Xác định tính đa hình của các gen tp53 và gen mdm2 ở bệnh nhân ung thư phổi

TỔNG QUAN

Ung thư phổi

1.1.1 Dịch tễ học ung thư phổi

 Tình hình ung thư phổi trên thế giới

Ung thư phổi hiện đang là loại ung thư phổ biến nhất và có tỷ lệ tử vong cao nhất trên toàn cầu Theo số liệu từ Globocan 2012, thế giới ghi nhận khoảng 1,82 triệu ca ung thư phổi mới và khoảng 1,59 triệu ca tử vong do căn bệnh này Tại Hoa Kỳ, thống kê năm 2016 cho thấy ung thư phổi đứng đầu về tỷ lệ tử vong và đứng thứ hai về tỷ lệ mắc mới ở cả hai giới, với khoảng 224.390 ca ung thư phổi mới được phát hiện và 158.080 ca tử vong, chiếm 26,5% tổng số ca tử vong do ung thư.

Hình 1.1: Tỷ lệ mới mắc ung thư phổi ở nam giới chuẩn hóa theo tuổi

Luận án tiến sĩ Y học

Hình 1.2: Tỷ lệ mới mắc ung thư phổi ở nữ giới chuẩn hóa theo tuổi

Ung thư phổi phổ biến hơn ở nam giới, với khoảng 1.241.600 ca mới được phát hiện vào năm 2012, chiếm 68% tổng số ca ung thư phổi Tỷ lệ nam/nữ là 2,1/1 toàn cầu, 2,4/1 ở các nước đang phát triển và 1,8/1 ở các nước phát triển Dù ung thư phổi ở nữ giới đứng thứ 3 trong các loại hình ung thư, số ca tử vong chỉ xếp sau ung thư vú Theo Hiệp hội ung thư Hoa Kỳ, năm 2007 có khoảng 114.760 ca ung thư phổi ở nam và 98.620 ca ở nữ, trong khi năm 2016, con số này là 117.920 và 106.470 Điều này cho thấy ung thư phổi đang giảm ở nam giới nhưng gia tăng nhanh chóng ở nữ giới, đặc biệt là ở Hoa Kỳ, nơi tỷ lệ gần như đạt 1/1.

 Tình hình ung thư phổi tại Việt Nam

Theo dữ liệu từ Globocan 2012, Việt Nam ghi nhận tỷ lệ ung thư phổi cao nhất thế giới ở nam giới với hơn 33 ca mới mắc trên 100.000 dân, và đứng thứ 4 ở nữ giới với khoảng 8,1-14,0 ca/100.000 dân, cho thấy tình hình ung thư tại nước ta đang ở mức đáng báo động.

Theo các ghi nhận ung thư mới nhất tại Việt Nam, sau 10 năm từ 2000 đến

Từ năm 2000 đến 2010, tỷ lệ mắc ung thư phổi ở nữ giới đã tăng hơn 200%, từ 6,4/100.000 dân lên 13,9/100.000 dân, cho thấy ung thư phổi là một trong năm loại ung thư có tốc độ gia tăng nhanh nhất.

Tại Trung tâm Hô hấp - Bệnh viện Bạch Mai, số ca ung thư phổi nhập viện đang gia tăng đều đặn qua các năm Cụ thể, giai đoạn 1969-1972 ghi nhận 89 trường hợp, từ 1974-1978 có 186 trường hợp, trong khi giai đoạn 1981-1985 tăng lên 285 trường hợp Đặc biệt, từ 1996 đến 2000, số ca ung thư phổi đã lên tới 639 trường hợp, chiếm 16,6% tổng số bệnh nhân điều trị, đứng thứ hai sau bệnh phổi tắc nghẽn mạn tính.

Ung thư phổi là loại ung thư phổ biến nhất toàn cầu và tại Việt Nam Dù đã có nhiều tiến bộ trong việc chẩn đoán và điều trị, tỷ lệ tử vong do ung thư phổi vẫn không giảm đáng kể, chủ yếu do phần lớn bệnh nhân được phát hiện ở giai đoạn muộn.

1.1.2 Bệnh nguyên, bệnh sinh ung thư phổi

Ung thư, đặc biệt là ung thư phổi, phát sinh và phát triển qua một quá trình phức tạp với nhiều giai đoạn Quá trình này chịu ảnh hưởng từ các yếu tố nguy cơ, bao gồm yếu tố môi trường và cá thể, dẫn đến biến đổi trong bộ gen tế bào Những biến đổi này khiến tế bào không ngừng tăng sinh, biệt hóa, xâm lấn và di căn.

 Các yếu tố nguy cơ ung thư phổi

Cho đến nay, người ta đã xác định được nhiều yếu tố nguy cơ gây ung thư phổi, trong đó yếu tố nguy cơ chính là hút thuốc lá

- Thuốc lá và ung thư phổi

Hút thuốc lá là nguyên nhân chính gây ung thư phổi, đặc biệt liên quan đến ung thư biểu mô vảy và ung thư tế bào nhỏ Tác động gây ung thư của khói thuốc lá đã được xác nhận từ những năm 1950 và được công nhận bởi các cơ quan quản lý y tế.

Khói thuốc lá chứa khoảng 4.000 loại hóa chất, trong đó có hơn 60 chất gây ung thư, với các PAHs (Hydrocarbon thơm đa vòng) như 3-4 Benzopyren là những phân tử quan trọng nhất liên quan đến ung thư phổi Khói thuốc có cả pha hơi và pha hạt, trong đó nồng độ gốc tự do rất cao, lên tới 10^15 gốc tự do trong mỗi gam ở pha hơi và 10^17 gốc tự do ở pha hạt Nicotin trong thuốc lá liên kết với thụ thể acetylcholine trên màng tế bào, kích hoạt các kênh canxi và ion khác, dẫn đến sự nghiện nicotin do tăng biểu hiện thụ thể sau thời gian dài tiếp xúc Mặc dù không có bằng chứng cho thấy nicotin gây ra khối u, nhưng nó có liên quan đến sự tiến triển của các khối u hiện có, đặc biệt là ung thư phổi, đại tràng và dạ dày.

Khoảng 80-85% các trường hợp ung thư phổi trên toàn cầu liên quan đến việc hút thuốc lá Nguy cơ mắc bệnh tăng lên tùy thuộc vào nhiều yếu tố, bao gồm tuổi bắt đầu hút thuốc (hút càng sớm, nguy cơ càng cao), số lượng bao thuốc mỗi năm (số lượng càng lớn, nguy cơ càng cao) và thời gian hút thuốc (thời gian hút càng dài, nguy cơ càng cao).

Luận án tiến sĩ Y học nguy cơ mắc bệnh càng lớn), nguy cơ ung thư phổi ở người hút thuốc lá cao gấp 10 –

Nguy cơ mắc ung thư phổi ở người hút thuốc cao gấp 20 lần so với người không hút thuốc, và mức độ rủi ro tăng theo thời gian và số lượng thuốc lá hút Cụ thể, việc hút một gói thuốc lá mỗi ngày trong 40 năm nguy hiểm hơn so với hút hai gói mỗi ngày trong 20 năm Ngoài ra, những người không trực tiếp hút thuốc nhưng thường xuyên tiếp xúc với khói thuốc lá (hút thuốc thụ động) cũng có nguy cơ mắc ung thư phổi rất cao Hút thuốc thụ động là một yếu tố khó đo lường và có thể gây nhiễu trong các nghiên cứu về ung thư phổi.

- Các yếu tố nguy cơ khác

Mặc dù hút thuốc lá là nguyên nhân chính gây ung thư phổi, khoảng 15-20% trường hợp ung thư phổi không có tiền sử hút thuốc Các yếu tố khác như ô nhiễm không khí, bức xạ ion hóa, phơi nhiễm nghề nghiệp, virus, chế độ ăn uống và tiền sử bệnh phế quản phổi cũng được xác định là nguy cơ gây ung thư phổi.

Bức xạ ion hóa, đặc biệt là từ radon, làm tăng nguy cơ ung thư phổi, điều này đã được chứng minh qua các trường hợp sống sót sau thả bom nguyên tử và bệnh nhân xạ trị Radon, khí phóng xạ tự nhiên từ sự phân hủy uranium trong đất, là yếu tố nguy cơ cao đối với ung thư phổi, đặc biệt trong môi trường sống Hiện nay, mối quan tâm chủ yếu xoay quanh phơi nhiễm radon trong nhà, được xem là nguyên nhân quan trọng gây ung thư phổi và là yếu tố nguy cơ thứ hai hàng đầu tại Hoa Kỳ, đặc biệt ở những người không hút thuốc.

[24] Ngoài ra, những người có nghề nghiệp phơi nhiễm với các chất có khả năng gây

Luận án tiến sĩ Y học ung thư như amiăng, silic, kim loại nặng và hydrocarbon thơm đa vòng cũng tăng nguy cơ mắc ung thư phổi [24]

Yếu tố gen di truyền ảnh hưởng đến cách mỗi cá thể phản ứng với môi trường, với thống kê cho thấy phần lớn bệnh nhân ung thư phổi là người hút thuốc, nhưng chỉ khoảng 15% trong số họ thực sự mắc bệnh Các biến thể di truyền có thể đóng vai trò quan trọng trong khả năng sống sót khi đối diện với các yếu tố nguy cơ Gia đình có người mắc ung thư phổi, đặc biệt là ở độ tuổi trẻ, có nguy cơ cao hơn do thừa hưởng gen nhạy cảm hoặc cùng sống trong môi trường tác động đến sức khỏe Ngoài ra, chế độ ăn uống, uống rượu, bệnh viêm nhiễm mạn tính ở phổi và ô nhiễm môi trường cũng được xem là các yếu tố nguy cơ của ung thư phổi.

 Cơ chế phân tử trong ung thư phổi

Nghiên cứu ở cấp độ phân tử chỉ ra rằng ung thư phổi phát triển qua nhiều giai đoạn, chịu ảnh hưởng từ các yếu tố nguy cơ, sự mẫn cảm gen và tích lũy đột biến trên các gen gây ung thư và gen áp chế ung thư Các cơ chế điều hòa gen hoạt động chặt chẽ, nhưng khi bị rối loạn, sẽ dẫn đến sự tăng cường hoặc ức chế bất thường các gen chức năng.

Hình 1.3: Các con đường tín hiệu phân tử trong bệnh sinh ung thư phổi [3]

(Theo Pass và cộng sự)

Tổng quan về SNP

Theo Viện sức khoẻ quốc gia Hoa Kỳ (NIH), single nucleotide polymorphisms (SNPs) là biến đổi di truyền phổ biến nhất ở người Mỗi SNP thể hiện sự khác biệt chỉ ở một nucleotid trong cấu trúc DNA Ví dụ, một SNP có thể thay thế nucleotid cytosin (C) bằng thymin (T) trong một đoạn DNA nhất định.

SNPs là hiện tượng phổ biến trong chuỗi DNA của mỗi người, hình thành do nhiều nguyên nhân khác nhau Những biến đổi này có thể ảnh hưởng đến các đặc điểm di truyền và sức khỏe của cá nhân.

Luận án tiến sĩ Y học cho thấy hệ gen của con người tự biến đổi và sửa chữa để thích nghi với môi trường sống Qua tiến hóa và chọn lọc tự nhiên, những biến thể thích nghi xuất hiện với tần số ổn định trong quần thể Tính đa hình của gen được định nghĩa bởi các điểm đa hình trên một gen, trong đó không phải mọi biến đổi nucleotid đều là SNP; để được công nhận là SNP, sự thay đổi nucleotid phải xuất hiện với tần suất từ 1% trở lên trong quần thể Với khoảng 10 triệu SNP trong bộ gen người, những biến thể này thường nằm trong đoạn DNA không mã hóa, ít ảnh hưởng đến chức năng protein và kiểu hình Tuy nhiên, chúng có thể là dấu ấn sinh học giúp xác định vị trí các gen liên quan đến bệnh Khi SNPs xuất hiện trong một gen hoặc khu vực điều khiển của gen, chúng có thể ảnh hưởng đến chức năng của gen và liên quan đến các bệnh lý cụ thể.

Hầu hết các SNPs không ảnh hưởng đến sức khỏe và sự phát triển cơ thể, nhưng một số SNPs lại đóng vai trò quan trọng trong nghiên cứu sức khỏe con người Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng SNPs có thể dự đoán phản ứng của cá nhân với thuốc, độ nhạy cảm với yếu tố môi trường như độc tố, và nguy cơ phát triển bệnh Chúng cũng có thể được dùng để theo dõi di truyền bệnh trong gia đình Xu hướng nghiên cứu hiện nay tập trung vào mối liên hệ giữa SNPs và các bệnh lý phức tạp như bệnh tim, tiểu đường, và ung thư, nhằm phát triển y học cá thể hóa trong điều trị.

Hình 1.9: Hiện tượng đa hình nucleotid đơn

Sự thay thế một nucleotid trong phân tử DNA có thể tạo nên những kiểu hình khác nhau trong quần thể (Nguồn: http://molecularbiologynews.org)

Dựa vào vị trí, SNPs được phân chia thành 2 loại chính [54]:

SNPs liên kết, hay còn gọi là SNPs chỉ thị, không nằm trong gen và không ảnh hưởng đến chức năng tổng hợp protein Tuy nhiên, chúng thường được phát hiện gần các gen liên quan đến bệnh, vì vậy có thể sử dụng SNPs như dấu hiệu sinh học để xác định bệnh hoặc gen gây bệnh.

SNPs trong gen có vai trò quan trọng trong việc ảnh hưởng đến chức năng của protein, liên quan đến sự phát triển của bệnh và tác động đến đáp ứng với thuốc điều trị.

 SNPs mã hoá nằm trên vùng mã hoá của gen dẫn đến sự thay đổi acid amin của protein do gen đó mã hoá

 SNPs không mã hóa nằm trong vùng điều hoà của gen có thể dẫn đến thay đổi mức độ biểu hiện gen thông qua mức độ RNA và protein

1.2.3 Vai trò và ứng dụng của SNPs trong Y học

Các biến thể trong trình tự DNA của con người có thể ảnh hưởng đến cách cơ

Luận án tiến sĩ Y học thể phát triển bệnh nghiên cứu cách cơ thể phản ứng với các tác nhân gây bệnh, hóa chất, thuốc, và vaccin, trong đó các SNP (biến thể đơn nucleotid) được coi là chìa khóa tiềm năng cho y học cá thể hóa SNP đóng vai trò quan trọng trong các nghiên cứu y học, đặc biệt là trong các nghiên cứu toàn bộ hệ gen (GWAS), giúp so sánh các vùng gen giữa bệnh nhân và người khỏe mạnh Một SNP đơn có thể gây ra bệnh di truyền, trong khi các bệnh phức tạp thường liên quan đến sự tương tác của nhiều SNP cùng với yếu tố môi trường Phát hiện gần đây về SNP trong GWAS không chỉ hỗ trợ phát hiện biến thể di truyền mà còn thúc đẩy nghiên cứu phòng ngừa và chữa bệnh trong tương lai Mỗi cá nhân có đặc điểm gen phức tạp, trong đó SNP đóng vai trò quan trọng, với nhiều SNP được sử dụng làm chỉ thị trong lập bản đồ gen liên quan đến bệnh SNP là kiểu đa hình phổ biến nhất, chiếm 80% sự biến đổi trong hệ gen người, nắm giữ chìa khóa phân tử quan trọng cho cơ thể sống.

