Xác định đột biến gen egfr quyết định tính đáp ứng thuốc trong điều trị bệnh ung thư phổi không tế bào nhỏ

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU

Trong giai đoạn từ 01/01/2012 đến 30/03/2013, 181 bệnh nhân mắc ung thư phổi giai đoạn cuối (IIIB-IV) đã được điều trị tại các bệnh viện Hữu Nghị, Bệnh viện K Trung Ƣơng, Bệnh viện Bạch Mai, Bệnh viện Phổi Trung Ương, Bệnh viện Ung Bướu Hà Nội và Bệnh viện Đại học Y Hà Nội, đáp ứng đầy đủ các tiêu chuẩn chọn mẫu và tiêu chuẩn loại trừ.

2.1.1 Xác định đột biến gen EGFR và gen KRAS

Uptu được chẩn đoán xác định là UTPKTBN giai đoạn IIIB-IV theo tiêu chuẩn của AJCC VII, dựa trên kết quả giải phẫu bệnh, bao gồm các loại ung thư như ung thư biểu mô tuyến, ung thư biểu mô vảy, ung thư biểu mô tuyến-vảy và ung thư biểu mô tế bào lớn, được mô tả và phân loại theo tiêu chuẩn của Tổ chức Y tế Thế giới.

- Có đầy đủ thông tin về hành chính, tiền căn, giai đoạn bệnh UTP, kết quả giải phẫu bệnh

- Đồng ý tham gia nghiên cứu

- Không xác định đƣợc đột biến gen EGFR hoặc KRAS do chất lƣợng mẫu kém

Luận án tiến sĩ Y học

2.1.2 Đánh giá hiệu quả điều trị

Trong nghiên cứu này, 61 bệnh nhân mắc UTPKTBN giai đoạn cuối (IIIB-IV) đã được xét nghiệm gen từ tổng số 181 bệnh nhân, với thời điểm kết thúc thu mẫu vào ngày 30/12/2013 Các bệnh nhân này đều đáp ứng đầy đủ các tiêu chuẩn chọn mẫu và tiêu chuẩn loại trừ đã được xác định.

- Chẩn đoán mô bệnh học là ung thƣ phổi thể biểu mô tuyến

- Đánh giá toàn trạng trước điều trị ≥70% theo chỉ số Karnofsky [122]; các chỉ số cận lâm sàng cần có: số lƣợng bạch cầu đa nhân trung tính

≥1500/mL, số lƣợng tiểu cầu ≥100 000/mL, nồng độ hemoglobin ≥ 9,0g/dL, nồng độ creatinine ≤ 1,5mg/dL, hoạt độ AST và ALT ≤ 2,5 lần giới hạn trên bình thường

- Chưa được điều trị kháng ung thư trước đó

- Không có tiền căn dị ứng

Để đảm bảo tính chính xác và đầy đủ của nghiên cứu, cần thu thập thông tin toàn diện từ hồ sơ bệnh án, bao gồm các dữ liệu về hành chính, tiền căn, bệnh sử, kết quả khám lâm sàng, thông số cận lâm sàng và chẩn đoán hình ảnh Việc này có thể thực hiện qua thư từ, cuộc gọi điện thoại với bệnh nhân hoặc gia đình của bệnh nhân cho đến khi kết thúc nghiên cứu.

- Đƣợc điều trị erlotinib ít nhất 1 tháng, tính đến thời điểm kết thúc nghiên cứu

- Đồng ý tham gia nghiên cứu

Suy gan, suy thận nặng và suy hô hấp tiến triển là những tình trạng nghiêm trọng cần được chú ý Nhiễm trùng chưa được kiểm soát, tình trạng có thai, và di căn não chưa kiểm soát cũng là những yếu tố nguy hiểm Ngoài ra, bệnh ung thư khác, loạn nhịp nặng đang phải dùng thuốc, cùng với bệnh tiểu đường hoặc các vấn đề về mắt nghiêm trọng, đều có thể ảnh hưởng đến sức khỏe tổng thể.

