Phân lập gen mã hóa protein vỏ của 2 loại virus gây bệnh trên hoa lan CymMV và ORSV

BỘ GIÁO DỤC ĐÀO TẠO VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT NGUYỄN THỊ MINH HẰNG “PHÂN LẬP GENE MÃ HÓA PROTEIN VỎ CỦA LOẠI VIRUS KHẢM HOA LAN CymMV ORSV” LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC Hà Nội, 2010 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn BỘ GIÁO DỤC ĐÀO TẠO VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT NGUYỄN THỊ MINH HẰNG “PHÂN LẬP GENE MÃ HÓA PROTEIN VỎ CỦA LOẠI VIRUS KHẢM HOA LAN CymMV ORSV” Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã số: 60 42 40 LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC Người hướng dẫn khoa học: PGS TS Chu Hồng Hà Hà Nội, 2010 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT µg microgram µl microlitre µm micrometer bp base pair cDNA Complementary DNA (DNA bổ sung tổng hợp nhờ enzym phiên mã ngược từ RNA thông tin) cs Cộng CymMV Cymbidium mosaic virus CP/NCP Coat protein/Nucleocapsid Protein (Protein vỏ) Đ/c Đối chứng DEPC Diethyl pyroCarbonate DNA Deoxyribonucleic acid EDTA Ethylene Diamine Tetra-acetic Acid ELISA Enzyme linked immunsorbent assay (kỹ thuật hấp thụ miễn dịch gắn enzym) g gram ORSV Odontoglossum ringspot virus IPTG Isopropylthio-β-D-galactoside Kb Kilobase LB Luria Bertani M Nồng độ mol/lit ml mililitre mm milimeter Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn NCBI National Center for Biological Information (Trung tâm Quốc gia thông tin Sinh học), http://www.ncbi.nlm.nih.gov ng Nanogram nm Nanometer PCR Polymerase Chain Reaction (Phản ứng chuỗi polymerase) PEG Polyethylene glycon RdRp RNA dependent RNA polymerase (RNA polymerase phụ thuộc RNA) RNA Ribonucleic acid RNase Ribonuclease RT- PCR Reverse transcription polymerase chain reaction (phản ứng PCR phiên mã ngược) TAE Tris - Acetate – EDTA Taq Thermus aquaticus v/p vịng/phút X-gal 5-brom-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactosidase Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn DANH MỤC CÁC HÌNH Trang Hình 1.1 Lá lan bị nhiễm virus ………………………………… ………….…… Hình 1.2 Hoa lan bị nhiễm virus ………………………………… Hình 1.3 Triệu chứng khảm vàng lan Hồ điệp …………………… .8 Hình 1.4 Triệu chứng vệt hoại tử hoa lan Cattleya ………………… .8 Hình 1.5 Ảnh chụp kính hiển vi điện tử CymMV ………….… …………9 Hình 1.6 Cấu trúc genome CymMV ………………………… ……………… Hình 1.7 Triệu chứng ORSV gây hoa lan ……… ……………….11 Hình 1.8 Hình dạng ORSV …………………………………….……… 11 Hình 1.9 Cấu trúc genome ORSV …………………………………………… 12 Hình 2.1 Cấu tạo vector pBT (Phan Trọng Hồng cs 2005) ………………… 23 Hình 3.1: Mẫu lan nghi ngờ nhiễm virus số địa điểm thu mẫu… ………28 Hình 3.2 RNA tổng số tách chiết từ mẫu lan nghi nhiễm virus (CymMV ORSV) ……………………………………………………………… 29 Hình 3.3 Kết điện di sản phẩm RT-PCR gene CP CymMV …… 30 Hình 3.4 Kết Điện di sản phẩm RT-PCR gen CP ORSV ……… .31 Hình 3.5 Kết biến nạp plasmid tái tổ hợp vào tế bào khả biến E.coli chủng DH5α …………………………………………………………………….