Luận án tiến sĩ dược học nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành phần hóa học và một số tác dụng sinh học hai loài stephania lour ở việt nam

Trang 1 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI HOÀNG VĂN THỦY NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT, THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ MỘT SỐ TÁC DỤNG SINH HỌC HAI LOÀI Trang 2 BỘ GIÁO

TỔNG QUAN

VỊ TRÍ PHÂN LOẠI VÀ PHÂN BỐ CHI STEPHANIA LOUR

Chi Stephania Lour được đặt tên lần đầu tiên bởi João de Loureiro vào năm 1790, sau đó được các nhà phân loại thực vật nổi tiếng như Hook & Thoms (1855), Benth & Hook (1862), Miers (1866) nghiên cứu và hoàn thiện dần.

The classification of Stephania Lour has been studied by various researchers, including Diels in 1910, Forman in 1956, and Lo in 1978 Currently, most classification systems place the genus Stephania Lour within the family Menispermaceae, under the order Ranunculales However, Thorn's classification differs slightly, placing Stephania Lour in the same family but under the order Berberidales.

Các nhà khoa học Việt Nam như Nguyễn Tiến Bân, Lê Khả Kế, Võ Văn Chi, Dương Đức Tiến, Lê Đình Bích, Trần Văn Ơn đều tán đồng hệ thống phân loại của Takhtajan, được chỉnh sửa thêm năm 1996, trong đó bỏ bậc phân loại phân bộ Menispermineae, và xác định vị trí của chi Stephania Lour trong hệ thống phân loại thực vật.

Phân lớp Hoàng liên (Ranunculidae)

Chi Stephania Lour có quan hệ họ hàng gần gũi với 2 chi khác là Cissampelos

L và Cyclea Arn Ex Wight do cùng là dây leo, có cuống đính vào phiến lá, bộ nhị có các nhị liền nhau thành một trụ, bao phấn hàn liền thành 1 bệ ngang; khác nhau ở chỗ cụm hoa của chi Stephania Lour là xim tán kép, còn của 2 chi Cissampelos L và Cyclea Arn Ex Wight là xim tán đơn (hay ngù) [4], [129], [170], [208]

1.1.2 Phân bố của chi Stephania Lour

1.1.2.1 Phân b ố c ủ a chi Stephania Lour trên th ế gi ớ i

Chi Stephania Lour phân bố khắp thế giới trong đó tập trung nhiều ở các nước vùng nhiệt đới, á nhiệt đới như: Trung Quốc (43 loài), Thái Lan (18 loài), Indonesia

Việt Nam hiện có 22 loài phong phú nhất, tiếp theo là Indonesia với 17 loài, châu Phi với 12 loài, Malaysia và Ấn Độ mỗi nước có 11 loài, Philippin có 8 loài, Papua New Guinea cũng có 8 loài, Australia có 7 loài, Myanma và Đài Loan mỗi nơi có 5 loài, khu vực Hymalaya và Campuchia mỗi nơi có 3 loài.

Luận án tiến sĩ Dược học

Nhật Bản (2 loài), Sri Lanka (2 loài), Lào (2 loài), Đông Timor (1 loài), Quần đảo Solomon (1 loài), Banglades (1 loài), Nepal (1 loài)…

1.1.2.2 Phân b ố c ủ a chi Stephania Lour t ạ i Vi ệ t Nam

Việt Nam có khoảng 22 loài Bình vôi, phân bố rộng khắp từ vùng núi cao đến đồng bằng, ven biển, thậm chí có loài mọc trên bãi cát hoặc gò hoang vùng ven biển Các loài Bình vôi này có thể được tìm thấy ở cả 3 miền, bao gồm miền Bắc với các tỉnh như Cao Bằng, Lạng Sơn, Quảng Ninh, Hải Phòng, Hà Nội, Hà Tây, Hòa Bình, Yên Bái, Lào Cai, Thái Nguyên, Tuyên Quang, Phú Thọ, Hà Giang, Sơn La, Nam Định, Ninh Bình, miền Trung với các tỉnh như Thanh Hóa, Nghệ An, Lâm Đồng, Đắc Lắc, Ninh Thuận, Quảng Nam, Đà Nẵng, Thừa Thiên Huế, Bình Định, Phú Yên và miền Nam với các tỉnh như An Giang, Đồng Nai, Sông Bé, Bà Rịa-Vũng Tàu.

Bảng 1.1 Phân bố một số loài thuộc chi Stephania Lour tại Việt Nam

Stt Tên loài Tên Vi ệ t Nam Phân b ố TLTK

Bình vôi núi cao, Bình vôi nhị ngắn

Campuchia Đắc Lắc, Lâm Đồng [11], [13],

Hán phòng kỷ, Bình vôi hoa đầu Quảng Ninh (Cẩm

Phả, Hòn Gai), Hòa Bình (Kỳ Sơn)

Củ dòm, củ gà ấp, bình vôi nhựa tím, cà tòm (Tày, Tuyên Quang)

Lào Cai, Yên Bái, Bắc cạn, Thái Nguyên, Sơn La, Hòa Bình, Phú Thọ,

Hà Tây, Bắc Giang, Bắc Ninh, Quảng Ninh

Ngải tượng, củ một, củthiên đầu thống, củ nghếch, củ mối tròn

Hà Giang, Tuyên Quang, Nam Định,

Hà Nam, Ninh Bình, Cao Bằng, Lạng Sơn, Thanh Hóa, Côn Đảo

Dây mối, xạ chen Lào Cai, Hà Tây,

Ninh Bình, Đà Nẵng, Quảng Nam, Ninh Thuận, Lâm Đồng, Đồng Nai

Thiên kim đằng, dây lõi tiền

Hà Nội, Nam Định, NghệAn, Đồng Nai

Dây mối, Lõi tiền Vùng đồng bằng và núi thấp [21]

11 S kerrii Craib Bình vôi Việt Nam [204]

Bình vôi Quảng Tây, bình vôi

Quảng Ninh, Hà Nam, Ninh Bình, Hà Tây, Lạng Sơn

S longa Lour Lõi tiền, dây lõi tiền rễ dài Vùng đất thấp từ Cao

Bằng, Lạng Sơn tới Thừa Thiên Huế

15 S oblata Craib Bình vôi Việt Nam [204]

16 S pierrei Diels Bình vôi, dây đồng tiền Bình Định, Phú Yên [28], [41]

Bình vôi Lâm Đồng, Thừa

18 S rotunda Lour Bình vôi Tây Nguyên, Bình

S sinica Diels Bình vôi, bình vôi Trung Quốc, củ một Trung quốc, dây lõi tiền bắc

Lạng Sơn, Quảng Ninh, Hà Tây, Hòa Bình, Hà Nam, Ninh Bình tới Bà Rịa- Vũng Tàu

Phấn phòng kỷ Lào Cai, Yên Bái, Hà

Bắc, Hà Giang, Hà Tây, Quảng Ninh

Bình vôi đỏ, lõi tiền đỏ Các tỉnh phía Nam [21], [38]

ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT CHI STEPHANIA LOUR VÀ HAI LOÀI NGHIÊN CỨU

1.2.1 Đặc điểm thực vật chi Stephania Lour

Theo các tài liệu, chi Stephania Lour có các đặc điểm chung sau:

Dây leo thường sống lâu năm hoặc hàng năm, với thân cây mảnh khảnh Thân non thường có màu xanh nhạt, xanh bóng hoặc xanh thẫm, trong khi thân già thường có rãnh dọc và mụn cóc sần sùi màu nâu xám, nâu đen hoặc màu nâu đất Thân cây có thể là gỗ hoặc cỏ, và gốc thân thường phình thành củ với rễ dạng sợi Củ của dây leo rất đa dạng về hình thái, kích thước và màu sắc, thường có dạng hình cầu, hình trứng, hình trụ hoặc hình dạng bất định, với khối lượng từ 0,5-2 kg, nhưng cũng có thể nặng tới 50-70 kg hoặc thậm chí 170 kg Màu sắc vỏ củ và thịt củ cũng thay đổi tùy theo loài, tuổi cây và điều kiện môi trường sống, với vỏ củ có thể nhẵn, xù xì, màu nâu sáng nhạt, xám tro hay đen, và thịt củ có màu trắng ngà, vàng tươi, vàng nhạt hoặc đỏ nâu, đỏ tươi.

Lá mọc cách Cuống lá thường mảnh, dài 2(-5)-15(-20) cm, hai đầu phình lên

Cuống lá thường đính vào phiến lá ở vị trí cách xa mép dưới của gốc lá với khoảng cách nhất định tùy từng loài, thường từ 1/15 đến 1/3 chiều dài phiến lá Phiến lá có thể mỏng hoặc dày, nhẵn bóng hoặc rải rác có lông, với hình dạng đa dạng như hình khiên, hình lọng, hình tam giác rộng, hình trứng-tam giác, tam giác tròn hoặc gần tròn Mép lá có thể nguyên hoặc chia thùy, còn gân lá thường có dạng chân vịt với 8-9 gân chính.

Lá cây thường có 10 đến 12 gân lá xuất phát từ đỉnh cuống lá, với chóp lá nhọn, thuôn nhọn, tù hoặc gần tròn Gốc lá thường gần tròn, phẳng hoặc gần hình tim Màu sắc của phiến lá rất đa dạng, tùy thuộc vào từng loài, bao gồm xanh nhạt, xanh vàng nhạt, xanh đậm, xanh nâu nhạt hoặc có đốm tía như ở loài S dielsiana.

Hoa của loài này thường mọc từ kẽ lá hoặc trên thân cây già không lá, với cụm hoa đực và cái riêng biệt Các cụm hoa thường có dạng tán đơn, tán kép, xim tán kép hoặc hình đầu đến tán ngù, và có thể có cuống hoặc mọc đơn độc, cũng như xếp thành chùm ít.

Luận án tiến sĩ Dược học đã chỉ ra rằng, các nhánh của tán cấp 1 thường có hoa đực và hoa cái với cấu tạo đặc trưng Hoa đực thường đối xứng tỏa tròn, với 6-8 đài rời xếp thành 2 vòng, và 3-4 cánh hoa hình trứng ngược màu vàng hoặc trắng xanh Nhị hoa thường có 4 chỉ nhị dính nhau tạo thành ống hình trụ Hoa cái thường đối xứng hoặc bất đối xứng, với 1 đài và 2 cánh hoa, bầu hình trứng và lá noãn 2, nhưng chỉ có 1 lá noãn phát triển thành hạt Vòi hoa cái rất ngắn hoặc không có, và núm nhụy thường có 4-6 thùy ngắn hoặc rách, choãi ra hình dùi.

Quả hạch có hình dạng đa dạng, bao gồm hình gần tròn, hình trứng, hình trứng ngược và hình trứng bầu, với đặc điểm chung là hai bên dẹt Khi quả trưởng thành, cuống quả thường lệch về một phía, gần với dấu vết còn lại của núm nhụy, tạo nên một hình dạng độc đáo.

Quả chín của cây thường có màu vàng đậm hoặc đỏ tươi với bề mặt nhẵn bóng Hạt của quả có hình dạng đặc trưng, thường là hình móng ngựa, trứng dẹt hoặc hơi tròn, với một dải hình móng ngựa gồm 2 hoặc 4 dãy dọc các bướu (gai) hay những gờ ngang (vân) Đặc điểm hình thái của hạt là dấu hiệu quan trọng để xác định tên loài, và giá noãn có thể có hoặc không có lỗ thủng Khi cây mầm xuất hiện, lá mầm thường có kích thước tương đương với rễ mầm và được bao quanh bởi nội nhũ.

1.2.2 Đặc điểm thực vật của loài Stephania venosa (Bl.) Spreng

Tên đồng nghĩa: Clypea venosa Bl [21], [38], [170]

Tên thường dùng: Bình vôi đỏ [38]

Tên khác: Lõi tiền đỏ [38]

Dây leo có củ to, mủ đỏ, đường kính lên tới 40 cm, thân màu rơm đỏ, nhẵn và không lông Lá mọc cách, hình trứng rộng tam giác, kích thước 6-11(-19) x 12 (-20) cm, với gốc lá lõm hình tim và ngọn lá nhọn hay tù Hoa đực có đài 6 và cánh hoa 3, trong khi hoa cái có cuống, đài 1 màu cam và cánh hoa 2 Quả hạch hình gần trứng, dẹp nhỏ, chứa hạt hình trứng bầu, dẹt, với 4 hàng gai nhỏ dọc chiều lưng bụng.

1.2.3 Đặc điểm thực vật của loài Stephania viridiflavens H S Lo et M Yang

Tên thường dùng: Bình vôi

Cây có thân leo, hơi hóa gỗ, với phiến lá tròn dạng tam giác có kích thước từ 8-15 cm, hiếm khi đạt đến 20 cm Chóp lá thường nhọn, ngắn hoặc hơi tù, trong khi gốc lá gần bằng, tròn hoặc hơi nhọn, tạo nên hình dạng độc đáo cho loài cây này.

Lá của loài cây này có dạng lõm, mép lá nguyên hoặc có gợn sóng, hai mặt lá không có lông Cuống lá gần bằng hoặc dài hơn phiến lá, khi khô có màu vàng Cụm hoa đực có dạng xim tán kép, thường mọc sớm ở thân già không có lá hoặc các cành nhỏ, sau đó mới ra hoa ở phần ngọn thân Hoa đực nhỏ, có cuống dài khoảng 2 mm, đài hoa 6 màu lục nhạt, xếp 2 vòng, và cánh hoa 3 màu hồng cam hình quạt tròn Nhị hoa 6 dính thành cột cao 1mm, bao phấn 6 hàn liền thành đĩa tròn, có vành trắng ở ngoài, đường kính 0,6 mm.

THÀNH PHẦN HÓA HỌC CHI STEPHANIA LOUR

Các alcaloid đã phân lập từ các loài trong chi Stephania Lour có thể xếp vào 9 nhóm: benzylisoquinolin, bisbenzylisoquinolin, aporphin, proaporphin, protoberberin, morphinan, hasubanan, stephaoxocan và eribidin

Các alcaloid thuộc nhóm này có khung chung là benzylisoquinolin, có 13 chất được phân lập từ 7 loài khác nhau

Bảng 1.2 Danh mục các chất thuộc nhóm benzylisoquinolin

Stt Tên ch ấ t Loài TLTK

Nhóm bisbenzylisoquinolin là một nhóm alcaloid phong phú với 47 hợp chất đã được phân lập từ 14 loài thực vật khác nhau Một số loài tiêu biểu có số lượng chất được phân lập nhiều bao gồm S tetrandra với 14 chất, S erecta với 14 chất và S cepharantha với 9 chất Đặc biệt, một số chất trong nhóm này như cepharanthin, tetrandrin và cycleanin đã chứng tỏ giá trị đáng kể trong lĩnh vực dược phẩm.

Bảng 1.3 Danh mục các chất thuộc nhóm bisbenzylisoquinolin

3 Cepharanthin (C37H38N2O6) S cepharantha, S brachyandra, S epigaea, S japonica, S erecta, S pierrei

Nhóm aporphin đã được xác định có 77 chất được phân lập và cấu trúc từ 33 loài khác nhau Một số loài nổi bật với số lượng alcaloid được phân lập đáng kể, bao gồm S venosa với 20 chất, S cepharantha với 15 chất, S sasakii với 13 chất và S abyssinica với 9 chất.