Kết quả xác định đột biến gen cho thấy có sự hiện diện của các đột biến ở vùng kháng thuốc điều trị đích dạng phân tử nhỏ của gen EGFR, bao gồm đột biến D761Y ở exon 19 và các đột biến T790M, N771T, V769L, S768I ở exon 20, cùng với các đột biến mới chưa được công bố trong y văn Ngoài ra, cũng phát hiện có đột biến tại codon 12 và 13 của exon 2 gen KRAS.

Nhiều bệnh nhân ngừng sử dụng thuốc khi bệnh chưa có dấu hiệu tiến triển, thường do tác dụng phụ của thuốc hoặc những lý do chủ quan từ phía bệnh nhân và gia đình.

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Nghiên cứu cắt ngang và mô tả loạt ca nhằm xác định đột biến gen EGFR và KRAS, cùng với nghiên cứu tiến cứu theo dõi dọc thời gian sống thêm, sẽ đánh giá hiệu quả điều trị.

- Thời gian nghiên cứu: từ 01/01/2012 đến hết 30/03/2014

2.2.2 Phương pháp tiến hành nghiên cứu

2.2.2.1 Xác định đột biến gen EGFR và gen KRAS

Sau khi bệnh nhân được chẩn đoán xác định dựa trên kết quả giải phẫu bệnh, cần thu thập mẫu mô UTP Mẫu mô này được lấy từ sinh thiết và được đúc trong khối nến để đảm bảo tính chính xác trong quá trình phân tích.

Sau khi được ký hiệu mã số bệnh nhân, các mẫu mô sẽ được xác định mô bệnh học và lựa chọn vùng tế bào ung thư tại khoa Giải phẫu bệnh Vùng mô ung thư sẽ được đánh dấu trên lam giải phẫu bệnh để phân biệt với vùng mô lành xung quanh, thường từ 5 đến 10 tiêu bản Sau đó, mô ung thư sẽ được cạo vào ống ly tâm 1,5 ml bằng các lưỡi dao phẫu thuật riêng biệt Đối với những trường hợp bệnh phẩm sinh thiết quá nhỏ, việc đánh dấu sẽ gặp khó khăn.

Luận án tiến sĩ Y học phân biệt vùng mô ung thƣ và mô lành nên đƣợc thu toàn bộ vào tube ly tâm

Sử dụng vùng mô này để tách chiết, tinh sạch DNA bộ gen

Tách chiết DNA từ mẫu mô UTP được thực hiện bằng xylene, sau đó tinh sạch bằng phương pháp phenol/chloroform Để kiểm tra chất lượng DNA vừa tách chiết, phản ứng PCR được sử dụng với cặp mồi gen nội chuẩn GAPDH.

- Xác định đột biến gen EGFR và KRAS bằng kỹ thuật giải trình tự gen

 DNA của bệnh nhân tách chiết từ mẫu mô UT đƣợc sử dụng để khuếch đại bằng phản ứng PCR với các cặp mồi đặc hiệu cho các exon 18 ÷

21 của gen EGFR (Phụ lục 4) và KRAS (Phụ lục 5)

 Sản phẩm sau PCR sẽ đƣợc điện di trên gel agarose 1,5% (Cách chuẩn bị gel agarose và tiến hành kỹ thuật điện di: phụ lục 6)

 Sản phẩm PCR sau khi điện di trên gel agarose đƣợc tinh sạch bằng hệ thống Promega Wizard SV gel clean-up system (Promega) (Phụ lục 7)

 Đoạn DNA sau khi tinh sạch sẽ đƣợc chạy phản ứng giải trình tự gen sử dụng BigDye Terminator v3.0 Ready Reaction Cycle Sequencing Kit

The genetic sequences of EGFR and KRAS from the patient were analyzed using the ABI3700 automated sequencer (Appendix 8) These sequences were then compared to the GenBank reference sequences (EGFR: NG_007726, KRAS: NG_007524, National Center for Biotechnology Information) and analyzed using Seqscape software (Applied Biosystems) The nucleotide notation conventions for the sequencing results are detailed in Appendix 8.

