Phân lập đoạn gen mã hóa protein vỏ từ smv (soybean mosaic virus) gây bệnh khảm lá ở đậu tương

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC NGUYỄN THỊ HƢƠNG LY PHÂN LẬP ĐOẠN GEN MÃ HÓA PROTEIN VỎ TỪ SMV (SOYBEAN MOSAIC VIRUS) GÂY BỆNH KHẢM LÁ Ở ĐẬU TƢƠNG Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 60.42.02.01 LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: GS.TS Chu Hoàng Mậu Thái Nguyên - 2013 Số hóa trung tâm học liệu Tai ngay!!! Ban co the xoa dong chu nay!!! http://www.lrc-tnu.edu.vn/ i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan nội dung trình bày luận văn tơi nghiên cứu hướng dẫn GS.TS Chu Hoàng Mậu giúp đỡ cộng nhóm nghiên cứu Các số liệu kết trình bày luận văn đồng ý của cán hướng dẫn nhóm nghiên cứu, tài liệu trích dẫn ghi rõ nguồn gốc Tác giả Nguyễn Thị Hƣơng Ly Số hóa trung tâm học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ ii LỜI CẢM ƠN Trước tiên, xin bày tỏ lịng biết ơn tới GS.TS Chu Hồng Mậu tận tình hướng dẫn, truyền đạt kiến thức kinh nghiệm q báu để tơi hồn thành luận văn thạc sĩ Công nghệ sinh học Tôi xin chân thành cảm ơn NCS Lò Thị Mai Thu, cảm ơn Thạc sĩ Hoàng Hà tập thể cán Phịng Cơng nghệ DNA Ứng dụng, Phịng Cơng nghệ tế bào thực vật, Viện Công nghệ sinh học tạo điều kiện tận tình giúp đỡ tơi hồn thành thí nghiệm luận văn Tơi xin cảm ơn thầy cô Bộ môn Di truyền Sinh học đại, Khoa Sinh - KTNN, Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên; Tôi xin cảm ơn PGS.TS Nguyễn Vũ Thanh Thanh Thầy, Cô khoa Khoa học Sự sống, Trường Đại học Khoa học - Đại học Thái Nguyên nhiệt tình giúp đỡ tơi q trình học tập nghiên cứu Cuối cùng, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn tới tồn thể gia đình, cảm ơn bạn bè đồng nghiệp cổ vũ, động viên suốt thời gian qua Tác giả Nguyễn Thị Hương Ly Số hóa trung tâm học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ v NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT bp Cặp base cs Cộng đtg Đồng tác giả DNA Deoxiribonucleic acid RNA Ribonucleic Acid kb Kilo base PCR Polymerase Chain Reaction TAE Tris acetat EDTA CP Coat Protein DEPC Diethyl pyrocarbonate RNAi RNA interference RNase Ribonuclease X-gal 5-brom-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactosidase cDNA Complementary DNA (DNA bổ sung) IPTG Isopropylthio-β-D-galactosidase SMV Soybean Mosaic Virus vi DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng Tên bảng Trang Bảng 1.1 Sản xuất đậu tương Việt Nam từ 2007 đến 2013 Bảng 2.1 Thành phần cho phản ứng tổng hợp cDNA 23 Bảng 2.2 Thành phần phản ứng PCR nhân gen CP 24 Bảng 2.3 Chu kỳ nhiệt cho phản ứng PCR nhân gen CP 25 Bảng 2.4 Thành phần phản ứng ghép nối gen CP vào vector tách dòng pBT 27 Bảng 2.5 Thành phần phản ứng colony – PCR 28 Bảng 2.6 Chu trình nhiệt phản ứng colony – PCR 28 Bảng 2.7 Thành phần hóa chất tách chiết plasmid 29 Bảng 3.1 Trình tự cặp mồi sử dụng nghiên cứu 34 Bảng 3.2 Các vị trí sai khác trình tự đoạn gen CP SMV dịng SL1 X63771 40 Bảng 3.3 Các vị trí sai khác trình tự amino acid CP SMV dịng SL1 CAA45307 43 vii DANH MỤC CÁC HÌNH Hình Tên hình Trang Hình 1.1 Sơ đồ gen hệ gen SMV 17 Hình 1.2 Sơ đồ protein vỏ SMV 18 Hình 