bài soạn công nghệ gen môn học công nghệ sinh học

ÔN TẬP CNSH CÔNG NGHỆ GEN A Đại cương Định nghĩa - CN gen tạo cá thể có tổ hợp đặc điểm di truyền: + Tạo phân tử ADN tái tổ hợp nhân tạo + Đưa ADN vào vector + Chuyển vector vào TB chủ Tạo dòng gen - Tạo dòng TB mang gen nghiên cứu - Mục đích: + Cơ lập gen cần nghiên cứu  Nghiên cứu chức thao tác biến đổi gen + Sản xuất lượng lớn gen đích B Cơng cụ I Chủng VSV *Thao tác gen thường tiến hành chủng E.coli vì: - Có máy di truyền nghiên cứu đầy đủ - Tốc độ tăng trưởng nhanh - Khả gây bệnh thấp Chủng tạo dòng Chủng biểu - Cho phép thu nhận ADN ngoại lại - Biểu gen đích Vai trị - Duy trì ổn định ADN ngoại lai với - Ổn định sản phẩm biểu số cao - Thu sản phẩm biểu gen – protein - Chiết tách trở lại thu ADN đích - Mang số đột biến phát dịng mang ADN đích kỹ thuật bổ sung alpha Một số 2.1 BL21(DE3) 2.1 JM103 - Mất gen β-galactosidase - Điều khiển biện mạch gen chủng ĐB từ plasmid F  phơi nhiễm với đích promoter T7 E.coli K12 phage dạng sợi - Đột biến gen protease Ion - Duy trì chủng chửa plasmid F ompT mơi trường tối thiếu 2.2 BL21trxB - Đột biến trxB: hình thành cầu nối 2.2 JM109 - Tương tự JM103: Dùng nhiều disulfid, giúp số protein gập lại hiệu suất thấp JM103 - Đột biến recA: khả tái tổ hợp tương đồng 2.3 DH5-α - Đặc tính bổ sung α tương tự JM103 JM 109 - Gen đột biến recA1 - Đột biến deoR: dễ dàng thu nhận mảnh ADN lớn NGUYỄN ĐẮC NHÂN – DCQ.2016 ƠN TẬP CNSH II Vector tạo dịng Cấu tạo 1.1 Plasmid - Phân tử ADN sợi kép, vịng kín, nhỏ, nhân độc lập tế bào - Họ plasmid mang đặc tính vector M13 pBR a pUC - Plasmid mang nhiều yếu tố thuận tiện cho thao tác b pGEM pBluescript II - Họ vector plasmid tạo dòng biểu gen, tinh chế c pET protein pGEX - Phage tiêu giải: vào tế bào chủ nhân ADN phage tạo 1.2 Phage virion, ly giải TB chủ phóng thích phage lambda 1.3 Cosmid - Lai phage plasmid  ưu hai dạng Yêu cầu – đặc tính 2.1 Plasmid a Yêu cầu: - Có yếu tố đánh dầu để chọn lọc dòng tái tổ hợp: + KT bổ sung alpha + Gen kháng kháng sinh - Điểm khởi đầu chép (Ori): + Nhân độc lập NST TB chủ + Kiểm soát được: cho phép khuếch đại  tăng số tăng hiệu suất + Vùng tạo dòng (MCS): Chứa nhiều trình tự nhận diện RE khác nằm liên tiếp (polylinker)  cắt duỗi chèn đoạn gen mong muốn b Plasmid lý tưởng - Kích thước nhỏ (2-10 kb) - Khơng tiếp hợp - Khơng di chuyển - Có kiểu hình biểu tế bào chủ  plasmid tái tổ hợp đưa vào TB chủ biến nạp hay thẩm điện c Một số họ plasmid đặc tính - Kích thước nhỏ pUC - Có gen kháng ampicillin - Vùng tạo dòng nằm lacZ  Dùng kỹ thuật bổ sung alpha - Cho số cao, khuếch đại chloramphenicol pGEM - Kích thước nhỏ pBlue- - Cho số cao script II - Vùng tạo dòng nằm promoter  Cho phép phiên mã trình tự xen vào NGUYỄN ĐẮC NHÂN – DCQ.2016 ƠN TẬP CNSH - Tối ưu hóa vùng tạo dịng, vị trí gắn Rbs, promoter - Trình tự mã hóa giúp tinh chế hay nhận diện protein biểu polyHis-tag, S-tag, GST-tag,… - Cắt bỏ phần gen KHƠNG liên quan đến q trình TIÊU GIẢI - Thay ADN cần tạo