- Xác định đột biến gen EGFR và KRAS bằng kỹ thuật Scorpion ARMS

 Sử dụng EGFR PCR kit và KRAS PCR kit (Qiagen) tích hợp kỹ thuật ARMS và công nghệ Scorpion, phát hiện 29 dạng đột biến gen EGFR và

7 dạng đột biến gen KRAS bằng phản ứng real-time PCR (Bảng 2.1 và 2.2)

Các đoạn mồi Scorpion được thiết kế để phát hiện các đột biến gen EGFR và KRAS, dựa trên trình tự gen tham chiếu của người trong ngân hàng gen toàn cầu Mỗi mẫu bệnh nhân được kiểm tra hai lần trong cùng một phản ứng, kèm theo mẫu chứng dương, chứng âm và mẫu nội chuẩn để đảm bảo độ chính xác trong kết quả.

Sơ đồ 2.1 Sơ đồ nghiên cứu xác định đột biến gen và theo dõi điều trị

Mẫu mô UTP Lựa chọn vùng tế bào UT Tách chiết và tinh sạch DNA

Xác định đột biến gen EGFR và KRAS bằng kỹ thuật Giải trình tự gen và Scorpion ARMS Điều trị đích bằng erlotinib Không điều trị đích

Ghi nhận đáp ứng thực thể và toàn trạng

Ghi nhận thời gian sống thêm

Có đột biến đáp ứng thuốc trên gen EGFR

Bệnh nhân có đột biến

KRAS (bất kể là có hay không có đột biến gen

Không có đột biến gen EGFR

Bệnh nhân không có đột biến gen KRAS

Có đột biến kháng thuốc trên gen EGFR

Bảng 2.1 Các dạng đột biến exon 18-21 gen EGFR đƣợc phát hiện bằng kỹ thuật Scorpion ARMS Đột biến Exon Biến đổi nucleotid Cosmic ID [123]

Bảng 2.2 Các dạng đột biến exon 2 gen KRAS đƣợc phát hiện bằng kỹ thuật Scorpion ARMS

Codon Dạng đột biến Biến đổi nucleotid COSMID ID [123]

- Các quy trình xác định đột biến gen EGFR và KRAS đƣợc thực hiện tại Trung tâm Nghiên cứu Gen-Protein, Trường Đại Học Y Hà Nội

2.2.2.2 Đánh giá hiệu quả điều trị

Tất cả bệnh nhân được phỏng vấn trực tiếp để ghi nhận bệnh sử, diễn tiến bệnh, cùng với các thông số lâm sàng và cận lâm sàng theo mẫu nghiên cứu đã được thống nhất.

Mỗi bệnh nhân sẽ được điều trị bằng erlotinib 150mg một viên mỗi ngày qua đường uống cho đến khi có dấu hiệu tiến triển của bệnh, bệnh nhân tử vong, xuất hiện tác dụng phụ không chấp nhận được hoặc khi bệnh nhân từ chối tiếp tục dùng thuốc Việc giảm liều hoặc ngừng điều trị sẽ được thực hiện theo quyết định của bác sĩ điều trị.