SNPs có nhiều chức năng khác nhau tùy thuộc vào vị trí của chúng trong bộ gen và những thay đổi mà chúng gây ra Câu hỏi đặt ra là liệu SNPs có phải là yếu tố thúc đẩy quá trình ác tính hóa hay chỉ là một phần của sự biến đổi ác tính của tế bào, hoặc chỉ là sự trùng hợp ngẫu nhiên Để trả lời câu hỏi này, cần thực hiện nhiều nghiên cứu sâu hơn về mối liên hệ giữa SNPs và các bệnh lý, đặc biệt là ung thư, nhằm cung cấp những hiểu biết toàn diện để cải thiện việc phòng ngừa, điều trị và tiên lượng bệnh.

1.2.4 SNPs và ung thư phổi

Nghiên cứu về SNPs và ung thư thường tập trung vào hai khía cạnh chính: đầu tiên là sự nhạy cảm của cơ thể đối với bệnh ung thư, và thứ hai là kết quả điều trị, bao gồm thời gian sống thêm và các biến chứng có thể xảy ra.

Luận án tiến sĩ Y học nghiên cứu về đáp ứng với thuốc điều trị, tập trung vào các SNPs của các gen liên quan đến cơ chế ung thư như oncogene và gen áp chế ung thư Nghiên cứu cũng xem xét các gen quy định enzyme sửa chữa DNA và quá trình chuyển hóa xenobiotic.

Sự nhạy cảm với ung thư là kết quả của một quá trình phức tạp, bao gồm nhiều giai đoạn dưới tác động của các yếu tố nguy cơ, mẫn cảm gen và sự tích lũy đột biến gen Nhiều nghiên cứu về ung thư phổi đã khảo sát các gen quan trọng trong chuyển hoá khói thuốc lá và nghiện nicotin, nhằm xác định tương tác giữa yếu tố nguy cơ cao và kiểu gen nhạy cảm hoặc bảo vệ Tương tác này đóng vai trò như một stress ảnh hưởng đến biểu hiện kiểu hình của các SNP nguyên nhân Chẳng hạn, gen myeloperoxidase (MPO) đã được nghiên cứu rộng rãi, cho thấy sự biến đổi nucleotid từ G thành A ở vị trí 463 của promoter gần dẫn đến giảm biểu hiện mRNA MPO, và những người mang kiểu gen đồng hợp tử AA có nguy cơ thấp hơn đáng kể phát triển ung thư phổi so với những người có đồng hợp tử GG.

Biến thể di truyền có thể ảnh hưởng đến kết quả điều trị, hỗ trợ bác sĩ trong việc ra quyết định lâm sàng Nghiên cứu của Ling Zhang và cộng sự năm 2012 đã chỉ ra mối liên quan giữa tính đa hình của các gen trong đường sửa chữa cắt bỏ nucleotid (NER) và khả năng dung nạp hóa trị của bệnh nhân UTPKTBN Cụ thể, gen MMS19L có liên quan đến các tác dụng phụ như giảm bạch cầu (p = 0,020), vàng da (p = 0,037) và tăng creatinine (p = 0,013) Ngoài ra, MMS19L cũng liên quan đến giảm tiểu cầu (p = 0,035) và RRM1 có mối liên hệ với triệu chứng nôn (p = 0,046) cùng các tác dụng phụ khác (p = 0,047).

Luận án tiến sĩ Y học cho thấy rằng nhóm 5 có mối liên hệ đáng kể với nhiễm trùng (p = 0,017) Các tác giả đã xác định một số SNPs của các gen trong con đường NER liên quan đến độc tính của hóa trị liệu kép ở bệnh nhân UTPKTBN, đặc biệt là SNPs của MMS19L, RRM1 và ERCC5.

Gen TP53 và gen MDM2

Gen TP53 nằm trên nhánh ngắn của nhiễm sắc thể 17 (17p13.1) và có chiều dài 20kb, bao gồm 11 exon (E1 đến E11, trong đó E1 không mã hóa) và 10 intron Gen này chịu trách nhiệm mã hóa cho protein p53, một phosphoprotein có trọng lượng phân tử đặc trưng trong cơ thể người.

53 kDa bao gồm 393 acid amin với 3 vùng chức năng khác nhau [4]:

- Vùng hoạt hóa N tận (NH2-terminal acidic transactivation domain) bao gồm:

 Vùng amin tận (1-42): vùng này cần thiết cho hoạt động sao chép và tương tác với MDM2

Vùng giàu prolin (61-94) có vai trò quan trọng trong chức năng pro-apoptosis và điều hòa hoạt động của gen p53 Việc xóa bỏ vùng này sẽ dẫn đến mất hoàn toàn khả năng pro-apoptosis của gen p53.

- Vùng gắn kết DNA (DNA binding domain) gồm các acid amin từ 102-292 và gắn kết các DNA có trình tự đặc biệt

- Vùng C tận (COOH-terminal oligomerization domain OD) bao gồm:

 Vùng tetramerization (324-355) tạo cấu trúc bậc 4 của p53

Vùng điều hòa nhóm carboxyl tận (363-393) đóng vai trò quan trọng trong việc điều chỉnh sự gắn kết DNA với vùng trung tâm và có liên quan đến quá trình apoptosis Khi sự tương tác giữa vùng C tận và vùng gắn DNA bị gián đoạn, vùng gắn DNA bị tổn thương sẽ được kích hoạt, dẫn đến sự gia tăng quá trình phiên mã.

Ngoài 3 vùng chức năng điển hình, protein p53 còn có vài vùng đặc trưng cần thiết cho hoạt động của p53 như NLS (Nuclear Localization Signals), NES (Nuclear Export Signal) giàu Leucin

Hình 1.10: Cấu trúc phân tử protein p53

(Theo Bai và cộng sự [4])

 Vai trò của gen TP53 trong bệnh sinh ung thư

Gen TP53 đóng vai trò then chốt trong việc sửa chữa DNA, kiểm soát chu kỳ tế bào và quá trình apoptosis Khi gen TP53 bị khiếm khuyết, sự tăng sinh tế bào bất thường xảy ra, dẫn đến nguy cơ hình thành ung thư Dưới tác động của các yếu tố như tổn thương DNA, stress tế bào, thiếu oxy và sự biểu hiện quá mức oncogen, protein p53 sẽ được kích hoạt để ngăn chặn chu kỳ phân bào cho đến khi DNA được sửa chữa, hoặc kích thích apoptosis nếu tổn thương không thể khắc phục Do đó, p53 được coi là "trạm gác" của bộ gen tế bào Bên cạnh đó, p53 còn có khả năng điều chỉnh hoạt động của một số gen khác.

- Vai trò kiểm soát chu kỳ tế bào

Gen TP53 có khả năng ngăn chặn chu kỳ tế bào tại các pha G1/S và G2/M thông qua việc tác động lên các gen điều tiết chu kỳ phân chia tế bào, bao gồm GADD 45, p21 và 14-3-3δ.

Sự dừng chu kỳ tế bào cho phép tế bào sửa chữa tổn thương DNA trước khi tiến vào giai đoạn tổng hợp DNA và nguyên phân Để bước vào pha S, tế bào cần enzyme cdk2, trong khi pha M yêu cầu enzyme cdc2 Cdk2 có thể bị ức chế bởi p21, trong khi cdc2 bị ức chế bởi p21, GADD45 và 14-3-3δ.

Khi DNA bị tổn thương, p53 gây tăng phiên mã p21 p21 có 2 vùng gắn với

Protein p21-CIP và p21-WAF1 đóng vai trò quan trọng trong việc điều tiết chu trình tế bào bằng cách bất hoạt các phức hợp cyclinE-CDK2 và CyclinD1-CDK4 Khi các phức hợp CDK bị bất hoạt, chúng không thể phosphoryl hóa pRB, dẫn đến pRB ở dạng kích hoạt và gắn kết với E2F E2F, một yếu tố phiên mã, kích hoạt các gen như myc và myb, tham gia vào quá trình nhân lên DNA trong pha S Sự hình thành phức hợp pRB-E2F ngăn cản chu trình tế bào chuyển từ pha G1 sang pha S, do đó làm dừng chu trình phân bào ở pha G1 cho đến khi DNA được sửa chữa.

Gen TP53 kích thích sự phiên mã của GADD 45, một protein có khả năng gắn vào CDC2, ngăn chặn sự hình thành phức hợp cyclin B/CDC2 và ức chế hoạt động của enzym kinase GADD 45 cũng ảnh hưởng đến quá trình nhân đôi DNA trong pha S bằng cách liên kết với PCNA, làm cản trở sự hoạt động của DNA polymerase Protein 14-3-3δ tham gia vào việc loại bỏ cyclin B/CDC2 khỏi nhân tế bào, tách biệt cyclin B/CDC2 khỏi các protein đích Sự biểu hiện quá mức của 14-3-3δ dẫn đến việc ngừng chu kỳ tế bào ở pha G2.

Hình 1.11: Cơ chế kiểm soát chu kỳ tế bào của p53 qua trung gian p21

- Vai trò khởi phát Apoptosis

Gen TP53 gây apoptosis thông qua yếu tố Bax (Bcl-2-associated X protein),

The article discusses key proteins involved in apoptosis, including DR5/KILLER, DRAL, Fas/CD95, PIG3, Puma, PIDD, PERP, Apaf-1, Scotin, and p53AIP1 These proteins are integral to both the intrinsic (mitochondrial) and extrinsic (death receptor) pathways of cell death Additionally, p53 plays a crucial role by directly activating Apaf-1 to initiate apoptosis, highlighting its significance in regulating cell death mechanisms.

 Tính đa hình gen TP53

Nghiên cứu đã chỉ ra rằng có nhiều SNPs được phát hiện trong cả vùng mã hóa và không mã hóa của gen TP53, như thể hiện trong hình 1.16.

Luận án tiến sĩ Y học này đã xác định các kiểu gen khác nhau của gen TP53 trong cộng đồng Một số SNPs được phát hiện có vai trò quan trọng trong sự phát sinh và phát triển của nhiều loại ung thư, và do đó, chúng được coi là những yếu tố nguy cơ cần được chú ý.

Hình 1.12: Các SNPs trên các vùng mã hóa và không mã hóa của gen TP53 [11]

Một số SNPs như P47S, R72P, V217M, G360A đã được xác định là làm tăng nguy cơ ung thư ở người, theo nghiên cứu của Whibley và cộng sự Đặc biệt, hiện tượng đa hình do sự thêm 16 base-pairs tại vùng không mã hóa thứ 3 (intron-3) của TP53 dẫn đến mức biểu hiện protein p53 thấp, làm gia tăng nguy cơ mắc các loại ung thư như ung thư phổi, ung thư vú và ung thư đại trực tràng Các SNPs ở vùng mã hóa của p53 tại các bộ ba mã hóa 21 (GAC → GAT), 34 (CCC → CCA) và 36 (CCG → CCT) không làm thay đổi trình tự acid amin nhưng cũng giảm sự biểu hiện của protein p53 Nghiên cứu đã chỉ ra rằng các SNPs này nằm tại vùng N-tận của TP53, nơi có vị trí tương tác với MDM2, làm giảm khả năng dịch mã của TP53 mRNA.

Luận án tiến sĩ Y học mã hóa cho thấy rằng sự thay đổi trình tự acid amin có thể ảnh hưởng đến khả năng bám của protein TP53 vào đoạn trình tự đặc hiệu của gen đích Những thay đổi này không chỉ tác động đến quá trình hoàn thiện và tính ổn định của protein, mà còn ảnh hưởng đến khả năng tương tác của p53 với các protein nội bào Cụ thể, các SNPs nằm tại các bộ ba mã hóa 47 (P47S) và 72 (R72P) đóng vai trò quan trọng trong những biến đổi này.

Dưới tác động của protein p38 và HIPK2, p53 được phosphoryl hóa tại vị trí S46, dẫn đến việc tăng cường sao chép các gen liên quan đến quá trình chết theo chương trình (apoptosis) Khi alen TP53-P47 bị thay thế bởi alen TP53-S47, sự phosphoryl hóa tại vị trí S46 giảm, làm giảm hoạt tính tác động lên các gen đích của quá trình thực bào và tăng khả năng mắc ung thư.

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Đối tượng nghiên cứu

Nghiên cứu được tiến hành trên 220 bệnh nhân ung thư phổi nguyên phát tại Trung tâm Hô hấp, Trung tâm Y học hạt nhân và Ung bướu - Bệnh viện Bạch Mai, cùng với 230 đối chứng, trong thời gian từ tháng 10 năm 2013 đến tháng 12 năm 2014.

Tại Trung tâm Hô Hấp, Trung tâm Y học hạt nhân và Ung bướu - Bệnh viện Bạch Mai, 220 bệnh nhân đã được chẩn đoán xác định mắc ung thư phổi thông qua kết quả xét nghiệm mô bệnh học.

- Đồng ý tham gia nghiên cứu

- Ung thư phổi thứ phát

- Ung thư phổi có kèm theo các ung thư khác

- Không đồng ý tham gia nghiên cứu

Trong nghiên cứu này, 230 đối chứng đã được lựa chọn từ những người đến khám sức khỏe tại khoa Khám bệnh của Bệnh viện Bạch Mai Tất cả nhóm chứng đều trải qua khám lâm sàng, thực hiện các xét nghiệm cận lâm sàng, chụp X-quang phổi và siêu âm, và được kết luận không mắc ung thư phổi hay bất kỳ loại ung thư nào khác.

- Tương ứng về tuổi và giới với nhóm bệnh nhân ung thư phổi.