….33 Hình 3.6 Kết điện di sản phẩm colony-PCR từ dòng khuẩn lạc mang gen CP-CymMV với cặp mồi pUC18-F/R ………………………….….……34 Hình 3.7 Kết điện di sản phẩm colony-PCR từ 12 dòng khuẩn lạc mang gen CP-ORSV cặp mồi pUC18-F/R.………………………………35 Hình 3.8 Kết tách chiết plasmid tái tổ hợp pBT-CP-CymMV Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn (3.8A) pBT-CP-ORSV (3.8B) …………………………………….…………… 36 Hình 3.9: Kết điện di sản phẩm cắt plasmid mang gen CP- CymMV BamHI ………………………………………………………….37 Hình 3.10 Kết điện di sản phẩm cắt plasmid mang gen CP - ORSV BamHI……………………………………………………………37 Hình 3.11 So sánh trình tự nucleotide gen CP-CymMV phân lập tư mẫu lan Hà Nội, Bắc Giang Thái Nguyên với trình tự tương ứng GenBank ………………………………….…………………… 43 Hình 3.12 Cây phát sinh chủng loại xây dựng sở so sánh trình tự nucleotide gen CP- CymMV phân lập từ mẫu lan Hà Nội, Bắc Giang Thái Ngun với trình giới cơng bố GenBank ………………………………………………………….……………45 Hình 3.13 So sánh trình tự nucleotide gen CP-ORSV phân lập từ mẫu lan Hà Nội, Hà Tây Bắc Giang với trình tự tương ứng GenBank ……………………………………………………………48 Hình 3.14 Cây phát sinh chủng loại xây dựng sở so sánh trình tự nucleotide gen CP- ORSV phân lập từ mẫu lan Hà Nội, Hà Tây Bắc Giang (BG1,BG2) với trình tự tương ứng GenBank…… ………………………………….…………… 50 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 2.1 Các điểm thu mẫu lan nghi nhiễm bệnh virus ………………………… 18 Bảng 2.2 Trình tự mồi sử dụng để nhân gen CP genome CymMV ORSV ……………………………………………………………… ………… 19 Bảng 2.3 Thành phần phản ứng RT-PCR………………………………………… 21 Bảng 2.4 Chu kỳ nhiệt phản ứng RT-PCR………… .21 Bảng 2.5 Thành phần phản ứng gắn gen vào vector …………….…………………23 Bảng 2.6 Thành phần phản ứng Colony – PCR ……………………………………25 Bảng 2.7 Chu kỳ nhiệt phản ứng Colony – PCR ………….……………………….25 Bảng 2.8 Thành phần phản ứng cắt plasmid enzyme BamHI …… …………26 Bảng 3.1 Hệ số tương đồng sai khác trình tự nucleotide gen CP- CymMV phân lập từ mẫu lan Hà Nội, Bắc Giang Thái Nguyên với trình tự tương ứng giới (GenBank) …………………………….… 44 Bảng 3.2 Hệ số tương đồng sai khác trình tự nucleotide gen CP- ORSV phân lập từ mẫu lan Hà Nội, Hà Tây Bắc Giang với trình tự tương ứng GenBank …………………………………………… 49 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn MỞ ĐẦU Lí chọn đề tài Họ lan có tên khoa học Orchidales, lớp thực vật mầm Các họ lan đánh giá loài hoa cao cấp vương quốc thảo mộc, bao gồm 25.000 loài khác nhau, với loài khám phá mô tả theo năm Ngày nghề trồng lan thú vui nghệ thuật, mà đem lại giá trị kinh tế cao Hoa lan ưa chuộng, có thị trường tiêu thụ mạnh nước xuất