- Trong quá trình theo dõi điều trị, bệnh nhân sẽ đƣợc đánh giá mức độ đáp ứng điều trị mỗi 03 tháng:

 Đánh giá đáp ứng toàn trạng theo chỉ số Karnofsky [122] (Bảng 2.3) Đáp ứng toàn trạng đƣợc đánh giá thành 2 mức: ổn định/tăng và giảm (chỉ số

Karnofsky giữ nguyên, tăng lên hoặc giảm đi so với thời điểm đánh giá trước)

 Đánh giá đáp ứng thực thể theo tiêu chuẩn RECIST v1.1 [75]

Tổn thương đo lường là những tổn thương có kích thước xác định trên hình ảnh chụp cắt lớp vi tính hoặc chụp cộng hưởng từ, theo bảng 2.4 Khi không xác định được khối u nguyên phát, đánh giá sẽ dựa vào tổn thương không đo lường như dịch màng phổi hoặc nồng độ các chất chỉ thị u, theo bảng 2.5 Tổn thương thứ phát xuất hiện trong quá trình điều trị, bao gồm hạch và di căn Tỷ lệ đáp ứng (ORR) được tính bằng tổng tỷ lệ đáp ứng hoàn toàn (%CR) và tỷ lệ đáp ứng một phần (%PR) Khi bệnh tiến triển, bệnh nhân sẽ được hội chẩn và thay đổi phác đồ điều trị.

Thời gian sống thêm bệnh không tiến triển (PFS) được ghi nhận từ khi bệnh nhân bắt đầu điều trị đặc hiệu bằng erlotinib cho đến khi có dấu hiệu bệnh tiến triển hoặc tử vong trước khi bệnh tiến triển Thông tin cuối cùng sẽ được thu thập trong trường hợp bệnh nhân mất theo dõi hoặc khi nghiên cứu kết thúc, thường được tính theo tháng.

Thời gian sống thêm toàn thể (OS) được ghi nhận từ khi bệnh nhân bắt đầu nhận điều trị đặc hiệu với erlotinib cho đến khi bệnh nhân qua đời vì bất kỳ nguyên nhân nào Trong trường hợp bệnh nhân mất theo dõi hoặc nghiên cứu kết thúc, thông tin cuối cùng sẽ được cập nhật vào tháng.

Theo dõi và phân loại mức độ nghiêm trọng của tác dụng phụ của thuốc dựa trên tiêu chuẩn Đánh giá độc tính và tác dụng phụ của hóa chất của Viện Ung thư quốc gia Hoa Kỳ, phiên bản 3.0 (CTCAEv3.0) Việc xử lý các tác dụng phụ của erlotinib, như tiêu chảy và phát ban thể nổi mụn, cần tuân theo chỉ định của bác sĩ điều trị.

Bảng 2.3.Đánh giá toàn trạng theo chỉ số Karnofsky [122] Điểm Mức hoạt động

100% Không có triệu chứng rõ ràng của bệnh, khả năng hoạt động mạnh

90% Khả năng hoạt động bình thường, triệu chứng bệnh tối thiểu

80% Khả năng hoạt động bình thường nhưng phải cố gắng Có triệu chứng bệnh

70% Không thể hoạt động bình thường hoặc làm việc Tự phục vụ tối thiểu được

60% Cần có sự giúp đỡ cần thiết và đƣợc chăm sóc y tế

50% Cần có sự trợ giúp rất lớn và được chăm sóc y tế thường xuyên

40% Không tự phục vụ tối thiểu, cần có sự trợ giúp liên tục và đƣợc chăm sóc đặc biêt

30% Liệt giường, nằm viện nhưng chưa có nguy cơ tử vong

20% Bệnh nặng chăm sóc đặc biệt ở bệnh viện

Bảng 2.4 Đánh giá đáp ứng thực thể theo tiêu chuẩn RECIST v1.1 đối với các tổn thương đo lường [75]

Tổn thương không đo lường

Tổn thương Thứ phát Đáp ứng tổng thể Đáp ứng hoàn toàn Đáp ứng hoàn toàn Không Đáp ứng hoàn toàn Đáp ứng hoàn toàn

Không đạt Đáp ứng hoàn toàn và không đạt Bệnh tiến triển

Không Đáp ứng một phần Đáp ứng hoàn toàn Không xác định đƣợc Không Đáp ứng một phần Đáp ứng một phần