Bảng 1.4 Danh mục các chất thuộc nhóm aporphin

11 Corydin (C20H23NO4) S lincagensis, S macrantha, S zippenlianna, S abyssinica, S dinklagei, S venosa, S viridiflavens

14 Crebanin (C20H21NO4) S abyssinica, S capitata, S cepharantha, S dielsiana, S aculeata, S bancroftii, S deltifolia, S hainanensis, S officinarum, S sasakii, S succifera, S venosa, S yunnanensis, S zippeliana, S brachyandra

21 Dicentrin (C20H21NO4) S dinklagei, S cepharantha, S brachyandra, S dentifolia, S dicentrinifera, S epigaea, S mashanica, S pierrei, S zippeliana, S abyssinica, S venosa

22 Dicentrinon (C19H13NO5) S abyssinica, S zippeliana, S dinklagei

32 Isocorydin (C20H23NO4) S cepharantha, S disciflora, S dolichopoda, S lincagensis, S macrantha, S officinarum, S pierrei, S yunnanensis, S dinklagei, S viridiflavens

36 Liriodenin (C17H19NO3) S sutchuenensis, S sasakii, S dinklagei S venosa

40 Magnoflorin (C20H24NO4) S dielsiana, s japonica, S gracilenta, S cepharantha, S pierrei, S tetrandra

42 Nor-Nuciferin (C18H19NO2) S cepharantha, S sasakii [48]

56 Oxocrebanin (C19H13NO5) S hainanensis, S succifera, S venosa

59 Oxostephanin (C18H11NO4) S zippeliana, S japonica, S dielsiana, S venosa

62 Roemerin (C18H17NO2) S lincagensis, S yunnanensis, S disciflora, S excentrica, s abyssinica, S venosa

67 Stephanin (C19H19NO3) S abyssinica, S aculeata, S brachyandra, S capitata, S cepharantha, S bancroftii, S dielsiana, S epigaea, S japonica, S kwangsiensis, S micrantha, S yunnanensis, S herbacea, S venosa

Nhóm proaporphin có 8 alcaloid đã được phân lập từ9 loài, trong đó loài S venosa là loài chiết được nhiều alcaloid thuộc nhóm này (5 alcaloid)

Bảng 1.5 Danh mục các chất thuộc nhóm proaporphin

6 Pronuciferin (C19H21NO3) S cepharantha, S.glabra, S sasakii, S sutchuenensis

7 Stepharin (C18H19NO3) S aculeata, S glabra, S bancroftii, S intermedia, S yunnanensi, S venosa, S viridiflavens

Nhóm protoberberin có 27 alcaloid phân lập từ 22 loài, trong đó một số loài có nhiều alcaloid đã phân lập thuộc nhóm này như: S glabra (13 alcaloid), S venosa

(7 alcaloid), S intermedia (6 alcaloid), S cepharantha, S macrantha, S succifera,

Trong nhóm này có một số alcaloid đã được sử dụng làm thuốc như: L- tetrahydropalmatin, palmatin, stepholidin,

Bảng 1.6 Danh mục các chất thuộc nhóm protoberberin

2 Corydalmin (C20H23NO4) S glabra, S succifera, S yuunanensis, S intermedia, S macrantha, S bancroftii, S aculeata, S brachyandra, S venosa

4 Cyclanolin (C20H24O4N + ) S dielsiana, S japonica, S tetrandra, S herbacea, S cephrantha, S venosa

14 Palmatin (C20H25N + O4) S glabra, S officinarum, S succifera, S yunnanensis, S kwangsiensis, S macrantha, S cepharantha, S intermedia, S venosa, S viridiflavens

21 Stepholidin (C19H21NO4) S glabra, S macrantha, S brachyandra, S venosa

S aculeata, S glabra, S officinarum, S macrantha, S mashanica, S succifera, S

Stt Tên ch ấ t Loài TLTK yunnanensis, S intermedia, S dielsiana, S brachyandra, S epigaea, S micrantha, S viridiflavens, S kwangsiensis, S bancroftii, S disciflora, S venosa

Nhóm morphinan có 21 alcaloid được phân lập từ 17 loài thuộc chi Stephania Lour., trong đó loài S cepharantha có nhiều alcaloid (12 alcaloid) được phân lập nhất thuộc nhóm này

Bảng 1.7 Danh mục các chất thuộc nhóm morphinan

17 Salutaridin (C19H21NO4) S yunnannensis, S pierrei, S cepharantha

19 Sinoacutin (C19H21NO4) S brachyandra, S cepharantha, S dielsiana, S dicentrinifera, S elegans, S epigaea, S glabra, S gracilenta, S mashanica, S micrantha, S officinarum

Nhóm hasubanan có 49 alcaloid, được phân lập từ 11 loài thuộc chi Stephania Lour., trong đó một số loài có số lượng alcaloid thuộc nhóm này nhiều như: S longa

(21 alcaloid), S japonica (13 alcaloid), S abyssinica (10 alcaloid),

Bảng 1.8 Danh mục các chất thuộc nhóm hasubanan

Các alcaloid nhóm eribidin (dibenzazonin)

Protostephanin (C20H27NO4) phân lập từ loài Stephania japonica [48], [57]

Bảng 1.9 Danh mục ba chất thuộc nhóm stephaoxocan

Duanyun Si và cộng sự, năm 2001 [164] đã chiết được 2 biflavonoid là stephaflavon A và stephaflavon B từ loài S tetrandra

Pal Mahesh và cộng sự, 1996 [144] đã chiết được một chất là: 7,4’ Dihydroxyisoflavon-8-C-β-glucopyranosid từ củ loài S glabra

Hai isoflavonoid là genistein, genistin được tìm thấy trong dịch chiết ethanol từ củ 6 tuổi của Stephania venosa (Bl.) Spreng [84]

Several other compounds have been isolated from the tubers of species within the Stephania Lour genus, including p-hydroxyphenylethyl-p-coumarate, cinnamic acid, β-sitosterol-D-glucoside, p-hydroxyphenylethyl ferulate, β-sitosterol, and aloe-emodin, which were found in S longa and S dinklagei, respectively.

THÀNH PHẦN HÓA HỌC HAI LOÀI STEPHANIA VENOSA VÀ

1.4.1 Thành phần hóa học loài Stephania venosa (Bl.) Spreng

Hoạt chất được quan tâm trong loài Stephania venosa (Bl.) Spreng Là các alcaloid Các nghiên cứu trên thế giới chỉ ra rằng, từ loài Stephania venosa (Bl.)

Spreng đã phân lập và xác định được 34 alcaloid, thuộc 3 nhóm:

- Nhóm Aporphin (21 chất): Ayuthianin [88], (-)-O-acetyl sukho diamin [148], d-corydin [172], crebanin [67], [114], dehydrocrebanin [67], dicentrin [87], [114],

[111], [160], 4-α-hydroxyushinsunin [61], kamalin [54], [67], liriodenin [68], nantenin [61], O-methylbulbocapnin [139], [191], [193], oxocrebanin [87], oxostephanin [87], oxostephanosin [67], [148], roemerin [61], stephanin [115], [121], sukhodiamin-β-N-oxid [61], sukhodiamin [88], thailandin [64], [67], ushinsunin-β- N-oxid [61], uthongin [87]

- Nhóm Proaporphin (6 chất): (±) N carboxamido stephanin [61], 11,12- dihydrostepharin [61], [67], glaziovin [67], N-methyltetrahydropalmatin [139], O- methylstepharinosin [61], stepharin [61]

- Nhóm Protoberberin (7 chất): Corydalmin, cyclanolin [96], N- methyltetrahydropalmatin [139], L- tetrahydropalmatin [48], [141], [135], palmatin

Nghiên cứu cũng phát hiện dấu vết của một số isoflavonoid, bao gồm genistein và genistin, trong dịch chiết từ củ 6 tuổi của loài Stephania venosa (Bl.) Spreng với hàm lượng lần lượt là 8,03 mg và 51,73 mg/100 g củ.

Chưa có nghiên cứu nào về phân lập các chất của loài S venosa thu hái tại Bà Rịa – Vũng Tàu (Việt Nam)

1.4.2 Thành phần hóa học loài Stephania viridiflavens H.S Lo & M Yang

Loài Stephania viridiflavens H.S Lo & M Yang chứa các hoạt chất quan trọng là alcaloid, đã được xác định và phân lập thành 17 hợp chất thuộc 4 nhóm khác nhau thông qua các nghiên cứu trên toàn thế giới.

- Nhóm aporphin (6 chất): (+)-6R, 6aS-isocorydin Nβ –oxid, (+)-6R, 6aS- corydin Nβ –oxid, (+)-N-methyl-laurotetanin [200], corydin, isocorydin, xylopinin

- Nhóm benzylisoquinolin (7 chất): orientalin [199] (+)-1S, 2R-laudanidin-Nβ- oxid; (+)-1S, 2S-laudanidin-Nα-oxid; (+)-laudanidin; (+)-reticulin; (+)-1S, 2R- reticulin-Nβ-oxid; (+)-1S, 2S-reticulin-Nα-oxid [199], [201]

- Nhóm Protoberberin (3 chất): jatrorrhizin [67], [77], palmatin, L- tetrahydropalmatin [20], [199]

Tại Việt Nam, nghiên cứu về loài S viridiflavens còn hạn chế, nhưng đáng chú ý là công trình của Vũ Xuân Giang năm 2003 đã thành công trong việc phân lập 2 alcaloid từ mẫu thu hái tại Sơn La.

Luận án tiến sĩ Dược học là L-tetrahydropalmatin và palmatin Định lượng alcaloid toàn phần trong dược liệu khô đạt 2,92%, hàm lượng l-tetrahydropalmatin có trong củ là 0,63%

Bên cạnh alcaloid, thành phần hóa học chính của củ bình vôi, các loài S venosa và S viridiflavens còn chứa tinh bột, đường khử, flavonoid và một số acid hữu cơ quan trọng khác.

TÁC DỤNG SINH HỌC VÀ CÔNG DỤNG LOÀI STEPHANIA VENOSA VÀ

1.5.1 Tác dụng sinh học và công dụng loài Stephania venosa (Bl.) Spreng

1.5.1.1 Tác d ụ ng sinh h ọ c t ừ d ị ch chi ế t t ổng và các phân đoạ n tinh ch ế t ừ loài Stephania venosa

Loài Stephania venosa (Bl.) Spreng đã được chứng minh có nhiều tác dụng sinh học đa dạng, bao gồm giảm lo âu, gây độc tế bào, ức chế kết tập tiểu cầu, kháng khuẩn, kháng nấm, chống oxy hóa, kháng viêm và tác động tích cực trên cơ quan sinh sản, mở ra nhiều tiềm năng ứng dụng trong lĩnh vực y học và chăm sóc sức khỏe.

Tác d ụ ng gi ả m lo âu

Một nghiên cứu đã sử dụng dịch chiết ethanol thô của S venosa trên chuột với liều uống khác nhau, từ 5, 10 và 20 mg/kg cân nặng mỗi ngày một lần trong 2 tuần Các tác dụng giải lo âu và chống trầm cảm được đánh giá tại các thời điểm khác nhau, bao gồm ngay sau khi uống một liều duy nhất, 1 và 2 tuần điều trị Kết quả cho thấy chỉ có liều 20 mg/kg cân nặng mới có tác dụng giải lo âu đáng kể trên chuột ở tất cả các thời gian điều trị, trong khi không có tác dụng chống trầm cảm đáng kể được ghi nhận.

Tác d ụ ng gây độ c t ế bào

Dịch chiết nước từ Stephania venosa (Bl.) Spreng đã cho thấy hoạt tính gây độc tế bào đáng kể, đồng thời cảm ứng chu trình chết (apoptosis) của tế bào, ngăn chặn sự tăng sinh, xâm lấn và di căn tế bào, thể hiện tiềm năng trong việc hỗ trợ điều trị các bệnh lý liên quan đến tế bào.

Dịch chiết nước của củ S venosa đã chứng minh hoạt tính gây độc tế bào và cảm ứng chu trình chết ở cả tế bào lympho bình thường và tế bào lympho phân lập từ bệnh nhân ung thư cổ tử cung Đặc biệt, kết hợp chiếu tia gamma 0,5 Gy (60Co) với 300 àg/ml S venosa cho thấy hiệu quả cao nhất trong việc ức chế tế bào ung thư.

Dịch chiết nước đã thể hiện hoạt tính gây độc tế bào trên các tế bào bạch cầu đơn nhân trong máu ngoại vi của người (PBMCs) với nồng độ ức chế IC50 là 300 µg/ml Thử nghiệm hoạt tính cảm ứng chu trình chết của tế bào PMBCs tại nồng độ 300 µg/ml cho thấy dịch chiết nước có tác dụng tương tự như bức xạ 0,5 Gy (60Co) trên cả tế bào của người khỏe mạnh và bệnh nhân ung thư cổ tử cung, khi so sánh với các tế bào không được xử lý.

Dịch chiết nước của cây S venosa đã thể hiện hoạt tính chống tăng sinh tế bào đáng kể, với giá trị IC50 là 40 μg/ml trong mô hình khảo nghiệm bằng 3 H-thymidine, cho thấy tiềm năng của nó trong lĩnh vực điều trị bệnh.

Nghiên cứu đã phân lập được ba chất tinh khiết từ dịch chiết nước, bao gồm palmatin, tetrahydropalmatin và crebanin, trong đó palmatin và crebanin cho thấy hoạt tính gây độc tế bào rõ rệt trên dòng tế bào MCF7 với IC 50 trong khoảng 5-6 μg/ml Ngoài ra, dịch chiết ethanol của củ loài S venosa và một alcaloid nhóm aporphin đã được đánh giá về hoạt tính gây độc tế bào trên các tế bào ung thư buồng trứng ở người (SKOV3) và cho thấy hiệu quả đáng kể phụ thuộc liều Đặc biệt, aporphin phân lập từ S venosa đã thể hiện tác dụng gây độc tế bào tại giá trị ED 50 là 6 μg/ml đối với SKOV3, chỉ ảnh hưởng đến tế bào ung thư mà không ảnh hưởng đến tế bào lành.

Dịch chiết methanol từ củ Stephania venosa (Blume) Spreng đã cho thấy tác dụng chống kết tập tiểu cầu hiệu quả với giá trị IC50 là 55,9 μg/ml trong thử nghiệm xác định hoạt động ức chế kết tập tiểu cầu gây ra bởi adenosin diphosphat (ADP) trên huyết tương người giàu tiểu cầu (PRP).

Dịch chiết phân đoạn ethanol của củ Stephania venosa (Blume) Spreng đã thể hiện hoạt tính kháng khuẩn in vitro đáng kể đối với các loại vi khuẩn phổ biến, bao gồm Bacillus cereus, Escherichia coli và Staphylococcus aureus, thông qua phương pháp khuếch tán trên đĩa Kết quả cho thấy giá trị MIC (nồng độ ức chế tối thiểu) lần lượt là đối với từng loại vi khuẩn, chứng tỏ tiềm năng của dịch chiết này trong việc ứng dụng trong lĩnh vực y tế và sức khỏe.

Phân đoạn n-hexan có tác dụng ức chế kém hơn với cả 3 chủng vi khuẩn, đặc biệt là với E coli với giá trị MIC lần lượt là 2,5; > 5,0 và 2,5 mg/ml, trong khi các giá trị MIC của các phân đoạn khác lần lượt là 0,078; 0,625 và 0,078 mg/ml.

Dịch chiết ethanol từ củ của S venosa đã cho thấy hoạt động ức chế đáng kể đối với Artemia sp., với giá trị LC50 là 260,26 µg/ml Ngoài ra, dịch chiết này cũng thể hiện khả năng kháng khuẩn với liều gây độc/liều gây chết đối với vi khuẩn là 750 mg/kg.

Dịch chiết ethanol từ củ Stephania venosa có tác dụng ức chế nấm Tyrosinase với IC 50 1,74 mg/ml trong thử nghiệm với phương pháp Dopachrome [127]

Tác d ụ ng ch ố ng oxy hóa

Dịch chiết ethanol từ củ Stephania venosa (Blume) Spreng đã chứng minh khả năng chống oxy hóa ấn tượng với giá trị EC50 là 4,98 mg/ml trong thử nghiệm dọn gốc tự do DPPH Ngoài ra, dịch chiết methanol cũng thể hiện tác dụng chống oxy hóa tương tự, không chỉ trong thử nghiệm DPPH mà còn trong thử nghiệm FRAP, đánh giá khả năng giảm hoạt tính chống oxy hóa của sắt.

