1 Công nghệ gen PGS TS Trần Cát Đông cnshduoc@gmail com 2 Mục tiêu Biết công nghệ gen là gì Biết các công cụ cơ bản Hiểu các bước cơ bản Biết một số ứng dụng 3 Định nghĩa Tổng quát Các thao tác di tru[.]
Các công cụ z Chủng vi sinh vật dùng tạo dịng gen z Cơng nghệ gen z PGS.TS Trần Cát Đơng cnshduoc@gmail.com z Chủng trì: mang đột biến cho phép nhận ổn định ADN ngoại lai DH5α, JM103, … Chủng biểu hiện: mang đột biến giúp biểu gen ngoại lai ổn định protein tái tổ hợp BL21(DE3), BL21(DE3)plysS, … Chọn chủng vi sinh vật phù hợp với mục đích vector sử dụng Mục tiêu z z z z Vector tạo dòng - Plasmid Plasmid z Biết cơng nghệ gen Biết cơng cụ Hiểu bước Biết số ứng dụng z z z z z z Có yếu tố đánh dấu để chọn lọc dịng tái tổ hợp, Có điểm khởi đầu chép (Ori) Có vùng tạo dịng Các plasmid sau tái tổ hợp đưa vào tế bào chủ cách biến nạp hay thẩm điện pGEM, pBR322 pBluescript II, … pET, pGEX, … Dễ sử dụng, thao tác, đa Khó tạo dịng ADN lớn z z Định nghĩa z z Plasmid Tổng quát: Các thao tác di truyền dùng để tạo cá thể có tổ hợp đặc điểm di truyền Cụ thể: z z Các thao tác tế bào, liên quan đến việc tạo tế bào lai Các thao tác phân tử, liên quan đến việc tạo phân tử ADN tái tổ hợp nhân tạo, đưa chúng vào vector chuyển vào tế bào chủ AmpR Tạo dịng gen z z Các vector từ phage lambda Tạo dòng tế bào mang đoạn gen cần nghiên cứu Mục đích: z z z lập đoạn gen cần nghiên cứu khỏi tập hợp gen chung để nghiên cứu chức thực thao tác biến đổi Sản xuất lượng lớn gen đích Đoạn gen đích Tạo dịng Vector mang gen đích Nghiên cứu chức Dịng tế bào mang gen đích z z Bộ gen phage sau tái tổ hợp đóng gói in vitro đơn giản cần ADN đích Thư viện phage dễ dàng phát với mẫu dò, khuếch đại bảo quản thời gian dài λgt10, λgt11, λZAP II, … Nuôi cấy Chiết tách Đưa trở lại tế bào Thực biến đổi Vector cosmid PCR Cosmid dạng lai phage plasmid có ưu hai dạng vector Đóng gói in vitro phage, hoạt động plasmid Tạo dịng ADN có kích thước lớn đến 50 kb z z z z Nguyên lý: chép ADN in vitro Trong điều kiện có sẵn nucleotid Enzym polymerase kéo dài mạch ADN theo nguyên tắc bổ sung đầu 3’-OH trống z z z Kỹ thuật PCR gồm bước: biến tính dsADN thành sợi đơn, ủ đoạn mồi (chuỗi oligonucleotid tổng hợp đặc hiệu) với ssADN, enzym kéo dài đoạn mồi theo nguyên tắc bổ sung với ssADN mẫu z z z Polymerase Vector từ phage dạng sợi - M13 z z z z 5’-P 3’-OH nucleotid 3’-OH 5’-P 13 PCR ADN đích Khả tạo dịng ADN sợi đơn lẫn sợi kép Thu lượng lớn ADN Có sử dụng chế bổ sung alpha để chọn lọc dòng Ứng dụng nhiều thí nghiệm định trình tự làm khuôn mẫu để gây đột biến đặc hiệu điểm 3’ 5’ 5’ 3’ 3’ 5’ ADN đích biến tính 5’ 3’ 3’ Đoạn đích quay lại 3’ Gắn mồi 3’ 3’ Kéo dài Biến tính Đoạn đích quay lại Gắn mồi Kéo dài Biến tính gắn mồi Kéo dài Tiếp tục biến tính, gắn mồi kéo dài 20-40 chu kỳ 10 Các enzym biến đổi acid nucleic z z z z NHÂN Cắt ADN vị trí xác định Tạo đầu dính đầu tù