Không đạt Bệnh tiến triển và không phải không xác định đƣợc

Không Đáp ứng một phần Bệnh giữ nguyên

Không đạt Bệnh tiến triển và không phải không xác định đƣợc

Không Bệnh giữ nguyên Không xác định đƣợc

Không đạt Bệnh tiến triển Không Không xác định đƣợc Bệnh tiến triển

Bất kỳ Có hoặc không Bệnh tiến triển

Bất kỳ Bệnh tiến triển Có hoặc không Bệnh tiến triển

Bất kỳ Bất kỳ Có Bệnh tiến triển

Bảng 2.5 Đánh giá đáp ứng thực thể theo tiêu chuẩn RECIST v1.1 đối với các tổn thương không đo lường được [75]

Tổn thương không đo lường Tổn thương thứ phát Đáp ứng Đáp ứng hoàn toàn Không Đáp ứng hoàn toàn

Bệnh giữ nguyên Không Bệnh giữ nguyên

Không xác định đƣợc Không Không xác định đƣợc

Bệnh tiến triển Có hoặc không Bệnh tiến triển

Bất kỳ bệnh tiến triển nào cũng có thể đạt được đáp ứng hoàn toàn (CR - Complete Response), khi đó các tổn thương sẽ biến mất và các dấu ấn ung thư trở về mức bình thường Ngoài ra, có thể có đáp ứng một phần (PR - Partial Response), nghĩa là tổn thương giảm ít nhất một phần.

30% tổng đường kính đo lường

Bệnh giữ nguyên (Stable Disease - SD) là tình trạng khi tổn thương không đạt tiêu chí khỏi bệnh hoàn toàn (CR) hoặc tiến triển bệnh (PD), trong khi các dấu ấn ung thư vẫn duy trì ở mức cao hơn giới hạn bình thường.

Bệnh tiến triển (PD) được xác định khi có sự gia tăng rõ rệt của tổn thương, cụ thể là tăng ít nhất 20% tổng đường kính đo lường (tối thiểu 5mm) Đồng thời, các dấu ấn ung thư cũng tiếp tục gia tăng vượt mức giới hạn bình thường.

2.3.PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ THỐNG KÊ

VẤN ĐỀ ĐẠO ĐỨC TRONG NGHIÊN CỨU

Nghiên cứu này được thực hiện dựa trên sự tự nguyện của các bệnh nhân được chẩn đoán UTPKTBN trên lâm sàng, với việc xét nghiệm phân tích đột biến gen EGFR chỉ được tiến hành khi có sự đồng ý của bệnh nhân và gia đình Nghiên cứu tuân thủ các nguyên tắc đạo đức theo Tuyên bố Helsinki và các số liệu sử dụng đã được Hội đồng Đạo Đức của Trường Đại học Y Hà Nội phê duyệt.

Xét nghiệm trên mẫu mô được sử dụng trong chẩn đoán ban đầu UTPKTBN, không yêu cầu lặp lại sinh thiết nếu mẫu có chất lượng kém không xác định được đột biến gen Nghiên cứu không can thiệp vào quyết định chẩn đoán và điều trị, chỉ ghi nhận triệu chứng lâm sàng và cận lâm sàng của bệnh nhân Thông tin bệnh nhân sẽ được bảo mật, và họ có quyền tự rút lui khỏi nghiên cứu bất cứ lúc nào.

Rủi ro trong nghiên cứu chủ yếu đến từ phản ứng quá mẫn với hóa chất Để đảm bảo an toàn, những bệnh nhân có cơ địa dị ứng sẽ không được tham gia vào nghiên cứu.