1.3 Vùng Poty_coat 18 Hình 2.1 Cấu trúc vecto pBT 26 Hình 3.1 Các mẫu đậu tương nghi nhiễm bệnh thu thập 31 tỉnh Thái Nguyên, Sơn La, Tuyên Quang, Hà Nội Hình 3.2 Kết xác định đoạn tương đồng 96 trình tự gen 34 CP so sánh BLAST NCBI Hình 3.3 Ảnh điện di sản phẩm PCR khuếch đại đoạn gen CP từ 35 cDNA SMV Hình 3.4 Kết biến nạp vecto tái tổ hợp vào tế bào khả biến 37 E.coli DH5 Hình 3.5 Hình ảnh điện di sản phẩm colony - PCR từ khuẩn lạc 38 Hình 3.6 Hình ảnh điện di sản phẩm tách plasmid mang gen CP 39 Hình 3.7 Trình tự đoạn gen CP SMV phân lập tỉnh Sơn 41 La trình tự gen CP dịng virus SMV đăng ký GenBank có mã số X63771 Hình 3.8 So sánh trình tự amino acid suy diễn từ gen CP phân lập từ virus SMV dịng SL trình tự amino acid 42 viii vùng Poty-coat protein có mã số CAA45307 GenBank Hình 3.9 Sơ đồ hình thiết lập dựa trình tự gen CP phân 43 lập từ 20 dịng SMV từ Việt Nam, Nhật Bản, Hàn Quốc, Mỹ, Trung Quốc, Canada, Ucraina Hình 3.10 Sơ đồ hình thiết lập dựa trình tự gen CP phân 44 lập từ 20 dòng SMV từ Việt Nam, Nhật Bản, Hàn Quốc, Mỹ, Trung Quốc, Canada, Ucraina Hình 3.11 Sơ đồ hình thiết lập dựa trình tự amino acid suy diễn từ gen CP phân lập từ 20 dòng SMV từ Việt Nam, Nhật Bản, Hàn Quốc, Mỹ, Trung Quốc, Canada, Ucraina 45 MỞ ĐẦU ĐẶT VẤN ĐỀ Đậu tƣơng (Glycine max (L.) Merrill) công nghiệp ngắn ngày, có giá trị kinh tế hàm lƣợng dinh dƣỡng cao Một đặc tính quan trọng đậu tƣơng có nốt sần rễ có khả cố định nitơ khơng khí, trồng đậu tƣơng góp phần cải tạo đất Hiện nay, suất sản lƣợng đậu tƣơng mức thấp nhiều giống trồng có tính ổn định chƣa cao, sức biến động lớn miền, vùng Khả kháng virus sâu bệnh giống đậu tƣơng trồng thấp chƣa có dự báo thời vụ gieo trồng thích hợp cho vùng chƣa xây dựng quy trình kỹ thuật sản xuất cho vùng sinh thái Theo kết điều tra bệnh Cục Bảo vệ thực vật trồng, xác định 20 loài bệnh hại, có bệnh nhiễm virus gây tổn thất lớn cho suất đậu tƣơng chƣa có biện pháp hiệu để phòng trừ bệnh virus Đậu tƣơng số trồng dễ bị nhiễm nhiều loại virus, nhƣ bệnh khảm (Soybean mosaic virus - SMV), bệnh khảm vàng hại đậu tƣơng (Bean yellow mosaic virus - SYMV), bệnh xoăn số bệnh virus khác Vì vậy, nghiên cứu tạo đậu tƣơng kháng virus phục vụ công tác chọn tạo giống đậu tƣơng bệnh cần thiết Bệnh khảm đậu tƣơng virus SMV gây nên Virus lan truyền rệp, bọ trĩ làm môi giới Sự lan truyền bệnh sang khoẻ rệp muội đồng chủ yếu, bệnh truyền qua hạt Hiện biện pháp phòng bệnh phổ biến là: Chọn lọc bệnh để làm giống; vệ sinh đồng ruộng, luân canh trồng, thu dọn tàn dƣ bệnh đồng ruộng; diệt trừ Số hóa trung tâm học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ côn trùng truyền bệnh Các biện pháp truyền thống thƣờng phức tạp, tốn thời gian, hiệu không cao bền vững Biện pháp hiệu để phòng virus sử dụng giống kháng virus, nhiên, nguồn kháng bệnh tự nhiên loại virus không nhiều Do vậy, phƣơng pháp chuyển gen để tạo kháng virus đặc biệt tỏ hữu ích lồi thực vật mà tự nhiên khan nguồn kháng bệnh Từ lí chúng tơi tiến hành đề tài: “Phân lập đoạn gen mã hóa protein vỏ từ SMV (Soybean mosaic virus) gây bệnh khảm đậu tương” MỤC TIÊU ĐỀ TÀI Phân lập xác định đƣợc trình tự đoạn gen CP virus SMV nhằm tạo