Phân lập promoter của gen mã hóa cho enzyme cinnamyl alcohol dehydrogenase (cad) và thiết kế vector chuyển gen mang đoạn gen mã hóa cho enzyme cinnamoyl coa reductase (ccr) từ câ

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM LÊ PHƢƠNG DUNG PHÂN LẬP PROMOTER CỦA GEN MÃ HÓA CHO ENZYME CINNAMYL ALCOHOL DEHYDROGENASE (CAD) VÀ THIẾT KẾ VECTOR CHUYỂN GEN MANG ĐOẠN GEN MÃ HÓA CHO ENZYME CINNAMOYL CoA REDUCTASE (CCR) TỪ CÂY BẠCH ĐÀN URO (EUCALYPTUS UROPHYLLA S.T BLAKE) LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC Thái Nguyên – 2009 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Tai ngay!!! Ban co the xoa dong chu nay!!! http://www.Lrc-tnu.edu.vn THAI NGUYEN UNIVERSITY COLLEGE OF EDUCATION LE PHUONG DUNG CLONING PROMOTER REGION OF GENE ENCODING CINNAMYL ALCOHOL DEHYDROGENASE (CAD) AND CONSTRUCTING PLANT TRANSFORMATION VECTOR CARRYING CINNAMOYL CoA REDUCTASE GENE FROM EUCALYPTUS UROPHYLLA S.T BLAKE Speciality: Genetics Code: 60.42.70 MASTER’S THESIS SUMMARY Supervisor: Dr Nguyen Huu Cuong Thai Nguyen, 2009 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.Lrc-tnu.edu.vn LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu tơi Các số liệu kết nghiên cứu luận văn hồn tồn trung thực chƣa có cơng bố cơng trình khác Tác giả Lê Phƣơng Dung Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.Lrc-tnu.edu.vn MỤC LỤC MỞ ĐẦU CHƢƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan bạch đàn 1.2 Tình hình trồng bạch đàn Việt Nam 1.3 Tình hình sinh trƣởng bạch đàn Việt Nam …………………… 1.4 Lignin chu trình sinh tổng hợp lignin thực vật 1.4.1 Lignin 1.4.2 Chu trình sinh tổng hợp lignin thực vật 1.4.3 Giới thiệu gen mã hóa cho enzyme cinnamyl alcohol dehydrogenase (CAD) 1.5 Tổng quan promoter 1.5.1 Mơ hình điều hồ biểu gen sinh vật nhân chuẩn 1.5.2 Cấu trúc chức promoter 1.5.3 Các loại promoter sử dụng công nghệ sinh học 1.5.4 Promoter điểu khiển hoạt động gen tầng xylem Error! Bookmark not defined 1.5 Một số kỹ thuật sinh học phân tử ứng dụng nghiên cứu CHƢƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu nghiên cứu 2.1.1 Vật liệu: 2.1.2 Hoá chất: 2.1.3 Máy móc, thiết bị 2.1.4 Địa điểm nghiên cứu 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.Lrc-tnu.edu.vn 2.2.1 Phƣơng pháp tìm kiếm thơng tin trình tự gen mã hóa cho enzyme CAD ngân hàng gen quốc tế 2.2.2 Thiết kế mồi đặc hiệu tách dòng gen/promoter 2.2.3 Tách chiết tinh DNA – RNA từ mô gỗ 2.3.4 Tổng hợp cDNA 2.2.5 Khuếch đại đoạn promoter EuCAD đoạn gen CCR phản ứng PCR 2.2.6 Phƣơng pháp tách dòng 2.2.7 Phƣơng pháp PCR trực tiếp từ khuẩn lạc (colony-PCR) Error! Bookmark not defined 2.2.8 Phƣơng pháp xác định trình tự gen 2.2.9 Phƣơng pháp Gateway CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Tách chiết DNA bạch đàn 3.2 Khuếch đại promoter PCR 3.3 Tách dịng xác định trình tự đoạn promoter EuCAD 3.3.1 Tinh sản phẩm PCR tạo vector tái tổ hợp 3.3.2 Biến nạp sản phẩm ligation vào tế bào vi khuẩn E.coli DH5 3.3.3 Chọn dòng tế bào E.coli mang vector tái