Khi nghiên cứu trên chuột, liều 250 mg/kg đường uống đã cho thấy tác dụng kháng viêm đáng kể trên mô hình gây phù nề chân chuột bằng carrageenin chỉ sau 1 giờ, với hiệu quả lên đến 74,3%, mặc dù tác dụng này có xu hướng giảm sau đó.

Tác d ụ ng trên cơ qua n sinh s ả n

Nghiên cứu của Gomuttapong và cộng sự đã chỉ ra rằng dịch chiết ethanol 95% từ củ 6 tuổi loài S venosa (Bl.) Streng không thể hiện hoạt tính estrogen trên chuột thử nghiệm khi sử dụng đường uống Tuy nhiên, kết quả cũng cho thấy dịch chiết này có thể gây độc, đặc biệt là trên chuột đã cắt buồng trứng, thể hiện qua sự tăng cao của các chỉ số bạch cầu.

Bằng cách tiêm RNA hoặc 5-HT, NMDA vào noãn bào Xenopus, các nhà nghiên cứu đã ghi lại phản ứng bằng kỹ thuật điện áp kẹp hai chiều, cho thấy dịch chiết nước của các hợp chất này có thể ảnh hưởng đến hoạt động điện của noãn bào.

NGUYÊN VẬT LIỆU, TRANG THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ TRANG THIẾT BỊ NGHIÊN CỨU

Nguyên liệu nghiên cứu là củ, thân, lá, hoa, quả, hạt các cây Bình vôi thu hái tại các địa điểm:

Mẫu M1 được thu hái tại tỉnh Bà Rịa – Vũng Tàu và hiện được lưu giữ tại hai địa điểm quan trọng Tại Phòng tiêu bản, Bộ môn Thực vật, Trường Đại học Dược Hà Nội, mẫu cây này được mã hóa là "HNIP/18073/14" Đồng thời, mẫu M1 cũng được lưu trữ tại phòng tiêu bản Viện sinh thái và Tài nguyên sinh vật - Viện khoa học và CN Việt Nam với mã số "HV – Thủy 1".

Mẫu M2 được thu hái tại Văn Chấn - Yên Bái và được lưu giữ tại hai địa điểm chính Tại Phòng tiêu bản, Bộ môn Thực vật, Trường Đại học Dược Hà Nội, mẫu cây được lưu giữ với mã số tiêu bản là “HNIP/18594/20” và “HNIP/18595/20” Ngoài ra, mẫu cũng được lưu tại phòng tiêu bản Viện sinh thái và Tài nguyên sinh vật - Viện khoa học và CN Việt Nam với mã số “HV – Thủy 2”.

Các cá thể mẫu Bình Vôi Bà Rịa – Vũng Tàu và Bình Vôi Yên Bái được trồng tại Vườn thực vật Trường ĐH Dược Hà Nội và vườn nghiên cứu tại Ba Trại - Ba Vì từ năm 2014 đến 2019 để theo dõi và thu thập hoa, quả, hạt, đồng thời đảm bảo điều kiện sinh trưởng đồng nhất.

3 kg, trong thời điểm cây không ra hoa, cân và xác định khối lượng củ trước khi nghiên cứu

2.1.2 Động vật và các dòng tếbào ung thư thí nghiệm

Chuột nhắt trắng chủng Swiss albino, cả hai giống, trọng lượng 20  2g, đạt tiêu chuẩn thí nghiệm, do Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương cung cấp

Chuột cống trắng chủng Wistar, giống đực, khỏe mạnh, trọng lượng 120  20g, 8-10 tuần tuổi, được sử dụng cho thí nghiệm và do Học Viện Quân Y cung cấp Động vật thí nghiệm được nuôi dưỡng ổn định trong điều kiện phòng thí nghiệm với thức ăn tiêu chuẩn của Viện Vệ sinh Dịch tễ và uống nước tự do trong ít nhất 5 ngày trước khi thực hiện thí nghiệm tại phòng nuôi động vật thí nghiệm của Bộ môn Dược lực, trường Đại học Dược Hà Nội.

Research has been conducted on various human cancer cell lines, including AGS (human stomach gastric adenocarcinoma), Hela (human prostate carcinoma), HepG2 (human hepatocellular carcinoma), and MCF7, to explore their potential applications in cancer treatment and management.

(human breast carcinoma - ung thư vú ở người) do GS TS J M Pezzuto, Trường Đại học Hawaii và GS Jeanette Maier, trường Đại học Milan, Italia cung cấp

Các hóa chất, dung môi và thuốc thử sử dụng trong nghiên cứu đều đạt tiêu chuẩn phân tích theo quy định của Dược điển Việt Nam IV, bao gồm n-butanol, cloroform, ethanol, ethylacetat, n-hexan, methanol, kali dihydrophosphat, triethylamin Ngoài ra, nghiên cứu còn sử dụng oxostephanin được phân lập từ đề tài của Nguyễn Vũ Minh và L-tetrahydropalmatin do Viện kiểm nghiệm thuốc trung ương cung cấp với mã số WS 0316141.01 và độ tinh khiết 96,16% C 21 H25NO4.

Các chất sử dụng trong nghiên cứu tác dụng sinh học:

The study utilized various reagents, including Trolox from Sigma Aldrich, Ascorbic acid from Fisher, Trypsin, Ellipticine from Sigma Aldrich, Acid thiobarbituric (TBA) from Sigma Aldrich, FeSO4, H2O2, Fetal Bovine Serum (FBS) from GIBCO and Invitrogen, Sulforhodamin B (SRB) from Sigma, Acid tricloacetic (TCA) from Fisher and Sigma, Acid acetic from Merck, and DPPH from Sigma Aldrich, to conduct the experiments.

- Quercetin chất chuẩn, độ tinh khiết 94,37%, mã QT104 111016, do Viện Kiểm nghiệm thuốc Thành phố Hồ Chí Minh cung cấp

- Indomethacin chất chuẩn, đạt tiêu chuẩn phân tích do Viện Kiểm Nghiệm Thuốc Trung Ương cung cấp

- Prednisolon dạng viên nén 5mg sản xuất bởi công ty cổ phần NAHAPHARM

Số đăng kí VD-16472-12, hạn sử dụng 04/05/2022

- Dung môi pha mẫu cao toàn phần dược liệu: Dimethyl sulfoxid do công ty Kanto Chemical Nhật Bản sản xuất, Cat.no 10378 – 01, Lot No 701B1131

- Viên bông khối lượng 20±2 mg đã tiệt trùng

- Đệm phosphat hoặc đệm KCl

- Carrageenin (Carragenan sodium salt, a naturally occurring polysaccharid) của hãng Sigma Aldrich, lọ 250 gam

2.1.4 Máy móc, thiết bị và dụng cụ nghiên cứu

Bộ môn nghiên cứu thực vật được trang bị đầy đủ các thiết bị hiện đại, bao gồm bộ dụng cụ phân tích hoa, kính lúp, bộ dụng cụ cắt, tẩy nhuộm tiêu bản, kính hiển vi điện tử Kruss (Đức), kính hiển vi soi nổi Leica EZ4 (Mỹ) và tủ sấy, giúp hỗ trợ việc nghiên cứu và giảng dạy đạt hiệu quả cao.

- Nghiên c ứ u hóa h ọ c: Bộ chiết Soxhlet 250ml; Buret; Các dụng cụ thủy tinh

Trong phòng thí nghiệm, các thiết bị như cốc có mỏ, bình định mức đóng vai trò quan trọng trong việc đo lường và pha chế các chất Bên cạnh đó, máy lắc siêu âm Ultrasonic LC 60H hỗ trợ quá trình trộn và hòa tan các mẫu một cách hiệu quả Máy nghiền dược liệu DF-4 giúp nghiền nhỏ các mẫu dược liệu để chuẩn bị cho quá trình phân tích Bộ sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao Camag, bao gồm máy phun mẫu bán tự động Camag Linomat 5, là công cụ quan trọng trong việc phân tích và xác định thành phần của các mẫu.

Các thiết bị và dụng cụ được sử dụng trong nghiên cứu bao gồm máy chụp ảnh bản mỏng và phân tích dữ liệu Camag TLC Visualizer, phần mềm winCATS và VideoScan, bản mỏng silicagel 60 F254 của Merck, máy cất quay, máy sắc ký lỏng hiệu năng cao Shimadzu và cột Phenomenex Germini C18 Ngoài ra, máy đo điểm chảy Kofler micro-hotstage, máy ghi Phổ khối lượng AGILENT 1100 LC – MSD Trap và máy ghi Phổ cộng hưởng từ hạt nhân Bruker Avance AM500 FT-NMR cũng được sử dụng trong nghiên cứu này.

Các nghiên cứu tác động sinh học được thực hiện với sự hỗ trợ của các thiết bị hiện đại như máy xét nghiệm sinh hóa Screen – Master của hãng Hospitex Diagnostic (Italy), pipette (eppendorf), cân phân tích, máy đo và máy đọc ELISA 96 giếng (Bio-rad), kính hiển vi điện tử đọc vi thể thận và máy đo độ phù chân chuột Plethysmometer No 7250 của hãng Ugo-Basile (Italy), giúp đảm bảo độ chính xác và tin cậy của kết quả.

NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1 Nghiên cứu về thực vật

2.2.1.1 Mô t ả đặc điể m hình thái 2 loài nghiên c ứ u

Quan sát và mô tả đặc điểm hình thái thực vật, điều kiện sinh trưởng và phát triển của cây tại thực địa là bước đầu tiên trong quá trình nghiên cứu Sau đó, thu hái mẫu cây, tạo tiêu bản và lưu giữ chúng để phục vụ cho việc phân tích sau này Sử dụng kính hiển vi soi nổi EZ4, các nhà nghiên cứu có thể phân tích, chụp ảnh và mô tả chi tiết đặc điểm của các bộ phận sinh sản quan trọng như hoa, quả và hạt.

2.2.1.2 Giám đị nh tên khoa h ọ c các m ẫ u nghiên c ứ u

Quy trình giám định tên khoa học của cây được thực hiện dựa trên phân tích đặc điểm hình thái và đặc điểm bộ phận sinh sản, sử dụng kính hiển vi soi nổi Leica EZ4 tại Bộ môn Thực vật, Trường Đại học Dược Hà Nội Các bước chính trong quy trình này bao gồm việc thu thập và phân tích mẫu cây, xác định đặc điểm hình thái và sinh sản, và cuối cùng là xác định tên khoa học của cây dựa trên các đặc điểm đã phân tích.

- Dựa trên khóa phân loại chi Stephania Lour của Thực vật chí Trung Quốc

[129], Nguyễn Chiều (Việt Nam) [14] và thực vật chí Thái Lan [170], so sánh với các đặc điểm thực vật đã mô tả để sơ bộ xác định loài

- So sánh với tiêu bản lưu trữ và các tài liệu phân loại thực vật [12], [14], [78],

[129], [170], [176], [207], [208] cùng với sự giúp đỡ của các chuyên gia phân loại thực vật để kết luận tên khoa học của loài

2.2.1.3 Xác định đặc điể m vi h ọ c 2 loài nghiên c ứ u

Để nghiên cứu chi tiết về cấu trúc vi phẫu của 2 loài, chúng tôi đã thực hiện phương pháp cắt tẩy nhuộm kép trên các mẫu thân, cuống lá và lá Sau đó, các mẫu này được chuẩn bị thành tiêu bản bằng phương pháp giọt ép, giúp chúng tôi thu được các tiêu bản vi phẫu dược liệu chất lượng cao Việc lựa chọn vị trí cắt vi phẫu được thực hiện cẩn thận để đảm bảo tính chính xác và đại diện của mẫu.

- Thân: Chọn đoạn thân bánh tẻ, khoảng lóng thứ 4 tính từ ngọn lá, vị trí cắt không được sát mấu

- Cuống lá: Chọn cuống lá của lá bánh tẻ, vị trí cắt ở khoảng giữa của cuống lá

- Lá: Chọn lá bánh tẻ, kích thước trung bình, vị trí cắt ở khoảng 1/3 (về phía cuống lá) giữa vị trí cuống lá gắn vào phiến lá và mép lá

Dược liệu được sấy khô và nghiền mịn thành bột từ củ và lá của hai loài nghiên cứu, sau đó được rây qua rây 355 để đảm bảo độ mịn đồng đều Tiếp theo, bột dược liệu này được sử dụng để tạo ra các tiêu bản bằng phương pháp giọt ép, giúp thu được các tiêu bản bột dược liệu chất lượng cao.

Quan sát các đặc điểm, mô tả và chụp ảnh các tiêu bản dưới kính hiển vi Kruss tại Bộ môn Thực vật, Trường Đại học Dược Hà Nội [26], [39], [42]

2.2.2 Nghiên cứu về thành phần hoá học

Định tính các nhóm chất hữu cơ trong dược liệu có thể được thực hiện thông qua các phản ứng hóa học hoặc sắc ký lớp mỏng Theo tài liệu tham khảo, các phản ứng hóa học được sử dụng để xác định các nhóm chức hữu cơ trong dược liệu Ngoài ra, phương pháp sắc ký lớp mỏng cũng được áp dụng để định tính các nhóm chất hữu cơ này, cung cấp thông tin chính xác về thành phần hóa học của dược liệu.

Tiến hành định tính bằng sắc ký lớp mỏng bột củ hai loài nghiên cứu theo quy trình sau đây:

Quá trình chiết xuất được thực hiện bằng cách cân chính xác khoảng 2,0 g bột dược liệu và ngâm trong dung môi MeOH Sau 24 giờ, hỗn hợp được cho vào bình chiết ngấm kiệt, với tốc độ bổ sung dung môi và rút dịch chiết là 20 giọt/phút Quá trình chiết kiệt alcaloid được kiểm tra theo phụ lục 12.3 - Dược điển Việt Nam IV Dịch chiết thu được sau đó được cô đến cắn và hòa tan trong chính xác 100ml MeOH để tạo dung dịch chấm mẫu.

- Chuẩn bị mẫu chuẩn: Pha các dung dịch chuẩn L-tetrahydropalmatin và oxostephanin có nồng độ 0,03 mg/ml (đối chứng)

- Khảo sát điều kiện sắc ký lớp mỏng:

+ Pha tĩnh: Sử dụng bản mỏng silicagel 60 F254 của hãng Merck Trước khi chấm, bản mỏng được hoạt hóa ở 110 o C trong 1 giờ

+ Pha động: Khảo sát một số hệ dung môi khai triển Lựa chọn hệ dung môi thích hợp cho hiệu năng tách tốt nhất

+ Chấm sắc ký: Chấm sắc ký bằng máy Linomat 5 Khảo sát thể tích tiêm mẫu và chiều dài băng chấm mẫu phù hợp

Triển khai sắc ký là bước quan trọng trong quá trình tách và xác định các thành phần của một dung dịch Để thực hiện bước này, bản mỏng được đặt thẳng vào bình sắc ký đã được bão hòa dung môi Sau đó, bình được đậy kín và để yên, cho phép quá trình tách diễn ra tự nhiên Quá trình này sẽ được quan sát cho đến khi vết dung môi cách mép trên bản mỏng, tại thời điểm đó, các thành phần của dung dịch sẽ được tách và xác định rõ ràng.