nguyên liệu thu thập thông tin để thiết kế vector mang cấu trúc RNAi phục vụ nghiên cứu tạo đậu tƣơng chuyển gen kháng virus SMV gây bệnh khảm NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 3.1 Thu mẫu nghi nhiễm virus SMV từ vùng trồng đậu tƣơng số địa phƣơng thuộc phía Bắc Việt Nam Lƣu giữ bảo quản mẫu theo quy phạm 3.2.Tách chiết RNA virus SMV tạo cDNA phản ứng phiên mã ngƣợc Nhân đoạn gen CP virus SMV 3.3 Tách dòng xác định trình tự đoạn gen CP virus SMV Phân tích so sánh với trình tự cơng bố GenBank 3.4 Phân tích đa dạng số dịng virus SMV dựa trình tự đoạn gen CP trình tự amino acid suy diễn Số hóa trung tâm học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ Chƣơng TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 CÂY ĐẬU TƢƠNG 1.1.1 Đặc điểm sinh học đậu tƣơng Cây đậu tƣơng loại trồng đƣợc biết đến từ sớm Các chứng lịch sử, địa lý khảo cổ học đậu tƣơng có nguồn gốc từ Trung Quốc Cây đậu tƣơng đƣợc hóa trồng làm lƣơng thực Trung Quốc kỉ XVII trƣớc công nguyên Cây đậu tƣơng đƣợc truyền bá sang Nhật Bản vào khoảng kỉ thứ XVIII, du nhập vào nhiều nƣớc châu Á khác nhƣ : Indonesia, Philippin, Thái Lan, Ấn Độ , Việt Nam… vài kỉ sau Cây đậu tƣơng đƣợc trồng châu Âu vào kỉ XVII Hoa Kì vào kỉ XVIII [1] Về phân loại học, đậu tƣơng hay đậu nành có tên khoa học Glycine max (L.) Merrill (2n=40) thuộc họ đậu (Lengminoceae), họ phụ cánh bƣớm (Papilionoideae) Về nguồn gốc phân loại đậu tƣơng đƣợc công bố cơng trình Hymowitz Newell (1981) Đối với đậu tƣơng trồng đƣợc phân biệt theo đặc điểm thực vật học, dựa theo thời gian sinh trƣởng, thời vụ Hiện nay, đậu tƣơng đƣợc trồng Việt Nam có nguồn gốc giống địa phƣơng giống nhập nội Đậu tƣơng loại trồng cạn thu hạt, gồm phận chính: rễ, thân, cành, lá, hoa, hạt Rễ đậu tƣơng loại rễ cọc, gồm rễ rễ phụ, rễ có nhiều nốt sần chứa vi khuẩn Rhizobium japonicum, có khả cố định đạm khơng khí tạo thành đạm dễ tiêu Số hóa trung tâm học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 42 kích thƣớc 720 nucleotide, mã hóa 240 amino acid có hệ số tƣơng đồng 99% Nhƣ vậy, kết luận trình tự cDNA mà phân lập đƣợc đoạn gen mã hóa protein vỏ SMV dịng SL1 Kết so sánh trình tự amino acid coat protein SMV dịng SL1 với coat protein có mã số CAA45307 GenBank suy diễn từ gen mã số X63771 SMV đƣợc trình bày Hình 3.8 Hình 3.8 Trình tự amino acid coat protein SMV dịng SL1 dịng virus SMV GenBank có mã số CAA45307 Hình 3.8 kết so sánh BLAST NCBI cho thấy trình tự amino acid CP SMV dịng SL1 có độ tƣơng đồng 99% so với trình tự amino acid mã số CAA45307 GenBank Tuy nhiên hai trình tự amino acid có sai khác vị trí amino acid: 231, 235, 237 (Bảng 3.3) Số hóa trung tâm học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 43 Bảng 3.3 Các vị trí sai khác trình tự amino acid CP SMV dịng SL1 CAA45307 Vị trí amino acid CAA45307 SL1 231 L (Leucine) V (Valine) 235 D (Aspartic acid) N (Asparagine) 237 N (Asparagine) K (Lysine) CP SMV mã số CAA45307 có 267 amino acid vùng Poty-coat protein CP có 232 amino acid; protein suy diễn từ trình tự đoạn gen CP SMV dịng SL1 có 240 amino acid với 208 amino acid vùng Poty-coat So sánh 208 amino acid vùng poty_coat CP kể từ amino