ÔN TẬP CNSH DƯỢC CÔNG NGHỆ ENZYM – PROTEIN I Đại cương Khái niệm: - CN enzym: dùng enzym xúc tác sinh học để tạo sản phẩm hay dịch vụ Ứng dụng: - Công nghiệp: + Thực phẩm + Tẩy rửa: bột giặt + Xử lý tinh bột: sản xuất dextrin biến đổi cấu trúc + Dệt da: Xử lý vải - Y Dược: + Trợ tiêu hóa: enzym tuyến tụy + Chẩn đốn: Test chẩn đốn sinh hóa + Điều trị: Điều trị liên quan khối đường, hóa trị + Hóa dược: Tạo dạng đồng phân giúp giảm liều - Nghiên cứu: Tăng độ xác SHPT, CN gen Nhu cầu sử dụng enzym Chỉ tiêu Lượng sử dụng Độ tinh khiết Nguồn gốc Giá sản xuất Công nghiệp Tấn Không tinh khiết - VSV ngoại bào: + Nội độc tố + Đôc tố VK + Độc tố TB Thấp Phân tích Dược phẩm Miligam Gam Tinh thể tinh khiết VSV nội bào Trung bình Cao II Xúc tác sinh học Khái niệm - Enzym chất xúc tác trình sinh học NGUYỄN ĐẮC NHÂN – DCQ.2016 ÔN TẬP CNSH DƯỢC - Bản chất enzym protein Tuy nhiên, số trường hợp chất xúc tác sinh học protein ARN polymerase hoạt động phân tử ARN, không hoạt động chất - Giống chất xúc tác hóa học: + Giúp phản ứng đạt điểm cân nhanh + Không thể xúc tác phản ứng với thay đổi lượng tự không thuận lợi - Khác chất xúc tác hóa học, chất xúc tác sinh học có đặc điểm: + Đặc hiệu: chất xúc tác – phản ứng + Hoạt động ĐK nhiệt độ, áp suất, pH thông thường Ưu điểm: Dễ tiến hành xảy phản ứng Nhược điểm: Khó thực phản ứng nhiệt độ cao ( PCR nhiệt độ 95oC) hay pH không phù hợp CN enzym đại - Hóa học protein: Thay đổi mơ hình motype - Lý sinh phân tử: Kết hợp yếu tố khác nhằm tăng hoạt tính - Sinh học phân tử: Cải tiến cấu trúc protein Cấu trúc – hoạt động protein – enzym Công nghệ protein: can thiệp để thay đổi phân tử protein – enzym Đặc tính chất xúc tác sinh học 3.1 Tính chọn lọc cao (*) a Chọn lọc theo vị trí - Phản ứng hóa học: Phải che vị trí khơng tác động Phản ứng Gỡ tinh Tốn công hiệu suất thấp - Xúc tác sinh học: Chỉ gắn vào vị trí nhóm b Chọn lọc không gian - Tùy type enzym xúc tác vị trí khơng gian thích hợp: + Lipase từ Candida rugosa tác động dạng S NGUYỄN ĐẮC NHÂN – DCQ.2016 ÔN TẬP CNSH DƯỢC + Lipase từ Aspergillus niger tác động dạng R 3.2 Cơ chất đa dạng - Cùng enzym tác động loại liên kết chất đa dạng khác cấu trúc - Tính chất đa dạng với enzym thuộc nhóm thủy giải (Hydrolase) enzym thường sản xuất từ VSV nên thích nghi với nhiều nguồn chất khác - Lưu ý: Một số enzym từ ĐV bậc cao Catalase thủy phân H2O2, không thủy phân liên kết peroxyd khác (3-4C) 3.3 Hoạt động môi trường nước - Các enzym chiết từ ĐV, TV, VSV: + Dung môi quen thuộc nước + Enzym lipase: hoạt động hệ nhị pha + Protease: Có phần kỵ nước bên - Vai trò enzym môi trường nước: + Xúc tác chất không bền mơi trường nước (thủy phân) + Hịa tan chất môi trường DMHC, n-hexan, môi trường 70 NonH2O: 30 H2O - Bản chất hoạt động enzym theo hai chiều: + Ester + H2O (Lipase) Acid béo + Alcol + Trong trường hợp %H2O/môi trường < 1%: Chất béo không bị thủy phân mà lipase xúc tác cho phản ứng tổng hợp ester theo chiều ngược lại bình thường Như vậy, mơi trường khan, enzym lipase đóng vai trị xúc tác tạo ester theo chiều nghịch 3.4 Khả đảm nhận chất cao - PCR: Cơ chất nhiều + Rối loạn mạng lưới q trình biến tính ADN Phản ứng xảy + Cơ chất chiếm không gian xung quanh enzym Khó lựa chọn vị trí xúc tác tượng cạnh tranh chất gây bất hoạt enzym NGUYỄN ĐẮC NHÂN – DCQ.2016 ÔN TẬP CNSH DƯỢC - Chỉ số enzym có khả đảm nhận chất cao protease 3.5 Tính kinh tế - Enzym sử dụng trị liệu: không qua tâm đến tính kinh tế - Enzym sử dụng sản xuất: + Chi phí PP sản xuất khác + Sử dụng nhiều lần: Kinh tế cao - Tái sử dụng enzym: + Sử dụng enzym cho nhiều test khác + Tái thu hồi enzym: Chí nhiều phức tạp (loại enzym bất hoạt enzym tinh chế enzym) - PP cố định enzym giúp enzym có khả thu hồi tái sử dụng nhiều lần III Enzym cố định Đặc điểm a Ưu điểm - Có thể sử dụng nhiều lần: Tăng tính kinh tế thu hồi enzym khơng tốn nhiều chi phí - Chế phẩm bền hơn: bảo vệ chất mang - Tốc độ phản ứng lớn tự động hóa: cho chất chạy qua enzym cố định thu hồi sản phẩm bên ngồi - Khơng lẫn enzym vào sản phẩm cuối: Không phải tác enzym bất hoạt enzym mà cần thu hồi - Bảo quản tốt hơn: enzym cố định dạng rắn bảo quản nhiệt độ phịng b Nhược điểm - Giảm hoạt tính enzym so với ban đầu - Cản trở mặt không gian liên kết với chất mang làm hạn chế tiếp xúc enzym chất c Sự thay đổi enzym gắn vào chất NGUYỄN ĐẮC NHÂN – DCQ.2016 ÔN TẬP CNSH DƯỢC - Mở rộng vùng LK: làm cho liên kết gắn lỏng lẻo - Thu hẹp trung tâm hoạt động: không gắn kết - Quay trung tâm gắn kết vào trong: không gắn kết - (): Trung tâm hoạt động cố định quay ngoài: + Tiếp xúc chất dễ dàng + Hoạt tính enzym tối đa Ứng dụng - Y học: + Loại ure máu + Bổ sung Catalase - Công nghiệp: + Aspartase sản xuất L-acid aspartic + Pinicillninamidase sản xuất 6-APA - Sinh hóa: Gắn enzym lên điện cực giúp tự động hóa giảm giá thành sản phẩm Vật liệu cố định 3.1 Yêu cầu - Rẻ tiền, dễ tìm, dễ tổng hợp - Tính lý ổn định: enzym tác dụng chất mang bị phá hủy - Bền vững hóa học: kho6nng bị tác động enzym môi trường - Diện tích bề mặt vừa đủ lớn + Nhỏ quá: enzym khó tiếp xúc chất + Lớn quá: chất mang nhỏ khó tách Trạng thái lơ lủng tốt 3.2 Phân loại - Chất mang hữu – Polymer tự nhiên + Tương thích sinh học cao NGUYỄN ĐẮC NHÂN – DCQ.2016 ÔN TẬP CNSH DƯỢC + Bền vững an tồn với mơi trường + Dễ bị VSV phân hủy + Khó bảo quản: dễ hư - Chất mang hữu – Polymer tổng hợp + Điều chỉnh kích thước lỗ dẽ dàng + Ổn định bền vững + Tương thích sinh học kém: bù trừ cách tạo liên kết nhánh với enzym - Chất mang vô cơ: chức chủ yếu phân phối + Phân tử nhỏ: kích thước nano cố định phân phối enzym trị liệu (chức chủ yếu phân phối, khơng phải mục đích tái sử dụng) 3.3 Phương pháp cố định enzym THUẬN NGHỊCH Phương pháp Hấp phụ Liên kết ion Liên kết lực Liên kết ion loại chelat Liên kết sulfit Đặc điểm - Polymer tổng hợp chất VC tạo nhiều lỗ rống giúp cố định enzym - (): + Tái sử dụng chất mang + Hoạt tính enzym cao khơng bị biến đổi - (): Kém bền – rỏ rỉ lượng enzym - Tích điện trai dấu - Yêu cầu pH cần phù làm protein cho hoạt tính: Thay đổi pH làm tách enzym - Gắn enzym lên thụ thể chất mang lực bền, tách cách thêm chất cạnh tranh - Khó tìm tạo ligand phù hợp với chất mang - Nguyên tắc trao đổi ion - (): Đơn giản thuận nghịch - (): Khó tìm điểu kiện enzym bền vững hoạt tính an tồn - Ái lực chọn lọc đặc biệt - (): giá thành cao - Thay đổi nhiệt độ, pH dễ phá vỡ NGUYỄN ĐẮC NHÂN – DCQ.2016 ÔN TẬP CNSH DƯỢC KHÔNG THUẬN NGHỊCH Liên kết đồng hóa trị Bắt giữ Tạo vi bao hạt - Sử dụng phổ biến + B1: Chất mang đãn sẳn sàng + B2: Hoạt hóa hình thành cầu nối glutaraldehyd - (): + Dễ thực + Tạo LK bền + Sử dụng hầu hết enzym nhờ vào cầu nối - (): + Liên kết trực tiếp gián tiếp qua nhóm ảnh hưởng hoạt tính enzym - Trộn enzym với monomer tạo polymer với điều kiện kích thước lỗ mạng - Sử dụng polymer thiên nhiên polymer tổng hợp - (): Tạo mạng lưới polymer dễ dàng - (): Khó tạo kích thước lỗ lớn - Sử dụng màng bán thấm dày cho hép chất sản phẩm qua lại tự không cho phân tử enzym qua - (): + Diễn liên tục + Khả tiếp xúc enzym cao S bề mặt lớn + Cố định hệ đa enzym - (): + Cơ chất có PTL lớn khó qua lại Liên kết chéo IV Enzym trị liệu Trị liệu enzym - Thay enzym bệnh di truyển hay mắc phải - Cung cấp tác dụng sinh học đặc hiệu: + Thủy phân VK, protein bị nặng + Chế phẩm enzym làm phân hủy chất nhày gây tắt nghẽn đường tiêu hóa NGUYỄN ĐẮC NHÂN – DCQ.2016 ƠN TẬP CNSH DƯỢC - Hỗ trợ, phối hợp liệu pháp hác Yêu cầu - Phải đến vị trí tác động - Có hoạt tính nơi tác động: + Cơ chất co-factor + Thế oxh-khử + pH + Sự diện chất ức chế - Đủ độ bền - Có hiệu điều trị - An tồn: hiệu điều trị cao phản ứng phụ - Hiệu chứng minh thử nghiệm lâm sàng - Dạng sử dụng thuận tiện: điều trị rối loạn tiêu hóa Vấn đề dặc thù protein Vấn đề Nguyên nhân - Không ổn - Enzym peptide: khơng biệt định nhiệt, pH cực đoạn, chất biến tính dễ bị phân ủy sinh học - Chất ức chế nội sinh làm giảm hoạt tính enzym - Sinh khả dụng - Tính thấm TB Giải pháp - Liên hợp PEGylat hóa - Liên kết chéo hóa học - Hệ thống phịng thích kiểm sốt hay trữ thuốc - Bao liposome nhân tao5 hay xác TB máu - Độ biến enzym vị trí nhận thụ thể - Enzym tan thân nước khó - Hướng đến mơ đặc hiệu: qua màng TB khơng có SKD + Biến đổi nhóm đường đường uống Chỉ điều trị + Dung hợp di truyền với chất chỗ định hướng đích – peptide ghim + CN gen: gắn theo hướng đích - Không vào mô Không tác - Giảm kích thước phân tử động nội bào - Dung hợp trình tự làm trung - Giới hạn tác dụng hệ tuần gian xuyên màng hoàn NGUYỄN ĐẮC NHÂN – DCQ.2016 ÔN TẬP CNSH DƯỢC - Gây miễn - Enzym chất lạ đáp ứng dịch miện dịch - Dị ứng hít bột enzym protease - Sản xuất - Giá thành cao vả kiểm - Kiểm nghiệm sản phẩm khó định khăn - Biến đổi hóa học: PEGlylat hóa - Di truyền: che, loại bỏ epitop Nguồn enzym Nguồn enzym - TB người/ Động vật - Nấm men - VK - SV chuyển gen - Liệu pháp gen Đặc điểm - Chất lượng tốt - Năng suất tốt - Nhiễm virus - Biến đổi hậu dịch mã khác người - Năng suất cai - Không thực hiên biến đổi hậu dịch mã không sử dụng - Tăng suất - Sản xuất yếu tố đơng máu - CHuyển gen vào người tính cá thể Liệu pháp enzym 5.1 Liệu pháp enzym thay - Adagen (Adenosine Deaminase): điều trị SCID - Ceradase (tiêm Alglucerase): Trị bệnh Gaucher bệnh tổn thương ly giải LSD khác - Laronidase: điều trị thay thể MPS I - Myozym: Trị bệnh Pompe - Sucrosidase: CSID - Pulmozym (Dorenase A): lỗng chất nhày tích lũy Trị xơ nang 5.2 Điều trị mô tổn thương - Vibrolysin: loại bỏ protein biến tính trị bỏng - Chondroitinase Hyaluaronidase: trị tổn thương cột sống 5.3 Điều trị bệnh nhiễm NGUYỄN ĐẮC NHÂN – DCQ.2016 ÔN TẬP CNSH DƯỢC - Lyzosym: trị virus HIV 5.4 Điều trị ung thư - Enzym cố định L-Aspartaginase - Urat oxidase: trị chứng cao uric hóa trị liệu 10 NGUYỄN ĐẮC NHÂN – DCQ.2016 ... động protein – enzym Công nghệ protein: can thiệp để thay đổi phân tử protein – enzym Đặc tính chất xúc tác sinh học 3.1 Tính chọn lọc cao (*) a Chọn lọc theo vị trí - Phản ứng hóa học: Phải che... hợp CN enzym đại - Hóa học protein: Thay đổi mơ hình motype - Lý sinh phân tử: Kết hợp yếu tố khác nhằm tăng hoạt tính - Sinh học phân tử: Cải tiến cấu trúc protein Cấu trúc – hoạt động protein. ..ÔN TẬP CNSH DƯỢC - Bản chất enzym protein Tuy nhiên, số trường hợp chất xúc tác sinh học protein ARN polymerase hoạt động phân tử ARN, không hoạt động chất - Giống chất xúc tác hóa học: + Giúp