Sau khi bản mỏng sắc ký đạt độ dày khoảng 2 cm, tiến hành lấy ra và đánh dấu đường dung môi Tiếp theo, để bản mỏng khô tự nhiên trong tủ hút Quan sát và chụp ảnh bản mỏng sắc ký dưới ánh sáng trắng và ánh sáng tử ngoại ở bước sóng 254 nm và 365 nm để ghi lại kết quả.

Dựa trên khả năng phân tách vết của hệ pha động và kích thước Rf, các vết trong dịch chiết và vết chuẩn đối chứng có thể được kết luận sơ bộ Quá trình này cho phép xác định và phân biệt các thành phần trong mẫu, từ đó đưa ra kết quả ban đầu về sự hiện diện và phân bố của chúng.

2.2.2.2 Chi ế t xu ấ t và phân l ậ p các h ợ p ch ất trong dượ c li ệ u

Quy trình chiết xuất các hợp chất từ dược liệu được thực hiện bằng phương pháp ngâm chiết với hỗn hợp MeOH và H2O (85:15) ở nhiệt độ phòng trong 3 lần, mỗi lần 24 giờ Sau đó, các dung môi có độ phân cực tăng dần được sử dụng để chiết phân bố Các chất trong từng phân đoạn được phân lập bằng cột sắc ký silicagel pha thường, pha đảo và sephadex LH 20 Để kiểm tra độ sạch của các chất, phương pháp sắc ký lớp mỏng được áp dụng, kết hợp với quan sát dưới ánh sáng đèn tử ngoại ở hai bước sóng 254 nm và 366 nm, đồng thời sử dụng thuốc thử Dragendorff để hiện màu sắc ký lớp mỏng.

2.2.2.3 Xác đị nh c ấ u trúc hóa h ọ c các h ợ p ch ấ t phân l ậ p

Cấu trúc hóa học của các chất phân lập được xác định thông qua việc phân tích các đặc tính vật lý như điểm chảy, độ quay quang học [α D ] và các phương pháp quang phổ hiện đại bao gồm phổ khối (MS), GC-MS, phổ khối phân giải cao (HR-MS) cùng với các kỹ thuật cộng hưởng từ hạt nhân một chiều và hai chiều, đồng thời đối chiếu với các tài liệu đã công bố để xác minh kết quả.

2.2.2.4 Định lượ ng alcaloid toàn ph ầ n và L-tetrahydropalmatin trong 2 m ẫ u nghiên c ứ u Định lượ ng alcaloid toàn ph ầ n b ằ n g phương pháp acid – base Định lượng alcaloid toàn phần trong củ của hai loài nghiên cứu theo Dược điển Việt Nam III [8].Định lượng 5 lần, lấy kết quả trung bình Định lượ ng L-tetrahydropalmatin Định lượng L-tetrahydropalmatin bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC), dựa theo phương pháp trong chuyên luận Bình vôi - DĐVN V [22]

2.2.3 Thửđộc tính cấp và đánh giá tác dụng sinh học

Để chuẩn bị mẫu cao thử cho thí nghiệm nghiên cứu độc tính và tác dụng sinh học, củ hai mẫu nghiên cứu được cắt nhỏ và sấy khô ở nhiệt độ 55 độ C đến khi đạt hàm ẩm dưới 10% Sau đó, mẫu được xay thành bột thô và xác định hàm ẩm bột Quá trình chiết xuất được thực hiện bằng phương pháp chiết ngấm kiệt với dung môi ethanol 70%, với tỷ lệ khối lượng dược liệu và dung môi là 20:1 Dịch chiết ethanol sau đó được cô thu hồi dung môi bằng dụng cụ cất quay để tạo ra cao 1:1, và cuối cùng được cô trên nồi cách thủy với công suất 800W để thu được mẫu cao thử cuối cùng.

Luận án tiến sĩ Dược học khi thể chất cao đặc, xác định khối lượng cao thu được Thông tin về mẫu cao được trình bày trong Bảng 2.1

Bảng 2.1 Thông tin mẫu cao chuẩn bịđể thửđộc tính và đánh giá tác dụng

Mẫu thử Mã cao Loài

Liều dùng quy đổi theo cao

Liều cao dùng quy đổi Chuột nhắt

Bình vôi thu hái tại Bà

4,5548 g dược liệu khô tuyệt đối

Bình vôi thu hái tại Văn

5,5520 g dược liệu khô tuyệt đối

Các mẫu cao thử được hòa tan trong DMSO theo tỷ lệ 1g cao/ 1,5 ml DMSO, sau đó siêu âm ở 30°C trong 20 phút để đảm bảo tan hoàn toàn Hỗn hợp này được phân tán thành dung dịch trong NaCMC 0,8% để tạo ra các nồng độ thích hợp cho thí nghiệm Sau đó, động vật được cho uống dung dịch chế phẩm thử qua kim đầu tù với các liều thử nghiệm đã được thiết kế Cuối cùng, chế phẩm thử sau khi pha chế được bảo quản trong tủ lạnh ở nhiệt độ 8°C để đảm bảo chất lượng và an toàn.

Nghiên cứu độc tính cấp và xác định liều gây chết 50% (LD50) trên chuột nhắt trắng được thực hiện thông qua đường uống theo phương pháp Litchfield – Wilcoxon, tuân thủ hướng dẫn của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) và các tài liệu tham khảo đáng tin cậy.

Bộ môn Dược lực, trường ĐH Dược Hà Nội

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VỀ THỰC VẬT

3.1.1 Đặc điểm hình thái thực vật 2 loài nghiên cứu

Dựa trên quá trình thu mẫu và theo dõi loài Bình vôi tại Vũng Tàu từ năm 2015 đến nay, các đặc điểm hình thái của loài này đã được xác định Các cơ quan sinh dưỡng và sinh sản của loài Bình vôi đã được mô tả chi tiết, cung cấp thông tin quan trọng về đặc điểm hình thái của loài này.

Hình 3.1 Đặc điểm củ và lá của loài M1

1-2 Củ; 3-4 Thân mang lá; 5 Nhựa màu đỏ; 6-7 Đặc điểm hai mặt lá

Cây leo có thân mảnh với màu tía đặc trưng, trong khi cành non thường có màu xanh nhạt và cành già chuyển sang màu xanh đậm Đặc điểm nổi bật của cây là không có lông trên toàn bộ thân cây Gốc thân cây thường phình thành củ, có hình dạng hình cầu hoặc bất định, và thường mọc nổi trên mặt đất với màu xám hoặc màu đất, vỏ trơn nhẵn.

Cây có lá đơn, mọc so le và chứa nhựa màu đỏ Cuống lá dài khoảng 6,5-7 cm, phình to ở gốc và có màu đỏ tím, đính giữa phiến lá ở khoảng 1/5-1/3 bên dưới trục đối xứng Phiến lá hình tam giác rộng, mỏng, nhẵn bóng hoặc có ít lông, với mép lá nguyên hơi chia thùy và ngọn lá có chóp nhọn Gân lá hình lọng hay chân vịt, có 8-10 gân nổi rõ cả hai mặt, tỏa đều từ đỉnh cuống lá.

Hoa của loài cây này có đặc điểm tính khác gốc, mọc ở nách lá Cụm hoa đực được cấu tạo theo hình xim tán kép, với cuống cụm hoa dài khoảng 6-7 cm và gồm 5 tán kép cấp 1, mỗi tán có cuống dài từ 2,5-3 cm Mỗi nhánh của tán cấp 2 có 5 nhánh nhỏ hơn, trên mỗi nhánh nhỏ có 4 hoa với cuống hoa dài 1-1,5 mm Lá bắc màu xanh nhạt được tìm thấy ở mỗi nhánh và mỗi hoa, trong khi đó, đài hoa gồm 6 lá đài rời, xếp thành 2 vòng với 3 lá đài vòng trong lớn hơn và xen kẽ với 3 lá đài vòng ngoài màu vàng nhạt Tràng hoa có màu vàng đậm hơn đài, với mép cánh hoa uốn cong vào trong Bộ nhị của hoa có chỉ nhị hàn liền thành hình trụ và các bao phấn hàn liền thành hình đĩa với đường kính khoảng 1mm.

Hình 3.2 Đặc điểm hoa đực của loài M1

1, 2 Hoa đực; 3 Cột nhị; 4 Đĩa phấn nhìn từ trên xuống; 5 Đĩa phấn nhìn ngang;

6 Đài ngoài; 7 Đài trong; 8 Tràng

Hoa cái của loài hoa này có đặc điểm bao hoa không đối xứng Cụm hoa cái thường mọc thành xim tán kép, với cuống cụm hoa dài khoảng 3cm Trong đó, tán cấp 1 được bao phủ bởi lá bắc và bao gồm 7-9 cụm hoa nhỏ, mỗi cụm có cuống dài khoảng 5mm, tạo thành tán cấp 2.

Loài hoa này có đặc điểm nổi bật với 5 nhánh, mỗi nhánh gồm 3 hoa đều có lá bắc, cuống hoa dài 3mm Hoa cái có màu đỏ, đài hoa có 1-2 lá đài cong lên với màu vàng nhạt, trong khi tràng hoa có 2-3 lá tràng màu đỏ đậm, hình hơi tròn hoặc thuôn dài Quả của loài này có hình trứng ngược và chuyển sang màu đỏ khi chín, chứa hạt hình móng ngựa với 4 hàng gai nhọn gờ lên ở phía lưng Mùa hoa thường diễn ra vào tháng 6-7, còn mùa quả là tháng 7-8.

Hình 3.3 Đặc điểm hoa cái và quả của loài M1

1 Cụm hoa cái; 2 Một hoa cái; 3 Hoa cái bổ dọc; 4 Bầu; 5 Núm nhụy; 6 Bầu cắt ngang; 7 Đài; 8 Tràng; 9a,b,c Các cấp lá bắc của hoa;

10 Cụm quả; 11 Hạt; 12 Lưng hạt

Đặc điểm hình thái loài M2 thu hái ở Yên Bái được ghi nhận thông qua quá trình thu mẫu và theo dõi sinh trưởng tại huyện Văn Chấn từ năm 2015 Quá trình này đã giúp mô tả chi tiết các đặc điểm hình thái của cơ quan sinh dưỡng và sinh sản của loài Bình vôi Các hình ảnh minh họa (Hình 3.4, 3.5, 3.6 và 3.7) cũng được sử dụng để hỗ trợ việc mô tả đặc điểm hình thái của loài này.

Cây leo là loại cây sống bám vào núi đá hoặc đất sỏi, có tuổi thọ nhiều năm Đặc điểm của cây là thân mảnh, màu xanh tươi, cành non có màu xanh lá cây trong khi cành già chuyển sang màu xanh đậm và hóa gỗ theo thời gian Một đặc điểm nổi bật của cây leo là toàn bộ cây không có lông.

Củ khoai tây có dạng hình cầu, đôi khi méo mó hoặc biến dạng, với kích thước lớn và màu nâu nhạt hay nâu xám Phần lớn củ hoặc toàn bộ củ mọc nổi trên mặt đất, trọng lượng có thể từ vài kg đến hàng chục kg Vỏ củ non thường nhẵn nhưng khi già sẽ bị nứt ra tạo thành những vết rạn và hình đa giác nhỏ không đều đặn.

Hình 3.4 Đặc điểm củ và lá loài M2

1 Củ; 2 Thân mang lá; 3-4 Lá; 5 Cuống lá phình

Lá đơn mọc so le, có nhựa cây trong và cuống lá mảnh dài khoảng 8-10 cm, thậm chí 13 cm, phình to ở gốc và có màu xanh lá Cuống lá đính vào giữa phiến lá, thường ở khoảng 1/5-1/3 bên dưới.

Phiến lá của cây có hình trứng – tam giác hay hình lọng, kích thước 11-13 (15) cm x 10-11 cm, chất giấy và có trục đối xứng Chóp lá hơi nhọn hoặc tù, gốc lá bằng, tròn hoặc hơi lõm, còn mép lá nguyên, hơi chia thùy, gợn sóng hoặc bất quy tắc Lá có màu xanh lá đậm ở mặt trên và màu nhạt hơn ở mặt dưới, khi khô chuyển sang màu vàng nâu Gân lá hình lọng hay chân vịt, gồm 10-12 gân tỏa đều từ nơi gắn cuống lá, thường nổi rõ ở mặt sau lá.

Hình 3.5 Đặc điểm hoa đực loài M2

1 Cụm hoa (cấp 2); 2, 3, 4 Lá bắc (tương ứng cấp 1, 2, 3); 5 Hoa đực nhìn từ trên xuống; 6 Hoa đực nhìn từdưới lên; 7 Bộ nhị; 8 Đài ngoài; 9 Đài trong;

10 Tràng; 11 Đĩa phấn; 12 Vành đĩa phấn

Hoa của loài này thường mọc ở nách lá, đặc biệt là trên các cành nhỏ, ngắn ở thân sau hoặc thân già không có lá Hiện tượng này thể hiện rõ khi cắt hết thân leo của cây vào mùa ra hoa, cây sẽ nhanh chóng ra hoa trở lại ngay tại gốc thân trước khi ra lá Điều này cho thấy hoa của loài này có thể tính khác gốc, mọc sớm ở thân già và sau đó mới xuất hiện ở phần ngọn thân.

Cụm hoa đực của loài này mọc xim tán kép với cuống cụm hoa dài 6-10 cm, bao gồm 6-12 tán kép cấp 1 có cuống dài 1,5-2,5 cm Mỗi tán cấp 1 lại có 3-6 nhánh, trên mỗi nhánh mang 2-3 hoa nhỏ với đường kính 2 mm Lá bắc của hoa có màu xanh nhạt, với lá bắc cấp 1 dài khoảng 1,3 mm, lá bắc cấp 2 và cấp 3 dài khoảng 1 mm Đài hoa gồm 6 phần, rời hoặc dính nhau rất ít ở cuống, có màu xanh lục nhạt hoặc đôi khi vàng, mỏng và có gân giữa cánh đài nổi rõ.

Hoa có màu hồng cam, dày và nạc, hình dạng giống vỏ sò với kích thước khoảng 0,5mm x 0,5mm, được xếp so le với 3 đài trong Đặc điểm nổi bật của hoa là 2 mép trên uốn cong vào phía trong và có 2 thể tuyến dạng đệm ở gần móng tràng Khi tách khỏi đế hoa, đài và tràng sẽ chuyển màu nâu rất nhanh Bộ nhị của hoa có chỉ nhị hàn liền thành hình trụ cao 1-1,2mm, bao phấn hàn liền thành đĩa tròn với đường kính 0,5mm và mép đĩa bao phấn có một cựa mật nhỏ hình chông cao khoảng 0,1mm Hạt phấn của hoa rất nhiều, có hình cầu và màu trắng.

Cụm hoa cái của loài này có dạng xim tán kép, với số lượng hoa lớn hơn và dài hơn so với hoa đực Cụm hoa cái có cuống dài 6-9 cm, bao gồm 12-20 tán kép cấp 1, mỗi tán có cuống dài 1-1,5 cm Mỗi tán cấp 1 lại phân nhánh thành 4-7 tán cấp 2, và trên mỗi nhánh mang 3-5 hoa Lá bắc của cụm hoa cái có màu xanh nhạt, với lá bắc ở mỗi nhánh và mỗi hoa, có kích thước dài khoảng 1,3 mm ở cấp 1 và 1 mm ở cấp 2.