acid thứ đến thứ 208 hai trình tự amino acid CP SL1 với CAA45307 cho thấy có vị trí amino acid sai khác, 199, 203, 205 (Hình 3.9) Hình 3.9 So sánh trình tự amino acid suy diễn vùng poty_coat SMV dòng SL1 vùng Poty-coat protein có mã số CAA45307 GenBank Số hóa trung tâm học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 44 3.3 PHÂN TÍCH SỰ ĐA DẠNG CỦA CÁC DÒNG VIRUS SMV DỰA TRÊN TRÌNH TỰ GEN CP VÀ TRÌNH TỰ AMINO ACID SUY DIỄN Chúng tơi tiến hành so sánh trình tự nucleotide đoạn gen CP SMV dòng SL1-Việt Nam với 19 trình tự gen CP cơng bố Ngân hàng gen quốc tế (NCBI), kết đƣợc thể Hình 3.10 AB100445.seq EU931454.seq DQ517430.seq AB100448.seq AJ609297.seq SL1.seq X63771.seq U25673.seq AY216489.seq AB206830.seq AB206832 seq AB206831.seq AB206834.seq AB206833.seq AY799852.seq AJ609298.seq AB100447.seq AF200578.seq DQ517427.seq JF431105.seq 4.7 Nucleotide Substitutions (x100) Hình 3.10 Sơ đồ hình thiết lập dựa trình tự gen CP phân lập từ 20 dịng SMV từ Việt Nam, Nhật Bản, Hàn Quốc, Mỹ, Trung Quốc, Canada, Ucraina (SL1- SMV thu thập từ đậu tương nhiễm bệnh tỉnh Sơn La- dòng SL1; 19 dịng SMV có trình tự nucleotide gen CP có mã số GenBank) Trong trình tự gen CP thuộc 20 dịng SMV đƣợc sử dụng so sánh có: dòng Việt Nam, dòng Nhật Bản, dòng Hàn Quốc, dòng Mỹ, dòng Trung Quốc, dịng Canada, dịng Ucraina Số hóa trung tâm học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 45 Sơ đồ hình hình 3.10 cho thấy 20 dòng virus phân bố nhóm với khoảng cách di truyền 4,7% dịng SL-Việt Nam, dịng có mã số X63771, dịng có mã số U25673 (Trung Quốc) phân bố nhóm với hệ số tƣơng đồng từ 99,1%-100% Tiếp tục phân tích mối quan hệ 20 dịng SMV dựa trình tự amino acid suy diễn chúng tơi thấy dịng SL-Việt Nam hai dòng Trung Quốc phân bố nhóm (Hình 3.11) Từ kết phân tích quan hệ 20 dịng virus dựa trình tự nucleotide gen CP trình tự amino acid suy diễn cho thấy dòng SL thu tỉnh Sơn La, Việt Nam có quan hệ gần với hai dịng Trung Quốc có mã số X63771 U25673 Ngân hàng gen quốc tế Hình 3.11: Sơ đồ hình thiết lập dựa trình tự amino acid suy diễn từ gen CP phân lập từ 20 dòng SMV từ Việt Nam, Nhật Bản, Hàn Quốc, Mỹ, Trung Quốc, Canada, Ucraina (SL1- SMV thu thập từ đậu tương nhiễm bệnh tỉnh Sơn La- dịng SL1; 19 dịng SMV có trình tự amino acid protein suy diễn có mã số GenBank) Số hóa trung tâm học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 46 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ KẾT LUẬN 1.1 Đã thu thập đƣợc mẫu bệnh nhiễm virus gây bệnh khảm đậu tƣơng địa phƣơng Hà Nội, Thái Nguyên, Sơn La, Tuyên Quang 1.2 Đã tách chiết đƣợc RNA tổng số mẫu nhiễm virus đảm bảo chất lƣợng cho phản ứng RT-PCR 1.3 Đã nhân bản, tách dịng thành cơng xác định trình tự đoạn mã hóa gen CP từ SMV thu thập tỉnh Sơn La Kích thƣớc đoạn gen CP đƣợc xác định có 720 nucleotide, mã hóa 240 amino acid có 208 amino acid vùng Poty-coat 1.4 SMV dịng SL1-Việt Nam có quan hệ gần phân bố nhóm với hai dịng SMV Trung Quốc có mã số X63771 U25673 Ngân hàng gen quốc tế ĐỀ NGHỊ Tiếp tục nghiên cứu sử dụng trình tự đoạn gen CP dịng SL – Việt Nam đƣợc phân lập để làm nguyên liệu thiết kế vector mang cấu trúc RNAi phục vụ chuyển gen nhằm cải