Phương pháp nghiên cứu

- Nghiên cứu mô tả cắt ngang có đối chứng

Cỡ mẫu nghiên cứu được tính toán dựa trên công thức tính cỡ mẫu cho so sánh

2 tỷ lệ của Tổ chức Y tế thế giới: n: cỡ mẫu

P 1 =0,3: tỷ lệ biến thể liên quan đến ung thư của nhóm bệnh [88]

P 2 =0,2: tỷ lệ biến thể liên quan đến ung thư của nhóm chứng [88]

Cỡ mẫu của nghiên cứu tối thiểu phải được 178 bệnh nhân và 178 đối chứng

2.2.3 Các chỉ số nghiên cứu

- Các thông tin: tuổi, giới, tình trạng hút thuốc lá

Các xét nghiệm cận lâm sàng bao gồm xét nghiệm tế bào học và mô bệnh học, được thực hiện từ các bệnh phẩm lấy qua soi phế quản, chọc hút qua thành ngực và sinh thiết.

Kết quả mô bệnh học được coi là tiêu chuẩn vàng trong việc lựa chọn nhóm bệnh nhân ung thư phổi Để đảm bảo tính chính xác, kết quả này cần được các bác sĩ giải phẫu bệnh tại Bệnh viện Bạch Mai đọc và xác nhận là ung thư phổi nguyên phát.

Thông tin về hút thuốc lá được thu thập qua phỏng vấn bệnh nhân, bao gồm việc xác định bệnh nhân có hút thuốc hay không Nếu có, phỏng vấn sẽ hỏi về số lượng điếu thuốc hút trong một ngày và thời gian hút thuốc Từ đó, số bao-năm được tính bằng cách nhân số bao hút trong một ngày với số năm hút thuốc, trong đó 20 điếu thuốc được quy đổi thành 1 bao thuốc.

- Các đa hình gen được phân tích

+ Thêm đoạn 16 cặp base tại intron 3 (dup 16)

+ SNP P34P, tại codon 34, exon 4 (CCC →CCA), mã hoá Prolin

+ SNP P36P, tại codon 36, exon 4 (CCG →CCA), mã hoá Prolin

+ SNP P47S, tại codon 47, exon 4, (CCG hoặc TCG), tương ứng với Prolin hoặc Serin

+ SNP R72P tại codon 72, exon 4, (CGC hoặc CCC), tương ứng với Arginin hoặc Prolin

+ SNP V217M, tại codon 217, exon 6, (GTG hoặc ATG), tương ứng với Valin hoặc Methionin

+ SNP G360A tại codon 360, exon 10, (GGG hoặc GCG), tương ứng với Glycin hoặc Alanin

 Gen MDM2 SNP 309 T>G : đa hình nucleotid đơn tại vị trí nucleotid 309, intron 1 vùng promoter của gen

2.2.4 Trang thiết bị, hóa chất

 Trang thiết bị: dụng cụ phải được vô trùng tuyệt đối (hấp ướt 120 o C trong 20 phút)

- Máy hấp vô trùng dụng cụ

- Máy Gene Amp PCR System 9700 (USA)

- Tủ lạnh sâu (-30 o C, -80 o C), tủ ấm

- Máy đọc trình tự gen 3100-Avant Genetic Analyzer của hãng ABI-PRISM

- Máy ly tâm để bàn Eppendorf (Đức), máy ly tâm lạnh Beckman (USA)

- Hệ thống điện di ngang Mupid (Nhật Bản)

- Máy soi gel và chụp ảnh tự động: Chemidoc EQ-Bio-Rad (USA)

- Máy đo nồng độ DNA Nano Drop 1000 (Mỹ)

- Pipette, pipette tip, polypropylene tube (200àL, 500 àL)

- Ống PCR, ống effpendorf 1,5ml, ống Falcon, găng tay, giấy thấm đã được vô trùng tuyệt đối

- Tách chiết DNA từ máu toàn phần: Kit Promega

- Kỹ thuật PCR: dung dịch đệm, cặp mồi đặc hiệu, dNTP, DNA polymerase,

Mg 2+ , nước cất 2 lần vô trùng

- Điện di sản phẩm PCR: gel agarose, dung dịch TBE (boric acid EDTA), ethidium bromide, loading dye, thang DNA chuẩn 100bp (marker 100bp)

- Tinh sạch sản phẩm PCR: Promega Wizard SV gel clean-up system (Promega

Inc.) gồm dung dịch gắn kết màng, dung dịch rửa màng, nước cất không có nuclease

+ Enzym MspAI nhận biết điểm cắt (CCG↓CTG) có vị trí nucleotid 309 của gen

MDM2 Sản xuất bởi Promega- USA

+ Enzym BstUI nhận biết điểm cắt (CG↓CG) tại vị trí codon 72 của gen TP53 Sản xuất bởi ThermoFisher scientific- Phần Lan

The BigDye Terminator v3.0 Ready Reaction Cycle Sequencing Kit from Applied Biosystems is essential for gene sequencing, comprising components such as BigDye Terminator v3.0 (including dATP, dCTP, dGTP, and dUTP), BigDye buffer, specific primers, and formamide solution The research process utilizing this kit is crucial for accurate genetic analysis.

 Lựa chọn đối tượng nghiên cứu, thu thập các chỉ số nghiên cứu, thu thập mẫu nghiên cứu

- Các đối tượng đủ tiêu chuẩn lựa chọn được khai thác thông tin theo bệnh án nghiên cứu mẫu (Phụ lục 1)

Trong nghiên cứu này, 2ml máu toàn phần được thu thập từ 220 bệnh nhân ung thư phổi tại Trung tâm Hô hấp và Trung tâm Y học Hạt nhân và Ung bướu, Bệnh viện Bạch Mai Để so sánh, 230 người khỏe mạnh đã được lựa chọn làm nhóm đối chứng.

+ Bảo quản mẫu trong tủ lạnh âm sâu (t o = -80 o C) cho đến khi phân tích mẫu

 Tách chiết DNA từ máu ngoại vi

- Tách chiết DNA toàn phần: theo kit Promega (Phụ lục 2)

Đo nồng độ và kiểm tra độ tinh sạch của DNA được thực hiện bằng phương pháp đo độ hấp thụ quang tại bước sóng 260 nm và 280 nm trên máy Nanodrop Kết quả OD được coi là đạt khi nồng độ DNA từ 20 ng/µl trở lên Đối với những mẫu có nồng độ DNA quá cao (>300 ng/µl), cần pha loãng để đưa về nồng độ dưới 100 ng/µl Độ tinh sạch của DNA được xác định qua tỷ số A260/A280, với mẫu DNA được coi là tinh sạch khi tỷ số này nằm trong khoảng từ 1,8 đến 2,0.

- Điện di DNA trên gel agarose để kiểm tra sự toàn vẹn của DNA

 Xác định các đa hình gen TP53 và gen MDM2

- Sử dụng kỹ thuật PCR xác định đột biến thêm 16bp tại vùng intron 3 của gen

+ Khuếch đại vùng gen chứa intron 3 gen TP53 bằng phương pháp PCR với cặp mồi đặc hiệu (Bảng 2.1)

+ Sản phẩm PCR sẽ được điện di trên gel agarose 3 % cùng với thang chuẩn 100→1000 (Phụ lục 4)

Hình ảnh điện di cho thấy rằng đoạn gen có thêm 16bp sẽ có kích thước 135bp, trong khi đoạn gen nguyên thủy chỉ có kích thước 119bp Cụ thể, kiểu gen A1A1 chỉ xuất hiện một băng 119bp, kiểu gen A1A2 có hai băng với kích thước 119bp và 135bp, còn kiểu gen A2A2 sẽ có một băng với kích thước 135bp.

Hình 2.1 Mô tả hình ảnh điện di xác định đa hình gen do thêm 16bp tại vùng intron 3 của gen TP53

- Sử dụng kỹ thuật PCR-RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism – PCR) xác định SNP R72P của gen TP53 (Phụ lục 5)

+ Khuếch đại vùng gen chứa SNP Arg72Pro của gen TP53 bằng phương pháp PCR với cặp mồi đặc hiệu (Bảng 2.1)

Phản ứng PCR sử dụng thể tích 10μl với các thành phần bao gồm 1X đệm PCR, 2,5mM dNTP, 0,2μM mồi xuôi và ngược, 0,5U Taq polymerase, 20-50ng DNA và H2O Quy trình nhiệt cho phản ứng PCR diễn ra ở 94°C trong 5 phút, sau đó là 35 chu kỳ với các bước 94°C trong 30 giây, 55°C trong 30 giây, và 72°C trong 30 giây, kết thúc với 72°C trong 5 phút Mẫu được bảo quản ở 15°C Đối với phân tích RFLP, sản phẩm PCR được ủ với enzym giới hạn BstUI trong điều kiện thích hợp.

Sản phẩm DNA được cắt điện di trên gel agarose 2% tại nhiệt độ 37 độ C qua đêm (18-22 giờ) cùng với thang chuẩn 100 bp Các băng DNA được nhuộm bằng ethidium bromide và ghi lại hình ảnh qua hệ thống EC3 Imaging Đoạn gen nghiên cứu chứa trình tự nhận biết của enzyme BstUI (CGCG) tại codon 72 Khi enzyme BstUI cắt gen, tạo ra các đoạn DNA kích thước 165 bp và 231 bp, tương ứng với kiểu allele Arg (wild type-GG) Nếu base G bị thay thế bằng base C, sẽ làm mất trình tự nhận biết của enzyme BstUI, dẫn đến kiểu allele Pro (mutant type-CC) mà không bị cắt Kiểu gen đồng hợp R72R có hai băng 165 và 231 bp, trong khi kiểu gen dị hợp R72P có ba băng 165, 231 và 396 bp Kiểu gen đồng hợp P72P chỉ có một băng 396 bp (Hình 2.2).

Hình 2.2: Xác định kiểu gen R72P bằng kỹ thuật PCR-RFLP

+ Kết quả được kiểm tra lại bằng giải trình tự trực tiếp

- Phân tích SNP309 của gen MDM2 bằng phương pháp RFLP-PCR (Restriction Fragment Length Polymorphism - PCR) (Phụ lục 5)

+ Khuếch đại vùng gen SNP309 của gen MDM2 bằng phương pháp PCR với cặp mồi đặc hiệu (Bảng 2.1)

Phản ứng PCR yêu cầu các thành phần chính trong thể tích 10μl, bao gồm: 1X đệm PCR, 2,5mM dNTP, 0,2μM mồi xuôi và mồi ngược, 0,5U Taq polymerase, 20-50ng DNA và H2O Chu trình nhiệt của phản ứng PCR được thực hiện với các bước: khởi đầu ở 94°C trong 5 phút, sau đó thực hiện 35 chu kỳ với nhiệt độ 95°C trong 30 giây mỗi chu kỳ.

55 o C/30 giây, 72 o C/30 giây), 72 o C/7 phút Bảo quản mẫu ở 15 o C

Kỹ thuật RFLP sử dụng sản phẩm PCR được ủ với enzym cắt giới hạn MspA1i ở nhiệt độ 37 độ C trong khoảng thời gian 18-22 giờ Sau khi cắt, sản phẩm DNA được điện di trên gel agarose 3% cùng với thang chuẩn 100bp Các băng DNA sau đó được nhuộm bằng ethidium bromide và chụp ảnh bằng hệ thống máy EC3 Imaging.

Luận án tiến sĩ Y học Đoạn gen được nghiên cứu chứa trình tự nhận biết của enzym MspA1i

(CCG↓CTG) tại vị trí SNP309 Bình thường vị trí SNP309 của gen MDM2 là

T, không chứa vị trí nhận biết của enzym MspA1i, đoạn gen được khuếch đại không bị cắt và giữ nguyên kích thước 157bp, tương ứng với kiểu allele T (wild type-TT) Khi có sự thay thế base T bởi base G sẽ xuất hiện trình tự nhận biết của enzym MspA1i, do đó đoạn gen bị cắt và tạo ra các đoạn DNA có kích thước 48 bp và 109 bp, tương ứng với kiểu allele G (mutant type-GG) Kiểu gen đồng hợp TT có một băng duy nhất 157 bp Nếu hình ảnh điện di có

3 băng 157, 109 và 48 bp, tương ứng với kiểu gen dị hợp GT Nếu kết quả có

2 băng 109 bp và 48 bp thì tương ứng với kiểu gen đồng hợp GG (Hình 2.3)

Hình 2.3: Xác định kiểu gen SNP309 gen MDM2 bằng kỹ thuật PCR-RFLP

+ Kết quả được kiểm tra lại bằng giải trình tự trực tiếp

- Phân tích các SNP P34P, P36P, P47S, V217M, G360A gen TP53 bằng phương pháp giải trình tự (Phụ lục 6, 7)

+ Khuếch đại đoạn gen chứa các SNP P34P, P36P, P47S, V217M, G360A bằng phương pháp PCR

 Thành phần phản ứng PCR (thể tích 20μl) gồm: 10 μl Taq polymerase, 1μl mồi xuôi, 1μl mồi ngược, 2μl DNA và 6μl H2O

 Chu trình nhiệt của phản ứng PCR: 94 o C/5 phút, 33 chu kỳ 94 o C/30 giây,

60 o C/30 giây, 72 o C/30 giây), 72 o C/7 phút Bảo quản mẫu ở 15 o C

+ Sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose kiểm tra, sau đó được tiến hành giải trình tự theo quy trình thường quy

+ Kết quả được so với trình tự Genebank

Bảng 2.1 Trình tự mồi cho phản ứng PCR khuếch đại các SNP [91], [92], [93],

STT Đa hình gen Trình tự mồi

2 R72P-TP53 F: 5’-CTG GTA AGG ACA AGG GTT GG-3’

R: 5’-ACT GAC CGT GCA AGT CAC AG-3’ 396

Thời gian và địa điểm nghiên cứu

- Bộ môn Hóa sinh- Trường Đại học Y Hà Nội

- Trung tâm Hô hấp, Trung tâm Y học hạt nhân và Ung bướu- Bệnh viện Bạch Mai

- Trung tâm Nghiên cứu Gen & Protein, Trường Đại học Y Hà Nội

- Từ tháng 10 năm 2013 đến tháng 10 năm 2017.

Xử lý số liệu

- Số liệu sau khi làm sạch được nhập và máy bằng phần mềm SPSS 20.0

- Phân tích số liệu bằng phần mềm SPSS 20.0, sử dụng các thuật toán thống kê:

 Kiểm định Khi bình phương được sử dụng trong so sánh 2 tỷ lệ

 Tỷ suất chênh (OR) và 95% khoảng tin cậy của OR được tính toán trong phân tích tương quan

 Mô hình hồi quy logistic đa biến được áp dụng trong phân tích mối tương quan nhằm khống chế các yếu tố nhiễu

 Mức ý nghĩa thống kê p < 0,05 được áp dụng.