khẩu, ngồi hoa lan cịn sử dụng làm nguồn hương liệu cho sản xuất nước hoa, nguyên liệu để điều chế keo, chất thuộc da đặc biệt số loài biết đến nguồn dược liệu có giá trị Đối với nhà vườn lan, việc khó khăn nguy hại gây hại nghiêm trọng tác nhân gây bệnh cho lan, gồm có trùng, nấm, vi khuẩn, virus Trong đó, mức độ tác hại virus gây nghiêm trọng khó phát sớm giai đoạn đầu mức độ lây lan cao Mặt khác, bệnh virus gây đến chưa có thuốc đặc trị, gây tổn thất lớn mặt kinh tế người trồng lan, đặc biệt lĩnh vực lan cắt cành Biện pháp việc quản lý bệnh phòng bệnh Vị vậy, việc phát sớm xác bệnh virus để ngăn ngừa kiểm soát virus gây nhiễm vấn đề then chốt đặt cho nhà nông nhà nghiên cứu nuôi trồng lan Hiện nay, nhờ ứng dụng tiến kỹ thuật di truyền, tạo chuyển gen kháng lại virus coi biện pháp hữu hiệu để ngăn chặn hạn chế tác hại virus gây Người ta tạo giống trồng có khả kháng lại bệnh virus gây cách đưa gen mã hóa protin vỏ (coat protein gene) virus vào genome thực vật Vấn đề đặt giống chuyển gen tạo cách sử dụng vật liệu di truyền từ virus gây bệnh (gen CP, gen mã hóa replicase ) kháng lại dòng virus gây bệnh có gen sử dụng để tạo chuyển gen dịng virus có quan hệ di truyền gần gũi Hay nói cách khác, tính kháng trồng chuyển gen nói chung số lồi lan nói riêng có hiệu chủng virus Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn vùng định mà không kháng với chủng virus từ vùng khác Chính mà cần phải tách dịng gen mã hóa protein vỏ (coat protein - CP) từ virus gây bệnh vùng có khả tạo kháng bệnh Xuất phát từ thực tế trên, chọn đề tài nghiên cứu “Phân lập gen mã hóa protein vỏ loại virus gây bệnh hoa lan CymMV ORSV” Việt Nam nhằm tách dòng gen CP (coat protein gene) mã hóa protein vỏ virus CymMV ORSV hai loại virus gây hại nhiều lồi lan khác nhau, làm nguyên liệu phục vụ cho công tác nghiên cứu tạo hoa lan chuyển gen kháng loại virus Việt Nam Mục tiêu nghiên cứu - Tách dịng xác định trình tự nucleotide gen CP (coat protein gene) loại virus CymMV ORSV gây bệnh hoa lan số tỉnh thành Việt Nam, làm nguyên liệu phục vụ chuyển gen tạo hoa lan kháng loại virus - Đánh giá đa dạng di truyền mức độ phân tử loại virus CymMV ORSV từ mẫu lan nhiễm virus thu địa phương thơng qua so sánh trình tự nucleotide gen CP, làm sở khoa học để lựa chọn trình tự bảo thủ thiết kế vector chuyển gen kháng loại virus CymMV ORSV phổ rộng Nội dung nghiên cứu - Thu thập mẫu lan nghi ngờ nhiễm bệnh từ số địa phương khác - Tách dịng xác định trình tự nucleotide gen CP-CymMV CP-ORSV - So sánh trình tự nucleotit gen CP-CymMV, CP-ORSV số tỉnh Việt Nam trình tự Thế giới công bố GenBank để đánh giá độ tương đồng mặt di truyền chủng virus gây bệnh lan Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Chƣơng TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu khái