thiện khả kháng virus SMV đậu tƣơng Việt Nam Số hóa trung tâm học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 47 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Chu Hoàng Mậu, Nguyễn Thị Thúy Hƣờng, Nguyễn Vũ Thanh Thanh, Chu Hoàng Hà (2011), Gen đặc tính chịu hạn đậu tương Nxb Đại học Quốc Gia, Hà Nội Ngô Thế Dân, Trần Đình Long cs (1999), Cây đậu tương Nxb Nơng nghiệp, Hà Nội Lê Thị Ánh Hồng, Phan Tố Phƣợng, Nguyễn Trí Thanh, Hứa Quyết Chiến, Trần Thị Thuần, Trần Duy Quý (2002), Phòng trừ sinh học bệnh hại thực vật Việt Nam Tạp chí khoa học kỹ thuật nông nghiệp phát triển nông thôn, 2-2002 Vũ Triệu Mân, Lê Lƣơng Tề (1998), Giáo trình bệnh nông nghiệp Nxb Nông Nghiệp, Hà Nội Vũ Triệu Mân, Lê Lƣơng Tề (2001), Bệnh vi khuẩn virus hại trồng Nxb Giaó Dục Chu Hoàng Hà, Nguyễn Minh Hùng, Bùi Chi Lăng, Lê Trần Bình (2004), Đánh giá tính đa dạng dịng virus gây bệnh đốm vòng đu đủ Việt Nam thơng qua tách dịng, xác định so sánh trình tự gen mã hố protein vỏ (CP), Tạp chí Cơng nghệ sinh học, 2(4):451-459 Chu Hoàng Hà, Đỗ Xuân Đồng, Phạm Bích Ngọc, Lâm Đại Nhân, Lê Văn Sơn, Lê Trần Bình (2011), Nghiên cứu tạo giống đu đủ kháng bệnh đốm vòng ứng dụng chế RNAi Hội Thảo quốc gia bệnh hại thực vật Việt nam: 316 – 326 Số hóa trung tâm học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 48 Đỗ Năng Vịnh (2007) Công nghệ can thiệp RNAi (RNAi) gây bất hoạt gen tiềm ứng dụng to lớn Tạp chí Cơng nghệ Sinh học, 5(3): 265-275 Nguyễn Thị Tâm, Nguyễn Vũ Thanh Thanh, Chu Hồng Mậu (2010), Phân lập xác định trình tự gen mã hoá protein vỏ virus Y khoai tây trồng Thái Nguyên Tạp chí Sinh học, 32(1): 81-87 10 Nguyễn Thị Hải Yến, Phạm Thị Vân, Chu Hồng Hà, Chu Hồng Mậu, Lê Trần Bình (2011), So sánh tính kháng bệnh xoăn vàng dịng cà chua chuyển gen mang cấu trúc RNAi đơn gen đồng thời hai gen Tomato yellow leaf curl Vietnam virus Hội thảo quốc gia Bệnh hại thực vật Việt Nam 2011: 290 – 299 11 Phạm Thị Vân, Nguyễn Văn Bắc, Lê văn Sơn, Chu Hoàng Hà, Lê Trần Bình (2008) Tạo thuốc kháng bệnh virus khảm dƣa chuột kỹ thuật RNAi Tạp chí cơng nghệ sinh học, (4A): 679 – 687 12 Nguyễn Thị Hải Yến, Phạm Thị Vân, Chu Hoàng Hà, Chu Hồng Mậu, Lê Trần Bình (2009), Thiết kế vector cấu trúc RNAi mang gen virus gây bệnh xoăn cà chua Hội nghị Cơng nghệ sinh học tồn quốc: 473477 13 Nguyễn Thị Hải Yến, Phạm Thị Vân, Chu Hồng Hà, Chu Hồng Mậu, Lê Trần Bình, (2008), Phân lập gen mã hóa protein vỏ virus gây bệnh xoăn vàng cà chua thu thập cà chua dại tỉnh Thái Ngun Tạp chí Cơng nghệ Sinh học, (4): 467-474 14 Nguyễn Thị Hải Yến (2012), Nghiên cứu tạo cà chua kháng bệnh xoăn vàng virus kỹ thuật chuyển gen Luận án tiến sĩ sinh học Viên Công nghệ sinh học-VAST Số hóa trung tâm học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 49 Tiếng Anh 15 Fire A, Xu S, Montgomery MK, Kostas SA, Driver SE, Mello CC (1998) Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans Nature 391: 806-811 16 Baulcombe D (2004) “RNA silencing in plants” Nature 431: 356-363 17 Adai A, Johnson C, Mlotshwa S, Archer-Evans S, Manocha V, Vance V and Sundaresan V (2005), Computational prediction of miRNAs in Arabidopsis thaliana Genome Res 15: 78–91 