Đạo đức trong nghiên cứu của đề tài

Nghiên cứu đã được phê duyệt bởi Hội đồng đạo đức Trường Đại học Y Hà Nội theo Quyết định số 188/HĐĐĐĐHYHN, ngày 31/1/2013 Bệnh nhân tham gia hoàn toàn tự nguyện và có quyền rút lui bất cứ lúc nào nếu không muốn tiếp tục Tất cả thông tin cá nhân của bệnh nhân được bảo mật tuyệt đối.

Kinh phí thực hiện đề tài

Đề tài này được thực hiện với sự tài trợ từ dự án cấp nhà nước, nhằm đánh giá sự phân bố kiểu gen của một số gen liên quan đến ung thư phổi và ung thư gan, thuộc nhiệm vụ của Quỹ gen “Đánh giá đặc điểm di truyền người Việt Nam”.

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

Đặc điểm của nhóm đối tượng nghiên cứu

3.1.1 Đặc điểm về tuổi của nhóm nghiên cứu

Bảng 3.1: Đặc điểm về tuổi của nhóm nghiên cứu (tuổi)

Bệnh nhân ung thư phổi (n"0)

- Tuổi trung bình của nhóm bệnh là 59,89 ± 9,432 không khác biệt với tuổi của nhóm chứng là 60,67 ± 9,335

Hình 3.1: Tỷ lệ bệnh nhân ung thư phổi theo nhóm tuổi

- Độ tuổi mắc ung thư phổi nhiều nhất từ 50-70 chiếm 72,7%

3.1.2 Đặc điểm về giới của nhóm nghiên cứu

Hình 3.2: Đặc điểm về giới của nhóm nghiên cứu

- Nam mắc ung thư phổi nhiều hơn nữ

- Tỷ lệ Nam/Nữ trong nhóm ung thư phổi là: 2,86/1

3.1.3 Tình trạng hút thuốc lá của nhóm nghiên cứu

Bảng 3.2: Tình trạng hút thuốc lá của nhóm nghiên cứu Đặc điểm

Bệnh nhân ung thư phổi

Tiền sử hút thuốc lá

Tỷ lệ hút thuốc lá ở nhóm bệnh nhân ung thư phổi là 42,7%, cao hơn đáng kể so với nhóm chứng (p=0,004) Trong số bệnh nhân ung thư phổi, 54,3% có tiền sử hút thuốc lá trên 20 bao-năm, trong khi tỷ lệ bệnh nhân hút thuốc lá dưới 20 bao-năm là 45,7%, không có sự khác biệt thống kê (p=0,726).

- Không gặp nữ giới hút thuốc lá trong nghiên cứu

3.1.4 Đặc điểm mô bệnh học của nhóm ung thư phổi

Bảng 3.3: Đặc điểm mô bệnh học của nhóm ung thư phổi Đặc điểm Bệnh nhân ung thư phổi (220) n %

- Ung thư biểu mô tuyến chiếm tỷ lệ cao nhất trong các typ mô bệnh học

Kết quả phân tích đa hình kiểu gen TP53

3.2.1 Đa hình thêm 16bp tại vùng intron 3 gen TP53

3.2.1.1 Hình ảnh điện di sản phẩm khuếch đại đoạn gen chứa intron 3 của gen TP53 Đoạn gen mang vùng intron 3 gen TP53 được khuếch đại bằng phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu, sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose 3%

Hình 3.3: Hình ảnh điện di sản phẩm PCR khuếch đại đoạn gen vùng intron 3 gen TP53 trên gel agarose 3%

M: Thang chuẩn 100bp, (-): Chứng âm

- Kiểu gen A1A1 có 1 băng duy nhất với kích thước 119bp

- Kiểu gen A1A2 có 2 băng với các kích thước 119bp và 135bp

- Băng DNA rõ nét, không có băng phụ đảm bảo việc xác định kiểu gen đa hình thêm 16bp tại vùng intron 3 của gen TP53

3.2.1.2 Kết quả phân tích đa hình do thêm 16 bp tại vùng intron 3 của gen TP53

Bảng 3.4: Kết quả phân tích đa hình do thêm 16bp tại vùng intron 3 của gen TP53 ở nhóm bệnh nhân ung thư phổi và nhóm chứng Đa hình

Kiểu gen A1A2 chiếm tỷ lệ 3,6% trong nhóm bệnh nhân ung thư phổi cao hơn trong nhóm chứng 1,7%, tuy nhiên sự khác biệt này không có ý nghĩa thống kê

3.2.2 Đa hình kiểu gen tại SNP R72P gen TP53

3.2.2.1 Hình ảnh điện di sản phẩm khuếch đại đoạn gen chứa SNP R72P gen TP53 Đoạn gen chứa SNP R72P được khuếch đại bằng phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu, sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose 1,5% Luận án tiến sĩ Y học

Hình 3.4: Hình ảnh điện di sản phẩm PCR khuếch đại đoạn gen chứa SNP R72P gen TP53 trên gel agarose 1,5%

Mẫu K22÷K26, C10÷C14: Đoạn gen chứa SNP R72P M: Thang chuẩn 100bp, (-): Chứng âm

Kết quả điện di kiểm tra sản phẩm PCR đoạn gen TP53 chứa SNP R72P cho thấy chỉ có một băng duy nhất, rõ nét, không có băng phụ nào, với kích thước 396bp so với thang DNA chuẩn.

3.2.2.2 Kết quả xác định kiểu gen chứa SNP R72P gen TP53 bằng phương pháp

Sản phẩm PCR được xử lý bằng enzym cắt giới hạn BstUI ở nhiệt độ 37 độ C trong khoảng thời gian từ 18 đến 22 giờ Sau đó, sản phẩm cắt được điện di trên gel agarose 2% cùng với thang chuẩn 100bp.

Hình 3.5: Hình ảnh điện di sản phẩm cắt đoạn gen TP53 mang SNP R72P bằng enzym BstU I trên các mẫu nghiên cứu

M: Thang chuẩn 100bp; (-): Chứng âm; (+): Chứng dương

Sản phẩm cắt đoạn gen chứa SNP R72P gen TP53 bởi enzym BstUI cho thấy các đoạn DNA với kích thước khác nhau Kiểu gen đồng hợp GG (R72P R/R) có 2 đoạn DNA kích thước 165bp và 231bp (mẫu K69, K73, C8) Kiểu gen đồng hợp CC (R72P P/P) chỉ xuất hiện 1 băng DNA duy nhất kích thước 396bp (mẫu K60, K61, C7) Đối với kiểu gen dị hợp tử GC (R72P R/P), sản phẩm điện di gồm 3 băng với kích thước 396bp, 231bp và 165bp (mẫu K46, K48, C13).

3.2.2.3 Kết quả kiểm tra kiểu gen tại vị trí SNP R72P bằng phương pháp giải trình tự gen

Sau khi được khuếch đại, sản phẩm PCR mang SNP R72P của gen

TP53 đã được tinh sạch và thực hiện phản ứng giải trình tự Kết quả giải trình tự sau đó được phân tích bằng phần mềm CLC Main Workbench và so sánh với trình tự chuẩn của gen TP53 trên GeneBank.

Hình 3.6: Kết quả giải trình tự exon 4 gen TP53 chứa SNP R72P tương ứng với các kiểu gen GC (R72P R/P), CC (R72P P/P), GG (R72P

Tại vị trí nucleotid thứ 2 của codon 72, kiểu gen GC (R72P R/P) có hai đỉnh nucleotid G và C, mỗi loại mang màu sắc riêng Trong khi đó, kiểu gen CC (R72P P/P) chỉ có một đỉnh nucleotid C duy nhất với màu sắc đặc trưng Cuối cùng, kiểu gen GG (R72P R/R) thể hiện một đỉnh nucleotid G duy nhất, cũng với màu sắc tương ứng.

- Sản phẩm giải trình tự rõ nét Các đỉnh màu tương ứng với các nucleotid rõ ràng và không có tín hiệu nhiễu

- Kết quả giải trình tự DNA của mẫu nghiên cứu cho thấy hoàn toàn phù hợp với kết quả phân tích PCR-RFLP Luận án tiến sĩ Y học

3.2.2.4 Kết quả phân tích kiểu gen SNP R72P gen TP53 bằng phương pháp PCR- RFLP ở nhóm nghiên cứu

Bảng 3.5 : Tỷ lệ các kiểu gen SNP R72P của gen TP53 ở nhóm nghiên cứu

Kiểu alen/gen Tổng số nhóm nghiên cứu (nE0) n %

- Tỷ lệ alen G trong nhóm nghiên cứu gần bằng alen C

- Kiểu gen đồng hợp GG có tần suất gần tương đương so với kiểu gen CC

- Kiểu gen dị hợp GC chiếm tỷ lệ cao nhất trong nhóm nghiên cứu

Bảng 3.6: Tỷ lệ phân bố các kiểu gen của SNP TP53 -R72P giữa nhóm bệnh và chứng Kiểu gen

- Kiểu gen dị hợp tử G/C codon 72 gen TP53 chiếm tỷ lệ cao nhất ở cả nhóm bệnh và nhóm chứng

Hình 3.7: Phân bố các kiểu gen của SNP TP53-R72P giữa nhóm bệnh và chứng

- Alen C có tỷ lệ cao hơn ở nhóm bệnh tuy nhiên sự khác biệt chưa có ý nghĩa thống kê

- Kiểu gen dị hợp GC có tỷ lệ cao nhất ở cả nhóm bệnh và nhóm chứng

Bảng 3.7: Các kiểu gen SNP R72P của gen TP53 và nguy cơ mắc ung thư phổi Đa hình

- Kiểu gen dị hợp tử G/C codon 72 gen TP53 chiếm tỷ lệ cao nhất ở cả nhóm bệnh và nhóm chứng

Kiểu gen G/C và C/C của codon 72 trong gen TP53 có thể làm tăng nguy cơ mắc ung thư phổi, tuy nhiên mối liên hệ này chưa đạt ý nghĩa thống kê rõ ràng.

Bảng 3.8: Độ tuổi trung bình của bệnh nhân ung thư phổi mang các kiểu gen TP53 SNP R72P (năm) Đặc điểm Độ tuổi trung bình

Tuổi trung bình của các nhóm bệnh nhân mang 3 kiểu gen tại SNP R72P gen

TP53: kiểu gen CC có tuổi trung bình thấp nhất tuy nhiên sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê

3.2.3 Xác định một số SNP không có vị trí cắt enzym giới hạn

3.2.3.1 SNPs không có vị trí cắt enzym giới hạn P34P (CCC → CCA), P36P (CCG

 Hình ảnh điện di sản phẩm khuếch đại exon 4 gen TP53

Chúng tôi đã khuếch đại exon 4 của gen TP53 để giải trình tự toàn bộ exon 4, do các codon 34, 36 và 47 đều nằm trong vùng này Sản phẩm PCR sau khi khuếch đại được điện di trên gel agarose 1.5%.

Hình 3.8: Hình ảnh điện di sản phẩm PCR exon 4 gen TP53 mang SNP: P34P, P36P, P47S

M: Thang chuẩn 100bp, (-): Chứng âm, Mẫu K80÷K84, C25÷C29: Exon 4 gen TP53 được khuếch đại

Sản phẩm PCR của exon 4 gen TP53, như thể hiện trong Hình 3.8, chỉ bao gồm một băng duy nhất, rõ nét mà không có băng phụ nào, với kích thước 511bp so với thang DNA chuẩn.

 Hình ảnh kết quả giải trình tự exon 4 xác định kiểu gen của các SNPs tại các vị trí codon 34, 36, 47

Hình 3.9: Hình ảnh kết quả giải trình tự exon 4 gen TP53 mang SNP: P34P, P36P, P47S tương ứng với các kiểu gen C/C, G/G, C/C Nhận xét:

Sản phẩm giải trình tự cho thấy rõ nét, với các đỉnh màu tương ứng với nucleotid mà không có tín hiệu nhiễu So sánh với trình tự gen TP53 trên GeneBank cho thấy không có sự thay thế nucleotid tại các codon của bộ ba mã hóa.

- Kết quả tương tự khi phân tích ở nhóm ung thư phổi và nhóm chứng

 Tỷ lệ kiểu gen của một số SNP không có vị trí cắt enzym giới hạn 34 (CCC → CCA), 36 (CCG → CCT), 47(CCG → CTG).

Bảng 3.9: Tỷ lệ kiểu gen của một số SNP không có vị trí cắt enzym giới hạn P34P (CCC → CCA), P36P (CCG → CCT), P47S (CCG → CTG)

Kiểu gen Nhóm bệnh Nhóm chứng n % n %

Tất cả các mẫu nghiên cứu đều mang cùng một kiểu gen tại các vị trí codon 34, 36 và 47 của gen TP53

 Hình ảnh điện di sản phẩm khuếch đại exon 10 mang SNP G360A gen

TP53 Đoạn gen chứa SNP G360A được khuếch đại bằng phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu, sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose 1%

Hình 3.10: Hình ảnh điện di sản phẩm PCR exon 10 gen TP53 chứa SNP G360A trên gel agarose 1,5%

M: thang chuẩn 100bp (-): chứng âm

Mẫu K157÷K161, C102÷C105: Exon 10 gen TP53 được khuếch đại

Sản phẩm PCR của exon 10 gen TP53 chỉ gồm một băng duy nhất, rõ nét, không có các băng phụ, kích thước 433bp so trên thang DNA chuẩn Như

Sản phẩm PCR thu được từ luận án tiến sĩ Y học có tính đặc hiệu, giúp đảm bảo cho kỹ thuật giải trình tự gen tiếp theo nhằm xác định tính đa hình codon 360 trên gen TP53.

 Hình ảnh kết quả giải trình tự exon 10 xác định SNP G360A gen TP53

Hình 3.11: Kết quả giải trình tự exon 10 xác định kiểu gen tại SNP G360A gen TP53 Nhận xét :

Hình 3.11 minh họa sản phẩm giải trình tự rõ ràng với các đỉnh màu tương ứng với nucleotid, không có tín hiệu nhiễu So sánh với trình tự gen TP53 trên GeneBank cho thấy không có sự thay thế nucleotid G thành C tại vị trí nucleotid thứ 2 của bộ 3 mã hóa.