tổ hợp 3.3.4 Tách chiết plasmid tái tổ hợp 3.3.5 Kết đọc trình tự nucleotide hai đoạn promoter CAD1 CAD2 3.3.6 Phân tích nhân tố điều hịa dạng cis có mặt trình tự promoter gen CAD tách dòng đƣợc từ bạch đàn nâu Eucalyptus urophylla S.T Blake 3.3.7 Kết đăng tải trình tự promoter gen mã hóa cho enzyme cinnamyl alcohol dehydrogenase ngân hàng gen quốc tế NCBI KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ……………………………………………… TÀI LIỆU THAM KHẢO Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.Lrc-tnu.edu.vn Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.Lrc-tnu.edu.vn DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1 Thành phần dung dịch đệm tách chiết … 19 Bảng2.2 Thành phần dung dịch đệm tách chiết 21 Bảng 2.3 Thành phần phản ứng khử DNA 22 Bảng 2.4A Thành phần phản ứng tổng hợp cDNA 23 Bảng 2.4B Thành phần phản ứng tổng hợp cDNA 23 Bảng 2.4C Chu trình nhiệt phản ứng tổng hợp cDNA 24 Bảng 2.5: Thành phần phản ứng PCR 24 Bảng 2.6 Thành phần phản ứng gắn gen/promoter vào vector tách dịng 26 Bảng 2.7 Thành phần hố chất tách plasmid 28 Bảng 2.8 Thành phần phản ứng cắt 29 Bảng 2.9 Thành phần phản ứng colony-PCR 29 Bảng 2.10 Thành phần phản ứng ghép nối 31 Bảng 2.11 Thành phàn phản ứng cắt plasmid pENTR/CCR 32 Bảng 2.12 Thành phần phản ứng LR 33 Bảng 2.13 Thành phần phản ứng cắt plasmid pBENDER/CCR 34 Bảng 3.1 Trình tự thơng số cần thiết mồi 35 Bảng 3.2 Trình tự thông số cần thiết hai mồi CCR entr-F, CCR-R 52 Bảng 3.3 Kích thƣớc phân đoạn thu đƣợc cắt plasmid tái tổ hợp pBENDER/CCR XhoI 64 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Ngun http://www.Lrc-tnu.edu.vn DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Đơn vị cấu trúc lignin ………………………………… Hình 1.2: Sinh tổng hợp lignin thực vật 10 Hình 1.3.Lát cắt thân chuyển gen CCR.H (A) không chuyển gen (B) 15 Hình 2.1 Chu trình nhiệt phản ứng PCR 25 Hình 2.2 Sơ đồ vector pBT 26 Hình 2.3 Chu trình nhiệt phản ứng colony – PCR 30 Hình 2.4 Sơ đồ vector pENTRTM/D-TOPO 31 Hình 2.5 Sơ đồ vector pBENDER 32 Hình 3.1 Kết điện di sản phẩm tách DNA từ gỗ bạch đàn 34 Hình 3.2 Kết điện di sản phẩm PCR với cặp mồi CADpro1 35 Hình 3.3 Kết điện di sản phẩm PCR với cặp mồi CADpro2 36 Hình 3.4 Kết điện di sản phẩm PCR với cặp mồi CADpro1 sau tinh 37 Hình 3.5 Kết điện di sản phẩm PCR với cặp mồi CADpro2 sau tinh 37 Hình 3.6: Kết biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến 39 Hình 3.7: Kết điện di sản phẩm colony-PCR trực tiếp từ khuẩn lạc .41 Hình 3.8: Kết điện di sản phẩm colony-PCR trực tiếp từ khuẩn lạc 41 Hình 3.9: Kết điện di plasmid tái tổ hợp tách từ tế bào E.coli DH5α …… 42 Hình 3.10: Kết điện di sản phẩm cắt plasmid tái tổ hợp mang đoạn promoter CAD1 43 Hình 3.11: Kết điện di sản phẩm cắt plasmid tái tổ hợp mang đoạn promoter CAD2 44 Hình 3.12: Kết điện di kiểm tra phản ứng nối hai đoạn promoter CAD1 CAD2 45 Hình 3.13: Kết so sánh trình tự DNA với gen CAD E gunnii 46 Hình 3.14: Kết phân tích promoter gen CAD ……………………… 48 Hình 3.15: Kết điện di RNA