18 Ambros V, Bartel B, Bartel DP, Burge CB, Carrington JC, Chen X, Dreyfuss G, Eddy SR, Griffiths-Jones S, Marshall M,(2003 a), “A uniform system for microRNA annotation” RNA 9: 277-279 19 Bartel B and Bartel DP (2003), MicroRNAs: At the root of plant development Plant Physiol 132: 709–717 20 Bartel DP (2004), MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism and function Cell 116: 281–297 21 Bernstein E, Caudy AA, Hammond SM, Hannon GJ (2001), Role for a bidentate ribonuclease in the initiation step of RNA interference Nature 409: 295-296 22 Denli AM, Tops BBJ, Plasterk RHA, Ketting RF, Hannon GJ (2004), Processing of primary microRNAs by the Microprocessor complex Nature 432:231–235 23 Dugas DV and Bartel B (2004), MicroRNA regulation of gene expression in plants Curr Opin Plant Biol 7: 512–520 24 Elbashir SM, Lendeckel W, Tuschl T (2001), RNA interference is mediated by 21- and 22- nucleotide RNAs Genes Dev 15:188–200 Số hóa trung tâm học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 50 25 Faller M, Guo F (2008), MicroRNA biogenesis: there's more than one way to skin a cat Biochimica et Biophysica Acta 1779 (11): 663–667 26 Gregory R, Chendrimada T, Shiekhattar R (2006), MicroRNA biogenesis: isolation and characterization of the microprocessor complex Methods in molecular biology (Clifton, N.J.) 342: 33–47 27 Hamilton JH, Baulcombe DC (1999), A species of small antisense RNA in post-transcriptional gene silencing in plants Science 286: 950-952 28 Hammond SM, Bernstein E, Beach D, Hannon GJ (2000), An RNAdirected nuclease mediates post-transcriptional gene silencing in Drosophila cells Nature 404: 293-296 29 He L and Hannon GJ (2004), MicroRNAs: Small RNAs with a big role in gene regulation Nat Rev Genet 5: 522–531 30 Ji X (2008), The mechanism of RNase III action: how dicer dices Current topics in microbiology and immunology 320: 99–116 31 Jones L, Ratcliff F and Baulcombe DC (2001), RNA-directed transcriptional gene silencing in plants can be inherited independently of the RNA trigger and requires Met1 for maintenance Curr Biol 11: 747−757 32 Jones-Rhoades MW and Bartel DP (2004), Computational identification of plant microRNAs and their targets, including a stress-induced miRNA Mol Cell 14: 787−799 33 Kai Z, Yan-Bing N and Xue-Ping Z (2005), Transgenic tobacco plants expressing dsRNA can prevent infection by Tobacco mosaic virus Chin J Agr Biotechnol 2: 201–205 Số hóa trung tâm học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 51 34 Kalantidis K, Psaradakis S, Tabler M and Tsagris M (2002), The occurrence of CMV-specific short RNAs in transgenic tobacco expressing virus-derived double-stranded RNA is indicative of resistance to the virus Mol Plant Microbe Interact 15: 826–833 35 Kidner CA and Martienssen RA (2005), The developmental role of microRNA in plants Curr Opin Plant Biol 8: 38–44 36 Lau NC, Lim LP, Weinstein EG, Bartel DP (2001), An abundant class of tiny RNAs with probable regulatory roles in Caenorhabditis elegans Science 294 (5543): 858–62 37 Lagos-Quintana M, Rauhut R, Lendeckel W, Tuschl T (2001), Identification of novel genes coding for small