Công nghệ sinh học dược

Công nghệ sinh học Các kỹ thuật sử dụng các hệ thống sống để tạo ra sản phẩm  Truyền thống: Có từ rất lâu, Dựa trên kinh nghiệm, vi sinh vật học  Công nghệ lên men  Hiện đại: Nửa sau

Công nghệ

sinh học dược

Công nghệ sinh học

 Các kỹ thuật sử dụng các hệ thống sống để tạo ra sản phẩm

 Truyền thống: Có từ rất lâu, Dựa trên kinh nghiệm,

vi sinh vật học

 Công nghệ lên men

 Hiện đại: Nửa sau thế kỷ 20, dựa trên sinh học phân

tử, sinh học tế bào, hóa sinh, …

 Công nghệ gen

 Công nghệ enzym-protein

 Công nghệ tế bào

Các giai đoạn phát triển

nước uống lên men Kỹ thuật được sử dụng bao gồm lên men, nuôi trồng và nuôi cấy mô thực vật

mô để sản xuất Sản phẩm của thế hệ này gồm

kháng sinh, enzym, vitamin, acid amin Kỹ thuật

được sử dụng bao gồm đột biến và chọn lọc chủng vi sinh vật và phương pháp lên men, nuôi cấy để sinh sản phẩm tối ưu

kỹ thuật tái tổ hợp di truyền Ứng dụng công nghiệp của nó bao gồm dược phẩm, nông nghiệp, hóa chất,

y học Các sản phẩm hiện nay đang là các protein trị liệu, chẩn đoán, vaccin và cải tạo giống nông nghiệp

Sự mở rộng nguồn gen

 Công nghệ cổ điển tạo giống hay tính trạng mới dựa vào lai tạo, đột biến-sàng lọc:

 Giới hạn trong phạm vi loài và lân cận

 Mất thời gian, hiệu suất không cao

 Công nghệ hiện đại thao tác trên gen:

 Cải tạo ở mức phân tử, dưới loài

 Không còn giới hạn loài

 Nhanh và hiệu quả

 Nguồn gen vô tận

Phạm vi ứng dụng

CNSH áp dụng trong nông nghiệp và xử lý môi

trường

Sử dụng xúc tác sinh học và công nghệ lên men để tạo ra các sản phẩm công nghiệp như hóa chất hay enzym

CNSH ứng dụng trong y tế Chẩn đoán và điều trị

bệnh Sản xuất dược phẩm

Đặc điểm của CNSHYD

Sản phẩm của CNSHYD

 Chẩn đoán y học

 Sản xuất sinh phẩm chẩn đoán

 Kỹ thuật chẩn đoán mới

 Thuốc có nguồn gốc sinh vật

 Sản xuất thuốc bằng xúc tác sinh học

 Nuôi cấy mô, tế bào

Các vấn đề của CNSH trong nước

 Thiếu qui hoạch Qui hoạch sai

 Đầu tư thấp

 Yếu kém trong phát triển nguồn nhân lực

 Bất hợp lý trong quản trị nhân lực

 Thiếu sự liên kết giữa cơ sở nghiên cứu và sản xuất

 Chưa có cơ sở hạ tầng công nghiệp thích hợp

Công nghệ lên men

Công nghệ lên men

 Định nghĩa: quá trình biến đổi do vi sinh vật thực hiện trong điều kiện yếm khí hay hiếu khí

 Sản phẩm

 Sinh khối vi sinh vật

 Enzym – protein vi sinh vật

 Sản phẩm trao đổi chất: sơ cấp + thứ cấp

 Các biopolymer và biosurfactant

 Sản phẩm tái tổ hợp gen

Chủng vi sinh vật

1: Không gây bệnh cho người, động vật và môi

trường (GRAS - Generally Recognized As Safe)