quát Lan 1.1.1 Đặc điểm chung họ Lan (Orchidaceae) Họ lan có tên khoa học Orchidaceae, thuộc Orchidales, lớp thực vật mầm Họ lan đánh giá loài hoa cao cấp vương quốc thảo mộc, bao gồm 25.000 loài khác nhau, với lồi khám phá mơ tả theo năm Chúng phân bố rộng khắp giới từ 680 vĩ độ Bắc đến 560 vĩ độ Nam, tập trung chủ yếu khu vực nhiệt đới Châu Á Châu Mỹ Các loài lan chủ yếu mọc cao, sống biểu sinh lâu năm gọi chung Phong lan, loài mọc đất gọi Địa lan, số loài mọc đá gọi Thạch lan Loài lan biết Phương Đông, từ đời vua Thần nông (2800 năm trước công nguyên) dùng làm thuốc chữa bệnh [27] 1.1.2 Đặc điểm hình thái lan - Rễ lan: Lan họ sống phụ (bì sinh) bám, treo lơ lửng thân gỗ khác Các dạng thân gỗ nạc dài, ngắn, mập hay mảnh mai đưa thể bò xa hay chụm lại thành bụi dày Rễ làm nhiệm vụ hấp thu chất dinh dưỡng, chúng bao lớp mô hút dày, ẩm bao gồm lớp tế bào chết chứa đầy khơng khí, ánh lên màu xám bạc Với lớp mơ xốp, rễ có khả hấp thu nước mưa chảy dọc dài vỏ cây, lấy nước lơ lửng khơng khí [27] - Thân lan: Thân ngắn dài, mang không xếp thành nhóm: nhóm đơn thân thường tăng trưởng theo chiều cao nhóm đa thân thường khơng tăng trưởng liên tục mà sau mùa tăng trưởng có thời gian để nghỉ ngơi, nhóm thứ ba nhóm trung gian nhóm trên, thân chúng thường biến động từ 0,1m – 4m Ở lồi lan sống phụ có nhiều đoạn phình lớn thành củ giả (giả hành) Đó phận dự trữ nước chất dinh dưỡng để nuôi điều kiện khô hạn sống bám cao Củ giả đa dạng: Hình cầu hình thn dài xếp sát hay rải rác đặn hình trụ xếp chồng chất lên thành thân giả Cấu tạo củ giả: Gồm nhiều mơ mềm chứa đầy dịch Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 43 AB541563-Korea AB541571-Korea AF405726-Singapore AJ698947-India AB197937-Japan EF125180-Haiwai C T C T T C C G C T C T Hình 3.11 So sánh trình tự nucleotide gen CP-CymMV phân lập tư mẫu lan Hà Nội, Bắc Giang Thái Nguyên với trình tự tương ứng GenBank Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 44 Bảng 3.1 Hệ số tương đồng sai khác trình tự nucleotide gen CP- CymMV phân lập từ mẫu lan Hà Nội, Bắc Giang Thái Nguyên với trình tự tương Hệ số sai khác ứng GenBank Hệ số tƣơng đồng (AB197937): Nhật Bản; (AB541560, AB541563, AB541571): Hàn Quốc; (AF405726): Singapore; (AJ698947): Ấn Độ; (AY429021): Đài Loan; (EF413032): Trung Quốc; (EF125180): Hawai; CymMV-Hà Nội1; CymMV-Bắc Giang1; CymMV-Thái Nguyên1 Tỷ lệ phần trăm tương đồng cặp so sánh chương trình phần mềm MEGA thống kê dạng ma trận tam giác (bảng 3.1) cho thấy đoạn gen CP có mức độ tương đồng từ 95.8% (CymMV-Bac Giang1 so với EF125180Haiwai) đến 99,4% (AB197937-Japan so với AB541560-Korea) Hệ số tương đồng mẫu Hà Nôi, Bắc Giang Thái Nguyên 96,4% - 99% (Hà Nội1 so với Bắc Giang1 96,7%; Hà Nội1 so với Thái Nguyên1 96,4%; Bắc Giang1 so với Thái Nguyên1 99%) Cây