expressed RNAs Science 294 (5543): 853–8 38 Lee RC, Ambros V (2001), An extensive class of small RNAs in Caenorhabditis elegans Science 294 (5543): 862–4 39 Lee Y, Kim M, Han J, Yeom KH, Lee S, Baek SH, Kim VN (October 2004), MicroRNA genes are transcribed by RNA polymerase II EMBO J 23 (20): 4051–60 40 Lund E, Dahlberg J (2006), Substrate selectivity of exportin and Dicer in the biogenesis of microRNAs Cold Spring Harbor symposia on quantitative biology 71: 59–66 41 Mette MF, Aufsatz W, van der Winden J, Matzke MA and Matzke AJ (2000), Transcriptional silencing and promoter methylation triggered by double-stranded RNA EMBO J 19: 5194−5201 Số hóa trung tâm học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 52 42 Missiou A, Kalantidis K, Boutla A, Tzortzakaki S, Tabler M and Tsagris M (2004), Generation of transgenic potato plants highly resistant to potato virus Y (PVY) through RNA silencing Mol Breed 14:185–197 43 Nicola-Negri ED, Brunetti A, Tavazza M and Ilardi V (2005), Hairpin RNA-mediated silencing of Plum pox virus P1 and HC-Pro genes for efficient and predictable resistance to the virus Transgenic Res 14:989– 994 44 Park SM, Lee JS, Jegal S, Jeon BY, Jung M, Park YS, Han SL, Shin YS, Her NH, Lee JH, Lee MY, Ryu KH, Yang SG and Harn CH (2005), Transgenic watermelon rootstock resistant to CGMMV (cucumber green mottle mosaic virus) infection Plant Cell Rep 24: 350–356 45 Reinhart BJ, Weinstein EG, Rhoades MW, Bartel B and Bartel DP (2002), MicroRNAs in plants Genes Dev 16: 1616–1626 46 Rivas FV, Tolia NH, Song JJ, Aragon JP, Liu J, Hannon GJ, Joshua-Tor L (2005), Purified Argonaute2 and an siRNA form recombinant human RISC Nat Struct Mol Biol 12:340–349 47 Rhoades MW, Reinhart BJ, Lim LP, Burge CB, Bartel B and Bartel DP (2002), Prediction of Plant MicroRNA Targets Cell 110: 513-520 48 Schwarz D S, Hutvagner G, Haley B and Zamore PD (2002), Evidenc that siRNAs funtion as guides, nt primers in the Drosophila and human RNAi pathways.Mol Cell 10: 537-548 49 Smith NA, Singh SP, Wang MB, Stoutjesdijk PA, Green AG and Waterhouse PM (2000), Total silencing by intron-spliced hairpin RNAs Nature 407: 319–320 Số hóa trung tâm học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 53 50 Song JJ , Smith SK, Hannon GJ, and Joshua-Tor L (2004), Crystal Structure of Argonaute and Its Implications for RISC Slicer Activity Science 305: 1434-1437 51 Sunkar R and Zhu J-K (2004), Novel and Stress-Regulated MicroRNAs and Other Small RNAs from Arabidopsis Plant Cell 16: 2001-2019 52 Volpe TA, Kidner C, Hall IM, Teng G, Grewal SIS and Martienssen RA (2002), Regulation of heterochromatic silencing and histone H3 lysine-9 methylation by RNAi Science 297: 1833−1837 53 Wang MB and Metzlaff M (2005), RNA silencing and antiviral defense in plants Curr Opin Plant Biol 8: 216-22 54 Wang MB, Abbott DC and Waterhouse PM (2000), A single copy of a virus-derived transgene encoding hairpin RNA gives immunity to barley yellow dwarf virus Mol Plant Pathol 1:347–356 55 Wassenegger M, Heimes S, Riedel L and Sanger HL (1994), RNAdirected de novo methylation of genomic sequences in plants Cell 76, 567−576 56 