2: Có thể gây khó chịu cho người, động vật và môi trường

3: Gây bệnh, truyền bệnh nhưng có cách chữa trị

4: Gây bệnh, truyền bệnh rất nhanh nhưng chưa có cách chữa trị

Yêu cầu của chủng công nghệ

1. Ổn định di truyền

2. Sản xuất hiệu quả sản phẩm mong muốn, và con

đường sinh tổng hợp sản phẩm đã được khảo sát kỹ

3. Không cần hay ít cần các bổ sung vitamin và yếu tố

tăng trưởng

4. Sử dụng được các cơ chất phổ biến và rẻ tiền

5. Có thể biến đổi di truyền được

6. An toàn, không gây bệnh, và không sản xuất chất

độc, trừ khi đó chính là sản phẩm

7. Dễ dàng thu hoạch từ quá trình lên men

8. Dễ dàng phá vỡ tế bào nếu sản phẩm là nội bào

9. Ít tạo ra sản phẩm phụ để thuận tiện cho việc tinh

chế sản phẩm

Cải tạo chủng

 Tái tổ hợp tự nhiên

 Gây đột biến

 Đột biến ngẫu nhiên

 Đột biến nhân tạo - cảm ứng

 Sử dụng base tương đồng

 Thay đổi về hóa học của các base

 Chiếu xạ

 Gây đột biến bằng transposon

 Lai ghép tế bào trần và biến nạp gen

 Thao tác di truyền trên vi sinh vật

Chiến lược thao tác di truyền

 Sàng lọc gen từ tế bào nguồn

 Cô lập gen quan tâm: tạo dòng

 Thực hiện các biến đổi cần thiết

 Đưa gen trở lại tế bào đích

 Kiểm tra và sàng lọc chủng mới

Sàng lọc thể đột biến

 Kiểu hình quan sát được

 Khuyết dưỡng: cấy trên môi trường tối thiểu

Làm giàu thể khuyết dưỡng bằng

Gây đột biến:

UV, HNO 2 ,…

Rửa và phân tán ở mật độ 107/ml

Thêm 100 U/ml penicillin

Loại bỏ penicillin Pha loãng đến 50-

100 tế bào/hộp Nuôi cấy 2-20 h

Môi trường hoàn chỉnh

Môi trường tối thiểu

Môi trường hoàn chỉnh

Nhân bản

Bảo quản giống vi sinh vật

 Ngân hàng tế bào

 Ngân hàng gốc (master cell bank)

 Ngân hàng làm việc (working cell bank)

 Cấy chuyền

 Làm khô

 Đông khô

 Đông lạnh

Môi trường lên men

 Cung cấp chất dinh dưỡng để tế bào phát triển

 Chất dinh dưỡng

 Yếu tố tăng trưởng

 Cung cấp các chất cần thiết để thu sản phẩm

 Sinh khối

 Chất chuyển hóa sơ cấp

 Chất chuyển hóa thứ cấp

 Chất cảm ứng

Các loại môi trường lên men

phần hóa học chính xác về mặt định tính và định

lượng

chỉ biết thành phần chính xác của một vài hợp chất (về mặt định lượng đối với các chất cần quan tâm

như yếu tố tăng trưởng, các thành phần khác dựa

theo kinh nghiệm)

đầu chủ yếu bắt nguồn từ các sản phẩm nông nghiệp hoặc từ sữa vì chúng rẻ và tương đối dồi dào

Tiêu chí chọn thành phần môi trường

chất.

không ảnh hưởng đến công thức chung, việc vận hành nồi

cũng như xứ lý sau lên men.

và năng suất sản phẩm trên gam cơ chất cao.

phụ thấp không làm ảnh hưởng đến quá trình tách sản phẩm chính sau đó

Biện pháp kiểm soát bọt

 Thay đổi công thức môi trường

 Phá bọt cơ học

 Các chất phá bọt: thường là các chất hoạt động bề mặt:

 Nhanh chóng phân tán và tác động nhanh

Vỏ ngoài

Rọ cản

Bộ phun khí

Khí vào Cổng thu

hoạch

Nước/hơi nước vào

Khí vô trùng Cổng phụ

Các thiết bị nuôi cấy khác

Các phương thức lên men

 Kiểu vận hành

 Lên men gián đoạn

 Lên men bổ sung dinh dưỡng gián đoạn

 Lên men liên tục

Lên men bề mặt

7

6 6

1

2

3 4

5

1-Giá đựng khay ; 2-Khay ; 3-Cửa cho không khí sạch vào buồng ; 4-Cửa cho không khí

ra ; 5-Quạt ; 6-Chỗ phun nước ; 7-Bộ phận xả hơi nóng để điều chỉnh nhiệt độ của buồng.

Giám sát quá trình lên men

 flow injection analysis

 sequential injection analysis

 khối phổ (mass spectrometry - MS)

 lỏng hiệu năng cao (HPLC)

 sắc ký khí (GC)

Sản xuất

Kháng sinh

 Sử dụng được cơ chất phức tạp và tiêu thụ tốt phenylacetat.

 Không tạo sắc tố gây khó khăn cho việc tinh chế.

 Có hệ sợi sinh trưởng rắn chắc.

Nhân giống

 Thu lượng giống tinh khiết cần thiết ở pha tăng trưởng lũy thừa (logarit) cho giai đoạn lên men

 Tiêu chuẩn

 giống không nhiễm

 mật độ tế bào đạt yêu cầu

giai đoạn nhân giống 10-20 m 3

giai đoạn sản xuất 125-250 m 3

Giai đoạn nhân giống trong thiết bị

Môi trường lên men

 Nguồn nitơ: nước thải ngâm bắp

 Bổ sung thêm giữa chừng: amoniac

 Nguồn carbon: glucose, sucrose và các dịch đường thô,

 65% để duy trì tế bào, 20–25% để tăng trưởng và 10– 12% cho sản xuất penicillin

 Trước đây: Lactose

 Canxi, magiê, phosphat, và các kim loại vi lượng

 Tiền chất:

 acid phenylacetic (G)

 acid phenoxyacetic (V)

 Gián đoạn bổ sung dinh dưỡng, thu hoạch từng phần

 Thời gian: 120-200 giờ

Lên men

Đường

Penicillin

Hậu lên men

 Loại tế bào: lọc/ly tâm

 Chiết penicillin

 pH: 2-2,5, dung môi: amyl acetate, butyl acetate và

methyl isobutyl ketone

 Chiết lại ở pH 7,5, dung môi: nước

 Loại sắc tố: than hoạt

 Kết tinh

 Thêm muối thích hợp (kali acetat)

 Tẩy màu lại và rửa bằng dung môi để tăng độ tinh khiết

 Hiệu suất thu hồi: >90%

 Giá thành: ~10 USD/kg

Tóm tắt qui trình

Nồi lên men

Thu hoạch 1/3 và thay 1/3 môi trường mới

10 lần / 6 ngày

Lọc quay

Môi trường

Nước ngâm bắp Saccharose/glucose Amoniac Khoáng Kiểm soát pH

Dịch lọc

Chiết bằng butylacetat Tủa bằng muối kali Rửa / Lọc / Làm khô

Penicillin 99,5%

Mẫu nhân giống

P chrysogenum

Tế bào nấm Thức ăn gia súc

Lên men cephalosporin C

 Lên men bổ sung dinh dưỡng gián đoạn A chrysogenum

 Galactose và sucrose: tăng trưởng chậm, năng suất cao hơn

 Thay dần đường bằng dầu đậu nành hay đậu phọng: giảm glucose, giúp hình thành bào tử đốt và cephalosporin C Dầu có tác dụng chống bọt

 Nguồn nitơ: bột đậu nành, hạt bông có bổ sung amonium sulfate Ammoniac

có thể dùng để kiểm soát pH

 Nước ngâm bắp hay dùng làm nguồn nitơ và khoáng chất, vitamin

 DL-Methionine: cảm ứng hình thành bào tử đốt

 Thông khí:

 Cyclase và expandase cần oxi để xúc tác: nếu oxi hòa tan giảm <20%

penicillin N sẽ tích tụ và hiệu suất cephalosporin C sẽ giảm

 Thêm acetyl esterase ( Rhodosporidium toruloides ): tích tụ

deacetylcephalosporin C (bền)  tăng năng suất

Thu hồi cephalosporin C

 Dùng cột than hoạt / cột nhựa không ion

 cephalosporin C được hấp phụ chọn lọc so với penicillin N, deacetylcephalosporin C, and deacetoxycephalosporin C

 Đánh bóng bằng sắc ký trao đổi anion

 Tạo dẫn xuất tetrabromocarboxybenzoyl cephalosporin C

 Kết tinh từ dịch nước acid / tạo muối với base hữu

cơ+chiết tách bằng dung môi

 Thích hợp thu hồi làm nguyên liệu bán tổng hợp

Sản xuất các beta-lactam khác

 Cephalosporin C, cephamycin C và penicillin được dùng để sản xuất các khung cho việc bán tổng hợp các beta-lactam khác

6-APA

Sản xuất các khung để bán tổng hợp

 6-APA: thủy phân Penicillin

 Hóa học: chiếm ưu thế từ 1970, nhưng hiện gặp nhiều vấn đề về môi trường, dung môi và tốn năng lượng