phát sinh chủng loại xây dựng theo phương pháp Bootstrap phần mềm MEGA4 sử dụng kết so sánh ClustalW trình tự nucleotide gen CPCymMV phân lập từ mẫu lan tỉnh Hà Nội, Bắc Giang, Thái Nguyên với 10 trình tự tương ứng đại diện cho dịng CP-CymMV khác giới (hình 3.12) Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 45 AB197937-Japan AB541571-Korea 35 AB541560-Korea EF125180-Haiwai 25 AB541563-Korea 42 AF405726-Singapore 72 AJ698947-India AY429021-Taiwan 97 CymMV-Ha Noi1 EF413032- China CymMV-Bac Giang 99 CymMV-Thai Nguyen1 Hình 3.12 Cây phát sinh chủng loại xây dựng sở so sánh trình tự nucleotide gen CP- CymMV phân lập từ mẫu lan Hà Nội, Bắc Giang Thái Nguyên với trình giới công bố GenBank Cây phát sinh chủng loại chia làm nhánh chính: Nhánh gồm hai mẫu Việt Nam (CymMV-Bac Giang CymMV-Thai Nguyen 1); nhánh gồm 10 mẫu lại chia làm nhánh phụ Nhánh phụ mẫu Trung Quốc (EF413032-China) nhánh phụ gồm mẫu nước Nhật Bản, Hàn Quốc, Haiwai, Singapore, Ấn Độ, Đài Loan Hà Nội – Việt Nam (Mẫu Hà Nội1 thuộc nhóm với mẫu Đài Loan) Kết cho thấy trình tự gen CP virus CymMV đa dạng Như trình bày sau so sánh trình tự gen CP-CymMV, hệ số tương đồng gen CP phân lập hoa lan Việt Nam 96,4% 99%, phát sinh chủng loại mẫu xếp chung vào nhóm (mẫu Bắc Giang Thái Nguyên; Hà Nội Đài Loan) độc lập với dòng gen Hàn Quốc, Nhật Bản, Hawaii, Singapore, Ấn Độ Sơ nhận định dòng virus có quan hệ di truyền gần gũi Tuy nhiên, cần phải phân lập gen CP từ mẫu bệnh thu nhiều tỉnh thành khác để khẳng định phương án tạo hoa lan chuyển gen kháng CymMV cho Việt Nam phải bắt đầu việc phân lập gen Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 46 CymMV từ hoa lan bệnh Việt Nam cách tiếp cận cần thiết đắn Nếu dùng nguồn gen CP quốc gia khác khơng thành cơng 3.5 So sánh trình tự gen CP-ORSV phân lập đƣợc từ mẫu lan Hà Nội, Hà Tây (cũ) Bắc Giang với trình tự GenBank Để có số liệu so sánh, chúng tơi lấy trình tự gen CP-ORSV đại diện cho số nước công bố GenBank, trình tự có mã số: (AB541519): Hàn Quốc; (AF406775): Đài Loan; (AJ429091): Đức; (AY360407): Trung Quốc; (EU653020): Trung Quốc; (EU683879): Hàn Quốc (X55295): Nhật Bản Các trình tự so sánh với trình tự gen CP-ORSV phân lập Việt Nam (CP-ORSV-HN1, CP-ORSV-Hà Tây2, CP-ORSV-Bắc Giang1 CP-ORSV-Bắc Giang2) phần mềm BioEdit Kết thu hình 3.13 Kết so sánh trình tự gen CP-ORSV-Hà Nội1 với trình tự gen CP-ORSVHà Tây2 khác điểm (vị trí 31 T thay C vị trí 477 G thay A); gen CP-ORSV-HN1 với trình tự gen CP-ORSV-Bắc Giang1 sai khác điểm (vị trí 31 T thay C, vị trí 291T thay C vị trí 477 G thay A); CP-ORSV-HN1 với trình tự gen CP-ORSV-Bắc Giang2 sai khác điểm (vị trí 72 A thay G, vị trí 441T thay C, vị trí 450 G thay A vị trí 477 G thay A) So sánh trình tự gen CP-ORSV-Hà Tây2 với trình tự gen CP-ORSV-Bắc Giang1 sai khác