ÔN TẬP CNSH CÔNG NGHỆ GEN A Đại cương Định nghĩa - CN gen tạo cá thể có tổ hợp đặc điểm di truyền: + Tạo phân tử ADN tái tổ hợp nhân tạo + Đưa ADN vào vector + Chuyển vector vào TB chủ Tạo dòng gen - Tạo dòng TB mang gen nghiên cứu - Mục đích: + Cơ lập gen cần nghiên cứu Nghiên cứu chức thao tác biến đổi gen + Sản xuất lượng lớn gen đích B Cơng cụ I Chủng VSV *Thao tác gen thường tiến hành chủng E.coli vì: - Có máy di truyền nghiên cứu đầy đủ - Tốc độ tăng trưởng nhanh - Khả gây bệnh thấp Chủng tạo dòng Chủng biểu - Cho phép thu nhận ADN ngoại lại - Biểu gen đích Vai trị - Duy trì ổn định ADN ngoại lai với - Ổn định sản phẩm biểu số cao - Thu sản phẩm biểu gen – protein - Chiết tách trở lại thu ADN đích - Mang số đột biến phát dịng mang ADN đích kỹ thuật bổ sung alpha Một số 2.1 BL21(DE3) 2.1 JM103 - Mất gen β-galactosidase - Điều khiển biện mạch gen chủng ĐB từ plasmid F phơi nhiễm với đích promoter T7 E.coli K12 phage dạng sợi - Đột biến gen protease Ion - Duy trì chủng chửa plasmid F ompT mơi trường tối thiếu 2.2 BL21trxB - Đột biến trxB: hình thành cầu nối 2.2 JM109 - Tương tự JM103: Dùng nhiều disulfid, giúp số protein gập lại hiệu suất thấp JM103 - Đột biến recA: khả tái tổ hợp tương đồng 2.3 DH5-α - Đặc tính bổ sung α tương tự JM103 JM 109 - Gen đột biến recA1 - Đột biến deoR: dễ dàng thu nhận mảnh ADN lớn NGUYỄN ĐẮC NHÂN – DCQ.2016 ƠN TẬP CNSH II Vector tạo dịng Cấu tạo 1.1 Plasmid - Phân tử ADN sợi kép, vịng kín, nhỏ, nhân độc lập tế bào - Họ plasmid mang đặc tính vector M13 pBR a pUC - Plasmid mang nhiều yếu tố thuận tiện cho thao tác b pGEM pBluescript II - Họ vector plasmid tạo dòng biểu gen, tinh chế c pET protein pGEX - Phage tiêu giải: vào tế bào chủ nhân ADN phage tạo 1.2 Phage virion, ly giải TB chủ phóng thích phage lambda 1.3 Cosmid - Lai phage plasmid ưu hai dạng Yêu cầu – đặc tính 2.1 Plasmid a Yêu cầu: - Có yếu tố đánh dầu để chọn lọc dòng tái tổ hợp: + KT bổ sung alpha + Gen kháng kháng sinh - Điểm khởi đầu chép (Ori): + Nhân độc lập NST TB chủ + Kiểm soát được: cho phép khuếch đại tăng số tăng hiệu suất + Vùng tạo dòng (MCS): Chứa nhiều trình tự nhận diện RE khác nằm liên tiếp (polylinker) cắt duỗi chèn đoạn gen mong muốn b Plasmid lý tưởng - Kích thước nhỏ (2-10 kb) - Khơng tiếp hợp - Khơng di chuyển - Có kiểu hình biểu tế bào chủ plasmid tái tổ hợp đưa vào TB chủ biến nạp hay thẩm điện c Một số họ plasmid đặc tính - Kích thước nhỏ pUC - Có gen kháng ampicillin - Vùng tạo dòng nằm lacZ Dùng kỹ thuật bổ sung alpha - Cho số cao, khuếch đại chloramphenicol pGEM - Kích thước nhỏ pBlue- - Cho số cao script II - Vùng tạo dòng nằm promoter Cho phép phiên mã trình tự xen vào NGUYỄN ĐẮC NHÂN – DCQ.2016 ƠN TẬP CNSH - Tối ưu hóa vùng tạo dịng, vị trí gắn Rbs, promoter - Trình tự mã hóa giúp tinh chế hay nhận diện protein biểu polyHis-tag, S-tag, GST-tag,… - Cắt bỏ phần gen KHƠNG liên quan đến q trình TIÊU GIẢI - Thay ADN cần tạo dòng - Kích thước vector lớn 78% nhỏ 