tổng số gel agarose 1% 51 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.Lrc-tnu.edu.vn Hình 3.16: Kết điện di khử DNA 51 Hình 3.17 Kết điện di kiểm tra sản phẩm PCR 53 Hình 3.18 Kết điện di kiểm tra sản phẩm thơi gel gel agarose 1% 54 Hình 3.19 Kết dựng phát sinh chủng loại gen CCR 56 Hình 3.20 Kết biến nạp plasmid tái tổ hợp pENTR/CCR vào tế bào khả biến E.Coli DH5 56 Hình 3.21 Kết điện di plasmid pENTR/CCR 58 Hình 3.22 Kết điện di sản phẩm cắt plasmid tái tổ hợp mang đoạn gen CCR 59 Hình 3.23 Kết colony PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu CCR entr F CCR R 61 Hình 3.24 Kết tách plasmid tái tổ hợp pBENDER/CCR 61 Hình 3.25 Kết cắt plasmid tái tổ hợp pBENDER/CCR enzyme XhoI 62 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.Lrc-tnu.edu.vn LỜI CẢM ƠN Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới TS Nguyễn Hữu Cường – Phòng Công nghệ tế bào thực vật – Viện công nghệ sinh học tận tình hướng dẫn, bảo giúp đỡ tơi suốt q trình thực luận văn Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn chân thành tới GS TS Lê Trần Bình, TS Chu Hồng Hà - Viện Công nghệ sinh học tạo điều kiện đóng góp ý kiến quý báu cho tơi thời gian thực tập Phịng Cơng nghệ tế bào thực vật, Viện Công nghệ sinh học Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới Ban chủ nhiệm Khoa Sinh – KTNN toàn thể cán nhân viên khoa tạo điều kiện tận tình giúp đỡ tơi suốt q trình thực luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn CN Hồng Hà tập thể cán Phịng Công nghệ tế bào thực vật, Viện Công nghệ sinh học tận tình giúp đỡ tơi hồn thành luận văn Cùng với lòng biết ơn sâu sắc gửi tới gia đình bạn bè giúp đỡ, động viên khích lệ tơi suốt q trình học tập thực thành công luận văn Thái Nguyên, ngày 09 tháng năm 2009 Học viên Lê Phương Dung Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.Lrc-tnu.edu.vn 10 Barakat A., Bagniewska-Zadworna A., Choi A., Plakkat U., DiLoreto D.S., Yellanki P., Carlson J.E (2009), The cinnamyl alcohol dehydrogenase gene family in Populus: phylogeny, organization, and expression BMC Plant Biology 9(26): 1-15 11 Chiang, V L., (2006) Understanding Gene Function and Control in Lignin Formation in Wood NABC Report 12 Ellen McCrady (1991), The Nature of Lignin Volume 4, number 13 Feuillet C., Lauvergeat V., Deswarte C., Pilate G., Boudet A., and Grima P.J (1995), Tissue- and cell-specific expression of a cinnamyl alcohol dehydrogenase promoter in transgenic poplar plants Plant Molecular Biology 4(27): 651-667 14 Fiona S Poke1, René E Vaillancourt, Robert C Elliott and James B Reid (2003), Sequence variation in two lignin biosynthesis genes, cinnamoyl CoA reductase (CCR) and cinnamyl alcohol dehydrogenase (CAD2) Molecular Breeding 12: 107–118, 2003 15 Gawel N J and Jarret R L (1991), A modified CTAB DNA extraction procedure for Musa and Ipomoea Plant Molecular Biology Reporter 3(9): 262-266 16 Goicoechea M., Lacombe E., Legay S., Mihaljevic S., Rech P., Jauneau A., Lapierre C., Pollet B., Verhaegen