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

XÁC ĐỊNH TỶ LỆ ĐỘT BIẾN GEN EGFR VÀ GEN KRAS

Từ ngày 01/01/2012 đến 30/12/2013, có 181 bệnh nhân từ các bệnh viện Hữu Nghị, K Trung Ƣơng, Bạch Mai và Phổi Trung Ƣơng đã được chọn mẫu và thực hiện xét nghiệm tìm đột biến exon 18-21 gen EGFR cùng đột biến codon 12-13 exon 2 gen KRAS Các kết quả thu được sẽ được trình bày trong bài viết này.

3.1.1 Kết quả tách chiết DNA từ mẫu mô ung thƣ

Nghiên cứu chỉ tuyển mộ bệnh nhân ung thư phổi giai đoạn IIIB/IV mới chẩn đoán, không còn chỉ định phẫu thuật, do đó tất cả mẫu mô ung thư đều là mẫu mô sinh thiết được đúc trong khối nến Sau khi tách chiết, mẫu DNA được kiểm tra nồng độ và độ tinh sạch bằng phương pháp đo mật độ quang.

Bảng 3.1 Nồng độ và độ tinh sạch của các mẫu DNA

(ng/àL) Độ tinh sạch (A 260/280 )

Nồng độ DNA (ng/àL) Độ tinh sạch (A 260/280 )

Kết quả từ bảng 3.1 cho thấy các mẫu DNA đều đạt độ tinh sạch cao, với tỷ số mật độ quang ở bước sóng 260/280 nm nằm trong khoảng 1,7 đến 2,0 khi đo bằng máy quang phổ Điều này chứng tỏ rằng các mẫu DNA sau quá trình tách chiết đảm bảo chất lượng, đủ điều kiện cho các thí nghiệm tiếp theo.

Kiểm tra chất lượng DNA là bước quan trọng sau khi tách chiết, được thực hiện thông qua phản ứng PCR với cặp mồi GAPDH Sản phẩm PCR sau đó được điện di trên gel agarose 1,5% để đánh giá độ tinh khiết và chất lượng của DNA.

Hình 3.1 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR sử dụng mồi GAPDH

(Giếng 1: chứng âm, giếng 2-8: sản phẩm PCR của các mẫu DNA khác nhau, giếng 9: marker 100bp)

Sản phẩm PCR khuếch đại gen GAPDH cho thấy chỉ một băng 300 bp đặc hiệu, chứng minh rằng chất lượng DNA tách chiết từ các mẫu mô ung thư là tốt, không bị đứt gãy Điều này đảm bảo đủ tiêu chuẩn cho kỹ thuật giải trình tự gen và Scorpion ARMS để xác định đột biến gen.

3.1.2 Kết quả khuếch đại exon 18-21 gen EGFR và exon 2 gen KRAS

Kết quả điện di sản phẩm khuếch đại các exon 18, 19, 20, 21 của gen EGFR và exon 2 của gen KRAS trên gel agarose 1,5% đƣợc trình bày trong hình 3.2

Hình 3.2 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR của các exon 18, 19, 20 và 21 gen EGFR (A) và exon 2 gen KRAS (B) trên gel agarose

(BN: bệnh nhân; (-): mẫu đối chứng âm; giếng 1-4 (hình B): mẫu bệnh nhân)

Sản phẩm PCR từ quá trình khuếch đại các exon 18-21 của gen EGFR và exon 2 của gen KRAS tạo ra một băng đặc hiệu, với chiều dài sản phẩm khuếch đại cho các exon 18, 19, 20 và 21 của gen EGFR lần lượt là 349 bp.

Các đoạn 397 bp, 408 bp và 374 bp của exon 2 gen KRAS (250 bp) cho thấy độ sáng đồng nhất, sắc nét và không có sản phẩm phụ, đáp ứng tiêu chuẩn cho kỹ thuật giải trình tự gen nhằm xác định đột biến Mẫu đối chứng âm sử dụng là nước cất đã cho kết quả âm tính, chứng minh không có hiện tượng nhiễm DNA trong phản ứng PCR.