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC

3.2.1 Kết quảđịnh tính 2 loài nghiên cứu (M1 và M2)

3.2.1.1 Đị nh tính các nhóm ch ấ t h ữu cơ bằ ng ph ả n ứ ng hóa h ọ c

Kết quả định tính các nhóm chất hữu cơ trong củ hai loài nghiên cứu bằng phản ứng hóa học được tóm tắt trong Bảng 3.1

Bảng 3.1 Kết quảđịnh tính các nhóm chất hữu cơ trong hai mẫu nghiên cứu bằng phương pháp hóa học STT Nhóm chất Phản ứng định tính Củ M1 Củ M2

Phản ứng với TT Liebermann + +

Phản ứng với kiềm (NaOH

5 Coumarin Mở, đóng vòng lacton - -

Phản ứng với TT Diazo - -

Phản ứng với TT Mayer ++ +++

Phản ứng với TT Dragendorff +++ +++ Phản ứng với TT Bouchardat + ++ Phản ứng với TT acid picric ++ ++

Phản ứng với TT gelatin 1% + +

Phản ứng với TT FeCl 3 5% + +

Phản ứng với chì acetat ++ +

8 Acid hữu cơ Phản ứng với Na 2 CO3 - -

9 Đường khử Phản ứng với TT Fehling +++ +

10 Caroten Phản ứng với TT H2SO4 - -

11 Sterol Phản ứng với TT Liebermann + +

12 Acid amin Phản ứng với TT Ninhydrin - -

STT Nhóm chất Phản ứng định tính Củ M1 Củ M2

13 Chất béo Phản ứng mờ giấy lọc + -

14 Tinh bột Phản ứng với TT Lugol +++ +++

Ghi chú: (-): âm tính; (+): dương tính; (++): dương tính rõ; (+++): dương tính rất rõ; (-/+): không rõ ràng

Nhận xét: Kết quả định tính ở bảng 3.1 có thể sơ bộ kết luận: trong củ của cả 2 loài Bình vôi nghiên cứu: Stephania venosa (mẫu M1) và Stephania viridiflavens

(mẫu M2) đều có 6 nhóm chất: alcaloid, tanin, flavonoid, đường khử, sterol, tinh bột Riêng chất béo chỉ có ở loài S venosa

3.2.1.2 K ế t qu ả đị nh tính b ằ ng s ắ c ký l ớ p m ỏ ng Đã tiến hành khảo sát với 6 hệ dung môi:

- Hệ 4: Toluen - Aceton - Ethanol - Amoniac [45 : 45 : 6 : 4]

- Hệ 5: Toluen - Aceton - Ethanol - Amoniac [45 : 45 : 7 : 3]

- Hệ 6: Toluen - Cloroform - Ethanol - Amoniac [45 : 45 : 6 : 4]

Kết quả khảo sát các hệ dung môi cho thấy hệ dung môi 5 thành phần gồm Toluen, aceton, ethanol và amoniac với tỷ lệ 45:45:7:3 là lựa chọn phù hợp để định tính các hợp chất bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng.

Tiến hành triển khai sắc ký với các điều kiện như sau:

- Bản mỏng: Bản mỏng TLC silicagel 60 F 254 (Merck) hoạt hóa ở 110 o C trong

1 giờ Kích thước bản mỏng: 20 x 9,8 cm

Quá trình đưa mẫu lên bản mỏng được thực hiện bằng máy chấm mẫu Linomat 5, với vị trí chấm mẫu được đặt cách mép dưới bản mỏng 1,0 cm và cách mép ngoài bản mỏng 1,5 cm Độ dài băng chấm là 7 mm và thể tích chấm mỗi vết là 2 àm.

14 vết, nhằm xác định độ lặp lại của phương pháp

- Hệ dung môi khai triển: sử dụng hệ dung môi Toluen - aceton - ethanol - amoniac [45 : 45 : 7 : 3]

- Quãng đường cài đặt: 70mm

Sau khi triển khai với hệ dung môi trên, bản mỏng được lấy ra và để bay hơi hết dung môi Tiếp đó, bản mỏng được quan sát dưới đèn tử ngoại ở bước sóng 254nm và 366nm để đánh giá sắc ký đồ TLC, kết quả được trình bày ở hình 3.19.

Hình 3.19 Hình ảnh sắc ký đồ TLC của dịch chiết mẫu M1 và M2

Bài viết này đề cập đến việc phân tích các mẫu củ loài Bình vôi, bao gồm Stephania venosa thu hái tại Bà Rịa – Vũng Tàu (M1) và Stephania viridiflavens thu hái tại Yên Bái (M2), với sự so sánh với các chuẩn Oxostephanin (Ox) và L-tetrahydropalmatin (Rot).

Kết quả sắc ký đồ thu được theo phương pháp TLC cho thấy vết L-tetrahydropalmatin có Rf khoảng 0,75-0,8 và vết oxostephanin có Rf khoảng 0,65-0,7 Đối với mẫu M1 (củ Bình vôi Stephania venosa thu hái tại Bà Rịa – Vũng Tàu), vết trùng với vị trí và màu sắc của oxostephanin khá rõ ràng, trong khi vết L-tetrahydropalmatin nhạt hơn so với mẫu chuẩn và mẫu M2 Ngược lại, mẫu M2 (củ Bình vôi Stephania viridiflavens thu hái tại Yên Bái) không có vết màu của oxostephanin, nhưng vết L-tetrahydropalmatin rất rõ và đậm hơn vết chuẩn, đồng thời có các vết màu xanh lục khác biệt ở Rf khoảng 0,3-0,4.

Như vậy, có thể sử dụng phương pháp sắc ký TLC để phân biệt giữa 2 loài M1 và M2

3.2.2 Chiết xuất và phân lập các hợp chất từ hai loài nghiên cứu

3.2.2.1 Chi ế t xu ấ t, phân l ậ p các h ợ p ch ấ t t ừ c ủ loài Stephania venosa

Mẫu củ S venosa sau khi thu hái được rửa sạch và thái nhỏ, sau đó sấy khô ở nhiệt độ 45-50 độ C và nghiền thành bột thô Để chiết xuất các hoạt chất, 1,5 kg bột thô được ngâm với hỗn hợp MeOH và H2O theo tỷ lệ 85:15 trong 3 lần, mỗi lần 24 giờ, tại nhiệt độ phòng Dịch chiết thu được sau đó được cất loại dung môi dưới áp suất giảm, thêm nước và chiết phân bố lần lượt với ethyl acetat và butanol, thu được 40,5g và 66,0g cặn chiết tương ứng.

Kết quả phân lập cặn chiết BuOH trên cột silicagel với hệ dung môi CH2Cl2 : MeOH cho thấy sự phân chia thành 10 phân đoạn Trong đó, phân đoạn 3 được tinh chế qua cột Sephadex LH 20 bằng dung môi MeOH, dẫn đến việc xác định được hợp chất SB3 với khối lượng 17 mg.

Phân đoạn 5 được phân lập qua cột Sephadex LH20, dung môi rửa giải là methanol thu được 2 chất ký hiệu SB1 (8 mg) và SB4 (10 mg)

Phân đoạn 6 được tinh chế qua cột Sephadex LH 20 với dung môi MeOH thu được chất SB2 (7 mg)

Sau khi lấy 40,5g cặn chiết EtOAc và phân lập qua cột Silicagel, quá trình rửa giải được thực hiện bằng hệ dung môi CH2Cl2 và MeOH với tỷ lệ MeOH tăng dần từ 0 đến 30%, thu được tổng cộng 20 phân đoạn Trong đó, phân đoạn 4 đã được để bốc hơi tự nhiên và xuất hiện tủa, sau đó được lọc và rửa bằng MeOH lạnh để thu được chất SE1 với khối lượng 173 mg.

Phân đoạn 5 phân lập tiếp trên cột silicagel, dùng dung môi MeOH rửa giải thu được chất SE2 (138 mg)

Phân đoạn 6 bốc hơi tự nhiên xuất hiện tủa rắn, lọc lấy tủa, rửa nhiều lần bằng MeOH thu được chất SE8 (52 mg)

Tinh chế phân đoạn 8 (210 mg) trên cột Sephadex LH20, dùng dung môi MeOH rửa giải thu được chất SE7 (100 mg)

Tinh chế phân đoạn 10 (710mg) trên cột silicagel với hệ dung môi rửa giải là

CH2Cl2 : aceton [10:1  4:1] thu được hợp chất SE3 (65 mg)

Phân đoạn 12 (1,24 g) được phân lập trên cột silicagel dùng hệ dung môi CH 2 Cl2

: aceton [4 : 0,7] rửa giải thu được SE5 (120mg) và SE6 (SDLE1.1) (70 mg)

Phân đoạn 16 để bốc hơi tự nhiên xuất hiện tủa, lọc, rửa tủa nhiều lần bằng MeOH lạnh thu được SE9 (21 mg)

Hình 3.20 Sơ đồ chiết xuất củ S venosa

Cắn BuOH (66g) BuOH thu hồi

Hình 3.21 Sơ đồ phân lập các chất từ 66g cắn BuOH

Hình 3.22 Sơ đồ phân lập các chất từ 40,5g cắn EtOAc

CH 2 Cl 2 : MeOH [V MeOH từ 5% đến 100%]

Phân đoạn 8 Phân đoạn 10 Phân đoạn 12

Xuất hiện tủa, lọc rửa với MeOH

Rửa bằng MeOH trên SKC Silicagel

Xuất hiện tủa, lọc rửa với MeOH Phân đoạn 4

Xuất hiện tủa, lọc rửa với MeOH

CH 2 Cl 2 : MeOH [V MeOH từ 0% đến 30%]

3.2.2.2 Chi ế t xu ấ t, phân l ậ p các h ợ p ch ấ t t ừ c ủ loài Stephania viridiflavens

2,0 kg bột củ S viridiflavens được ngâm chiết với hỗn hợp MeOH : H 2 O [85 :

Sau khi cất loại dung môi dưới áp suất giảm, cặn MeOH thu được được hòa trong 100 ml nước và tiến hành chiết phân bố lần lượt với các dung môi có độ phân cực tăng dần, bao gồm n-hexan, dichloromethan và n-butanol Quá trình này được thực hiện để tách và thu hồi các thành phần có độ phân cực khác nhau Kết quả thu được là 12,1 g cặn chiết từ n-hexan, 83,2 g cặn chiết từ dichloromethan và 52,0 g cặn chiết từ n-butanol.

- Lấy 52,0 g cặn chiết butanol phân lập trên cột silicagel, rửa giải bằng hệ dung môi CH2Cl2 : MeOH : H2O [VMeOH: 5 → 100%; V H2O : 0→20%] thu được 8 phân đoạn SVB1.1 - SVB1.8

Phân đoạn SVB1.3 được phân tách tiếp trên cột silicagel, dung môi rửa giải là

Sau quá trình phân lập, hỗn hợp CH2Cl2 : MeOH [5 : 0,1] đã được tách thành 4 phân đoạn nhỏ SVB3.1-SVB3.4 Tiếp tục phân lập phân đoạn SVB3.1 và SVB3.2 trên cột silicagel, sử dụng hệ dung môi CH2Cl2 : aceton [5 : 0,4] và CH2Cl2 : aceton [5 : 0,6], đã thu được 15 mg chất 1 (SVB7) và 12 mg chất 2 (SVB6.1) Đồng thời, chất rắn xuất hiện trong phân đoạn SVB3.3 đã được lọc và kết tinh lại trong EtOH, cho kết quả là 450 mg chất 5 (SVB4).

Phân đoạn SVB1.4 được phân tách trên cột silicagel, rửa giải bằng hệ dung môi

CH2Cl2: MeOH [5 : 0,5] thu được 8 mg chất 3 (SVB12) và 92 mg chất 4 (SUB2) Phân đoạn SVB1.5 được phân lập trên cột silicagel, rửa giải bằng hệ dung môi

CH2Cl2 : aceton [5 : 0,4] và sephadex LH-20, rửa giải bằng MeOH thu được 6 mg chất 6 (SVB8)

- Lấy 83,2 g cắn chiết CH2Cl2 được phân lập trên sắc kí cột silicagel, rửa giải bằng hệ dung môi CH 2 Cl2 : MeOH [VMeOH: 0 → 40%] thu được 5 phân đoạn SVC1.1 – SVC1.5

Quá trình sắc kí lặp lại các phân đoạn SCV1.1 và SCV1.2 trên cột silicagel sử dụng hệ dung môi rửa giải CH2Cl2 : aceton với tỷ lệ [5 : 0,3] và [5 : 0,6] đã cho kết quả đáng khích lệ Sau quá trình này, chúng tôi đã thu được 16 mg SVB13.1 và 120 mg SVB2 (SVB2A), đánh dấu một bước tiến quan trọng trong việc phân lập và tinh chế các hợp chất này.

Hình 3.23 Sơ đồ chiết xuất và phân lập các chất từ củ S viridiflavens

Hình 3.24 Sơ đồ phân lập các chất từ 52g cắn BuOH

2 Cột sephadex LH-20 Dung môi MeOH

Lọc, kết tinh lại trong EtOH

Hình 3.25 Sơ đồ phân lập các chất từ 83,2g cắn CH 2 Cl 2

3.2.3 Xác định cấu trúc hóa học các hợp chất phân lập

3.2.3.1 Các h ợ p ch ấ t phân l ậ p t ừ c ủ loài Stephania venosa

Từ củ loài S venosa đã được phân lập thành công 12 hợp chất quan trọng, bao gồm SB1, SB2, SB3, SB4, SE1, SE2, SE3, SE5, SE6 (SDLE1), SE7, SE8 và SE9, trong đó một số chất được phân lập từ phần chiết butanol.

- Hợp chất SB1: Palmatin C 21 H 22 NO 4 +

Hợp chất SB1 được phân lập dưới dạng bột màu vàng và có pic ion phân tử ở m/z 352,0 [M] + trong phổ khối ESI-MS, tương ứng với công thức phân tử C21H22NO4+ Dựa trên dữ liệu phổ 1H-, 13C-NMR và HMBC, chất SB1 được dự đoán là một alcaloid bậc 4 với nhóm thế ở các vị trí 2, 3, 9, 10.

Phổ 1 H-NMR của SB1 ở vùng trường thấp cho tín hiệu của 2 proton đặc trưng cho khung protoberberin ở δ H 9,88 (1H, s, H-8), 8,55 (1H, s, H-13) và 4 proton vòng thơm gồm 2 proton ở vòng A với 2 singlet ở δ H 7,45 (1H, s, H-1), 6,74 (1H, s, H-4) và 2 proton còn lại nằm ở vị trí octa đối với nhau trên vòng D tại δH 7,91 (1H, d, J 9,0 Hz, H-12), 7,71 (1H, d, J = 9,0 Hz, H-11) Ngoài ra, còn có 2 tín hiệu triplet của

2 nhóm methylen dạng C-CH 2 -CH 2 -N ở δH 5,02 (2H, t, J = 6,5 Hz, H-6) và 3,24 (2H, t, J = 6,5 Hz, H-5) cùng với tín hiệu của 4 nhóm methoxy ở δH 4,18 (3H, s), 4,05 (3H, s), 3,99 (3H, s), 3,96 (3H, s)

Phổ 13 C-NMR và phổ DEPT của SB1 xuất hiện tín hiệu của 21 nguyên tử carbon gồm 9 carbon bậc bốn, 6 carbon methin, 2 carbon methylen và 4 carbon methoxy

Phổ HMBC của SB1 cho thấy sự tương tác của proton trong các nhóm methoxy ở các vị trí khác nhau với các nguyên tử carbon tương ứng, cụ thể là tương tác giữa proton ở δ H 4,18 với C-9, proton ở δ H 4,05 với C-2, proton ở δ H 3,99 với C-10 và proton ở δ H 3,96 với C-3 Ngoài ra, còn có sự tương tác giữa các proton H-4, H-6 với C-5, H-4, H-13 với C-13b và H-8 với C-12a, C-13a, C-9 Những dữ liệu này chứng minh rằng SB1 là một loại protoberberin alcaloid với bốn nhóm thế methoxy ở các vị trí khác nhau.