 Tỷ lệ các kiểu gen tại SNP G360A gen TP53(GGGGCG)Luận án tiến sĩ Y học

Bảng 3.10: Tần số các kiểu gen tại codon 360 gen TP53

Kiểu gen Nhóm bệnh (n"0) Nhóm chứng (n#0) n % n %

Nhận xét: Tất cả các mẫu nghiên cứu đều mang cùng 1 kiểu gen GG

3.2.3.3 Đa hình kiểu gen tại SNP V217M (GTG → ATG)

 Hình ảnh điện di sản phẩm khuếch đại exon 6 mang SNP V217M gen

TP53 Đoạn gen chứa SNP V217M được khuếch đại bằng phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu, sản phẩm PCR được điện di trên gel agarose 1,5%

Hình 3.12: Hình ảnh điện di sản phẩm PCR exon 6 gen TP53 chứa SNP V217M trên gel agarose 2%

M: thang chuẩn 100bp; (-): chứng âm

Mẫu K22÷K26, C10÷C14: Exon 6 gen TP53 được khuếch đại Nhận xét:

Sản phẩm PCR của exon 6 gen TP53 hiển thị một băng duy nhất, rõ nét với kích thước 181bp, không có băng phụ nào Điều này chứng tỏ sản phẩm PCR đạt tính đặc hiệu, tạo điều kiện thuận lợi cho việc giải trình tự gen tiếp theo nhằm xác định tính đa hình codon 217 trên gen TP53.

 Hình ảnh kết quả giải trình tự exon 6 xác định SNP V217M gen TP53

Hình 3.13: Kết quả giải trình tự exon 6 xác định kiểu gen tại SNP V217M gen TP53 Nhận xét :

Sản phẩm giải trình tự thể hiện rõ nét với các đỉnh màu tương ứng chính xác cho từng nucleotid, không có tín hiệu nhiễu So sánh với trình tự gen TP53 trên GeneBank cho thấy không có sự thay thế nucleotid G thành A tại vị trí thứ nhất của bộ ba mã hóa.

 Tỷ lệ các kiểu gen tại SNP V217M gen TP53 (GTGATG)

Bảng 3.11: Tỷ lệ các kiểu gen tại codon 217 gen TP53

Kiểu gen Nhóm bệnh (n"0) Nhóm chứng (n#0) n % n %

Nhận xét: Tất cả các mẫu nghiên cứu đều mang cùng 1 kiểu gen GG

Kết quả phân tích đa hình kiểu gen SNP 309T>G gen MDM2

3.3.1 Hình ảnh điện di sản phẩm khuếch đại đoạn gen mang SNP 309T>G của gen MDM2 Đoạn gen mang SNP 309T>G gen MDM2 được khuếch đại bằng phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu Sản phẩm PCR được điện di kiểm tra trên gel agarose 2%

Hình 3.14: Hình ảnh điện di sản phẩm PCR đoạn gen mang SNP 309T>G của gen MDM2

M: Thang chuẩn 100bp; (-): Chứng âm;

Mẫu K45÷K49, C61÷C65: Khuếch đại đoạn gen mang SNP 309T>G của gen MDM2

Sản phẩm PCR của đoạn gen chứa SNP 309T>G của gen MDM2 thể hiện một băng duy nhất, rõ nét với kích thước 157bp, không có băng phụ, so với thang DNA chuẩn.

3.3.2 Kết quả xác định kiểu gen tại SNP 309T>G gen MDM2 bằng phương pháp PCR-RFLP

Sản phẩm PCR khuếch đại đoạn gen SNP 309 T>G được ủ với enzym MspA1i ở 37 oC trong 18-22 giờ Sau đó, sản phẩm cắt được điện di trên gel agarose 3% cùng với thang chuẩn 100-1000 bp.

Hình 3.15: Hình ảnh điện di sản phẩm cắt đoạn gen MDM2 mang SNP 309T>G bằng enzym MspA1i trên các mẫu nghiên cứu

Mẫu K17, C7: Kiểu gen đồng hợp tử T/T

Mẫu K16, K23, C16: Kiểu gen đồng hợp tử G/G

Mẫu K7, K13, C18, C21: Kiểu gen dị hợp tử T/G

M: Thang chuẩn 100bp; (-): Chứng âm, (-): Chứng dương

Sản phẩm cắt DNA có kích thước khác nhau tùy thuộc vào kiểu gen Mẫu kiểu gen T/T thể hiện một băng DNA 157bp (mẫu K17, C7) Mẫu kiểu gen G/G có hai băng DNA với kích thước 109bp và 48bp (mẫu K16, K23, C16) Đối với mẫu kiểu gen dị hợp tử T/G, có ba băng DNA với kích thước 157bp, 109bp và 48bp (mẫu K7, K13, C18, C21).

3.3.3 Kết quả kiểm tra kiểu gen tại vị trí SNP 309T>G gen MDM2 bằng phương pháp giải trình tự gen

Sau khi được khuếch đại, sản phẩm PCR mang SNP 309T>G gen

MDM2 được tinh sạch và tiến hành phản ứng giải trình tự kiểm tra kiểu gen

Kết quả giải trình tự được phân tích bằng phần mềm CLC Main Workbench sau đó được so sánh với trình tự chuẩn của gen MDM2 trên GeneBank

Hình 3.16: Kết quả giải trình tự đoạn gen chứa SNP 309T>G gen MDM2 tương ứng kiểu gen T/T, T/G, G/G

Tại vị trí nucleotid thứ 309 trong intron 1 của gen MDM2, kiểu gen T/T thể hiện một đỉnh nucleotid T duy nhất với màu sắc tương ứng Kiểu gen T/G có hai đỉnh nucleotid T và G, mỗi đỉnh mang màu sắc riêng biệt Trong khi đó, kiểu gen G/G chỉ có một đỉnh nucleotid.

G duy nhất với màu sắc tương ứng

- Sản phẩm giải trình tự rõ nét Các đỉnh màu tương ứng với các nucleotid rõ ràng và không có tín hiệu nhiễu

- Kết quả giải trình tự DNA của mẫu nghiên cứu cho thấy hoàn toàn phù hợp với kết quả phân tích PCR-RFLP Luận án tiến sĩ Y học

3.3.4 Kết quả phân tích kiểu gen SNP 309T>G gen MDM2 ở nhóm nghiên cứu

Bảng 3.12: Tỷ lệ các kiểu gen SNP 309T>G của gen MDM2 ở nhóm nghiên cứu

Tổng số nhóm nghiên cứu (nE0) n %

- Tỷ lệ alen G trong nhóm nghiên cứu gần bằng alen T

- Kiểu gen đồng hợp TT có tần suất gần tương đương so với kiểu gen CC

- Kiểu gen dị hợp TG chiếm tỷ lệ cao nhất trong nhóm nghiên cứu

Bảng 3.13: Tỷ lệ phân bố các kiểu gen của SNP MDM2 -309T>G giữa nhóm bệnh và chứng Kiểu gen

- Kiểu gen GG có tần suất cao hơn ở nhóm bệnh (28,6%) so với nhóm chứng (19,1%) Sự khác biệt có ý nghĩa thống kê với p=0,015

Hình 3.17: Phân bố các kiểu gen của SNP MDM2-309T>G giữa nhóm bệnh và chứng

- Alen đột biến G chiếm tỷ lệ cao hơn ở nhóm bệnh, tuy nhiên sự khác biệt không có ý nghã thống kê

- Kiểu gen GG chiếm tỷ lệ cao hơn ở nhóm bệnh với p=0,015

Bảng 3.14: Độ tuổi trung bình của bệnh nhân ung thư phổi mang kiểu các kiểu gen của SNP MDM2 -309T>G (tuổi)

Kiểu gen MDM2 309T>G Độ tuổi trung bình

- Không ghi nhận sự khác biệt về tuổi giữa các nhóm bệnh nhân ung thư phổi mang các kiểu gen khác nhau tại SNP 309T>G gen MDM2

3.3.5 Các kiểu gen SNP 309T>G của gen MDM2 và nguy cơ mắc ung thư phổi

Bảng 3.15: Các kiểu gen SNP 309T>G của gen MDM2 và nguy cơ mắc ung thư phổi Đa hình

Nhóm chứng (n#0) OR, 95%CI OR*, 95%CI n % n %

OR* được điều chỉnh theo các biến: tuổi, giới, tình trạng hút thuốc lá theo mô hình hồi quy logistic đa biến

- Kiểu gen dị hợp tử SNP 309T>G chiếm tỷ lệ cao nhất ở cả nhóm bệnh và nhóm chứng

- Kiểu gen đồng hợp tử SNP 309GG làm tăng nguy cơ mắc ung thư phổi 1,7 lần theo mô hình gen lặn (OR = 1,7; 95% CI= 1,09 – 2,63)

Nghiên cứu cho thấy rằng khi điều chỉnh theo tuổi, giới tính và tình trạng hút thuốc lá, kiểu gen đồng hợp tử SNP 309GG vẫn làm tăng nguy cơ mắc ung thư phổi lên 1,61 lần theo mô hình gen lặn (OR = 1,61; 95% CI = 1,03 – 2,51).

Mối liên quan giữa đa hình kiểu gen TP53 và gen MDM2 với nguy cơ mắc

3.4.1 Mối liên quan giữa đa hình gen TP53 và nguy cơ mắc ung thư phổi theo một số đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng trong ung thư phổi

3.4.1.1 Mối liên quan giữa đa hình kiểu gen TP53 SNP R72P và nguy cơ mắc ung thư phổi theo giới

Bảng 3.16: Mối liên quan giữa đa hình kiểu gen TP53 SNP R72P và nguy cơ mắc ung thư phổi theo giới

Chưa ghi nhận mối liên quan có ý nghĩa thống kê giữa kiểu gen SNP R72P gen TP53 với nguy cơ ung thư phổi theo giới

3.4.1.2 Mối liên quan giữa đa hình kiểu gen TP53 SNP R72P và nguy cơ mắc ung thư phổi theo đặc điểm mô bệnh học

Bảng 3.17: Mối liên quan giữa đa hình kiểu gen TP53 SNP R72P và nguy cơ mắc ung thư phổi theo mô bệnh học

UTBM không tế bào nhỏ

Chưa ghi nhận mối liên quan có ý nghĩa thống kê giữa kiểu gen SNP R72P gen TP53 với nguy cơ ung thư phổi theo giới

3.4.1.3 Mối liên quan giữa đa hình kiểu gen TP53 SNP R72P và nguy cơ mắc ung thư phổi theo tình trạng hút thuốc lá

Bảng 3.18: Mối liên quan giữa đa hình kiểu gen TP53 SNP R72P và nguy cơ mắc ung thư phổi theo trình trạng hút thuốc lá

Chưa có mối liên quan có ý nghĩa thống kê giữa kiểu gen SNP R72P gen

TP53 với nguy cơ ung thư phổi theo tình trạng hút thuốc lá

3.4.2 Mối liên quan giữa đa hình gen MDM2 SNP 309T>G và nguy cơ mắc ung thư phổi theo một số đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng trong ung thư phổi

3.4.2.1 Mối liên quan giữa đa hình kiểu gen MDM2 SNP309T>G và nguy cơ mắc ung thư phổi theo giới

Bảng 3.19: Mối liên quan giữa đa hình kiểu gen MDM2 SNP 309T>G và nguy cơ mắc ung thư phổi theo giới

- Kiểu gen đồng hợp tử SNP 309GG làm tăng nguy cơ mắc ung thư phổi ở nam giới 1,66 lần theo mô hình gen lặn (OR=1,66; 95% CI=1,01-2,76)

3.4.2.2 Mối liên quan giữa đa hình kiểu gen MDM2 SNP 309T>G và nguy cơ mắc ung thư phổi theo mô bệnh học

Bảng 3.20: Mối liên quan giữa đa hình kiểu gen MDM2 SNP309T>G và nguy cơ mắc ung thư phổi theo mô bệnh học

UTBM không tế bào nhỏ

Nghiên cứu cho thấy kiểu gen đồng hợp tử SNP 309GG ở những người hút thuốc lá có nguy cơ mắc ung thư phổi không tế bào nhỏ cao hơn 1,71 lần (OR=1,71; 95% CI= 1,09-2,68) và ung thư phổi tuyến cao hơn 1,69 lần (OR=1,69; 95% CI= 1,05-2,72) theo mô hình gen lặn.

3.4.2.3 Mối liên quan giữa đa hình kiểu gen MDM2 SNP 309T>G và nguy cơ mắc ung thư phổi theo tình trạng hút thuốc lá

Bảng 3.21: Mối liên quan giữa đa hình kiểu gen MDM2 SNP 309T>G và nguy cơ mắc ung thư phổi theo tình trạng hút thuốc lá

- Kiểu gen đồng hợp tử SNP 309GG trong nhóm có hút thuốc lá làm tăng nguy cơ mắc ung thư phổi 2,09 lần theo mô hình gen lặn (OR= 2,09; 95% CI= 1,01-4,31)

3.4.3 Nguy cơ mắc ung thư phổi khi kết hợp đa hình gen TP53 SNP R72P và gen MDM2 SNP 309T>G

3.4.3.1.Nguy cơ mắc ung thư phổi khi kết hợp đa hình gen TP53 SNP R72P và gen MDM2 SNP 309T>G với hút thuốc lá

Bảng 3.22 trình bày nguy cơ mắc ung thư phổi khi kết hợp đa hình gen TP53 SNP R72P và gen MDM2 SNP 309T>G với thói quen hút thuốc lá Các đặc điểm ung thư phổi được phân tích giữa nhóm chứng, với tỷ lệ phần trăm và số liệu cụ thể, cho thấy mối liên hệ giữa các yếu tố di truyền và nguy cơ mắc bệnh Kết quả nghiên cứu chỉ ra rằng sự kết hợp của các gen này có thể làm tăng nguy cơ ung thư phổi ở những người hút thuốc.

SNP R72P và không hút thuốc

SNP309T>G và không hút thuốc

- Hút thuốc lá làm tăng nguy cơ mắc ung thư phổi 1,78 lần (OR= 1,78; 95% CI= 1,20-2,62)

Hút thuốc lá hơn 20 bao-năm làm tăng nguy cơ mắc ung thư phổi lên 1,87 lần (OR=1,87; 95% CI= 1,15-3,06), cao hơn so với nguy cơ mắc ung thư phổi ở những người hút thuốc lá dưới 20 bao-năm (OR=1,68; 95% CI= 1,01 – 2,79).

Người mang kiểu gen CC của gen TP53 SNP R72P có nguy cơ mắc ung thư phổi cao gấp 3,06 lần so với người mang kiểu gen GG và không hút thuốc lá, với tỷ lệ Odds Ratio (OR) là 3,06 và khoảng tin cậy 95% (CI) từ 1,37 đến 6,48.

Người mang kiểu gen GG của gen MDM2 SNP 309T>G có nguy cơ mắc ung thư phổi cao gấp 2,3 lần so với người mang kiểu gen TT và không hút thuốc lá, với tỷ lệ Odds Ratio (OR) từ 1,07 đến 4,93.