Lưu ý tính tương thích cắt nối ADN P NST Polymerase z z z z z Tổ chức vật liệu di truyền Enzym cắt hạn chế / methylase z ADN polymerase phụ thuộc ADN Polymerase phụ thuộc ARN (hoặc ADN) ADN Polymerase không phụ thuộc khuôn mẫu ARN polymerase phụ thuộc ADN ARNt R Operon R Gen +1 R ADN P NST T Gen Phiên mã R T Dịch mã CAP ARN M Gppp exon intron exon intron exon T Phiên mã P exon intron exon intron exon đuôi AAAAA ARNt nguyên thủy sau phiên mã Loại bỏ intron ARN hoạt động M7Gppp Protein AAAAA Xuất tế bào chất ARN AAAAA M7Gppp Dịch mã Ligase z 14 Protein Nối hai đoạn ADN Nhân nguyên thủy Nhân chuẩn 11 Tính tương thích phản ứng cắt nối Tạo đoạn ADN đích z z z z 15 Enzym cắt giới hạn Điểm nhận diện Cắt giới hạn ADN nguồn PCR biết trình tự hai đầu RT-PCR Tổng hợp ADNc Đầu cắt Tính tương thích Sản phẩm nối Dính Sau3A -GATC-CTAG- -GATC - CTAG- BamHI -GGATCC-CCTAGG- -GGATC C-C CTAGG- EcoRI -GAATTC-CTTAAG- -G AATTC-CTTAA G- EcoRI -GAATTC-CTTAAG- -G AATTC-CTTAA G- DraI -TTTAAA-AAATTT- -TTT -AAA EcoRV -GATATC-CTATAG- -GAT -CTA Dính Tương thích Dính -GGATC-CCTAGKhơng tương thích Dính -GAATTC-CTTAAGTương thích Tù -GAATTC-CTTAAGKhơng tương thích AAATTTTù 12 -GATCC-CTAGG- -TTTATC-AAATAGTương thích ATCTAG- -GATAAA-CTATTT- 16 Đưa ADN vào tế bào z Biến nạp z z z z z Tế bào thu nhận ADN tự môi trường ngoại bào Tế bào xử lý với CaCl2 Không phải loại tế bào biến nạp z Lai hóa z z z Dùng điện trường cao làm thủng tạm thời màng tế bào Có thể thực với nhiều loại tế bào z Nhận diện ADN nhờ đoạn dò đánh dấu Miễn dịch z Thẩm điện z z Sàng lọc dòng tái tổ hợp Nhận diện kháng nguyên, kháng thể Protein phải biểu Hoạt tính z z Dựa vào hoạt tính đặc hiệu Protein phải biểu Tải nạp z Dùng virus để đưa gen vào tế bào 17 Tạo dòng đoạn ADN nhỏ z z z z z Biểu gen tái tổ hợp ADN đích Tạo đoạn ADN đích Cắt ADN đích vector Nối ADN đích vector Biến nạp vào tế bào Kiểm tra dòng tế bào 21 z Plasmid vector z Vị trí cắt BamHI Tetr r Amp Vị trí cắt BamHI Cắt BamHI Cắt BamHI Ampr z Các mảnh ADN z ADN ligase T4 Ampr Sự phù hợp vector hệ thống biểu Chọn hệ thống biểu hiện: z + Ampr Tetr z Biến nạp vào E coli Theo protein đích Năng suất Giá thành An tồn Trãi E coli lên mơi trường chọn lọc Khơng có kháng sinh Ampicillin Các dịng kháng Ampicillin In khóm Ampicillin Các khóm nhạy Tet kháng Amp mang dòng tái tổ hợp Tetracyclin 18 Tạo dòng phage λ Đầu ADN 45 kb 22 Tối ưu hóa biểu z đầu cos đầu cos z Nhiễm sắc thể vi khuẩn Đuôi z Cắt giới hạn Phage λ 27 kb 40 kb ADN không thiết yếu phage 15 kb 15 kb z 10 kb kb 19 kb 24 kb 17 kb z Đóng vỏ in vitro z 40 kb Q lớn khơng đóng z 27 kb z 24 kb 19 kb Đóng vỏ thành phage 17 kb z 10 kb Q nhỏ khơng đóng xác kb ADN Nhiễm sắc thể 23 Sản xuất protein tái tổ hợp Vector λ z Sản xuất đường chiết tách z z Cắt với enzym Cắt phần với enzym giới hạn PCR giới hạn với đầu cắt tương thích với đầu cắt nhiễm sắc thể Cắt với enzym giới hạn