2, 3, 9, 10 Do đó, cấu trúc của SB1 được xác định là 2,3,9,10-tetramethoxy berberin

(hay còn gọi là palmatin hoặc gindarinin) [174]

Hình 3.26 Cấu trúc hóa học các chất SB1 (palmatin)

Bảng 3.2 Dữ liệu phổ NMR của SB1 (CDCl 3 , 500, 125 MHz, δ ppm)

- Hợp chất SB2: Jatrorrhizin (C 20 H 20 NO 4 + )

Hợp chất SB2 phân lập được dưới dạng bột màu vàng

Phổ khối ESI-MS cho tín hiệu pic ion phân tử tại m/z 338,0 [M] + , tương ứng với công thức phân tử C20H20NO4 +

Dữ liệu phổ 1 H-, 13 C-NMR của chất SB2 cho thấy chất này cũng là một protoberberin alcaloid Phổ 1D-NMR của nó tương tự với phổ 1D-NMR của chất

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ĐỘC TÍNH CẤP VÀ TÁC DỤNG SINH HỌC 100 1 Độc tính cấp của 2 loài nghiên cứu

3.3.1 Độc tính cấp của 2 loài nghiên cứu

3.3.1.1 Độ c tính c ấ p c ủ a loài Stephania viridiflavens (BV1)

Kết quả từ thử nghiệm thăm dò đã giúp xác định các mức liều thử đối với BV1 cho thử nghiệm chính thức, bao gồm 1600 mg/kg, 2000 mg/kg, 2500 mg/kg, 3130 mg/kg, 3910 mg/kg, 4880 mg/kg, 6100 mg/kg và 7630 mg/kg.

Số lượng động vật chết ở các lô trong thời gian theo dõi thể hiện ở Bảng 3.20

Bảng 3.20 Sốlượng chuột nhắt trắng chết khi dùng mẫu thử BV1 ở các mức liều thử

(mg/kg) n Số chuột chết trong 72 giờđầu

Số chuột chết từ 72 giờđến 14 ngày

- Xác định LD50 trên chuột nhắt trắng

Dựa vào số chuột chết ở từng mức liều thử trong vòng 72 giờ, tính LD 50 bằng hồi qui probit, kết quả như sau:

LD50 = 4875 mg/kg (CI 95%: 4258 mg/kg – 5709 mg/kg) tương ứng với 27,07 g dược liệu/kg

- Tình trạng chung, dấu hiệu ngộ độc

Sau khi sử dụng mẫu thử, đa số chuột ở các lô đều giảm hoạt động đáng kể, tụ thành từng đám hoặc ngủ lịm Biểu hiện chủ yếu của chúng liên quan đến ức chế thần kinh trung ương, thể hiện qua việc ít hoặc không đáp ứng với kích thích Hơn nữa, chuột cũng không còn phản xạ lật sấp và hầu như không tiêu thụ thức ăn, nước uống.

Các động vật thử nghiệm thường chết sau khoảng thời gian từ 1 đến 3 giờ kể từ khi sử dụng mẫu thử, hiện tượng này thường liên quan đến việc ức chế quá mức hệ thần kinh trung ương, dẫn đến các triệu chứng nghiêm trọng và tử vong.

Các động vật còn sống bắt đầu đáp ứng với kích thích sau khoảng 5 giờ tùy mức liều thử, với tỷ lệ đáp ứng cao hơn ở các lô dùng liều thấp và ít hoạt động ở các lô dùng liều cao Tuy nhiên, sau 24 giờ dùng mẫu thử, các động vật đã phục hồi trở lại, hoạt động bình thường, phản xạ tốt với các kích thích và tiêu thụ thức ăn/nước uống bình thường Kết quả cũng cho thấy cân nặng của động vật đều tăng so với thời điểm bắt đầu thử nghiệm Ngoài ra, kết quả giải phẫu đại thể các cơ quan của động vật chết không quan sát thấy các dấu hiệu bất thường rõ rệt.

3.3.1.2 Độ c tính c ấ p c ủ a loài Stephania venosa (BV2)

Kết quả từ thử nghiệm thăm dò đã xác định được các mức liều thử đối với BV2 cho thử nghiệm chính thức, bao gồm 2000 mg/kg, 2500 mg/kg, 3130 mg/kg, 3910 mg/kg, 4880 mg/kg, 6100 mg/kg, 7630 mg/kg và 9540 mg/kg.

Số lượng động vật chết ở các lô trong thời gian theo dõi thể hiện ở bảng 3.21

Bảng 3.21 Sốlượng chuột nhắt trắng chết khi dùng mẫu thử BV2 ở các mức liều thử

(mg/kg) n Số chuột chết trong 72 giờđầu

Số chuột chết từ 72 giờđến 14 ngày

- Xác định LD 50 trên chuột nhắt trắng

Dựa vào số chuột chết ở từng mức liều thử trong vòng 72 giờ, tính LD 50 bằng hồi qui probit, kết quả như sau:

LD50 = 5711 mg/kg (CI 95%: 4971 mg/kg – 6674 mg/kg) tương đương 26,01 g dược liệu/kg

- Tình trạng chung, dấu hiệu ngộ độc

Sau khi sử dụng mẫu thử, đa số chuột ở các lô đều giảm hoạt động đáng kể, tụ thành từng đám hoặc ngủ lịm Biểu hiện chủ yếu liên quan đến ức chế thần kinh trung ương, thể hiện qua việc ít hoặc không đáp ứng với kích thích, mất phản xạ lật sấp và hầu như không tiêu thụ thức ăn, nước uống.

Các động vật chết thường xuất hiện trong khoảng thời gian từ 1 giờ đến 3 giờ sau khi dùng mẫu thử, điều này thường liên quan đến biểu hiện ức chế quá mức hệ thần kinh trung ương, dẫn đến những hậu quả nghiêm trọng cho sức khỏe của chúng.

Động vật còn sống bắt đầu đáp ứng với kích thích từ khoảng sau 5 giờ tùy mức liều thử Ở các lô dùng liều thấp, động vật tỉnh sớm hơn và có tỷ lệ đáp ứng với kích thích cao hơn, đa số động vật hoạt động bình thường trở lại Tuy nhiên, ở các lô dùng liều cao, động vật vẫn giảm hoạt động dù đã tỉnh Sau 24 giờ dùng mẫu thử, các động vật còn sống đã phục hồi trở lại, hoạt động bình thường và tiêu thụ thức ăn/nước uống bình thường Tại thời điểm kết thúc thử nghiệm, cân nặng của động vật đều tăng so với thời điểm bắt đầu thử nghiệm.

+ Mổ động vật chết, không quan sát thấy các dấu hiệu bất thường rõ rệt về mặt đại thể các cơ quan

3.3.2 Tác dụng giảm đau của 2 loài nghiên cứu

3.3.2.1 Tác d ụ ng gi ảm đau ngo ạ i vi

Số cơn quặn đau của các lô chuột trong giai đoạn từ 0-30 phút sau khi gây đau bằng acid acetic được trình bày ở bảng 3.22

Bảng 3.22 Tác dụng giảm đau trên mô hình gây đau quặn

Lô và liều dùng n Số cơn đau quặn và % ức chế đau Tổng số cơn đau quặn

Lô Indomethacin li ề u 10 mg/kg 10 6 (4 – 21)**

(Sốcơn quặn đau biểu diễn ở dạng trung vị (25% - 75%),

**, p < 0,01; *, p < 0,05 khi so sánh với lô chứng)

Chứng dương indomethacin với liều 10 mg/kg đã cho thấy tác dụng giảm đau đáng kể, làm giảm số cơn quặn đau của chuột so với lô chứng trong suốt khoảng thời gian 30 phút thử nghiệm, với mức độ ý nghĩa thống kê cao (p < 0,01) Cụ thể, tỷ lệ ức chế đau so với chứng lần lượt là 85,4%, 63,6% và 65,2%, tất cả đều có mức độ ý nghĩa thống kê cao (p < 0,01).

Nghiên cứu cho thấy cao BV1 có tác dụng giảm số cơn quặn đau ở chuột Cụ thể, liều 260 mg/kg có tác dụng này trong khoảng 10 phút cuối, trong khi liều 520 mg/kg và 1040 mg/kg có tác dụng giảm đau trong toàn bộ thời gian nghiên cứu Tổng quá trình theo dõi 30 phút, cả 3 liều thử nghiệm đều thể hiện tác dụng giảm số cơn quặn đau so với lô chứng, với tỷ lệ ức chế đau lần lượt là 19,3%, 59,6% và 62,4%.

Cao BV2 ở liều 290 mg/kg và 580 mg/kg cho thấy tác dụng giảm số cơn quặn đau ở chuột so với lô chứng trong suốt thời gian nghiên cứu, trong khi liều 1160 mg/kg có tác dụng giảm số cơn quặn đau từ phút thứ 11 đến phút thứ 30 Tổng số cơn quặn đau trong 30 phút theo dõi cho thấy cao BV2 ở cả ba liều thử 290 mg/kg, 580 mg/kg và 1160 mg/kg đều có tác dụng giảm số cơn quặn đau so với chứng, với tỷ lệ ức chế đau lần lượt là 29,4%, 39,4% và 44,0%, và không có sự khác biệt về tác dụng giữa ba mức liều thử.

3.3.2.2 Tác d ụ ng gi ảm đau trung ương

Thời gian đáp ứng đau của chuột sau khi thực hiện mô hình đo đau trên mâm nóng, kết quả được trình bày trong Bảng 3.23

Bảng 3.23 Tác dụng giảm đau trên mô hình mâm nóng

(Các thông số thời gian đáp ứng đau biểu diễn ở dạng M± SE

**, p < 0,01; *, p < 0,05 khi so sánh với lô chứng) Nh ậ n xét

- Lô chứng dương dùng codein liều 60 mg/kg có tác dụng kéo dài thời gian phản ứng với nhiệt độ của chuột so với lô chứng với p < 0,01

Kết quả nghiên cứu cho thấy, lô sử dụng chế phẩm BV1 với liều thấp 260 mg/kg không thể hiện tác dụng đáng kể Tuy nhiên, khi tăng liều lên 520 mg/kg và liều cao 1040 mg/kg, chế phẩm BV1 đã kéo dài thời gian tác dụng phản ứng với nhiệt độ một cách đáng kể, với mức độ ý nghĩa thống kê p < 0,05 và p < 0,01 so với lô chứng bệnh lý Đặc biệt, thời gian kéo dài ở lô dùng liều 1040 mg/kg cao hơn đáng kể so với lô dùng liều 520 mg/kg, với sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (p < 0,05).

Kết quả cho thấy lô sử dụng chế phẩm BV2 với liều thấp 290 mg/kg không có sự khác biệt về thời gian phản ứng đau so với lô chứng bệnh lý Tuy nhiên, ở các lô sử dụng liều 580 mg/kg và 1160 mg/kg, thời gian phản ứng đau được kéo dài đáng kể (p < 0,05).

1160 mg/kg không có sự khác biệt (p >0,05)

3.3.3 Tác dụng chống viêm của 2 loài nghiên cứu

3.3.3.1 Tác d ụ ng ch ố ng viêm c ấ p

Kết quả đo mức độ phù bàn chân chuột tại thời điểm 1 giờ, 3 giờ, 5 giờ gây viêm bằng carragenan được trình bày ở bảng 3.24

Bảng 3.24 Ảnh hưởng của cao BV1 và BV2 lên mức độ phù chân chuột theo thời gian

Lô và liều dùng n Thông số Thời điểm

Sau 1 giờ Sau 3 giờ Sau 5 giờ

Lô n Thời gian đáp ứng đau (giây)

(I% phần trăm ức chế so với lô chứng Mức độ phù chân chuột biểu diễn dưới dạng M±SE **, p < 0,01; *, p < 0,05 khi so sánh với lô chứng) Nh ậ n xét:

- Indomethacin liều 10 mg/kg thể hiện tác dụng chống viêm tốt tại thời điểm sau

1 giờ, 3 giờ, 5 giờ; tỷ lệ ức chế lần lượt là 40,33% (p < 0,05); 45,45% (p < 0,01) và 37,13% (p < 0,05)

- Cao BV1 ở hai mức liều thử 150 mg/kg và 300 mg/kg không thể hiện tác dụng ức chế phù bàn chân chuột tại các thời điểm nghiên cứu (p >0,05)

Cao BV2 liều 170 mg/kg không làm thay đổi mức độ phù bàn chân chuột ở cả 3 thời điểm nghiên cứu Tuy nhiên, liều 340 mg/kg đã cho thấy tác dụng ức chế phù bàn chân chuột đáng kể tại các thời điểm 1 giờ và 3 giờ sau khi gây viêm, với tỷ lệ ức chế lần lượt là 34,12% (p < 0,05) và 40,58% (p < 0,01), chứng tỏ hiệu quả chống viêm của cao BV2 ở liều cao hơn.

3.3.3.2 Tác d ụ ng ch ố ng viêm m ạ n

Tác dụng chống viêm mạn được đánh giá qua mức độ giảm khối lượng u hạt tươi và khô Kết quả được biểu diễn ở bảng 3.25

Bảng 3.25 Ảnh hưởng của cao BV1 và BV2 lên khối lượng u hạt trên chuột cống trắng

Lô và liều dùng n Khối lượng u hạt tươi (mg) Khối lượng u hạt khô (mg)

% giảm khối lượng so với lô chứng Tươi Khô

Liều 150 mg/kg 8 330,4 ± 25,5** 39,2 ± 4,6** 36,7% 38,8% Liều 300 mg/kg 8 401,2 ± 25,3* 50,8 ± 2,9* 23,2% 20,6%

Liều 170 mg/kg 8 371,0 ± 21,7* 46,9 ± 4,0* 28,9% 26,7% Liều 340 mg/kg 8 422,4 ± 26,4 54,8 ± 3,8 19,1% 14,4%

**, p < 0,01; *, p < 0,05 khi so sánh với lô chứng

Kết quả cho thấy, so với lô chứng, cao BV1 liều 150 mg/kg có tác dụng giảm đáng kể khối lượng u hạt tươi và khô, lần lượt là 36,7% và 38,8% (p < 0,01) Trong khi đó, liều 300 mg/kg cũng mang lại hiệu quả giảm tương ứng là 23,2% và 20,6% (p < 0,05), cho thấy cao BV1 có tiềm năng trong việc ức chế sự phát triển của u hạt.

BÀN LUẬN

VỀ ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT

Chi Stephania Lour thường được xếp vào họ Tiết dê (Menispermaceae) trong các hệ thống phân loại khác nhau, mặc dù vị trí của nó có thể thay đổi.

Chi Stephania là một chi thực vật lớn với 107 loài trên toàn thế giới, tập trung chủ yếu ở châu Á với 93 loài Các quốc gia có số lượng loài Stephania phong phú bao gồm Trung Quốc với 43 loài, Thái Lan với 18 loài, Indonesia với 17 loài và Việt Nam với 22 loài Sự phân bố này cho thấy các quốc gia này có sự tương đồng về địa hình và khí hậu Để xác định tên khoa học của các loài nghiên cứu, luận án này đã tham khảo tài liệu trong và ngoài nước, đồng thời tiến hành đối chiếu tiêu bản các mẫu nghiên cứu với các tiêu bản mẫu lưu ở các phòng tiêu bản của các quốc gia lân cận.

Mỗi loài trong chi Stephania đều có những ưu và nhược điểm riêng biệt Qua quá trình theo dõi và nghiên cứu từ năm 2015 đến tháng 9-2019, đề tài đã thu thập và mô tả đầy đủ các đặc điểm của cả cây cái và cây đực thuộc 2 loài nghiên cứu Các đặc điểm này bao gồm cơ quan sinh dưỡng như hình dạng, màu sắc của củ, màu dịch thân, lá, củ và đặc điểm của lá như hình dạng, gân, mép, ngọn, phiến, gốc lá và vị trí đính của cuống lên phiến lá Ngoài ra, đề tài cũng nghiên cứu về cơ quan sinh sản, bao gồm đặc điểm của cụm hoa, các xim tán cấp 1, 2, 3, lá bắc, chiều dài cuống tán, xim, hoa và đặc điểm của bộ nhị, bộ nhụy.