dòng - Kích thước vector lớn 78% nhỏ 102% so với dạng hoang dại: 51 – 38 kb  Cần ý kích thước đoạn gen muốn chèn - Thuận lợi để xây thư viện tái tổ hợp: + Đóng gói in vitro: Trộn protein vỏ đóng gói  Đưa ADN tái tổ hợp vào TB E.coli chủ + Dễ dàng phát với mẫu dò, khuếch đại bảo quản thời gian dài - Tạo dòng đoạn gen kích thước lớn - Mang yếu tố chọn lọc, điểm Ori plasmid - Vị trí tạo dịng trình tự phage lambda mã hóa cho vị trí cos - Tái tổ hợp cách dùng RE cắt vị trí tạo dịng trộn với gen chèn  Nối vector đoạn chèn enzym ligase tạo ADN thẳng với đoạn chèn kẹp vecto  Ủ với protein vỏ tạo phage  gây nhiễm vào E.coli  ADN tái tổ hợp tạo thành vòng hoạt động plasmid pET pGEX 2.2 Phage lambda 2.3 Cosmid III Các enzym làm biến đổi acid nucleic Enzym cắt giới hạn (RE)/ Methylase 1.1 Chức - Endonuclease cắt gắn trình tự nhận diện đặc hiệu - Enzym methylase: xúc tác methyl hóa trình tự nhận diện đặc hiệu ngăn cản tác động enzym cắt giới hạn 1.2 Phân loại RE - Loại I III: + Phức hệ mang hoạt tính cắt giới hạn methyl hóa + Cần ATP + Cắt vị trí xa trình tự nhận diện - Loại II: + Chỉ có hoạt tính endonuclease + Không cần ATP + Cắt gần trình tự nhận diện 1.3 Vị trí nhận diện/ cắt - Trình tự – nucleotide, thường đối xứng cặp (palindrome) - Có kiểu xếp: + Palindrome + Palindrome bị ngắt + Trình tự thối biến NGUYỄN ĐẮC NHÂN – DCQ.2016 ƠN TẬP CNSH + Khơng phải Palindrome Polymerase - Là enzym tổng hợp acid nucleic từ đơn vị nucleotide - Tổng hợp 5’ – 3’ - Exonuclease: 5’ – 3’ 3’ – 5’ - Đoạn lớn Polymerase I E.coli - Khơng có hoạt tính exonuclease 5’ – 3’ - Strategenes: exo- Klenow enzym c ADN polymerase T4 - Tác động tương tự đoạn Klenow hoạt tính exonuclease 3’ – 5’ mạnh d ADN polymerase T7 - Tiểu đơn vị lớn: hoạt tính enzym phage T7 mã hóa - Tiểu đơn vị nhỏ: Thioredoxin từ protein TB E.coli mã hóa  Thay đổi làm hoạt tính exonuclease 3’ – 5’ - Có khả thực nhiệt độ cao nên tránh e Taq ADN cấu trúc thứ cấp khuông mẫu polimerase - Tiến hành với lượng mẫu nhỏ - Enzym chép ngược: reverse transcriptase 2.2 Polymerase phụ thuộc ADN ARN - Terminal transferase: Có khả thêm 2.3 Polymerase khơng phụ thuộc nucleotide vào nhóm 3’OH mà khơng cần khuôn khuông mẫu mẫu - Phiên mã ARN từ khuôn mẫu ADN: phiên mã 2.4 ARN polymerase phụ thuộc từ trình tự khởi động ADN 2.1 ADN a E.coli ADN polymertase polymerase I phụ thuộc b Đoạn Klenow ADN Ligase - Xúc tác liên kết cộng hóa trị phosphodiester  Nối phân tử ADN đóng vịng ADN - ADN ligase E.coli: Cần NAD sửa chửa chỗ cắt khía nối đầu dính, KHƠNG nối đầu tù - ADN ligase T4: Cần ATP sửa chỗ cắt khía, nối đầu dính đầu tù C Kỹ thuật thao tác gen I Tạo đoạn ADN đích Tổng hợp cADN a Phương pháp tổng hợp - Tổng hợp thay thế: Sử dụng Rnase để cắt phần ARN phân tử lai ARN – ADN thành mảnh  Mồi tổng hợp ADN nhờ ADN polymerase I  Loại bỏ mồi nối lại ADN ligase - Tổng hợp thích ứng: Loại bỏ sợi ARN kiềm  Thêm poly C đầu 3’ sợi ADN nhờ enzym terminal transferase  Dùng đoạn mồi polyG tổng hợp sợi thứ hai ADN polymerase (Vùng 5’ADN CAP nguyên vẹn) NGUYỄN ĐẮC NHÂN – DCQ.2016 ÔN TẬP CNSH Cắt giới hạn ADN nguồn - Cắt giới hạn NST - Hiện dùng, dùng nghiên cứu PCR - Nếu biết trình tự hai đầu RT – PCR - Đoạn dò chất ARN II Cắt nối ADN - Đầu cắt enzym thương tương thích với - Mọi đầu tù tương thích với - Đầu tù đầu dính chắn khơng tương thích - Hai đầu dính cắt enzym khác dính phần so le tương thích với - Khi tương thích, đầu tù dễ tách trước enzym ligase kịp tác dụng, đầu dính tồn thời gian ngắn đủ để enzym ligase nối lại  Đầu dính dễ nối đầu tù III Đưa vecto vào TB chủ Biến nạp - Tế bào thu ADN từ môi trường - Xử lý với CaCl2 giúp tăng tần số biến nạp - Thích hợp cho VK E.coli, Baccilus,… - Albumin chất phản ứng nối làm di chuyển chậm lại  Biến nạp Thẩm điện - Dòng điện trường cao thủng tạm thời màng TB  ADN rơi vào bên - Thích hợp với VK, ĐV, TV, nấm men,… Tải nạp - Dùng virus đưa gen vào tế bào - Virus phải tương thích TB ký chủ: dịng VK IV Sàn lọc dòng tái tổ hợp Phương pháp lai - Bắt cặp với gen đích - Có tín hiệu có đoạn chèn Phương pháp miễn dịch - Đoạn gen mã hóa tọa protein sinh kháng nguyên Phương pháp dựa vào hoạt tính - Gen mã hóa sản phẩm quan sát V Biểu gen tái tổ hợp Chọn hệ thống biểu gen 1.1 Tiêu chí - Theo protein đích NGUYỄN ĐẮC NHÂN – DCQ.2016 ÔN TẬP CNSH - Năng suất - Giá thành - An toàn 1.2 Một số giống biểu Đặc tính - Ni cấy quy mơi lớn Ưu điểm - Xuất nhiều protein vào môi trường - Xuất protein vào mơi trường tốt - Glycosyl hóa tốt - Kiểm soát phiên mã dịch mã biết rõ - Đã sản xuất thành công - Biến đổi hậu dịch mã xác - Hệ thống biểu mức độ cao Nhược điểm - Protein tái tổ hợp không tạo thể khơng tan TB chất - Khơng có nguy nhiễm virus hay prion - Protein tái tổ hợp ổn định cao - Thu lượng lớn protein tái tổ hợp - Tương đối rẻ - Không thực hết hầu hết biến đổi dịch mã Chủng VSV - E coli - Sacchraromyces cerevisae - Bacillus subtilis - Nấm men - Bacillus subtilis - Sacchraromyces cerevisae - Nấm men - Sacchraromyces cerevisae - Một số chủng nấm men tối ưu hóa - TB trùng - E coli - E coli: Insulin, Interferon, Somatotropin - TB ĐV có vú - ĐV chuyển gen - Saccharomyces cerevisae - TB côn trùng - TB ĐV có vú - Sacchraromyces cerevisae - TB trùng - TB ĐV có vú - ĐV chuyển gen - ĐV chuyển gen - E coli - Sacchraromyces cerevisae - Bacillus subtilis - Nấm men Tối ưu hóa phiên mã - NGUYỄN ĐẮC NHÂN – DCQ.2016 ... dịch - Đoạn gen mã hóa tọa protein sinh kháng nguyên Phương pháp dựa vào hoạt tính - Gen mã hóa sản phẩm quan sát V Biểu gen tái tổ hợp Chọn hệ thống biểu gen 1.1 Tiêu chí - Theo protein đích... virus đưa gen vào tế bào - Virus phải tương thích TB ký chủ: dòng VK IV Sàn lọc dòng tái tổ hợp Phương pháp lai - Bắt cặp với gen đích - Có tín hiệu có đoạn chèn Phương pháp miễn dịch - Đoạn gen mã... - TB ĐV có vú - ĐV chuyển gen - Saccharomyces cerevisae - TB côn trùng - TB ĐV có vú - Sacchraromyces cerevisae - TB trùng - TB ĐV có vú - ĐV chuyển gen - ĐV chuyển gen - E coli - Sacchraromyces