với plasmid z z z Tách ADN theo kích thước Nối z Plasmid Cosmid Đóng vỏ in vitro Đóng vỏ in vitro Tải nạp vào E coli Tải nạp vào E coli Sàng lọc khóm Sàng lọc khóm Sàng lọc plaque z z 20 Hàm lượng thấp Qui trình sản xuất khó khăn tốn Giá thành sản xuất cao Protein từ động vật lại khơng hồn toàn giống người Nguy nhiễm mầm virus hay prion Sản xuất công nghệ gen z Nối Biến nạp / Thẩm điện vào E coli In vivo In vitro 19 Tóm tắt bước tạo dịng Plasmid / Cosmid rbs, codon khởi đầu, sử dụng mã hợp lý Protein dung hợp Biến đổi hậu dịch mã z 15 kb Promoter Cảm ứng Dịch mã: z 35 kb Nối 35 kb Phiên mã: Gen người tạo dòng sản xuất nhờ vi sinh vật tái tổ hợp Sản phẩm có nguồn gốc từ người (gen người) Các nồi lên men qui mô công nghiệp 2000-5000 lít 24 Erythropoietin Đoạn xuất động vật có vú Hormon tăng trưởng 24 25 z z z z z z E coli Gen có với chiều dài kb với vùng promoter nhỏ, exon, intron, trình tự tăng cường cảm ứng giảm oxi máu Protein: nguyên thủy: 193 aa, hoạt động: 165 aa Protein bị glycosyl hóa mạnh E coli Gen hGH Gen hGH Met Tế bào chất Tế bào chất Met Xuất vùng chu chất Dịng tế bào BHK ψ2 Ni cấy bề mặt khay nhựa Thu dịch nuôi cấy để chiết sản phẩm Met Cắt bỏ đoạn xuất protease Somatotropin hoạt tính Somatotropin hoạt tính Tinh chế hGH từ dịch ly giải tế bào 25 Erythropoietin z T Promoter cảm ứng Sản xuất z Đoạn xuất vi khuẩn T Vùng chu chất z Met Promoter cảm ứng Vùng chu chất z 24 Met Hormon tạo máu, sản xuất nhờ tế bào biểu mơ mao mạch quanh tiểu quản thận Kích thích tăng sinh biệt hóa erythroid EPO người z 191 24 EPO z ADNc hGH tái tổ hợp Enzym giới hạn Met Thu hGH phá vỡ tế bào áp suất thẩm thấu 29 Vaccin viêm gan B tái tổ hợp Virus viêm gam B Tinh chế Kháng nguyên bề mặt HBsAg Qui trình Dịch ni cấy đặc Protein (A280) Hoạt tính (U x 104) Hoạt tính chuyên biệt (U/A280) Hiệu suất (%) Mức tinh chế (lần) 473.000 1.990 42 100 Phân lập gen HBsAg Protein lõi Gen HBsAg Promoter cảm ứng nấm men Gen HBsAg Terminator Điểm ori nấm men Cột hấp phụ miễn dịch 141 1.680 119.000 84 2.830 Sephadex G-100 97 1.310 135.000 66 3.210 Hydroxyapatit 75 1.030 137.000 52 3.260 Leu Điểm ori vi khuẩn TetR Biến nạp vào nấm men Lên men điều kiện thiếu leucin 26 Interferon z z Là cytokin: sản xuất tế bào miễn dịch để đáp ứng với virus, ký sinh trùng tế bào u Thương mại: z z z z z z Alpha: 2a, 2b, n3, alfacon-1; Beta: 1a, 1b Gamma: 1b Sản xuất: tái tổ hợp vào E.coli, nấm men, nuôi cấy tế bào động vật Tinh chế: sắc ký lực với Matrex Gel Blue A Loại chí nhiệt tố: RIEF (điện di đẳng điện) 27 Insulin tái tổ hợp A SH SH Đoạn nối C Đoạn xuất N SH SH Chuỗi B SH SH Chuỗi A S S Vận chuyển qua màng Thành lập cầu disulfit Preproinsulin B Proinsulin Chuỗi A β-gal P S S Cắt bỏ đoạn nối S S S S Met Insulin Chuỗi B β-gal T P S S S S Met T CNBr Oxi hóa cystein tạo cầu disulfit S S S S S S Insulin hoạt tính 28 Chiết tách kháng nguyên HBsAg Vaccin 30