Các đặc điểm của quả, hạt như lỗ, số lượng hàng gai trên lưng hạt và đặc điểm của gai đóng vai trò quan trọng trong việc xác định tên loài Trong đó, khóa phân loại của Thái Lan được đánh giá dễ sử dụng trong thực tế nhờ vào việc nhận biết đặc điểm hình thái củ, thân, lá khi chưa thu được hoa, quả Tuy nhiên, khóa phân loại của Trung Quốc lại có ưu điểm về số lượng loài lớn hơn, lên đến 39 loài, so với 15 loài của khóa phân loại Thái Lan Đối với mẫu thu hái tại Bà Rịa – Vũng Tàu, việc tham khảo khóa phân loại của Thực vật chí Thái Lan có ý nghĩa quan trọng do vị trí địa lý gần Thái Lan, đồng thời cũng cần tham khảo khóa phân loại của Thực vật chí Trung Quốc và Nguyễn Chiều để khẳng định chắc chắn.

Mặc dù có bốn loài Stephania khác cũng có nhựa thân và lá màu đỏ, bao gồm S dentifolia, S yunnannensis, S longipes và S dielsiana, nhưng khi đối chiếu, cả bốn loài này đều có đặc điểm khác biệt so với mẫu M1 Loài S dentifolia có mép lá khía răng cưa và cụm hoa đực, cái gần giống nhau, trong khi loài nghiên cứu không có đặc điểm này Loài S yunnannensis có gai ở lưng hạt đầu tù và hai tuyến lớn ở gốc cánh hoa đực, nhưng loài nghiên cứu không có đặc điểm này Ngoài ra, loài S longipes có cánh hoa đực mép phẳng, trái ngược với loài nghiên cứu có mép cánh hoa đực uốn cong vào trong Cuối cùng, loài S dielsiana có hai vòng đài hoa đực đều nhau, trong khi loài nghiên cứu có hai vòng đài không đều nhau.

Bảng 4.1 Đặc điểm làm cơ sởgiám định tên khoa học [170]

(2) Đặc điể m ch ọ n trong khóa phân lo ạ i [170]

(3) Đặc điể m không ch ọ n trong khóa phân lo ạ i [170]

Cuống lá thường (4) mảnh, dài 6,5 - 7 cm Phi ế n lá hình tam giác rộng, mảnh

1b Cuống lá dài hơn 4mm tính từ mép nguyên c ủ a gốc lá, ở hầu hết các lá Lá có hình g ầ n gi ố ng tam giác trứng đến tròn hoặc dẹt

1a Cuống lá dài nhỏ hơn 2mm tính t ừ mép nguyên c ủ a gốc phiến lá Lá gần giống hình tam giác

Cây leo, thân mảnh, màu tía, có cánh hoa

2b Cây leo, có cánh hoa

2a Cây c ỏ, cao đế n 30cm tính từ củ Lá gần hình tròn, đườ ng kính kho ả ng 6cm Không có cánh hoa

Phiến lá mỏng, nhẵn bóng hoặc có ít lông

3b Lá nhẵn hoặc có một ít gai nhú ở mặt dưới phiến lá

3a Lá có lông hoặc dễ thấy gai nhú ở mặt dưới phiến lá

C ụ m hoa cái m ọ c xim tán kép

Cụm hoa đực mọc xim tán

6b C ụ m hoa là xim tán kép

6a C ụm hoa đầ u gồm nhiều hoa nhỏ dạng đĩa Lá thường m ỏ ng, s ắ c nh ọ n hoặc có đuôi ở ngọn lá

Toàn cây có nhựa màu đỏ

Hoa đực có đài 6, rời, xếp thành 2 vòng, 3 lá đài vòng trong lớn hơn và xếp xen kẽ

7a Cây có nhựa đỏ Lá thườ ng chia thùy ít, dạng màng Hoa đực có các đài hoa không đều

Cây có nhựa không màu Để xác định loài cây này, các nhà khoa học đã tiến hành so sánh tiêu bản mẫu tại Phòng tiêu bản Singapore Botanic Garden (Singapore) với các số mẫu 15164, 37820, 2364 và tại Phòng tiêu bản Queen Sirikit Botanic Garden (Chiang Mai, Thái Lan) với các số mẫu QBG 20633, QBG 11544, QBG.

6884 và tham khảo ý kiến chuyên gia, loài nghiên cứu ký hiệu M1 được giám định là

Stephania venosa (Bl.) Spreng , họ Tiết dê (Menispermaceae)

Bảng 4.2 So sánh tiêu bản loài nghiên cứu mẫu M1 với tiêu bản ơ các phòng tiêu bản (PTB) nước ngoài

Dượ c Hà N ộ i PTB Singapore Botanic

PTB Queen Sirikit Botanic Garden (Chiang Mai, Thailand)

Loài Stephania venosa (Bl.) Spreng phân bố chủ yếu ở các nước châu Á, bao gồm Việt Nam, Trung Quốc, Thái Lan, Malaysia, Indonesia và Philippines Tại Việt Nam, loài này chỉ tập trung ở các tỉnh phía Nam, trong khi không có ghi nhận nào về sự hiện diện của nó ở phía Bắc Thay vào đó, cây Củ dòm (Stephania dielsiana Y.C.Wu) là loài phổ biến ở phía Bắc Để phân biệt hai loài này, cần dựa vào đặc điểm của hoa đực và hoa cái, vì khi chỉ có củ hoặc thân lá, việc phân biệt trở nên rất khó khăn.

Bảng 4.3 So sánh đặc điểm thực vật giữa 2 loài S venosa (Bl.) Spreng và

S.dielsiana Y.C.Wu [23] Đặc điể m Stephania venosa (Bl.) Spreng (M1) Stephania dielsiana Y.C.Wu

Củ Hình dạng bất định, vỏ trơn nhẵn Hình dạng bất định, vỏ xù xì có những nốt sần dọc dài

Thân Thân leo, nhỏ, không lông Thân leo, nhỏ, không lông

Lá Đơn, so le Đơn, so le

Cuống lá mảnh, dài 6,5-7 cm, phình to ở gốc, màu đỏ tím, gốc lá bằng hoặc hơi lõm

Cuống lá dài; phiến hình trứng nhọn hoặc hình tim; gốc lá bằng hoặc hơi lõm; ngọn lá nhọn

Lá có 8-10 gân n ổ i rõ, t ỏa đề u xu ấ t phát t ừ đỉ nh cu ố ng lá

Gân 9-12, t ỏ a tròn xu ấ t phát t ừ đỉ nh c ủ a cu ố ng lá

Hoa đực - Xim tán kép, cuống cụm hoa dài khoảng 6-7 cm; gồm 5 tán kép cấp 1, có

- Xim tán kép, cuống cụm hoa dài 1,3-2 cm, gồm 8-12 tán kép Mỗi

Luận án tiến sĩ Dược học đã nghiên cứu đặc điểm của loài Stephania venosa (Bl.) Spreng (M1) và Stephania dielsiana Y.C.Wu Đặc điểm của loài này bao gồm cuống dài từ 2,5-3 cm và tán cấp 2 có 5 nhánh, trên mỗi nhánh có 4 hoa với cuống hoa dài 1-1,5 mm.

- Đài 6, rời, xếp thành 2 vòng, 3 lá đài vòng trong lớn hơn và xếp xen kẽ 3 lá đài vòng ngoài, màu vàng nhạt

- B ộ nh ị có ch ỉ nh ị hàn li ề n thành hình tr ụ , các bao ph ấ n hàn li ề n thành hình đĩa tán lại gồm 7-11 tán nhỏ, cuống tán rất ngắn

- Đài 6, màu tím, xếp 2 vòng, kích thước đều nhau Cánh hoa 3, rời, đều nhau, xếp xen kẽ lá đài, màu đỏ cam, hình trứng ngược

- Ch ỉ nh ị dính li ề n nhau, bao ph ấ n

6, x ế p thành vòng tròn trên m ộ t mặt phẳng

Hoa cái của loài này thuộc dạng Xim tán kép, với cuống cụm hoa dài khoảng 3cm Cụm hoa cấp 1 bao gồm 7-9 cụm hoa nhỏ, mỗi cụm có cuống dài 5mm Mỗi cụm hoa cấp 2 lại được chia thành 5 nhánh, và mỗi nhánh thường có 3 hoa đều có lá bắc bảo vệ, cùng với cuống hoa dài 3mm.

- Đài 1 - 2, mép đài cong lên, màu vàng nh ạ t Tràng 2- 3 kích thướ c có th ể giống hoặc khác nhau, màu đỏ đậm, hình hơi tròn hoặc thuôn dài

- Bầu trên, lệch về phía lá bắc

- Xim tán kép gần dạng đầu, cuống cụm hoa dài 1,2 cm, gồm 6-7 tán kép Mỗi tán kép có cuống dài 1,5- 2mm, g ồ m 6 hoa nh ỏ

- Đài 1, màu vàng xanh đậm về phía g ố c Cánh hoa 2, r ờ i, x ế p l ệ ch v ề m ộ t phía, hình tr ứng ngượ c, dày, nạc

- Bầu hình trứng ngược, thẳng, núm nhụy chia 5 thùy

Quả Quả hình trứng ngược, khi chín có màu đỏ

Hình trứng ngược, dài 0,8cm -1,2 cm khi chín có màu đỏ tươi Hạt - Hạt hình móng ngựa, có 4 hàng gai nhọn gờ lên ở phía lưng, mỗi hàng gồm

- Hạt hình móng ngựa, trên lưng có

4 hàng gai nhọn, Mỗi hàng 13-17 gai

- Giá noãn có l ỗ th ủ ng ở gi ữ a

Luận án tiến sĩ Dược học đã nghiên cứu mẫu M2 thu hái tại Văn Chấn – Yên Bái, một địa phương gần Trung Quốc Để xác định loài của mẫu này, luận án đã tham khảo các khóa phân loại của Thái Lan, khóa phân loại của Nguyễn Chiều và đặc biệt là khóa phân loại chi Stephania của Trung Quốc Kết quả cho thấy loài bình vôi M2 thuộc nhóm các loài có rễ, củ to, với đặc điểm bên trong cánh hoa có 2 thể tuyến.

S.excentrica, S.kwangsiensis, S.kuinanensis, và S viridiflavens Các đặc điểm khác biệt cơ bản giữa S viridiflavens với 3 loài còn lại là mép cánh hoa đực của loài này cuộn vào phía trong và vào mùa ra hoa dễ phát hiện loài này, căn cứ vào đặc điểm hoa ra sớm ở phần gốc thân già không có lá, sau đó mới ra hoa ở các phần trên (có lá) của thân Đặc điểm này của S viridiflavens giống với đặc điểm của loài S.cambodia Tuy nhiên hoa đực của loài S viridiflavens có 6 đài, 3 tràng, trong khi hoa đực của loài S.cambodia lại có 4 đài, 4 tràng [129] Đó là đặc điểm sử dụng để phân biệt giữa 2 loài này

Loài Stephania vidiriflavens H S Lo & M Yang hiện chỉ được ghi nhận có mặt tại Sơn La, Việt Nam, sau khi được nhóm nghiên cứu của Nguyễn Chiểu và Nguyễn Tiến Vững công bố phát hiện vào năm 2002.

Loài bình vôi Stephania viridiflavens H S Lo & M Yang cũng là đối tượng nghiên cứu trong luận văn thạc sĩ dược học của Vũ Xuân Giang Tuy nhiên, các nghiên cứu trước đây chỉ mới mô tả đặc điểm hình thái và dựa trên kết quả phân tích về cây đực, mà chưa tìm thấy cây cái và chưa có mô tả về cây cái Đáng chú ý, nghiên cứu này là lần đầu tiên mô tả đặc điểm thực vật của hoa cái và quả, hạt loài bình vôi Stephania viridiflavens tại Việt Nam, bổ sung nghiên cứu về loài tại Việt Nam.

Nam Đồng thời, kết quả nghiên cứu đã bổ sung thêm một loài bình vôi vào hệ thực vật của tỉnh Yên Bái

Nghiên cứu về đặc điểm vi phẫu và bột dược liệu của hai loài M1 và M2 cho thấy không có sự khác biệt rõ rệt giữa chúng Tuy nhiên, khi quan sát dưới kính hiển vi, đặc điểm khác biệt về nhựa luyện (màu đỏ hay không màu) của các loài có thể được xác định Khi so sánh tỉ lệ, số hàng tế bào và cách sắp xếp của các mô trong các loại vi phẫu, có sự khác biệt nhỏ giữa hai loài S venosa và S viridiflavens, đặc biệt là trong đặc điểm của vi phẫu lá Cụ thể, tỉ lệ bề dày giữa phiến lá và gân lá của S venosa vào khoảng 1/4-1/3, trong khi tỉ lệ này ở S viridiflavens là khác biệt.

Phần tiết diện của gân lá loài S venosa có tỉ lệ chiều dài và chiều rộng gần tương đương nhau, tạo hình gần tròn, trong khi loài S viridiflavens có hình elip Đặc biệt, phần biểu bì của loài S viridiflavens có nhiều nhú dài và hẹp hơn so với loài S venosa, dẫn đến sự khác biệt rõ ràng trong hình ảnh soi bột lá.

VỀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC

Nghiên cứu đã thực hiện định tính các nhóm chất có trong củ của hai loài nghiên cứu thông qua phản ứng hóa học và định tính TLC dịch chiết methanol Kết quả cho thấy, đã chiết xuất và phân lập được 15 hợp chất từ loài Stephania venosa và 8 hợp chất từ loài Stephania viridiflavens Ngoài ra, nghiên cứu cũng tiến hành định lượng alcaloid toàn phần và L-tetrahydropalmatin có trong củ của cả hai loài, cung cấp thông tin quý giá về thành phần hóa học của chúng.

V ề đị nh tính các nhóm ch ấ t và s ắc ký đồ TLC: Trong củ của cả 2 loài Bình vôi nghiên cứu: Stephania venosa (mẫu M1) và Stephania viridiflavens (mẫu M2) đều có

Các nghiên cứu đã xác định được 6 nhóm chất chính có trong loài S venosa, bao gồm alcaloid, tanin, flavonoid, đường khử, sterol và tinh bột Kết quả này phù hợp với các nghiên cứu trước đó về các loài thuốc chi Stephania Lour nói chung Ngoài ra, loài S venosa còn chứa chất béo, điều này đã được xác nhận qua quá trình phân lập.

Sử dụng hệ dung môi Toluen - aceton - ethanol - amoniac với tỷ lệ 45 : 45 : 7 : 3, hình ảnh sắc ký đồ TLC của hai mẫu nghiên cứu có thể phân biệt được dựa vào độ đậm vết của L-tetrahydropalmatin, với giá trị Rf khoảng 0,75-0,8, đặc biệt là mẫu M2 (S viridiflavens) cho thấy độ đậm vết rõ ràng.

Luận án tiến sĩ Dược học chỉ ra sự khác biệt đáng kể giữa mẫu M1 (S viridiflavens) và mẫu M2 (S venosa) thông qua một số đặc điểm quan trọng Đặc biệt, mẫu M2 (S venosa) thể hiện sự hiện diện của vết oxostephanin màu đỏ hung với giá trị Rf khoảng 0,65 – 0,7 khi quan sát dưới ánh sáng 366nm, điều này không được quan sát thấy ở mẫu M1 (S viridiflavens) Ngoài ra, mẫu M2 còn có các vết màu xanh lục ở Rf khoảng 0,3-0,4, khác biệt rõ ràng so với các vết của mẫu M1.