 Enzym: được sử dụng từ 1960, nhưng ngưng do giá thành và vấn

đề tái sử dụng Đến 1990 enzym cố định giải quyết được vấn đề

 E coli tái tổ hợp để sản xuất penicillin G acylase và Fusarium

oxysporum tái tổ hợp sản xuất penicillin V acylase

 7-ADCA: là tiền thân của 1/3 cephalosporin

 7-ADCA được sản xuất từ penicillin G bằng phản ứng mở rộng vòng

 Merck và Panlabs: dùng P chrysogenum mang gen cefE

(expandase) của S clavuligerus Khi cung cấp disodium adipate, nó sản xuất adipoyl 6-APA, rồi được chuyển thành adipoyl 7-ADCA nhờ expandase tái tổ hợp Mạch adipoyl được cắt nhờ adipoyl acylase của Pseudomonas thành 7-ADCA

 7-ACA: là tiền thân của 2/3 cephalosporin

 được sản xuất từ cephalosporin C bằng phản ứng deacyl hóa nhờ enzym hay hóa học

Các thế hệ Cephalosporin

 I (cephalothin, cephaloridine, and cefazoline): biến đổi

vị trí C-3 và C-7 của 7-ACA

 II: kháng β-lactamase

 Cephamycin C mang nhóm 3-carbamoyl và 7-methoxy

 kháng β-lactamase: cefoxitin and moxalactam

 7-oximinoacyl cephalosporin: cefuroxime

 III: kháng β-lactamase + phổ rộng:

 thêm nhóm aminothiazole thân nước vào

oximinocephalosporin (thế hệ II): cefotaxime, ceftizoxime, và ceftazidime

 IV (cefepime và cefpirome): có vòng aminothiazole ở C-7 cùng với nhóm thế oxyimino và nitơ bậc IV ở C-3

O O

H

O H

C H 3

Sản xuất acid amin

Phương pháp sản xuất acid amin

 Phương pháp trích ly các acid amin từ dịch thủy

phân protein Phương pháp này dùng để thu nhận L-cystein, L-cystin, L-leucin, L-asparagin, L-tyrosin

 Phương pháp tổng hợp hóa học Phương pháp này

dùng để sản xuất glycin, alanin, methionin,

tryptophan

 Phương pháp lên men vi sinh vật

Phương pháp lên men vi sinh vật

(L-glutamic acid, L-alanine, L-valine)

threonine, L–arginine, L– citrulline, L–ornithine, L–homoserine, L-tryptophan, L-phenylalanine, L-tyrosine, L-histidine, …)

 Phương pháp thêm các tiền chất ( throenine, isoleucine, tryptophan…)

L- Phương pháp enzym (aspartic acid, alanine, cyteine, dihydroxyphenylalanine, D-p-hydroxyphenyl-glycine…)

các kỹ thuật biến đổi gene, protein và chất chuyển hóa hoặc

sự kết hợp của các kỹ thuật trên (hydroxy-L-proline)

L-Glutamic acid - điều kiện sản xuất

 Vi khuẩn Corynebacterium glutamicum

 Môi trường có nồng độ đường và các ion aminonium cao, nồng độ khoáng chất thích hợp

 Nồng độ biotin giới hạn hoặc bổ sung penicllin hoặc

xà phòng

 Điều kiện hiếu khí

 Năng suất L-glutamate: khoảng 100 g/L /2-3 ngày

L-Glutamic acid - điều kiện sản xuất

 Chủng vi khuẩn: Corynebacterium , cần biotin

 Nguồn carbon: glucose, thủy phân tinh bột

 Nguồn nitơ: cao, ammoniac

 Cơ chế: glutamate dehydrogenase amin hóa glutarate (Chu trình Krebs) thành glutamate

2-oxo- Vai trò biotin (hoặc penicillin, xà phòng): làm rò rỉ

 Công nghệ gen:

 Đột biến mất gen mã hóa 2-oxoglutamate

dehydrogenase  sản xuất glutamate

 Đột biến mất gen dtsR  sản xuất glutamate

 Rút ngắn thời gian hậu phẫu ruột

 Acid amin không thiết yếu

 Quá liều: nhức đầu, hội chứng “nhà hàng Trung Hoa”

Asp Asp-P ASA Hse Thr

Ile Met

DDP Leu

DAP Lys

Ức chế Ức chế ngược

L-Lysine - Chủng

methionine), thiếu enzym homoserine dehydrogenase

 Công nghệ gen: tạo dòng và giải trình tự các gen liên quan

 Gen ldc (mã hóa lysine decarboxylase - phá hủy lysine)