3.4.3.2 Kết hợp đa hình kiểu gen SNP R72P và SNP 309T>G MDM2 với nguy cơ ung thư phổi

Bảng 3.23: Kết hợp đa hình kiểu gen TP53 SNP R72P và SNP 309T>G MDM2 với nguy cơ ung thư phổi

Bảng tổ hợp các kiểu gen của hai đa hình gen TP53 SNP R72P và MDM2 309T>G được sắp xếp theo trình tự tăng dần nguy cơ mắc ung thư phổi Hai kiểu gen nguyên thủy là GG của TP53 SNP R72P.

Biến thể gen MDM2 309T>G kiểu TT được đánh giá là không có nguy cơ Phân tích cho thấy không có mối liên hệ nào giữa hai kiểu gen này và sự gia tăng nguy cơ mắc ung thư phổi.

BÀN LUẬN

Đặc điểm chung của nhóm nghiên cứu

4.1.1 Đặc điểm về tuổi mắc bệnh của nhóm bệnh nhân ung thư phổi

Nghiên cứu trên 220 bệnh nhân cho thấy độ tuổi dao động từ 33 đến 86, với tuổi trung bình là 59,89 ± 9,432 tuổi Kết quả này tương đồng với các nghiên cứu trước đây trong nước, như nghiên cứu của Trần Nguyên Phú (2007), cho biết tuổi trung bình của nhóm nghiên cứu là 58 ± 10 tuổi.

Tuổi của bệnh nhân mắc ung thư phổi dao động từ 18 đến 78 tuổi, với tuổi trung bình là 58,9 ± 8,6 theo nghiên cứu của Ngô Quý Châu và cộng sự tại Trung tâm Hô hấp Bệnh viện Bạch Mai năm 2012 Các nghiên cứu quốc tế cũng cho thấy tuổi mắc bệnh tương tự, như nghiên cứu tại Mayo Clinic ghi nhận tuổi trung bình là 65,4 ± 11,0 tuổi từ 1997 đến 2003, và một nghiên cứu ở Tây Ban Nha năm 2008 công bố tuổi trung bình là 64,3 tuổi Theo Xiang-Yang Chu (2011), tuổi trung bình của nhóm bệnh nhân ung thư phổi là 59,1 ± 11,1.

Theo nghiên cứu của Lu và cộng sự năm 2013, tuổi trung bình của nhóm bệnh nhân ung thư phổi là 60,9 tuổi Các nghiên cứu khác tại Trung Quốc cũng cho thấy tuổi trung bình tương tự, như công bố của Dazhong Liu năm 2013 với tuổi trung bình là 60,8 tuổi và nghiên cứu của Datong Zheng năm 2014 ghi nhận tuổi trung bình là 57 tuổi.

[102] Một nghiên cứu khác ở dân cư Bangladesh năm 2014 cũng cho kết quả là 57,9 tuổi [83]

Độ tuổi thường gặp nhất ở bệnh nhân ung thư phổi là từ 50-70 tuổi, chiếm 72,7%, trong khi 93,6% bệnh nhân có độ tuổi từ 45 trở lên Chỉ có 5 trường hợp bệnh nhân ung thư phổi trẻ tuổi (dưới 40 tuổi), tương đương 2,7% Kết quả này phù hợp với ghi nhận của nhiều tác giả khác, theo Nguyễn Hải Anh.

(2006), độ tuổi 60- 69 chiếm 34,96% và BN có độ tuổi từ 50 trở lên là 77,2%

[103] Tác giả Gadgeel SM và CS (1999) nghiên cứu trên 1012 BN ung thư phổi tại Viện ung thư quốc gia Detroit (Hoa Kỳ) ghi nhận 87,5% BN từ 50 tuổi trở lên [104]

Nghiên cứu về ung thư phổi cho thấy độ tuổi mắc bệnh đang ngày càng trẻ hóa Một nghiên cứu tại Mayo Clinic từ 1997 đến 2003 ghi nhận tuổi trung bình của bệnh nhân ung thư phổi là 65,4 tuổi, trong khi nghiên cứu ở Trung Quốc năm 2010 cho thấy tuổi trung bình chỉ 60 tuổi, với trường hợp thấp nhất là 20 tuổi Các tác giả Dazhong Liu và Datong Zheng vào năm 2013 và 2014 cũng công bố tuổi trung bình lần lượt là 60,8 và 57 tuổi Sự phát triển xã hội đã dẫn đến sự gia tăng các yếu tố nguy cơ cho ung thư phổi, làm cho độ tuổi mắc bệnh ngày càng giảm Điều này đã thúc đẩy sự quan tâm toàn cầu đối với các nghiên cứu ung thư, nhằm phát hiện nguy cơ và biện pháp phòng ngừa, trong đó yếu tố di truyền đang được nghiên cứu một cách sâu rộng.

4.1.2 Đặc điểm về giới của nhóm nghiên cứu

Nghiên cứu dịch tễ học toàn cầu và tại Việt Nam đã chỉ ra rằng ung thư phổi thường gặp hơn ở nam giới Kết quả nghiên cứu của chúng tôi một lần nữa khẳng định sự phổ biến này của ung thư phổi trong nhóm nam giới.

Nghiên cứu tiến sĩ Y học cho thấy tỷ lệ nam giới mắc ung thư phổi cao hơn nữ giới, với 220 bệnh nhân tham gia, trong đó có 163 nam (74,1%) và 57 nữ (25,9%), tạo ra tỷ lệ nam/nữ là 2,86/1 Kết quả này phù hợp với các nghiên cứu trước đây, như ghi nhận của Chung Giang Đông và cộng sự năm 2007 với tỷ lệ 2,67/1 Nghiên cứu của Ngô Quý Châu và cộng sự năm 2012 tại Trung tâm cũng đã xác nhận xu hướng này.

Tại Bệnh viện Bạch Mai, tỷ lệ bệnh nhân nam giới chiếm 73,3%, với tỷ lệ nam/nữ là 2,75/1 Nghiên cứu của Nguyễn Bá Đức cho thấy từ năm 2000 đến 2010, tỷ lệ mắc ung thư phổi ở nữ tại Việt Nam đã tăng hơn 200%, từ 6,4/100.000 lên 13,9/100.000 dân, đứng trong top 5 loại ung thư có tốc độ gia tăng nhanh nhất Các nghiên cứu quốc tế cũng chỉ ra rằng tỷ lệ nam mắc ung thư phổi cao hơn nữ, với tỷ lệ khoảng 4/1 theo Sun Ha Park và cộng sự năm 2006.

Tỷ lệ nam/nữ trong nhóm bệnh nhân UTBMKTBN năm 2010 là khoảng 1,9/1, trong khi theo Xiang-Yang Chu (2011), tỷ lệ này là 3/1 ở nhóm bệnh nhân ung thư phổi Nghiên cứu của Wenlei Zhuo và cộng sự năm 2012 cho thấy tỷ lệ nam/nữ là 1,85/1, cao hơn ở người châu Á và gần xấp xỉ ở người da trắng Tại Trung Quốc, Dazhong Liu và Datong Zheng ghi nhận tỷ lệ nam/nữ lần lượt là 2,3/1 và 2,6/1 Năm 2012, ước tính có khoảng 1,8 triệu trường hợp ung thư phổi mới trên toàn thế giới, chiếm 13% tổng số các loại ung thư Tỷ lệ mắc bệnh ung thư phổi ở nam giới cao nhất ở Bắc Mỹ, Châu Âu và Đông Á, trong khi nữ giới có tỷ lệ cao nhất ở Bắc Mỹ, Châu Âu, Úc, New Zealand, Bắc Triều Tiên và Trung Quốc Các số liệu thống kê từ Globocan 2008 và 2012 cho thấy xu hướng phát triển của bệnh ung thư phổi.

Luận án tiến sĩ Y học cho thấy sự thay đổi trong tỷ lệ mắc ung thư phổi theo giới tính Theo thống kê năm 2008, ở các nước phát triển, số ca mới mắc ung thư phổi là 529.176 ở nam giới và 209.707 ở nữ giới (tỷ lệ nam/nữ là 2,5/1) Đến năm 2012, con số này giảm ở nam giới (490.300) nhưng tăng ở nữ giới (267.900), tỷ lệ còn lại là 1,83/1 Trong khi đó, ở các nước đang phát triển, số ca mới mắc năm 2008 là 564.306 ở nam và 224.580 ở nữ (tỷ lệ 2,5/1), và đến 2012 là 751.300 và 315.200 (tỷ lệ 2,38/1) Điều này cho thấy ung thư phổi ở nam giới có xu hướng giảm ở các nước phát triển, trong khi ở các nước đang phát triển, số ca mới không ngừng tăng, đặc biệt là ở nữ giới Sự gia tăng này có thể liên quan đến thói quen hút thuốc lá ở phụ nữ các nước phát triển Tuy nhiên, Trung Quốc lại có tỷ lệ nữ giới mắc ung thư phổi cao hơn một số nước Châu Âu dù tỷ lệ hút thuốc lá thấp hơn, cho thấy ô nhiễm môi trường là một yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến tỷ lệ mắc ung thư phổi ở cả hai giới Điều này chỉ ra rằng bên cạnh thuốc lá, còn nhiều yếu tố khác tác động đến sự hình thành và phát triển ung thư phổi.

4.1.3 Tiền sử hút thuốc lá

Hút thuốc là nguyên nhân chính gây ung thư phổi, ảnh hưởng không chỉ từ việc hút thuốc chủ động mà còn cả hút thuốc thụ động Thời gian, số lượng và độ tuổi bắt đầu hút thuốc càng cao thì nguy cơ mắc bệnh càng lớn Ngoài thuốc lá, các yếu tố như tiếp xúc với tia radon, amiăng, arsenic, chế độ ăn uống, di truyền, hormone, nhiễm trùng và viêm cũng góp phần làm tăng nguy cơ ung thư phổi.

Luận án tiến sĩ Y học gây nguy cơ, khoảng 95% ung thư phổi ở nam giới và 90% phụ nữ ở Hoa Kỳ là do hút thuốc lá [111], [112], [113]

Xu hướng và tỷ lệ mắc ung thư phổi chủ yếu bị ảnh hưởng bởi tỷ lệ hút thuốc lá trong cộng đồng Nghiên cứu của Bilano và cộng sự cho thấy tỷ lệ hút thuốc khác nhau giữa các khu vực và quốc gia Trong khi tỷ lệ hút thuốc giảm mạnh ở các nước Châu Mỹ và Châu Âu thu nhập cao, thì vẫn cao ở Châu Phi, khu vực Địa Trung Hải và các nước Châu Âu thu nhập thấp Sự bất bình đẳng về thu nhập ảnh hưởng đến kiểm soát hút thuốc, dẫn đến tỷ lệ mắc và tử vong do ung thư phổi cũng khác nhau theo khu vực Thói quen hút thuốc có sự khác biệt giữa các nền văn hóa; nghiên cứu tại Hàn Quốc ghi nhận 69,9% bệnh nhân sử dụng thuốc lá, trong khi tại Nhật Bản tỷ lệ này là 79,2% Tại Mayo Clinic, tỷ lệ hút thuốc ở bệnh nhân ung thư phổi đạt 86,6% Trung Quốc và các nước Đông Nam Á có tỷ lệ hút thuốc cao ở nam giới và thấp ở nữ giới.

Nghiên cứu của chúng tôi ghi nhận 94/220 (42,7%) trường hợp có hút thuốc, cho thấy tỷ lệ hút thuốc lá trong nhóm bệnh nhân ung thư phổi đã giảm đáng kể so với các nghiên cứu trước đây Cụ thể, Nguyễn Việt Cồ (1996) ghi nhận tỷ lệ này là 76%, Trần Nguyên Phú (2007) là 64,2%, và Nguyễn Hải Anh (2006) cho thấy 75,2% trong số 125 bệnh nhân nghiên cứu có hút thuốc Điều này cho thấy ý thức về tác hại của thuốc lá đối với sức khỏe đã được nâng cao, dẫn đến sự giảm tỷ lệ người hút thuốc Tuy nhiên, vẫn còn sự khác biệt giữa tỷ lệ bệnh nhân ung thư phổi có hút thuốc lá.

Hút thuốc lá là nguyên nhân chính gây ung thư phổi, với nguy cơ mắc bệnh cao gấp 1,78 lần ở người hút thuốc so với người không hút thuốc Tỷ lệ ung thư phổi thường phản ánh tỷ lệ hút thuốc với thời gian trễ vài thập kỷ Hút thuốc lá và tiếp xúc với khói thuốc đã được chứng minh là nguyên nhân gây ung thư phổi, chiếm khoảng 80% trường hợp ở nam giới và 50% ở phụ nữ toàn cầu Ngoài ra, tác hại của thuốc lá không chỉ ảnh hưởng đến người hút mà còn đến những người hút thuốc thụ động, dẫn đến khoảng 21.400 ca tử vong do ung thư phổi hàng năm ở những người không hút thuốc.

Nghiên cứu này không ghi nhận trường hợp nữ giới nào hút thuốc, trong khi nghiên cứu của Trần Nguyên Phú cho thấy có 7,1% (1/14) bệnh nhân nữ hút thuốc Nghiên cứu của Sekine I tại Nhật Bản trên 3312 bệnh nhân ung thư phổi cho thấy 38,9% (367/943) bệnh nhân nữ có tiền sử hoặc hiện tại hút thuốc Sự khác biệt trong thói quen hút thuốc giữa hai giới phần nào giải thích tỷ lệ ung thư phổi cao hơn ở nam giới Tuy nhiên, cần lưu ý rằng chỉ xét đến hút thuốc lá chủ động, trong khi hút thuốc thụ động cũng là yếu tố nguy cơ cao gây ung thư phổi, với nguy cơ tăng 1,5 lần cho những người hít phải khói thuốc lá lâu ngày so với người ít hoặc không tiếp xúc Ngoài khói thuốc lá, còn nhiều nguyên nhân khác cũng đã được xác định gây ung thư phổi.

4.1.4 Kết quả mô bệnh học của nhóm bệnh nhân ung thư phổi

Đa hình gen TP53 ở nhóm nghiên cứu

Mặc dù thuốc lá chứa chất gây ung thư, không phải tất cả người hút thuốc đều mắc ung thư phổi, và ngược lại, có những người không hút thuốc vẫn bị bệnh Điều này cho thấy rằng có thể có nhiều yếu tố khác, bao gồm tính đa hình gen, ảnh hưởng đến sự phát triển của ung thư phổi Nghiên cứu đã chỉ ra sự khác biệt về độ nhạy cảm với ung thư giữa các cá nhân dù họ tiếp xúc với cùng một môi trường Các đặc điểm cá nhân, bao gồm đa hình gen liên quan đến ung thư, có thể là nguyên nhân cho sự khác biệt này Do đó, nhiều nghiên cứu đã được thực hiện để khám phá mối liên hệ giữa đa hình gen và nguy cơ ung thư phổi, với một số đa hình di truyền được xác định là yếu tố nguy cơ độc lập hoặc kết hợp với các yếu tố môi trường.