nucleotide vị trí 291 T thay C CPORSV-Hà Tây2 với trình tự gen CP-ORSV-Bắc Giang2 sai khác nucleotide (tại vị trí 31 C thay T, vị trí 72 A thay G, vị trí 441T thay C vị trí 450 G thay A) So sánh trình tự gen CP-ORSV-Bắc Giang1 với trình tự gen CP-ORSV-Bắc Giang2 sai khác nucleotide (tại vị trí 31 C thay T, vị trí 72 A thay G, vị trí 291 C thay T, vị trí 441 T thay C vị trí 450 G thay A) Kết cho thấy, trình tự gen CP virus ORSV địa phương Hà Nội, Hà Tây (cũ) Bắc Giang có mức độ tương đồng cao So sánh trình tự gen CP- ORSV phân lập Việt Nam với trình tự gen tương ứng giới cho thấy có mức độ tương đồng cao, nhiều đoạn trình tự gen CP ORSV Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 47 bảo thủ (từ vị trí nucleotide 75 – 290 có 10 trình tự giống 100% 11 trình tự so sánh) Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 48 ORSV-Ha Noi1 ORSV-Ha Tay2 ORSV-Bac Giang1 ORSV-Bac Giang2 AB541519-Korea EU683879-Korea EU653020-China AY360407-China AF406775-Taiwan X55295-Japan AJ429091-Germany 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | ATGTCTTACACTATTACAGACCCGTCTAAGTTGGCTTATTTAAGCTCGGCTTGGGCTGACCCCAATTCACTAATCAACCTTTGTACCAATTCTCTGGGTA C C .G C C C C C C G C ORSV-Ha Noi1 ORSV-Ha Tay2 ORSV-Bac Giang1 ORSV-Bac Giang2 AB541519-Korea EU683879-Korea EU653020-China AY360407-China AF406775-Taiwan X55295-Japan AJ429091-Germany 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | ATCAGTTCCAAACACAACAAGCTCGAACAACTGTTCAACAGCAGTTTGCTGATGTTTGGCAGCCGGTTCCTACTTTGACCAGTAGGTTCCCTGCAGGCGC C .C .C.C ORSV-Ha Noi1 ORSV-Ha Tay2 ORSV-Bac Giang1 ORSV-Bac Giang2 AB541519-Korea EU683879-Korea EU653020-China 210 220 230 240 250 260 270 280 290 300 | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | TGGTTACTTCAGAGTTTATCGCTATGATCCTATATTAGATCCTTTAATAACTTTCTTAATGGGTACTTTTGATACTCGTAATAGAATAATTGAGGTAGAA C C C C Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 49 AY360407-China AF406775-Taiwan X55295-Japan AJ429091-Germany C C C CC.C C T C G C .C ORSV-Ha Noi1 ORSV-Ha Tay2 ORSV-Bac Giang1 ORSV-Bac Giang2 AB541519-Korea EU683879-Korea EU653020-China AY360407-China AF406775-Taiwan X55295-Japan AJ429091-Germany 310 320 330 340 350 360 370 380 390 400 | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | AATCCGCAGAATCCGACAACTACGGAAACATTAGATGCAACTCGTAGAGTTGATGATGCAACTGTAGCAATAAGATCTGCAATAAATAATCTATTAAATG .C C ORSV-Ha Noi1 ORSV-Ha Tay2 ORSV-Bac Giang1 ORSV-Bac Giang2 AB541519-Korea EU683879-Korea EU653020-China AY360407-China AF406775-Taiwan X55295-Japan AJ429091-Germany 410 420 430 440 450 460 470 | | | | | | | | | | | | | | | AGTTAGTTAGGGGAACTGGTATGTACAATCAAGTCTCATTTGAGACGATGTCTGGACTTACTTGGACCTCTTCCTAG A A C A A C A A A A A A A T A Hình 3.13 So sánh trình tự nucleotide gen CP-ORSV phân lập từ mẫu lan Hà Nội, Hà Tây Bắc Giang với trình tự