D., Chaubet G.N., Grima P.J (2005), EgMYB2, a new transcriptional activator from Eucalyptus xylem, regulates secondary cell wall formation and lignin biosynthesis The Plant Journal 43(4): 553-567 17 Hai L., Qingyin Z., Yan L.Z., Shasheng W and Xiangning J (2003), Xylem specific expression of a GRP1.8 promoter: 4CL gene construct in transgenic tobacco Plant Growth Regulation 41: 279-286 18 Hawkins S., Samaj J., Lauvergeat V., Boudet A., and Pettenati J C (1997), Cinnamyl alcohol dehydrogenase: Identification of new sites of promoter activity in transgenic Poplar Plant Physiology 113: 321-325 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 63 http://www.Lrc-tnu.edu.vn 19 Hu W.J., Harding S.A., Lung J., Popko J.L., Ralph J., Stokke D.D., Tsai C.J & Chiang V.L (1999), Repression of lignin biosynthesis promotes cellulose accumulation and growth in transgenic trees Nature Biotechnology 17: 808-812 20 Johan Wadenback, Sara von Arnold, Ulrika Egertsdotter, Michael H Walter, Jacqueline Grima-Pettenati, Deborah Goffner, Goran Gellerstedt, Terry Gullion, David Clapham (2008), Lignin biosynthesis in transgenic Norway spruce plants harboring an antisense construct for cinnamoyl CoA reductase (CCR) Transgenic Res (2008) 17:379–392 21 Kim S.J., Kim M.R., Bedgar D.L., Moinuddin S.G., Cardenas C.L., Davin L.B., Kang C., Lewis N.G (2004), Functional reclassification of the putative cinnamyl alcohol dehydrogenase multigene family in Arabidopsis Proceedings of the National Academy of Sciences 101:1455-1460 22 Simon Hawkins, Jozef Samaj, Virginie Lauvergeat, Alain Boudet, and Jacqueline Crima-Pettenati (1997), Cinnamyl Alcoholl Dehydrogenase: Identification of New Sites of Promoter Activity in transgenic Poplar Plant Physiol 113: 321-325 23 Lauvergeat V., Rech P., Jauneau A., Guez C., Coutos T.P and Grima P.J (2002), The vascular expression pattern directed by the Eucalyptus gunnii cinnamyl alcohol dehydrogenase EgCAD2 promoter is conserved among woody and herbaceous plant species Plant molecular biology 50(3): 497509 24 Matthieu Chabannes, Abdellah Barakate, Catherine Lapierre, Jane M Marita, John Ralph, Michel Pean, SaoEda Danoun1, Claire Halpin, Jacqueline Grima-Pettenati and Alain Michel Boudet1 (2001), Strong decrease in lignin content without significant alteration of plant development is induced by simultaneous down-regulation of cinnamoyl CoA reductase (CCR) and cinnamyl alcohol dehydrogenase (CAD) in tobacco plants The Plant Journal (2001) 28(3), 257±270 25 pENTR™ Directional TOPO® Cloning Kits (6 April 2006) Invitrogen Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 64 http://www.Lrc-tnu.edu.vn 26 Sambrook J., Fritsch E.F., Maniatis T (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual Vol 1, 2, and Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York 27 Simon Hawkins, Jozef Samaj, Virginie Lauvergeat, Alain Boudet, and Jacqueline Crima-Pettenati (1997), Cinnamyl Alcoholl Dehydrogenase: Identification of New