Các nghiên cứu toàn cầu hiện nay đang chú trọng vào tính đa hình của gen liên quan đến ung thư, đặc biệt là gen TP53, vì nó đóng vai trò quan trọng trong việc ức chế sự hình thành và phát triển của bệnh Nhiều nghiên cứu chỉ ra rằng tính đa hình của gen TP53 có thể ảnh hưởng đến chức năng ức chế ung thư của con đường tín hiệu p53, từ đó làm thay đổi độ nhạy cảm với ung thư ở con người.

Luận án tiến sĩ Y học đã được nghiên cứu rộng rãi trên toàn cầu, nhưng kết quả vẫn chưa đạt được sự thống nhất Nghiên cứu này tiến hành khảo sát một số SNP của gen TP53, bao gồm đa hình thêm 16bp tại vùng intron 3, SNP21, SNP34 và SNP36.

Nghiên cứu SNP47, SNP R72P, SNP217 và SNP360 ở bệnh nhân ung thư phổi so với nhóm chứng nhằm khám phá mối liên hệ giữa tính đa hình gen TP53 và nguy cơ mắc ung thư phổi.

4.2.1 Đa hình gen thêm 16bp tại vùng intron 3 của gen TP53

Nghiên cứu về mối liên quan giữa đa hình gen thêm 16bp tại intron 3 của gen TP53 và ung thư đã được một số tác giả thực hiện, nhưng do tính hiếm gặp của đa hình này và thiếu thông tin công bố, mối liên hệ với nguy cơ ung thư phổi vẫn chưa được xác định rõ ràng Trong nghiên cứu này, kết quả khuếch đại gen cho phép xác định kiểu gen tại vị trí intron 3, và đa hình gen thêm 16bp tại vùng intron 3 của gen TP53 đã được công bố lần đầu tiên.

Nghiên cứu năm 2002 cho thấy kiểu gen A1A1 có nguy cơ mắc ung thư vú thấp hơn so với kiểu gen A1A2 (OR = 1,3; 95% CI = 1,0-1,7) và A2A2 (OR = 1,7; 95% CI = 0,8-3,4) ở phụ nữ Đức Trong nghiên cứu của chúng tôi, 8/220 bệnh nhân ung thư phổi có kiểu gen A1A2 với thêm 16bp tại intron 3 gen TP53, chiếm 3,6%, cao hơn so với nhóm chứng 1,7% (4/230 trường hợp), nhưng không có ý nghĩa thống kê (OR = 2,13; 95% CI = 0,633 - 7,184) Chúng tôi không phát hiện trường hợp nào mang kiểu gen A2A2 có thêm 16bp tại intron 3 ở cả hai alen Những người mang alen A2 có thể có biểu hiện protein p53 thấp và nguy cơ mắc ung thư cao, cho thấy SNPs có thể ảnh hưởng đến quá trình hoàn thiện mRNA Gần đây, một phân tích cộng gộp từ 25 nghiên cứu đã được thực hiện.

Nghiên cứu tiến sĩ Y học cho thấy kiểu gen A2A2 làm tăng nguy cơ mắc ung thư so với kiểu gen A1A1 (OR = 1,45; 95% CI = 1,22 - 1,74), tuy nhiên, kết quả này không đồng nhất giữa các chủng tộc Thêm vào đó, đa hình 16 bp vùng intron 3 gen TP53 cũng cho thấy sự khác biệt giữa các loại ung thư Cụ thể, kiểu gen A2A2 là yếu tố nguy cơ cho ung thư vú và ung thư đại tràng, nhưng không có ý nghĩa trong ung thư phổi Nghiên cứu của chúng tôi lần đầu tiên phân tích đa hình 16 bp vùng intron 3 gen TP53 trên bệnh nhân ung thư phổi tại Việt Nam, góp phần làm rõ mối liên hệ giữa yếu tố chủng tộc và loại hình ung thư, cần tính đến tính đa hình của gen TP53.

Gen TP53 có sự thay thế nucleotid G (guanine) bằng C (cytosine) tại vị trí thứ 2 của codon 72, dẫn đến việc thay đổi acid amin từ Arg thành Pro, ảnh hưởng đến cấu trúc và chức năng sinh học của protein Do đó, đa hình SNP R72P của TP53 có thể tạo ra những tác động khác nhau đối với nhiều loại ung thư, thậm chí trong cùng một loại ung thư, tùy thuộc vào quần thể dân cư khác nhau.

Sự thay đổi gen tạo ra ba kiểu gen khác nhau: GG (SNP R72P R/R), GC (SNP R72P R/P) và CC (SNP R72P P/P) Một phân tích tổng hợp từ 32 nghiên cứu với 19.255 đối tượng cho thấy mối liên hệ giữa đa hình gen TP53 codon 72 và ung thư phổi Tuy nhiên, một phân tích khác không tìm thấy bằng chứng về nguy cơ này ở người da trắng và người Mỹ gốc Phi, có thể do sự khác biệt chủng tộc mà vẫn chưa được làm rõ Nghiên cứu của chúng tôi nhằm tìm hiểu tỷ lệ các kiểu gen này trong quần thể.

Luận án tiến sĩ này nghiên cứu về kiểu gen đa hình của gen TP53 tại codon 72 và mối liên hệ giữa đa hình này với nguy cơ ung thư phổi tại Việt Nam Nghiên cứu nhằm làm rõ vai trò của biến thể gen TP53 trong việc tăng cường nguy cơ mắc ung thư phổi, từ đó cung cấp thông tin quan trọng cho việc phòng ngừa và điều trị bệnh Kết quả của luận án có thể góp phần nâng cao hiểu biết về di truyền học ung thư tại Việt Nam.

Trong số các SNP của gen TP53, R72P là SNP được nghiên cứu nhiều nhất, với codon 72 nằm trong exon 4, liên quan đến chức năng apoptosis của protein p53 Sự thay thế nucleotid tại codon 72 dẫn đến sự thay đổi từ arginin sang prolin Chúng tôi đã sử dụng kỹ thuật PCR-RFLP để phân tích codon này, đảm bảo độ tin cậy của kết quả thông qua giải trình tự trực tiếp exon 4 Kết quả cho thấy tỷ lệ kiểu gen SNP R72P P/P ở bệnh nhân ung thư phổi là 26,4%, cao hơn không đáng kể so với 25,6% ở nhóm chứng Phân tích tỷ suất chênh OR cho thấy sự gia tăng nguy cơ mắc ung thư phổi, nhưng không có ý nghĩa thống kê Mặc dù nhiều nghiên cứu đã đề cập đến SNP R72P và ung thư phổi, kết quả vẫn chưa thống nhất Nghiên cứu của chúng tôi phù hợp với một số nghiên cứu không tìm thấy mối liên quan, như nghiên cứu của Chua và cộng sự (2010) và Xin Wang (2015) Gần đây, một nghiên cứu ở Iran cũng không ghi nhận mối liên quan này Chỉ một số báo cáo với cỡ mẫu lớn tìm thấy sự kết hợp giữa SNP R72P và nguy cơ mắc ung thư phổi, như nghiên cứu của Zhang và cộng sự năm 2006.

Nghiên cứu của Piao và cộng sự (2011) cho thấy tỷ lệ kiểu gen SNP R72P P/P ở bệnh nhân ung thư phổi tại Hàn Quốc cao hơn so với nhóm chứng, với 16,7% so với 11,2% Kiểu gen SNP R72P P/P làm tăng nguy cơ mắc ung thư phổi với tỷ suất chênh OR là 1,83 (95% CI = 1,48 - 2,26) Thêm vào đó, ghi nhận của Mostaid MS và cộng sự (2014) cho thấy kiểu gen SNP R72P P/P và R/P cũng làm tăng nguy cơ mắc ung thư phổi với OR lần lượt là 4,62 (95% CI = 2,31 - 9,52) và 2,51 (95% CI).

Các nghiên cứu của Liu và cộng sự, Hung và cộng sự, cùng Wang và cộng sự đã chỉ ra rằng tỷ lệ odds (OR) của SNP R72P P/P so với R/R trong quần thể người da trắng lần lượt là 1,37 (95% CI = 1,0 - 1,9), 1,18 (95% CI = 0,92-1,51) và 0,93 (95% CI = 0,67-1,29).

Nghiên cứu cho thấy gen codon 72 SNP R72P P/P có liên quan đến nguy cơ ung thư phổi, với tần suất cao hơn ở người Châu Á so với người da trắng Một phân tích gộp năm 2014 chỉ ra rằng nguy cơ này tăng trong tất cả các mô hình di truyền (mô hình trội: OR = 1,13; mô hình lặn: OR = 1,14; mô hình cộng gộp: OR = 1,19) Đặc biệt, một nghiên cứu năm 2009 khẳng định rằng nguy cơ ung thư phổi ở người Châu Á với kiểu gen SNP R72P P/P là cao hơn (OR = 1,37) trong khi không tìm thấy mối liên quan này ở người da trắng (OR = 0,96) Tần số kiểu gen đa hình cũng cho thấy sự khác biệt theo chủng tộc và môi trường.

Trong cùng một quần thể địa lý, có sự khác biệt rõ rệt về phân bố kiểu gen của SNP R72P gen TP53 giữa các chủng tộc khác nhau Nghiên cứu của Wu và cộng sự (2002) chỉ ra rằng sự phân bố các kiểu gen của SNP Arg72Pro có ý nghĩa thống kê.

Đa hình gen MDM2 ở nhóm nghiên cứu

MDM2 là yếu tố điều chỉnh chính trong con đường tín hiệu p53, có khả năng điều hòa ngược âm tính hoạt động của p53 Biểu hiện quá mức của MDM2 ức chế khả năng kiểm soát tế bào của p53, dẫn đến mất kiểm soát chu trình phân bào, khả năng tự sửa chữa DNA và chết theo chu trình của tế bào MDM2 cũng thúc đẩy quá trình giáng hóa p53 thông qua ubiquitin hóa Sự biểu hiện quá mức của MDM2 có thể gây ra sự hình thành tế bào ung thư, và ngay cả một thay đổi nhỏ trong mức protein MDM2 cũng có thể ảnh hưởng đến sự phát triển ung thư qua con đường tín hiệu p53 Một đa hình nucleotid đơn tại vị trí 309 trong gen MDM2 (rs2279744) có thể làm tăng biểu hiện MDM2 và suy giảm con đường tín hiệu p53, với nghiên cứu cho thấy kiểu gen G/G có thể tăng cường tổng hợp protein MDM2 gấp 4 lần so với T/T và T/G tăng 1.9 lần so với T/T.

Nhiều nghiên cứu trước đây đã chỉ ra rằng sự kết hợp của đa hình MDM2 309T>G có thể làm tăng nguy cơ mắc một số loại ung thư, bao gồm sarcom, ung thư nội mạc tử cung, ung thư tế bào gan và ung thư vú.

Alen G có thể có vai trò dự phòng ung thư vùng đầu cổ ở người da trắng, cho thấy rằng đa hình nucleotid đơn gen MDM2 309T>G có thể ảnh hưởng khác nhau đến các loại ung thư khác nhau Cần tiến hành nghiên cứu sâu hơn để hiểu rõ vai trò của nó trong từng loại ung thư cụ thể.

Trong nghiên cứu này, để xác định được kiểu gen tại vị trí SNP309 gen MDM2 chúng tôi sử dụng phương pháp PCR-RFLP với enzym cắt giới hạn

MspA1i nhận diện đoạn gen chứa SNP309, nơi thay đổi nucleotid tại SNP309 của gen MDM2 dẫn đến biến đổi trình tự nhận biết của enzym MspA1i, tạo ra các đoạn gen có độ dài khác nhau Quy trình kỹ thuật này đã được chuẩn hóa bởi các chuyên gia tại Trung tâm Gen – Protein, Trường Đại học Y Hà Nội Sau khi xác định kiểu gen bằng phương pháp PCR-RFLP, mẫu được lấy ngẫu nhiên để kiểm tra lại bằng phương pháp giải trình tự gen, cho thấy kết quả đồng nhất giữa hai phương pháp Chúng tôi đã thực hiện xác định kiểu gen SNP 309T>G của gen MDM2 trên 220 bệnh nhân ung thư phổi.

Trong nghiên cứu với 230 đối chứng, chúng tôi đã phân tích tỷ lệ kiểu gen và alen, so sánh giữa nhóm bệnh nhân ung thư phổi và nhóm chứng dựa trên tỷ suất chênh OR với 95% CI Kết quả cho thấy tỷ lệ alen biến đổi G gần tương đương với alen nguyên thủy T (49,1% so với 50,8%) Tỷ lệ các kiểu gen TT, TG và GG trong nhóm ung thư phổi lần lượt là 27,3%; 44,1%; 28,6%, trong khi ở nhóm chứng là 23,9%; 57,0%; 29,1% Điều này cho thấy tỷ lệ kiểu gen dị hợp tử có mặt ở cả hai nhóm ung thư phổi và nhóm chứng.

Nghiên cứu của chúng tôi cho thấy TG chiếm đa số, tương tự như các nghiên cứu trước đó về tỷ lệ kiểu gen SNP 309T>G MDM2 ở người châu Á Kết quả nghiên cứu chỉ ra rằng tỷ lệ kiểu gen SNP 309T>G MDM2 khác nhau theo chủng tộc, được tổng hợp trong bảng 4.1.

Bảng 4.1: Tỷ lệ các kiểu gen SNP 309T>G MDM2 trên bệnh nhân ung thư phổi và nhóm chứng trong một số nghiên cứu trên thế giới

Tác giả Năm công bố Chủng tộc

Li [90] 2006 Người Mỹ da trắng 135 472 419 164 573 408

Pine [170] 2006 Người Mỹ gốc Phi 2 20 111 5 47 203

Pine [170] 2006 Người mỹ da trắng 54 167 150 52 187 182

Liu [171] 2008 Người da trắng 283 802 702 199 631 530 Mittelstrass

Gansmo[87] 2015 Người da trắng 183 581 567 502 1783 1464 Enokida

Các nghiên cứu hiện nay chủ yếu tập trung vào nhóm người da trắng và người châu Á, trong khi dữ liệu về người gốc Phi vẫn còn hạn chế Kết quả cho thấy không có sự chênh lệch tỷ lệ kiểu gen TT và GG ở người châu Á, điều này khác biệt so với nhóm người da trắng, nơi tỷ lệ kiểu gen SNP 309GG thấp hơn so với SNP 309TT ở cả bệnh nhân ung thư phổi và nhóm chứng Sự khác biệt này phản ánh sự phân bố kiểu gen theo chủng tộc, tuy nhiên, để khẳng định điều này, cần có các nghiên cứu dịch tễ gen sâu rộng hơn.

