đầu tiên thể hiện tính an toàn khi sử dụng cũng nhƣ xác định liều lƣợng trên lâm sàng của dƣợc liệu Do các sản phẩm từ Giảo cổ lam trong thực tế thường được sử dụng dưới dạng nước sắc và trà nên việc đánh giá tác dụng độc tính cấp của cao chiết nước là phù hợp Ngoài ra, luận án cũng tiến hành đánh giá độc tính cấp của cao EtOH 80% nhằm mục đích xác định liều dùng trong các thử nghiệm về tác dụng sinh học Sở dĩ trong luận án đã tiến hành xác định độc tính cấp của dịch chiết nước và độc tính cấp của dịch chiết cồn EtOH 80% vì độc tính cấp của dịch chiết cồn để thử tác dụng sinh học và độc tính cấp của dịch chiết nước để ứng dụng phát triển sản phẩm định hướng dưới dạng trà túi lọc Theo kết quả tra cứu về loài Giảo cổ lam quả dẹt thì chƣa có thông tin về độc tính của loài này Do vậy, việc đánh giá độc tính cấp của loài Giảo cổ lam quả dẹt là cần thiết và đây cũng là công bố đầu tiên về độc tính cấp của loài
Theo tiêu chuẩn tính toán liều an toàn, liều lượng có tác dụng của cao chiết phải thấp hơn ít nhất 10 lần so với liều LD50; hệ số này càng lớn thì độ an toàn của cao chiết càng cao Đặc biệt, cao chiết được coi là an toàn khi liều có tác dụng nhỏ hơn khoảng 50 lần so với liều LD50.
Kết quả đánh giá độc tính cấp cho thấy:
Nghiên cứu về tác động của cao nước Giảo cổ lam quả dẹt cho thấy, khi sử dụng liều 15,8 g cao/kg chuột, có hiện tượng đi ngoài với phân lỏng và 1 chuột chết sau 18-20 giờ Tỷ lệ tử vong của chuột tăng dần, và ở liều 29,0 g cao/kg, toàn bộ chuột trong lô thí nghiệm đều chết Kết quả này xác định LD0 của cao chiết nước Giảo cổ lam quả dẹt là 13,0 g cao/kg, trong khi liều LD100 là 29,0 g cao/kg.
LD50 = 20,4 g cao/kg, tương đương 102 g dược liệu khô/kg ttc