Sites of Promoter Activity in transgenic Poplar Plant Physiol 113: 321-325 28 Tsutomu Kawasaki, Hisako Koita, Tomoyuki Nakatsubo, Kana Hasegawa, Kenichi Wakabayashi, Hiroki Takahashi, Kenji Umemura, Toshiaki Umezawa, and Ko Shimamoto (2005), Cinnamoyl-CoA reductase, a key enzyme in lignin biosynthesis, is an effector of small GTPase Rac in defense signaling in rice PNAS vol 103 no 1, pg 230– 235 28 Whettena R and Sederoffa R (1995), Lignin Biosynthesis The Plant Cell 7: 1001-1013 29 Xu Q., Wen X.P., and Deng X.X (2004), A Simple Protocol for Isolating Genomic DNA from Chestnut Rose (Rosa roxburghii Tratt) for RFLP and PCR Analyses Plant Molecular Biology Reporter 22: 301a-301g TÀI LIỆU WEB 30 http://www.ncbi.nlm.nih.gov 31 http://www.community.h2vn.com/index.php?action=printpage%3Btopic= 061.0 32 http://vi.wikipedia.org/wiki/Xylem 33 http://www.ebi.ac.uk/embl/Submission/webin.html Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 65 http://www.Lrc-tnu.edu.vn LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu Các số liệu kết nghiên cứu luận văn hồn tồn trung thực chưa có cơng bố cơng trình khác Tác giả Lê Phương Dung Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.Lrc-tnu.edu.vn LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Nguyễn Hữu Cường – Phịng Cơng nghệ tế bào thực vật – Viện cơng nghệ sinh học tận tình hướng dẫn, bảo giúp đỡ suốt q trình thực luận văn Tơi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới GS TS Lê Trần Bình, TS Chu Hồng Hà - Viện Cơng nghệ sinh học tạo điều kiện đóng góp ý kiến quý báu cho thời gian thực tập Phịng Cơng nghệ tế bào thực vật, Viện Cơng nghệ sinh học Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới Ban chủ nhiệm Khoa Sinh – KTNN toàn thể cán nhân viên khoa tạo điều kiện tận tình giúp đỡ tơi suốt q trình thực luận văn Tơi xin chân thành cảm ơn CN Hồng Hà tập thể cán Phịng Cơng nghệ tế bào thực vật, Viện Cơng nghệ sinh học tận tình giúp đỡ tơi hồn thành luận văn Cùng với lịng biết ơn sâu sắc gửi tới gia đình bạn bè giúp đỡ, động viên khích lệ tơi suốt trình học tập thực thành công luận văn Thái Nguyên, ngày 09 tháng năm 2009 Học viên Lê Phương Dung Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.Lrc-tnu.edu.vn NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT bp : base pair cDNA : Complementary DNA DNA : Deoxyribonucleic Acid DEPC : Diethyl pyrocarbonate dNTP : Deoxyribonucleotide triphosphate E.coli : Escherichia coli EDTA : Ethylen dimine tetra acetic acid g/l : Gam/lít IPTG : Isopropylthio-beta-D-galactoside Kb : Kilobase kDa : KiloDalton LB : Luria Bertani mg/l : miligam/lít OD : Optical density PCR : Polymerase Chain Reaction RNA : Ribonucleic Acid RNase : Ribonuclease SDS : Sodium dodecyl sulphate TAE : Tris - Acetic acide - EDTA Taq polymerase : Thermus aquaticus polymerase TE : Tris – EDTA v/p : vòng/phút X-gal : 5-brom- 4-chloro-3-indolyl--D-galactosidase CTAB : Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.Lrc-tnu.edu.vn ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM - LÊ PHƢƠNG DUNG PHÂN LẬP PROMOTER CỦA GEN MÃ HÓA CHO ENZYME CINNAMYL ALCOHOL DEHYDROGENASE (CAD) VÀ THIẾT KẾ VECTOR CHUYỂN GEN MANG ĐOẠN GEN MÃ HÓA CHO ENZYME CINNAMOYL CoA REDUCTASE (CCR) TỪ CÂY BẠCH ĐÀN URO (EUCALYPTUS UROPHYLLA S.T BLAKE) CHUYÊN NGÀNH: DI TRUYỀN MÃ SỐ: 60.42.70 LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC Người hướng dẫn khoa học: TS Nguyễn Hữu Cường Thái Nguyên – 2009 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.Lrc-tnu.edu.vn DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1: Thành phần dung dịch đệm tách chiết 17 Bảng 2.2: Thành phần dung dịch đệm tách chiết 19 Bảng 2.3: Thành phần phản ứng khử DNA 20 Bảng 2.4A: Thành phần phản ứng tổng hợp cDNA 21 Bảng 2.4B: Thành phần phản ứng tổng hợp cDNA 21 Bảng 2.4C: Chu trình nhiệt phản ứng tổng hợp cDNA 21 Bảng 2.5: Thành phần phản ứng PCR 22 Bảng 2.6: Thành phần phản ứng gắn gen/promoter vào vector tách dòng 24 Bảng 2.7: Thành phần hoá chất tách plasmid 26 Bảng 2.8: Thành phần phản ứng cắt 27 Bảng 2.9: Thành phần phản ứng colony-PCR 27 Bảng 2.10 Thành phần phản ứng ghép nối 29 Bảng 2.11 Thành phàn phản ứng cắt plasmid pENTR/CCR 31 Bảng 2.12 Thành phần phản ứng LR 31 Bảng 2.13 Thành phần phản ứng cắt plasmid pBENDER/CCR 31 Bảng 3.1: Trình tự thơng số cần thiết mồi 32 Bảng 3.2: Trình tự thơng số cần thiết hai mồi CCR entr-F, CCR-R 47 Bảng 3.3 Kích thước phân đoạn thu cắt plasmid tái tổ hợp pBENDER/CCR XhoI 58 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.Lrc-tnu.edu.vn DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1: Đơn vị cấu trúc lignin Hình 1.2: Sinh tổng hợp lignin thực vật Hình 1.3: Lát cắt thân chuyển gen CCR.H (A) khơng chuyển gen (B) 13 Hình 2.1: Chu trình nhiệt phản ứng PCR 23 Hình 2.2: Sơ đồ vector pBT 24 Hình 2.3: Chu trình nhiệt phản ứng colony-PCR 28 Hình 2.4 Sơ đồ vector pENTRTM/D-TOPO 28 Hình 2.5 Sơ đồ vector pBENDER 30 Hình 3.1: Kết điện di kiểm tra sản phẩm tách DNA từ gỗ bạch đàn 33 Hình 3.2: Kết điện di sản phẩm PCR với cặp mồi CADpro1 34 Hình 3.3: Kết điện di sản phẩm PCR với cặp mồi CADpro2 35 Hình 3.4: Kết điện di sản phẩm PCR với cặp mồi CADpro1 sau tinh 36 Hình 3.5: Kết điện di sản phẩm PCR với cặp mồi CADpro2 sau tinh 36 Hình 3.6: Kết biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến 37 Hình 3.7: Kết điện di sản phẩm colony-PCR trực tiếp từ khuẩn lạc 39 Hình 3.8: Kết điện di sản phẩm colony-PCR trực tiếp từ khuẩn lạc 40 Hình 3.9: Ảnh điện di plasmid tái tổ hợp tách từ tế bào E.coli DH5α 41 Hình 3.10: Kết điện di sản phẩm cắt plasmid tái tổ hợp mang đoạn promoter CAD1 41 Hình 3.11: Kết điện di sản phẩm cắt plasmid tái tổ hợp mang đoạn promoter CAD2 42 Hình 3.12: Kết điện di kiểm tra phản ứng nối hai đoạn promoter CAD1 CAD2 43 Hình 3.13: Kết so sánh trình tự DNA với gen CAD E gunnii 44 Hình 3.14: Kết phân tích promoter gen CAD 45 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.Lrc-tnu.edu.vn Hình 3.15 Kết điện di RNA tổng số 48 Hình 3.16 Kết