102% so với dạng hoang dại: 51 – 38 kb Cần ý kích thước đoạn gen muốn chèn - Thuận lợi để xây thư viện tái tổ hợp: + Đóng gói in vitro: Trộn protein vỏ đóng gói Đưa ADN tái tổ hợp vào TB E.coli chủ + Dễ dàng phát với mẫu dò, khuếch đại bảo quản thời gian dài - Tạo dòng đoạn gen kích thước lớn - Mang yếu tố chọn lọc, điểm Ori plasmid - Vị trí tạo dịng trình tự phage lambda mã hóa cho vị trí cos - Tái tổ hợp cách dùng RE cắt vị trí tạo dịng trộn với gen chèn Nối vector đoạn chèn enzym ligase tạo ADN thẳng với đoạn chèn kẹp vecto Ủ với protein vỏ tạo phage gây nhiễm vào E.coli ADN tái tổ hợp tạo thành vòng hoạt động plasmid pET pGEX 2.2 Phage lambda 2.3 Cosmid III Các enzym làm biến đổi acid nucleic Enzym cắt giới hạn (RE)/ Methylase 1.1 Chức - Endonuclease cắt gắn trình tự nhận diện đặc hiệu - Enzym methylase: xúc tác methyl hóa trình tự nhận diện đặc hiệu ngăn cản tác động enzym cắt giới hạn 1.2 Phân loại RE - Loại I III: + Phức hệ mang hoạt tính cắt giới hạn methyl hóa + Cần ATP + Cắt vị trí xa trình tự nhận diện - Loại II: + Chỉ có hoạt tính endonuclease + Không cần ATP + Cắt gần trình tự nhận diện 1.3 Vị trí nhận diện/ cắt - Trình tự – nucleotide, thường đối xứng cặp (palindrome) - Có kiểu xếp: + Palindrome + Palindrome bị ngắt + Trình tự thối biến NGUYỄN ĐẮC NHÂN – DCQ.2016 ƠN TẬP CNSH + Khơng phải Palindrome Polymerase - Là enzym tổng hợp acid nucleic từ đơn vị nucleotide - Tổng hợp 5’ – 3’ - Exonuclease: 5’ – 3’ 3’ – 5’ - Đoạn lớn Polymerase I E.coli - Khơng có hoạt tính exonuclease 5’ – 3’ - Strategenes: exo- Klenow enzym c ADN polymerase T4 - Tác động tương tự đoạn Klenow hoạt tính exonuclease 3’ – 5’ mạnh d ADN polymerase T7 - Tiểu đơn vị lớn: hoạt tính enzym phage T7 mã hóa - Tiểu đơn vị nhỏ: Thioredoxin từ protein TB E.coli mã hóa Thay đổi làm hoạt tính exonuclease 3’ – 5’ - Có khả thực nhiệt độ cao nên tránh e Taq ADN cấu trúc thứ cấp khuông mẫu polimerase - Tiến hành với lượng mẫu nhỏ - Enzym chép ngược: reverse transcriptase 2.2 Polymerase phụ thuộc ADN ARN - Terminal transferase: Có khả thêm 2.3 Polymerase khơng phụ thuộc nucleotide vào nhóm 3’OH mà khơng cần khuôn khuông mẫu mẫu - Phiên mã ARN từ khuôn mẫu ADN: phiên mã 2.4 ARN polymerase phụ thuộc từ trình tự khởi động ADN 2.1 ADN a E.coli ADN polymertase polymerase I phụ thuộc b Đoạn Klenow ADN Ligase - Xúc tác liên kết cộng hóa trị phosphodiester Nối phân tử ADN đóng vịng ADN - ADN ligase E.coli: Cần NAD sửa chửa chỗ cắt khía nối đầu dính, KHƠNG nối đầu tù - ADN ligase T4: Cần ATP sửa chỗ cắt khía, nối đầu dính đầu tù C Kỹ thuật thao tác gen I Tạo đoạn ADN đích Tổng hợp cADN a Phương pháp tổng hợp - Tổng hợp thay thế: Sử dụng Rnase để cắt phần ARN phân tử lai ARN – ADN thành mảnh Mồi tổng hợp ADN nhờ ADN polymerase I Loại bỏ mồi nối lại ADN ligase - Tổng hợp thích ứng: Loại bỏ sợi ARN kiềm Thêm poly C đầu 3’ sợi ADN nhờ enzym terminal transferase Dùng đoạn mồi polyG tổng hợp sợi thứ hai ADN polymerase (Vùng 