Waterhouse PM, Graham MW and Wang MB (1998), Virus resistance and gene silencing in plants can be induced by simultaneous expression of sense and antisense RNA Proc Natl Acad Sci USA 95:13959–13964 57 Wesley SV, Helliwell CA, Smith NA, Wang MB, Rouse DT, Lie Q, Gooding PS, Singh SP, Abbott D, Stoutjesdijk PA, Robinson SP, Gleave AP, Green AG and Waterhouse PM (2001), Construct design for efficient, effective and high-throughput gene silencing in plants Plant J 27: 581– 590 Số hóa trung tâm học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 54 58 Zamore P D, Tuschl T, Sharp P A and Bartel D P (2000), RNAi: doublestranded RNA directs the ATP-dependent cleavage of mRNA at 21 to 23 nucleotide intervals Cell 101: 25–33 59 Zhou X, Ruan J, Wang G, Zhang W (March 2007), Characterization and identification of microRNA core promoters in four model species PLoS Comput Biol (3): 37 60 Zilberman D, Cao X and Jacobsen SE (2003), ARGONAUTE4 control of locus specific siRNA accumulation and DNA and histone methylation Science 29 61 http://www.gos.gov.vn 62 http://www.ncbi.nlm.nih.gov Số hóa trung tâm học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ iii MỤC LỤC MỞ ĐẦU 1 ĐẶT VẤN ĐỀ MỤC TIÊU ĐỀ TÀI NỘI DUNG NGHIÊN CỨU Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU……………………………………… 1.1 CÂY ĐẬU TƢƠNG 1.1.1 Đặc điểm sinh học đậu tƣơng 1.1.2 Giá trị kinh tế đậu tƣơng 1.1.3 Tình hình sản xuất đậu tƣơng giới Việt Nam 1.2 BỆNH VIRUS HẠI CÂY TRỒNG 1.2.1 Tình hình bệnh virus hại trồng 1.2.2 Bệnh virus đậu tƣơng 10 1.2.3 Ứng dụng kỹ thuật RNAi nghiên cứu tạo chuyển gen kháng virus 11 1.3 VIRUS SMV VÀ HỆ GEN CỦA SMV 16 Chƣơng 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19 2.1 VẬT LIỆU VÀ THIẾT BỊ 19 2.1.1 Vật liệu nghiên cứu 19 2.1.2 Hoá chất thiết bị 20 2.1.3 Địa điểm nghiên cứu 20 2.2 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 21 2.2.1 Phƣơng pháp thu mẫu 21 2.2.2.2 Phƣơng pháp tổng hợp cDNA 23 2.2.2.3 Phƣơng pháp PCR 24 2.2.2.4 Phƣơng pháp tinh sản phẩm PCR 25 2.2.2.5 Phƣơng pháp ghép nối đoạn gen CP vào vector pBT 26 Số hóa trung tâm học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ iv 2.2.2.6 Phƣơng pháp PCR trực tiếp từ khuẩn lạc (colony – PCR) 27 2.2.2.7 Phƣơng pháp tách chiết plasmid 29 2.2.2.8 Phƣơng pháp xác định trình tự nucleotide gen 30 2.2.3 Phƣơng pháp phân tích xử lý trình tự gen 30 Chƣơng 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 31 3.1 KẾT QUẢ THU MẪU LÁ ĐẬU TƢƠNG NHIỄM BỆNH Ở MỘT SỐ ĐỊA PHƢƠNG MIỀN BẮC VIỆT NAM 31 3.2 KHUẾCH ĐẠI, TÁCH DÒNG VÀ XÁC ĐỊNH TRÌNH TỰ ĐOẠN GEN CP TỪ HỆ GEN CỦA VIRUS SMV 32 3.2.1 Tách chiết RNA tổng số 32 3.2.2 Kết nhân gen CP 33 3.2.3 Kết tinh sản phẩm PCR 36 3.2.4 Kết biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến E.coli DH5 36 3.2.5 Kết tách plasmid từ khuẩn lạc mẫu nghiên cứu 39 3.2.6 Kết xác định trình tự đoạn gen CP SMV 39 3.3 PHÂN TÍCH SỰ ĐA DẠNG CỦA CÁC DỊNG VIRUS SMV DỰA TRÊN TRÌNH TỰ GEN CP VÀ TRÌNH TỰ AMINO ACID SUY DIỄN 44 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 46 KẾT LUẬN 46 ĐỀ NGHỊ 46 TÀI LIỆU THAM KHẢO 47 Số hóa trung tâm học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/