tương ứng GenBank Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 50 Bảng 3.2 Hệ số tương đồng sai khác trình tự nucleotide gen CP- ORSV phân lập từ mẫu lan Hà Nội, Hà Tây Bắc Giang với trình tự tương ứng GenBank Hệ số sai khác Hệ số tƣơng đồng (AB541519): Hàn Quốc; (AF406775): Đài Loan; (AJ429091): Đức; (AY360407): Trung Quốc1; (EU653020): Trung Quốc; (EU683879): Hàn Quốc; ORSV-Bắc Giang1; ORSVBắc Giang2; ORSV-Hà Nội 1; ORSV-Hà Tây 2; (X55295): Nhật Bản Tỷ lệ phần trăm tương đồng cặp so sánh chương trình phần mềm MEGA thống kê dạng ma trận tam giác (bảng 3.2) cho thấy đoạn gen CP có mức độ tương đồng cao từ 96,2% (ORSV-Bac Giang2 so với AJ429091Germany) đến 100% Hệ số tương đồng mẫu Hà Nội, Hà Tây Bắc Giang từ 99% đến 99,8% (Bắc Giang1 so với Bắc Giang2 99%; Bắc Giang1 so với Hà Nội1 99,4%; Bắc Giang1 so với Hà Tây2 99,8%; Bắc Giang2 so với Hà Nội1 99,2%; Bắc Giang2 so với Hà Tây2 99,2%; Hà Nội1 so với Hà Tây2 99,6%) Cây phát sinh chủng loại xây dựng theo phương pháp Bootstrap phần mềm MEGA4 sử dụng kết so sánh ClustalW trình tự nucleotide gen CPORSV phân lập từ mẫu lan tỉnh Hà Nội, Hà Tây (cũ) Bắc Giang với trình tự tương ứng đại diện cho dòng CP-ORSV khác giới (hình 3.14) Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 51 51 X55295-Japan ORSV-Bac Giang2 16 ORSV-Ha Noi1 28 ORSV-Ha Tay2 EU653020-China AB541519-Korea AF406775-Taiwan AY360407-China EU683879-Korea ORSV-Bac Giang1 AJ429091-Germany Hình 3.14 Cây phát sinh chủng loại xây dựng sở so sánh trình tự nucleotide gen CP- ORSV phân lập từ mẫu lan Hà Nội, Hà Tây Bắc Giang (BG1,BG2) với trình tự tương ứng GenBank Cây phát sinh chủng loại chia làm nhánh chính: Nhánh có mẫu Đức (AJ429091-Germany) khác lớn so với mẫu đem so sánh; nhánh gồm 10 mẫu lại Ở nhánh 2, hai mẫu ORSV-Hà Nội1 ORSV-Hà Tây2 nằm nhóm; ORSV-Bắc Giang2 X55295-Japan nằm nhóm Mẫu ORSV-Bắc Giang nằm nhóm với mẫu Đài Loan, Trung Quốc Hàn Quốc Như vậy, hệ số tương đồng gen CP-ORSV phân lập từ mẫu lan Việt Nam cao từ 99% đến 99,8% So sánh trình tự gen CP-ORSV phân lập Việt Nam với trình tự gen tương ứng giới cho thấy có mức độ tương đồng cao, nhiều đoạn trình tự gen CP ORSV bảo thủ (từ vị trí nucleotide 75 – 290 có 10 trình tự giống 100% 11 trình tự so sánh) Có thể sử dụng gen CP với trình tự bảo thủ cho mục đích thiết kế vector chuyển gen đa đoạn, mở rộng phổ kháng ORSV nhiều chủng khác Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 52 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN Từ mẫu lan nghi ngờ bị nhiễm CymMV ORSV thu Hà Nội, Hà Tây (cũ), Bắc Giang Thái Nguyên tách chiết thành công RNA tổng số với chất lượng tốt, RNA tổng số tinh sạch, không bị phân cắt có nồng độ cao đáp ứng cho thí nghiệm tách dịng gen Phân lập trình tự gen CP (coat protein gene) CymMV có chiều dài 672 