Nghiên cứu của chúng tôi cho thấy kiểu gen đồng hợp tử SNP 309GG làm tăng nguy cơ mắc ung thư phổi gấp 1,7 lần so với kiểu gen kết hợp SNP 309TT và TG theo mô hình gen lặn (OR=1,7; 95%CI=1,09-2,63) Kết quả này tương đồng với nghiên cứu của Gui và cộng sự năm 2009, phân tích dữ liệu từ 8 nghiên cứu với 6.603 bệnh nhân ung thư phổi và 6.678 đối chứng, ghi nhận SNP 309GG cũng làm tăng nguy cơ ung thư phổi (OR=1,17; 95% CI=1,02-1,34) Đặc biệt, phân tích theo chủng tộc cho thấy nguy cơ ung thư phổi ở người châu Á tăng lên với kiểu gen TG so với TT (OR=1,2; 95% CI=1,05-1,37) và GG so với TT (OR=1,26; 95% CI=1,01-1,79), cũng như theo mô hình gen trội (OR=1,26; 95% CI=1,11-1,43) Ngược lại, nghiên cứu không tìm thấy mối liên quan giữa kiểu gen SNP 309 MDM2 ở người châu Âu và châu Phi Do đó, cần làm rõ vai trò của kiểu gen theo chủng tộc và môi trường sống trong nguy cơ phát sinh ung thư phổi Kết quả cụ thể được trình bày trong bảng 4.2 [75].

Bảng 4.2: Kết quả phân tích kiểu gen SNP 309T>G gen MDM2 và nguy cơ mắc ung thư phổi theo chủng tộc trong nghiên cứu của Gui (2009)

Chủng tộc OR GG/TT

Phân tích của Wenwu He và cộng sự (2012) cho thấy nguy cơ phát triển ung thư phổi liên quan đến gen MDM2 SNP 309GG với OR=1,144 (95% CI=1,037-1,262) theo mô hình gen lặn và OR=1,379 (95% CI=1,142-1,665) ở người Châu Á theo mô hình gen trội Mặc dù nghiên cứu của Gui và Wenwu He có ưu điểm về kích thước mẫu lớn, nhưng vẫn tồn tại một số hạn chế như sự không đồng nhất trong việc lựa chọn đối chứng, với hầu hết được chọn từ quần thể khỏe mạnh mà chưa loại trừ hoàn toàn các yếu tố nguy cơ khác Thêm vào đó, số lượng người Châu Phi trong nghiên cứu khá nhỏ, dẫn đến thiếu sức mạnh thống kê để phát hiện mối liên quan có ý nghĩa Cuối cùng, kết quả của Gui dựa trên các ước tính chưa được điều chỉnh.

Luận án tiến sĩ Y học phân tích chính xác hơn dựa trên dữ liệu cá nhân, cho phép điều chỉnh theo các biến số như tuổi, dân tộc, tình trạng hút thuốc, yếu tố môi trường và lối sống Việc lựa chọn nhóm bệnh và nhóm chứng phù hợp, cùng với ước tính hiệu chỉnh theo đặc điểm cá nhân, sẽ mang lại kết quả đáng tin cậy hơn Nghiên cứu của chúng tôi đã chọn nhóm ung thư phổi theo tiêu chuẩn giải phẫu bệnh và nhóm chứng từ những người khám sức khỏe, có sàng lọc ung thư, tương ứng về tuổi và giới tính Kết quả được hiệu chỉnh theo đặc điểm tuổi giới để tìm ra mối liên quan chặt chẽ hơn Tuy nhiên, hạn chế của nghiên cứu là số lượng mẫu nhỏ, gây khó khăn trong việc xác định mối liên quan có ý nghĩa thống kê, và sự xem xét giữa gen - gen và gen - môi trường vẫn chưa được đề cập Do đó, để hiểu rõ hơn về mối liên quan giữa đa hình gen MDM2 SNP309T>G và nguy cơ ung thư phổi, cần phân tích các yếu tố trên trong nghiên cứu.

Mối liên quan giữa đa hình gen TP53 và gen MDM2 với nguy cơ mắc ung thư phổi

Ung thư phổi là kết quả của sự tương tác phức tạp giữa gen và môi trường, với các yếu tố này chỉ có thể ảnh hưởng khiêm tốn đến sự phát triển của bệnh Do đó, việc đánh giá đa hình gen cần được xem xét trong mối liên hệ với đặc điểm sinh học và yếu tố môi trường để xác định nguy cơ mắc bệnh một cách chính xác hơn Nghiên cứu này tập trung vào mối liên quan giữa các đa hình gen TP53, gen MDM2 và nguy cơ mắc ung thư phổi dựa trên một số đặc điểm lâm sàng và cận lâm sàng của bệnh nhân.

4.4.1 Mối liên quan giữa đa hình gen TP53 và nguy cơ mắc ung thư phổi theo một số đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng trong ung thư phổi

Trong nghiên cứu của chúng tôi về bệnh nhân ung thư phổi, chúng tôi đã so sánh độ tuổi mắc bệnh trung bình giữa các kiểu gen khác nhau Kết quả cho thấy kiểu gen SNP R72P P/P có tuổi mắc bệnh trung bình thấp hơn so với kiểu gen SNP R72P R/R Tuy nhiên, sự khác biệt về độ tuổi mắc bệnh giữa các kiểu gen TP53 không được ghi nhận.

Nghiên cứu của Trịnh Quốc Đạt và cộng sự năm 2017 cho thấy SNP R72P không có ý nghĩa thống kê, nhưng kiểu gen đồng hợp SNP R72P P/P ở bệnh nhân ung thư gan có độ tuổi trung bình thấp hơn 7,7 năm so với kiểu gan nguyên thủy SNP R72P R/R (p=0,01) Kết quả này gợi ý rằng sự thay đổi kiểu gen có thể làm tăng độ nhạy cảm với ung thư Tuy nhiên, ung thư gan cũng chịu ảnh hưởng từ nhiều yếu tố nguy cơ khác như nghiện rượu, xơ gan, và viêm gan virus, do đó, cần nghiên cứu sự tương tác giữa kiểu gen và môi trường để hiểu rõ hơn về sự nhạy cảm này.

Khi phân tích mối liên quan giữa gen TP53 SNP R72P và ung thư phổi theo giới, chúng tôi không ghi nhận được mối liên quan có ý nghĩa thống kê Mặc dù xu hướng cho thấy kiểu gen P/P có thể làm tăng nguy cơ mắc ung thư phổi ở nữ giới hơn nam giới, nhưng các nghiên cứu hiện có về vấn đề này vẫn còn nhiều mâu thuẫn Một số nghiên cứu, như của Piao và CS, cho thấy gen SNP R72P P/P làm tăng nguy cơ mắc ung thư phổi ở nam giới hơn nữ giới, trong khi nghiên cứu của Irarraza và CS (2003) cũng công bố rằng alen P làm tăng nguy cơ ở nam giới hơn Ngược lại, một số nghiên cứu khác lại chỉ ra rằng SNP R72P P/P có thể gia tăng nguy cơ mắc ung thư phổi ở nữ giới hơn ở nam giới Sự khác biệt về cỡ mẫu có thể là nguyên nhân dẫn đến sự khác biệt trong độ nhạy cảm với ung thư phổi giữa hai giới.

Nghiên cứu của Piao, với mẫu lớn gồm 3.939 bệnh nhân ung thư phổi và 1.700 đối chứng tại Hàn Quốc trong giai đoạn 2000-2010, đã chỉ ra rằng kiểu gen SNP R72P P/P có thể làm tăng nguy cơ mắc ung thư phổi ở nam giới.

Tính đa hình gen TP53 có ảnh hưởng khác nhau đến các loại mô bệnh học ung thư phổi Nghiên cứu của chúng tôi cho thấy phần lớn bệnh nhân mắc ung thư phổi thuộc loại ung thư biểu mô tuyến (73,2%), tiếp theo là ung thư tế bào nhỏ (9,5%) và ung thư biểu mô vảy (5,9%) Chúng tôi đã phân tích mối liên quan giữa kiểu gen SNP R72P và các loại ung thư, nhưng không ghi nhận được mối liên quan có ý nghĩa thống kê nào giữa SNP R72P và nguy cơ mắc ung thư phổi theo loại mô bệnh học Nghiên cứu toàn cầu đã chỉ ra rằng SNP R72P có thể liên quan đến sự phát triển của các loại mô bệnh học ung thư phổi, với nghiên cứu của Piao tại Hàn Quốc cho thấy kiểu gen P/P làm tăng nguy cơ mắc tất cả các loại ung thư phổi, đặc biệt là ung thư tế bào nhỏ và tế bào vảy Mặc dù nhiều nghiên cứu đã phân tích mối liên quan này, kết quả vẫn chưa đồng nhất, với một số nghiên cứu chỉ ra rằng kiểu gen P/P làm tăng nguy cơ ung thư biểu mô tuyến hơn ung thư biểu mô vảy, trong khi một số nghiên cứu khác lại cho thấy ngược lại.

Nghiên cứu của Fernandez-Rubio và CS vào năm 2008 cho thấy kiểu gen P/P codon 72 của gen TP53 có liên quan đến việc tăng nguy cơ mắc ung thư biểu mô vảy so với ung thư biểu mô tuyến.

Hút thuốc lá làm tăng nguy cơ mắc nhiều loại khối u, đặc biệt là ung thư phổi, do tác động trực tiếp đến DNA và gây biến đổi gen, nhất là gen TP53 Mức độ nguy cơ gia tăng theo số năm hút thuốc, số lượng thuốc lá tiêu thụ hàng ngày và tuổi bắt đầu hút Nguy cơ mắc ung thư phổi tăng ngay cả với bất kỳ lượng thuốc lá nào, không có giới hạn dưới cho việc hút thuốc gây ung thư Thời gian hút thuốc cũng rất quan trọng; thời gian hút càng dài thì tác hại càng lớn.

Hút thuốc thụ động làm tăng nguy cơ mắc ung thư phổi với chỉ số nguy cơ tương đối từ 1,2 đến 1,5, và gây ra khoảng 50.000 ca tử vong hàng năm Hút thuốc thụ động là việc hít phải hỗn hợp khói từ thuốc lá đang cháy, bao gồm dòng khói phụ từ điếu thuốc hoặc xì gà, chứa các hạt nhỏ dễ xâm nhập vào tế bào và rất giàu chất gây ung thư, cùng với dòng khói mà người hút thuốc thở ra.

Hút thuốc lá kết hợp với các yếu tố độc hại khác làm gia tăng nguy cơ ung thư phổi, đặc biệt ở những cá thể có kiểu gen nhạy cảm Do đó, nghiên cứu mối liên quan giữa đa hình kiểu gen và nguy cơ mắc ung thư phổi là rất cần thiết để cải thiện công tác dự phòng, chẩn đoán và điều trị bệnh Mục tiêu của nghiên cứu này là khám phá mối liên hệ giữa đa hình kiểu gen TP53 và nguy cơ ung thư phổi.

Luận án tiến sĩ Y học gen nghiên cứu mối liên hệ giữa gen MDM2 và thói quen hút thuốc lá trong việc xác định nguy cơ mắc ung thư phổi Các đối tượng nghiên cứu đã được phỏng vấn về tình trạng hút thuốc, đồng thời phân tích kiểu gen đa hình để phát hiện mối liên quan có ý nghĩa giữa các yếu tố này.

Nghiên cứu về ung thư phổi cho thấy hút thuốc lá làm tăng nguy cơ mắc bệnh này gấp 1,78 lần so với không hút thuốc, với mức độ nguy cơ tăng theo số bao-năm Cụ thể, người hút dưới 20 bao-năm có nguy cơ tăng 1,68 lần, trong khi người hút trên 20 bao-năm có nguy cơ tăng 1,87 lần Tuy nhiên, không có mối liên quan thống kê giữa tình trạng hút thuốc và kiểu gen TP53 codon 72 cũng như nguy cơ mắc ung thư phổi theo các mô hình gen Đặc biệt, những người có kiểu gen SNP R72P P/P và hút thuốc có nguy cơ mắc ung thư phổi cao hơn 3,06 lần, cho thấy sự cộng hưởng giữa gen nhạy cảm và yếu tố nguy cơ khác Việc hiểu rõ kiểu gen và tính nhạy cảm với ung thư phổi sẽ giúp cải thiện các biện pháp dự phòng hiệu quả hơn.

Nghiên cứu về mối liên hệ giữa gen TP53 và nguy cơ ung thư phổi vẫn còn chưa nhất quán Một số tài liệu chỉ ra rằng việc hút thuốc lá có thể ảnh hưởng đến đáp ứng của đa hình tại codon.

Nghiên cứu về gen TP53 cho thấy đa hình kiểu gen tại codon 72 có liên quan đến nguy cơ ung thư phổi, đặc biệt là ở người hút thuốc Các nghiên cứu của Fan và cộng sự (2000), Zhang và cộng sự (2006), và Fernandez-Rubio (2008) đã chỉ ra rằng nguy cơ mắc ung thư phổi tăng cao hơn ở người hút thuốc với tỷ lệ Odds Ratio (OR) lần lượt là 1,48 so với 1,34 ở người không hút thuốc, với khoảng tin cậy 95% tương ứng là 1,01-2,16 và 1,04-1,73 Nghiên cứu của Dazhong Liu và cộng sự cũng đã xác nhận mối liên hệ này.

Biến thể gen TP53 tại codon 72 có ảnh hưởng đến nguy cơ ung thư phổi ở những người hút thuốc lá, cho thấy mối liên hệ giữa việc hút thuốc và đa hình gen trong sự phát sinh của bệnh ung thư.

Tiêu đề	Xác Định Tính Đa Hình Của Các Gen TP53 Và Gen MDM2 Ở Bệnh Nhân Ung Thư Phổi
Tác giả	Trần Khánh Chi
Người hướng dẫn	PGS.TS. Trần Huy Thịnh, PGS.TS. Nguyễn Thị Hà
Trường học	Trường Đại Học Y Hà Nội
Chuyên ngành	Hóa Sinh
Thể loại	luận án tiến sĩ
Năm xuất bản	2019
Thành phố	Hà Nội

Định dạng
Số trang	159
Dung lượng	2,84 MB