5’ADN CAP nguyên vẹn) NGUYỄN ĐẮC NHÂN – DCQ.2016 ÔN TẬP CNSH Cắt giới hạn ADN nguồn - Cắt giới hạn NST - Hiện dùng, dùng nghiên cứu PCR - Nếu biết trình tự hai đầu RT – PCR - Đoạn dò chất ARN II Cắt nối ADN - Đầu cắt enzym thương tương thích với - Mọi đầu tù tương thích với - Đầu tù đầu dính chắn khơng tương thích - Hai đầu dính cắt enzym khác dính phần so le tương thích với - Khi tương thích, đầu tù dễ tách trước enzym ligase kịp tác dụng, đầu dính tồn thời gian ngắn đủ để enzym ligase nối lại Đầu dính dễ nối đầu tù III Đưa vecto vào TB chủ Biến nạp - Tế bào thu ADN từ môi trường - Xử lý với CaCl2 giúp tăng tần số biến nạp - Thích hợp cho VK E.coli, Baccilus,… - Albumin chất phản ứng nối làm di chuyển chậm lại Biến nạp Thẩm điện - Dòng điện trường cao thủng tạm thời màng TB ADN rơi vào bên - Thích hợp với VK, ĐV, TV, nấm men,… Tải nạp - Dùng virus đưa gen vào tế bào - Virus phải tương thích TB ký chủ: dịng VK IV Sàn lọc dòng tái tổ hợp Phương pháp lai - Bắt cặp với gen đích - Có tín hiệu có đoạn chèn Phương pháp miễn dịch - Đoạn gen mã hóa tọa protein sinh kháng nguyên Phương pháp dựa vào hoạt tính - Gen mã hóa sản phẩm quan sát V Biểu gen tái tổ hợp Chọn hệ thống biểu gen 1.1 Tiêu chí - Theo protein đích NGUYỄN ĐẮC NHÂN – DCQ.2016 ÔN TẬP CNSH - Năng suất - Giá thành - An toàn 1.2 Một số giống biểu Đặc tính - Ni cấy quy mơi lớn Ưu điểm - Xuất nhiều protein vào môi trường - Xuất protein vào mơi trường tốt - Glycosyl hóa tốt - Kiểm soát phiên mã dịch mã biết rõ - Đã sản xuất thành công - Biến đổi hậu dịch mã xác - Hệ thống biểu mức độ cao Nhược điểm - Protein tái tổ hợp không tạo thể khơng tan TB chất - Khơng có nguy nhiễm virus hay prion - Protein tái tổ hợp ổn định cao - Thu lượng lớn protein tái tổ hợp - Tương đối rẻ - Không thực hết hầu hết biến đổi dịch mã Chủng VSV - E coli - Sacchraromyces cerevisae - Bacillus subtilis - Nấm men - Bacillus subtilis - Sacchraromyces cerevisae - Nấm men - Sacchraromyces cerevisae - Một số chủng nấm men tối ưu hóa - TB trùng - E coli - E coli: Insulin, Interferon, Somatotropin - TB ĐV có vú - ĐV chuyển gen - Saccharomyces cerevisae - TB côn trùng - TB ĐV có vú - Sacchraromyces cerevisae - TB trùng - TB ĐV có vú - ĐV chuyển gen - ĐV chuyển gen - E coli - Sacchraromyces cerevisae - Bacillus subtilis - Nấm men Tối ưu hóa phiên mã - NGUYỄN ĐẮC NHÂN – DCQ.2016 ... dịch - Đoạn gen mã hóa tọa protein sinh kháng nguyên Phương pháp dựa vào hoạt tính - Gen mã hóa sản phẩm quan sát V Biểu gen tái tổ hợp Chọn hệ thống biểu gen 1.1 Tiêu chí - Theo protein đích... virus đưa gen vào tế bào - Virus phải tương thích TB ký chủ: dòng VK IV Sàn lọc dòng tái tổ hợp Phương pháp lai - Bắt cặp với gen đích - Có tín hiệu có đoạn chèn Phương pháp miễn dịch - Đoạn gen mã... - TB ĐV có vú - ĐV chuyển gen - Saccharomyces cerevisae - TB côn trùng - TB ĐV có vú - Sacchraromyces cerevisae - TB trùng - TB ĐV có vú - ĐV chuyển gen - ĐV chuyển gen - E coli - Sacchraromyces