 Gen cadA (mã hóa chất cảm ứng ldc)

 Gen lysE (mã hóa chất vận chuyển lysine ra khỏi tế bào)

L-Lysine - Ứng dụng

 Lysine được dùng làm chất bổ sung cho thức ăn gia cầm, heo vì các thức ăn thường dùng như ngũ cốc, đậu nành không béo chứa ít lysine, là một acid amin thiết yếu cho vật nuôi

 Lượng L-lysine được sản xuất trên thế giới hàng năm khoảng 400.000 tấn

 Dược lý:

 Acid amin thiết yếu

 Dự phòng và điều trị Herpes simplex

 Hỗ trợ điều trị ung thư (đang nghiên cứu)

 đột biến dị dưỡng lysin, diaminopimelate, hay methionin

Asp Asp-P ASA Hse Thr

Ile Met

DDP Leu

DAP

Lys

Ức chế Ức chế ngược

L-Threonin - Công nghệ gen

 S marcescen đột biến bằng giới nạp với phage

 khiếm khuyết enzym thoái hóa L-threonin

 đột biến trên aspartokinase và homoserine

dehydrogenase làm mất nhạy cảm với quá trình ức chế ngược của L-threonin

 đột biến ở các enzym sinh tổng hợp L-threonin làm cho chúng không bị ức chế bởi L-threonin

 đột biến trên aspartokinase làm mất nhạy cảm với sự

ức chế ngược bởi L-lysin

 đột biến ở aspartokinase và homoserine

dehydrogenase làm cho chúng không bị ức chế bởi methionine

L-Sản lượng L-threonin của các chủng vi khuẩn đột biến

Giống Thời gian

(h)

Lượng (g/l)

Tốc độ (g/l/h) Tác giả

13.000-L-Aspartic Acid

 Sản xuất bằng công nghệ enzym 1 hoặc 2 giai đoạn

 Nguyên liệu đầu là fumarate (1 giai đoạn) hoặc

maleate (2 giai đoạn)

 Enzym aspartase được cố định trên nhựa trao đổi ion

 E coli sinh aspartase được cố định trong

polyacrylamid hay K-carageenan

 E coli sinh aspartase được cố định trong

polyurethane và polyazetidine

 Công nghệ gen: chủng coryneform có hoạt tính

maleate isomerase và aspartase, nồi phản ứng màng

L-Aspartic Acid

Maleate Maleate isomerase Fumarate Aspartase L-aspartate

L-Aspartic Acid - ứng dụng

 dịch truyền dinh dưỡng, phụ gia thực phẩm,

 nguyên liệu sản xuất aspartame,

aspartyl-phenylalanine methyl ester

 sản xuất polymer có thể phân hủy sinh học

 dùng như xà phòng, tác nhân chelat hóa hay xử lý nước

 Công nghệ enzym với aspartate β-decarboxylase

 Pseudomonas dacunhae cố định trên polyacrilamide, carageenan, nhồi cột

L-aspartate Aspartate β-decarboxylase L-alanine + CO2 Fumarate + NH3 aspartase

Thực phẩm chức năng

Một số định nghĩa

 Thực phẩm chức năng (functional food)

 Thực phẩm tăng cường (fortified food)

Prebiotic - yêu cầu

 Không được thủy phân hay hấp thu ở đoạn trên của

ống tiêu hóa

 Là cơ chất chọn lọc của một hay một số giới hạn vi

khuẩn có lợi sống hội sinh trong ruột già, do đó các

vi khuẩn này sẽ được kích thích tăng trưởng hay

chuyển hóa

 Có khả năng thay đổi thành phần hệ vi khuẩn ruột

già theo hướng có lợi

 Tạo ra các hiệu ứng có lợi tại chổ hay toàn thân đối

với người sử dụng

 carbohydrate không tiêu hóa được: các oligo

fructose, glucose, xylose và galactose

Prebiotic - chức năng

 kiểm soát thời gian lưu chuyển thức ăn qua ruột

 cải thiện hấp thu glucose,

 giảm hấp thu chất béo và cholesterol,

 tăng thể tích và khả năng giữ nước của thức ăn

trong ruột non,

 điều hòa sự lên men vi sinh vật để làm tăng sản xuất các acid béo chuỗi ngắn,

 giảm pH và ammoniac

 giảm các rối loạn đường ruột (táo bón và tiêu chảy),

 bệnh tim mạch, và ung thu ruột