3.1.3 Kết quả xác định đột biến bằng kỹ thuật giải trình tự gen

3.1.3.1 Kết quả xác định đột biến gen EGFR

Nghiên cứu sử dụng mẫu mô lành tính để so sánh và phát hiện các dạng đột biến khác nhau trên exon 18, 19, 20 và 21 của gen EGFR Qua kỹ thuật giải trình tự gen, 25 trường hợp đột biến L858R đã được phát hiện trong số 181 bệnh nhân, đây là đột biến thay thế một nucleotid tại codon 858 thuộc exon 21 gen EGFR, được minh họa trong hình 3.3.

Hình 3.3 Hình ảnh giải trình tự gen phát hiện đột biến L858R trên exon 21 của gen EGFR (mã số mẫu 110)

Nhận xét: Hình 3.3 là hình ảnh đại diện cho kết quả đột biến L858R tại exon 21 của bệnh nhân ung thƣ phổi (có mã số mẫu 110) bằng kỹ thuật giải

Mẫu lành tính Mẫu bệnh nhân ung thƣ

Luận án tiến sĩ Y học trình tự gen so sánh với trình tự DNA lành tính cho thấy tại vị trí nucleotid 2537 trên exon 21, có sự xuất hiện của một đỉnh T biến đổi thành G, dẫn đến sự thay đổi trong cấu trúc acid amin.

Leucine (L) tại codon 858 biến đổi thành Arginine (R), gây nên đột biến

Nghiên cứu sử dụng kỹ thuật giải trình tự gen đã phát hiện 2 trường hợp đột biến L861Q trong số 181 bệnh nhân, đây là một đột biến thay thế nucleotid xảy ra tại codon 861 trong exon 21 của gen EGFR Hình ảnh minh họa cho đột biến này được trình bày trong hình 3.4.

Hình 3.4 Hình ảnh giải trình tự gen phát hiện đột biến L861Q trên exon 21 của gen EGFR (mã số mẫu 23)

Hình 3.4 minh họa kết quả đột biến L861Q tại exon 21 của bệnh nhân ung thư phổi (mã số mẫu 23) thông qua kỹ thuật giải trình tự gen So với trình tự DNA bình thường, tại vị trí nucleotid 2582 trên exon có sự khác biệt đáng chú ý.

21, xuất hiện thêm một đỉnh T bị biến đổi thành A, làm cho acid amin Leucine

(L) tại codon 861 biến đổi thành Glutamine (Q), gây nên đột biến L861Q

Nghiên cứu sử dụng kỹ thuật giải trình tự gen đã phát hiện 45 trường hợp đột biến LREA trong số 181 bệnh nhân, với đột biến này là dạng xóa đoạn điển hình xảy ra tại exon 19 của gen EGFR Hình ảnh minh họa cho đột biến này được trình bày trong hình 3.5.

Hình 3.5 Hình ảnh giải trình tự gen phát hiện đột biến xóa đoạn LREA trên exon 19 của gen EGFR (mã số mẫu 179)

Hình 3.5 minh họa kết quả đột biến xóa đoạn LREA tại exon 19 của bệnh nhân ung thư phổi (mẫu số 179) qua kỹ thuật giải trình tự gen So với trình tự DNA bình thường, đột biến này thể hiện sự xóa đoạn 15 nucleotid tại exon 19, dẫn đến việc mất các acid amin glutamic (E), leucine (L), arginine (R), glutamic (E) và alanine (A) tại các codon 746 đến 750 Do đó, đột biến này được gọi là đột biến ∆E746-A750 hay LREA.

Bằng kỹ thuật giải trình tự gen, nghiên cứu phát hiện đƣợc các đột biến G719S (exon 18), đột biến T790M đơn độc (exon 20), đột biến đôi T70M (exon

Trong nghiên cứu trên 181 bệnh nhân, đã phát hiện 20+ L858R (exon 21) và đột biến đôi S768I + V769L (exon 20), mỗi loại đột biến chỉ xuất hiện ở một trường hợp Các đột biến này là những thay thế một nucleotid xảy ra trên gen EGFR, được minh họa trong hình 3.6, 3.7 và 3.8.