Kết quả định tính bằng TLC cho thấy khả năng phân biệt và đóng góp vào việc tiêu chuẩn hóa hai dược liệu S venosa và S viridiflavens Đặc biệt, đây là lần đầu tiên tại Việt Nam, hình ảnh sắc ký đồ TLC của cả hai loài S venosa và S viridiflavens được công bố, cung cấp thông tin quan trọng cho việc xác định và phân loại các dược liệu này.

V ề phân l ập và xác đị nh c ấ u trúc các ch ấ t phân l ập đượ c t ừ hai m ẫ u nghiên c ứ u : Alcaloid là thành phần hóa học chính trong các loài thuộc chi Stephania Lour

Các nhà khoa học trên toàn thế giới đã phân lập thành công khoảng 230 alcaloid tinh khiết từ chi Stephania, bao gồm 41 loài, chiếm 38,3% tổng số loài trên thế giới là 107 loài Một số loài trong chi này có số lượng alcaloid phân lập đáng kể, bao gồm S cepharantha với 54 alcaloid, S tetrandra với 34 alcaloid, S japonica với 31 alcaloid và S sasakii với 21 alcaloid.

Các loài thuộc chi Stereospermum chứa nhiều alcaloid, với số lượng đáng kể ở các loài như S abyssinica (19 alcaloid), S venosa (34 alcaloid), S glabra (17 alcaloid) và S viridiflavens (17 alcaloid) Tuy nhiên, các nhóm chất khác vẫn chưa được nghiên cứu và công bố rộng rãi Qua quá trình nghiên cứu, luận án đã phân lập được 20 hợp chất khác nhau từ hai loài, bao gồm 3 hợp chất chung cho cả hai loài, 12 hợp chất riêng từ loài S venosa và 5 hoạt chất riêng từ loài S viridiflavens.

* Các hợp chất phân lập được trong cả 2 loài nghiên cứu:

Palmatin là một alcaloid nhóm protoberberin được phân lập từ củ của các loài S venosa (hợp chất SB1) và S viridiflavens (hợp chất SuB2), sở hữu nhiều hoạt tính quý giá như kháng khuẩn, chống sốt rét, chống viêm, chống sốt và chống giãn mạch.

Palmatin được tìm thấy trong tự nhiên từ nhiều loài cây khác nhau, bao gồm Jatrorrhiza palmata thuộc họ Tiết dê (Menispermaceae) và các loài thuộc chi Berberis và Mahonia thuộc họ Hoàng liên gai (Berberidaceae) Ngoài ra, palmatin cũng được phân lập từ nhiều loài thuộc chi Stephania Lour., chẳng hạn như S glabra, S officinarum, S succifera, S yunnanensis, S kwangsiensis, S macrantha, S cepharantha, S intermedia.

[98], [132], [146], [211], và đã công bố phân lập được trước đó từ hai loài S venosa

[107], S viridiflavens [199] cả trong và ngoài nước

Stepharin là một alcaloid thuộc nhóm proaporphin được phân lập từ củ của loài S venosa (hợp chất SB4) và loài S viridiflavens (hợp chất SVB12) Ngoài ra, chất này cũng được tìm thấy trong nhiều loài bình vôi khác như S aculeata, S glabra, S bancroftii, S intermedia, S yunnanensi và hai loài S venosa, S viridiflavens Tại Việt Nam, chất này đã được nghiên cứu và phát hiện trong một số loài thực vật bản địa.

Luận án tiến sĩ Dược học đã thành công trong việc phân lập hoạt chất từ loài Stephania rotunda, tuy nhiên vẫn còn thiếu thông tin về việc phân lập hoạt chất này từ hai loài khác là S venosa và S viridiflavens tại Việt Nam.

L-Tetrahydropalmatin là hợp chất đã được phân lập từ nhiều loài bình vôi khác nhau, bao gồm S venosa và S viridiflavens Ngoài ra, hợp chất này cũng đã được tìm thấy trong các loài như S aculeata, S glabra, S officinarum, S macrantha, S mashanica, S succifera, S yunnanensis, S intermedia, S dielsiana, S brachyandra, S epigaea, S micrantha, S viridiflavens, S kwangsiensis và S bancroftii.

S disciflora, S venosa, [55], [59], [108], [152], [211], đây là hoạt chất chính thuộc nhóm protoberberin được phân lập từ nhiều loài thuộc chi Stephania Đây là hoạt chất quan trọng được dùng trong ngành dược, tuy nhiên cần nghiên cứu tiếp các loài khác để có thể xác định danh mục các loài có hàm lượng L-tetrahydropalmatin cao để phục vụ cho việc bảo tồn và phát triển các loài Bình vôi làm nguyên liệu để sản xuất L- tetrahydropalmatin làm thuốc

* Các hợp chất khác phân lập từ loài S venosa thu hái tại Bà Rịa –Vũng Tàu:

Jatrorrhizin là một alcaloid thuộc nhóm protoberberin, được phân lập từ củ loài S venosa - hợp chất SB2, tương tự như palmatin Hợp chất này có tác dụng ức chế enzym acetylcholinesterase (AChE) mạnh mẽ với giá trị IC50 là 48,1 μM và có tác dụng hạ đường huyết Mặc dù jatrorrhizin đã được tìm thấy trong các loài Bình vôi khác như S intermedia và S glabra, nhưng nghiên cứu này là lần đầu tiên công bố phân lập được hợp chất jatrorrhizin từ củ của loài S venosa thu hái ở Bà Rịa, Vũng Tàu.

Ayuthianin và Sukhodiamin là hai alcaloid nhóm aporphin được phân lập từ củ của loài S venosa, thuộc hỗn hợp chất SB3 Cả hai hợp chất này chỉ khác nhau ở một nhóm thế Trước đây, ayuthianin đã được công bố phân lập từ các loài S bancroftii, S venosa và S aculeata, trong khi sukhodiamin cũng đã được tìm thấy trong loài S venosa Tuy nhiên, cho đến nay vẫn chưa có công bố nào về việc phân lập hoạt chất này từ loài S venosa thu hái tại Việt Nam.

VỀ ĐỘC TÍNH CẤP VÀ TÁC DỤNG SINH HỌC

Về độc tính cấp của hai loài Bình vôi nghiên cứu

Củ và dịch chiết từ củ Bình vôi đã được sử dụng trong dân gian để chữa các chứng đau đầu, đau dây thần kinh, đau khớp và sốt rét Tại Yên Bái, Việt Nam, Bình vôi được ứng dụng trong các bài thuốc dân gian để điều trị nhiều bệnh khác nhau, bao gồm viêm dạ dày, viêm khớp, đau xương khớp và vôi hóa khớp, với công dụng an thần và chữa mất ngủ Tuy nhiên, để đảm bảo tính an toàn khi sử dụng, việc đánh giá độc tính cấp của hai loài Bình vôi S viridiflavens và S venosa là cần thiết.

Kết quả nghiên cứu cho thấy liều 7630 mg/kg gây tử vong toàn bộ các cá thể thử nghiệm Ở liều thấp, động vật thử nghiệm nhanh chóng hồi phục và có phản ứng tốt hơn với các kích thích, trong khi ở liều cao, phản xạ của chuột chậm hồi phục hơn Tuy nhiên, sau 24 giờ, tất cả động vật sống sót đều hồi phục hoàn toàn Liều LD 50 của mẫu thử S viridiflavens được xác định là 4875 mg/kg (CI 95%: 4258 mg/kg – 5709 mg/kg), tương đương 27,07 g dược liệu/kg.

Kết quả thử độc tính của S venosa (cao BV2) cho thấy tỷ lệ tử vong của chuột thí nghiệm tăng dần theo mức tăng liều dùng Cụ thể, mức liều 2000 mg/kg không gây tử vong cho bất kỳ cá thể nào, trong khi mức liều cao nhất là 9540 mg/kg gây độc làm chết toàn bộ số cá thể của lô Giá trị LD50 của S venosa được xác định là 5711 mg/kg (CI 95% là 4971 mg/kg – 6674 mg/kg), tương đương 26,01 g dược liệu/kg.

So sánh với độc tính cấp của một số loài Bình vôi đã được nghiên cứu ở việt Nam như loài S dielsiana Y U Wu có LD50 là 22,2 g (CI 95%: 18,5g – 26,6g) dược

Luận án tiến sĩ Dược học liệu/kg thể trọng chuột [23], cho thấy độc tính của các loài Bình vôi không có khác biệt lớn

Các nghiên cứu về độc tính của Bình vôi đã chỉ ra rằng các chất phân lập từ cây này có thể gây độc tế bào ung thư và tổn thương gan Đặc biệt, L-tetrahydropalmatin là một hoạt chất được nghiên cứu nhiều, có tác dụng an thần tốt nhưng lại gây độc khi dùng liều cao Các nghiên cứu cũng chỉ ra rằng thành phần alcaloid trong củ Bình vôi, bao gồm L-tetrahydropalmatin, có thể gây độc lên hệ thần kinh trung ương và gan khi sử dụng liều cao Do đó, khi sử dụng Bình vôi, cần quan tâm đến liều dùng để đảm bảo an toàn và hiệu quả.

Việc đánh giá độc tính cấp và xác định LD 50 của hai loài Bình vôi là cơ sở để sử dụng dược liệu an toàn hơn Theo nghiên cứu, liều tối đa nên dùng cho chuột nhắt của S viridiflavens là 488 mg/kg và S venosa là 571 mg/kg, tương đương 1/10 giá trị LD 50 đã xác định Khi quy đổi sang liều dùng cho người, mức liều tối đa tương ứng là 41 mg/kg và 48 mg/kg, giúp đảm bảo an toàn khi sử dụng dược liệu này.

48 mg/kg (bằng 1/12 liều so với chuột nhắt)

Về tác dụng giảm đau của hai loài Bình vôi nghiên cứu

Các loài thuộc chi Stephania Lour đã được chứng minh sở hữu nhiều tác dụng sinh học quý giá, bao gồm giảm đau, an thần và giảm đau dây thần kinh, thu hút sự quan tâm nghiên cứu từ các nhà khoa học trong nước và trên toàn thế giới.

Ở Việt Nam, đặc biệt là các tỉnh miền núi phía Bắc như Yên Bái, Lào Cai, Sơn La, các loài thuộc chi Stephania Lour thường được nhân dân sử dụng để điều trị bệnh thoái hóa khớp, vôi hóa khớp và viêm khớp Do đó, nghiên cứu này đã tiến hành thử nghiệm tác dụng giảm đau và chống viêm của các loài thuộc chi này để đánh giá hiệu quả của chúng trong điều trị các bệnh lý liên quan đến khớp.

- Về tác dụng giảm đau ngoại vi trên mô hình gây đau quặn bằng acid acetic

Phương pháp nghiên cứu sử dụng mô hình gây đau quặn trên chuột nhắt bằng acid acetic, một mô hình gây đau kinh điển, để đánh giá tác dụng giảm đau của thuốc Thiết kế liều trong nghiên cứu dựa vào tri thức dân gian, với liều sử dụng từ 10 g đến 12 g dược liệu, có khi lên đến 30 g, tùy thuộc vào từng bài thuốc Các chế phẩm thử được pha từ cao đặc của Bình vôi và sử dụng trên đối tượng chuột nhắt trắng với ba mức liều khác nhau, bao gồm 1/2 liều dùng trên người, tương đương liều dùng trên người và gấp 2 lần liều dùng trên người Cụ thể, chế phẩm thử S viridiflavens được sử dụng với liều 260 mg/kg, 520 mg/kg và 1040 mg/kg, trong khi chế phẩm thử S venosa được sử dụng với liều 290 mg/kg, 580 mg/kg và 1160 mg/kg.

Kết quả nghiên cứu cho thấy cả S viridiflavens và S venosa đều có tác dụng giảm số cơn đau quặn đáng kể Đặc biệt, S venosa thể hiện xu hướng giảm đau tốt hơn so với S viridiflavens Ở mức liều thấp nhất, S viridiflavens (260 mg/kg) đã làm giảm chỉ số cơn đau quặn từ phút thứ, cho thấy hiệu quả giảm đau đáng kể của cả hai loại thảo mộc này.

Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng S viridiflavens và S venosa có hiệu quả giảm đau quặn, đặc biệt là ở liều tương đương với liều dùng trên người, với S viridiflavens liều 520 mg/kg và S venosa liều 580 mg/kg cho kết quả giảm đau tốt Tuy nhiên, khi tăng liều gấp đôi (S viridiflavens liều 1040 mg/kg và S venosa liều 1160 mg/kg), mặc dù vẫn có hiệu quả giảm đau, nhưng lại gây ra tử vong ở một số cá thể Điều này cho thấy cần phải cân nhắc kỹ lưỡng về hiệu quả và độ an toàn của mức liều này trong các thử nghiệm tiếp theo.

Trong mô hình này acid acetic là nguyên nhân gián tiếp gây giải phóng bradykinin, serotonin, histamin và các prostaglandin, chính những chất này gây ra

Luận án tiến sĩ Dược học đã chứng minh rằng S viridiflavens có thể đáp ứng hiệu quả đối với đau quặn Cụ thể, tác dụng giảm đau quặn của S viridiflavens và S venosa có thể được giải thích là do khả năng ức chế sự tổng hợp prostaglandin và các chất trung gian hóa học gây viêm khác.

Để đánh giá tác dụng giảm đau trung ương của hai loài bình vôi, nghiên cứu đã tiến hành thử nghiệm trên mô hình mâm nóng với ba mức liều S viridiflavens và S venosa Mô hình này được lựa chọn vì tính đơn giản, thời gian thực hiện ngắn và dễ áp dụng trong điều kiện phòng thí nghiệm, giúp đánh giá hiệu quả giảm đau của hai loài này.

Nghiên cứu đã chỉ ra rằng cả hai chế phẩm thử S viridiflavens và S venosa đều mang lại hiệu quả giảm đau tốt ở cả hai mức liều quy đổi, bao gồm liều dùng tương đương với liều dùng trên người và liều cao gấp 2 lần Cụ thể, S viridiflavens ở liều 520 mg/kg và S venosa ở liều 580 mg/kg đã cho thấy tác dụng giảm đau đáng kể Tuy nhiên, ở mức liều thấp nhất, không có tác dụng giảm đau trung ương được ghi nhận Ngược lại, ở mức liều cao nhất, thời gian đo đau của chuột được kéo dài hơn, thậm chí có một số cá thể không có phản xạ nhảy lên hoặc liếm chân.

Nghiên cứu cho thấy tác dụng giảm đau của củ bình vôi có thể đạt được chỉ trong vòng 60 giây, chứng tỏ hiệu quả giảm đau ở mức liều cao là rất tốt Tuy nhiên, khi sử dụng mức liều cao, các thành phần alcaloid trong củ bình vôi, đặc biệt là L-tetrahydropanmaltin (rotundin), có thể gây ra tình trạng chuột li bì và mất phản xạ nhảy lên hoặc liếm chân làm kéo dài thời gian đáp ứng đau Điều này cho thấy rotundin có thể có tác dụng giải lo âu, an thần thông qua tương tác với receptor GABA khi sử dụng ở mức liều thấp.

Tiêu đề	Nghiên Cứu Đặc Điểm Thực Vật, Thành Phần Hóa Học Và Một Số Tác Dụng Sinh Học Hai Loài Stephania Lour. Ở Việt Nam
Tác giả	Hoàng Văn Thủy
Người hướng dẫn	GS. TS. Phạm Thanh Kỳ, PGS. TS. Nguyễn Quốc Huy
Trường học	Trường Đại Học Dược Hà Nội
Chuyên ngành	Dược Liệu - Dược Học Cổ Truyền
Thể loại	Luận Án Tiến Sĩ Dược Học
Năm xuất bản	2020
Thành phố	Hà Nội

Định dạng
Số trang	346
Dung lượng	7,29 MB