điện di khử DNA 48 Hình 3.17 Kết điện di kiểm tra sản phẩm PCR 49 Hình 3.18 Kết điện di kiểm tra sản phẩm gel gel agarose 1% 50 Hình 3.19 Kết dựng phát sinh chủng loại gen CCR 52 Hình 3.20 Kết biến nạp plasmid tái tổ hợp pENTR/CCR vào tế bào khả biến E.Coli DH5 53 Hình 3.21 Kết điện di plasmid pENTR/CCR 54 Hình 22 Kết điện di sản phẩm cắt plasmid tái tổ hợp mang đoạn cDNA gen CCR 55 Hình 3.23 Kết colony PCR sử dụng cặp mồi đặc hiệu CCR entr F CCR R 57 Hình 3.24 Kết tách plasmid tái tổ hợp pBENDER/CCR 57 Hình 3.25 Kết cắt plasmid tái tổ hợp pBENDER/CCR enzyme XhoI 58 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.Lrc-tnu.edu.vn MỤC LỤC MỞ ĐẦU 1.1 Lý chọn đề tài 1.2 Mục đích nội dung nghiên cứu 1.2.1 Mục đích 1.2.2 Nội dung nghiên cứu CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan bạch đàn 1.2 Tình hình trồng bạch đàn Việt Nam 1.3 Lignin chu trình sinh tổng hợp lignin thực vật 1.3.1 Lignin 1.3.2 Chu trình sinh tổng hợp lignin 1.3.3 Các loại promoter điều khiển biểu gen tầng xylem 1.3.4 Enzyme cinnamoyl CoA reductase vai trị q trình sinh tổng hợp lignin 11 CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15 2.1 Vật liệu nghiên cứu 15 2.1.1 Vật liệu 15 2.1.2 Hoá chất 15 2.1.3 Máy móc, thiết bị 15 2.1.4 Địa điểm nghiên cứu 16 2.2 Phương pháp nghiên cứu 16 2.2.1 Phương pháp tìm kiếm thơng tin trình tự gen mã hóa cho enzyme CAD CCR ngân hàng gen quốc tế 16 2.2.2 Phương pháp thiết kế mồi đặc hiệu tách dòng promoter gen CAD cDNA gen CCR 16 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.Lrc-tnu.edu.vn 2.2.3 Phương pháp tách chiết, tinh DNA RNA từ mô gỗ 17 2.2.4 Phương pháp tổng hợp cDNA 21 2.2.5 Phương pháp khuếch đại đoạn promoter EuCAD đoạn cDNA gen CCR phản ứng PCR 22 2.2.6 Phương pháp tách dòng 23 2.2.7 Phương pháp PCR trực tiếp từ khuẩn lạc (colony-PCR) 27 2.2.8 Phương pháp Gateway 28 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 32 3.1 Kết phân lập promoter gen mã hóa cho enzyme cinnamyl alcohol dehydrogenase (CAD) 32 3.1.1 Kết thiết kế mồi 32 3.1.2 Kết tách chiết DNA bạch đàn 32 3.1.3 Kết tối ưu hóa phản ứng PCR 34 3.3 Tách dịng xác định trình tự đoạn promoter EuCAD 36 3.3.1 Tinh sản phẩm PCR tạo vector tái tổ hợp 36 3.3.2 Biến nạp sản phẩm ligation vào tế bào vi khuẩn E.coli DH5 37 3.3.3 Chọn dòng tế bào E.coli mang vector tái tổ hợp 38 3.3.4 Tách chiết plasmid tái tổ hợp 40 3.3.5 Kết đọc trình tự nucleotide hai đoạn promoter CAD1 CAD243 3.3.6 Phân tích nhân tố điều hịa dạng cis có mặt trình tự promoter gen CAD tách dòng từ bạch đàn nâu Eucalyptus urophylla S.T Blake 44 3.3.7 Kết đăng tải trình tự promoter gen mã hóa cho enzyme cinnamyl alcohol dehydrogenase ngân hàng gen quốc tế NCBI 46 3.2 Kết tách dòng thiết kế vector chuyển gen mang đoạn gen mã hóa cho enzyme cinnamoyl coa reductase (CCR) 47 3.2.1 Kết thiết kế mồi 47 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.Lrc-tnu.edu.vn 3.2.2 Kết tách chiết RNA tổng số bạch đàn 47 3.2.3 Kết tối ưu hóa phản ứng PCR 48 3.2.4 Kết gel tinh sản