Hình 3.6 Hình ảnh giải trình tự gen phát hiện đột biến G719S trên exon 18 của gen EGFR (mã số mẫu 102)

Hình 3.6 minh họa kết quả đột biến G719S tại exon 18 của bệnh nhân ung thư phổi (mã số mẫu 102) thông qua kỹ thuật giải trình tự gen So với trình tự DNA bình thường, tại vị trí nucleotid 2155 trên exon 21, có sự xuất hiện của đỉnh G biến đổi thành A, dẫn đến sự thay đổi acid amin Glycine (G) tại codon 718 thành Serine (S), gây ra đột biến G719S.

Hình 3.7 Hình ảnh giải trình tự gen phát hiện đột biến T790M trên exon 20 và đột biến L858R trên exon 21 gen EGFR của cùng một bệnh nhân (mã số mẫu 48)

Mẫu bệnh nhân ung thƣ

Nhận xét: Hình 3.7 là hình ảnh đại diện cho kết quả phát hiện đồng thời

ĐÁNH GIÁ HIỆU QUẢ ĐIỀU TRỊ

Sau khi xét nghiệm xác định đột biến gen trên 181 bệnh nhân, có 28 bệnh nhân phát hiện đột biến exon 2 gen KRAS, 75 bệnh nhân không có đột biến gen EGFR, 3 bệnh nhân có đột biến gen EGFR gây kháng thuốc điều trị đích, và 3 bệnh nhân có đột biến gen EGFR mới chưa rõ đáp ứng với thuốc Đặc biệt, một bệnh nhân mang đột biến gen EGFR mới cũng có đột biến trên gen KRAS Cuối cùng, theo tiêu chuẩn chọn mẫu và loại trừ, còn lại 72 bệnh nhân đủ điều kiện tham gia đánh giá hiệu quả điều trị erlotinib.

1 Tuy nhiên, do một số yếu tố khách quan nhƣ lý do kinh tế, thể mô bệnh học không phải là ung thư biểu mô tuyến, lựa chọn một phương pháp điều trị khác do ước muốn của người bệnh, người bệnh không đồng ý tiếp tục nghiên cứu…nên chỉ còn 61 bệnh nhân thực sự đƣợc theo dõi điều trị erlotinib

Từ ngày 01/01/2012 đến 30/12/2013, có 61 bệnh nhân từ Bệnh viện K Trung Ơng và Bệnh viện Bạch Mai đủ tiêu chuẩn được tham gia nghiên cứu theo dõi hiệu quả điều trị của erlotinib Độ tuổi trung bình của nhóm bệnh nhân này là 66,16 ± 18,24 Các đặc điểm của bệnh nhân được tóm tắt trong bảng 3.10.

Bảng 3.10 Đặc điểm của nhóm bệnh nhân điều trị erlotinib Đặc điểm

Giới tính Độ tuổi Tiền căn hút thuốc*

Tổng cộng Nam Nữ

Tiêu đề	Xác Định Đột Biến Gen EGFR Quyết Định Tính Đáp Ứng Thuốc Trong Điều Trị Bệnh Ung Thư Phổi Không Tế Bào Nhỏ
Tác giả	Nguyễn Minh Hà
Người hướng dẫn	TB.BS. Trần Võn Khỏnh, GS. Đỗ Đỡnh Hồ
Trường học	Trường Đại Học Y Hà Nội
Chuyên ngành	Hóa Sinh Y Học
Thể loại	luận án tiến sĩ y học
Năm xuất bản	2014
Thành phố	Hà Nội

Định dạng
Số trang	193
Dung lượng	7,01 MB