phẩm gel 49 3.2.5 Kết phân tích so sánh trình tự cDNA gen CCR 50 3.2.6 Kết tạo plasmid tái tổ hợp pENTRTM/D-TOPO® có gắn đoạn cDNA gen CCR biến nạp vào tế bào khả biến E.coli DH5 52 3.2.7 Kết tách chiết plasmid tái tổ hợp 54 3.2.8 Kết phản ứng LR tái tổ hợp tạo plasmid pBENDER/CCR theo kĩ thuật Gateway® 55 3.2.9 Kết dịng hóa plasmid pBENDER/CCR vào tế bào E.coli DH5 56 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 60 TÀI LIỆU THAM KHẢO Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.Lrc-tnu.edu.vn Phụ lục Kết phân tích độ tƣơng đồng 26 lồi thực vật 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 Zea_mays Arabidopsis_thaliana 0.49 Lycopersicon_esculentum 0.52 0.38 Hordeum_vulgare 0.17 0.42 0.49 Triticum_aestivum 0.18 0.43 0.51 0.05 Vitis_vinifera 1.00 0.94 0.86 0.91 0.96 Solanum_tuberosum 0.46 0.36 0.19 0.45 0.49 0.94 Saccharum_officinarum 0.07 0.48 0.53 0.15 0.19 0.98 0.47 Populus_trichocarpa 0.39 0.34 0.28 0.36 0.38 0.87 0.27 0.39 10 Prunus_persica 0.41 0.35 0.30 0.39 0.40 0.80 0.24 0.42 0.21 11 Capsicum_annuum 0.43 0.36 0.19 0.40 0.43 0.88 0.09 0.43 0.27 0.25 12 Fragaria_ananassa 0.39 0.34 0.32 0.38 0.41 0.89 0.25 0.41 0.25 0.16 0.25 13 Eucalyptus_globulus 1.34 1.31 1.24 1.25 1.24 1.63 1.28 1.40 1.28 1.33 1.22 1.33 14 Linum_album 0.39 0.36 0.33 0.39 0.41 0.87 0.31 0.41 0.27 0.29 0.30 0.28 1.27 15 Eucalyptus_gunnii 0.37 0.38 0.36 0.35 0.36 0.81 0.32 0.38 0.25 0.25 0.30 0.27 1.41 0.31 16 Eucalyptus_nudicaulis 1.34 1.29 1.24 1.23 1.24 1.61 1.28 1.38 1.25 1.35 1.21 1.34 0.03 1.28 1.41 17 Eucalyptus_chloroclada 1.37 1.32 1.25 1.26 1.25 1.63 1.28 1.40 1.29 1.38 1.21 1.37 0.04 1.31 1.44 0.02 18 Eucalyptus_brassiana 1.34 1.30 1.23 1.23 1.23 1.63 1.28 1.37 1.27 1.34 1.20 1.35 0.03 1.27 1.40 0.01 0.01 19 Eucalyptus_cordata 1.33 1.29 1.23 1.23 1.23 1.60 1.27 1.38 1.27 1.32 1.20 1.31 0.01 1.26 1.40 0.03 0.03 0.02 20 Eucalyptus_vicina 1.35 1.30 1.24 1.24 1.24 1.59 1.27 1.38 1.26 1.35 1.20 1.34 0.03 1.29 1.41 0.01 0.01 0.01 0.03 21 Eucalyptus_saligna 0.39 0.38 0.36 0.36 0.37 0.83 0.32 0.40 0.25 0.25 0.30 0.26 1.36 0.31 0.02 1.36 1.39 1.35 1.35 1.36 22 Eucalyptus_blakelyi 1.36 1.31 1.25 1.25 1.26 1.61 1.28 1.39 1.27 1.37 1.21 1.35 0.04 1.30 1.42 0.01 0.02 0.01 0.03 0.00 1.37 23 Eucalyptus_alba 1.32 1.29 1.23 1.21 1.22 1.67 1.31 1.36 1.27 1.34 1.23 1.32 0.03 1.28 1.40 0.02 0.03 0.02 0.03 0.02 1.35 0.03 24 Eucalyptus_punctata 1.32 1.26 1.22 1.21 1.21 1.57 1.26 1.35 1.24 1.32 1.20 1.30 0.03 1.25 1.38 0.03 0.03 0.02 0.02 0.03 1.33 0.03 0.02 25 Eucalyptus_grandis 1.36 1.29 1.23 1.23 1.25 1.59 1.28 1.39 1.28 1.35 1.21 1.34 0.03 1.27 1.39 0.01 0.02 0.02 0.03 0.02 1.35 0.02 0.02 0.02 26 Eucalyptus_urophylla 0.39 0.38 0.35 0.36 0.37 0.81 0.32 0.39 0.25 0.25 0.30 0.27 1.36 0.31 0.02 1.37 1.39 1.35 1.36 1.37 0.02 1.38 1.35 1.34 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.Lrc-tnu.edu.vn 25 1.35 26 Phụ lục Kết đăng ký trình tự gen CCR ngân hàng gen quốc tế Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.Lrc-tnu.edu.vn