nucleotides mã hóa cho protein vỏ có trọng lượng phân tử 24 KDa trình tự gen CP có chiều dài 477 nucleotides mã hóa cho protein vỏ có trọng lượng phân tử 18 KDa ORSV Trình tự gen CP CymMV Hà Nội, Bắc Giang Thái Nguyên có mức độ tương đồng cao 96,4 -99% So sánh trình tự gen CP-CymMV Việt Nam với với giới cho thấy trình tự gen CP CymMV đa dạng Trình tự gen CP ORSV Hà Nội, Hà Tây Bắc Giang có mức độ tương đồng cao 99% – 99,8% So sánh trình tự gen CP -ORSV Việt Nam với giới có mức độ tương đồng cao 96,2% - 100% Trình tự gen CP ORSV có nhiều đoạn nucleotide bảo thủ (từ vị trí nucleotide 75 – 290 có 10 trình tự giống 100% 11 trình tự so sánh) Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 53 KIẾN NGHỊ Tiếp tục nghiên cứu phân lập xác định trình tự gen CP –CymMV CPORSV gây bệnh hoa lan nhiều địa phương khác Việt Nam Từ trình tự gen CP –CymMV CP-ORSV lựa chọn đoạn nucleotide đặc hiệu làm nguyên liệu chuyển gen tạo giống hoa lan kháng phổ rộng hai loại virus Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 53 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt Hồ Huỳnh Thùy Dương 2002, Sinh học phân tử NXB Giáo Dục Phan Trọng Hồng, Nơng Văn Hải, Lê Trần Bình, Chu Hồng Hà, 2005, Sử dụng enzym XcmI để thiết kế vector pBT phục vụ tách dịng đọc trình tự gen, Tạp chí Cơng nghệ sinh học 3: 459-463 Roger Shivas, Dean Beasley, John Thomas TS Andrew Geering, Ian Riley, 2005, Phương pháp quản lý mẫu bệnh thực vật Commonwealth, Australia Lê Trần Bình, Phan Văn Chi, Nơng Văn Hải, Trương Nam Hải, Lê Quang Huấn, 2003 Áp dụng kỹ thuật sinh học phân tử nghiên cứu tài nguyên sinh vật Việt Nam Nhà xuất khoa học kỹ thuật, Hà Nội Nguyễn Như Hiền, 2007 Sinh học tế bào Nhà xuất Giáo dục Võ Thị Thương Lan, 2007 Sinh học Phân tử tế bào ứng dụng Nhà xuất Giáo dục Lê trần Bình, 2008 Phát triển trồng chuyển gen Việt Nam Nhà xuất Khoa học tự nhiên công nghệ Tài liệu tiếng nước Marais F., 2002 Virus Diseases Orchid Society of Northern Transvaal Http://www.ont.co.za/virus_diseases.htm Moran J and Knoxfield, 1999 Virus diseases of orchids Http://www.dpi.vic.gov.au/DPI/nreninf.nsf/childdocs 10 Wong S M, Mahtani P H., Lee K C., Yu H H., Tan Y., Neo K K., chan Y., Wu M., and Chng C G., 1997 Cymbidium mosaic potexvirus RNA: complete nucleotide sequence and phylogenetic analysis Archives of Virology 142, p 383-391 11 Cheng C G., Wong S M., Mahtani P H., Loh C S., Goh C., Kao M C., Chung M C and Watanabe Y The complete sequence of a Singapore isolate of odonto Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 54 glossum ringspot virus and comparison with other tobamoviruses Gene, 171, p 155-161 12 McMillan, JR, RT and Vendrame WA., 2005 Color break in orchid flowers Proc Fla State Hort Soc, 118, p 287-288 13 Ryu K.H and Park W.M., 1995 The complete nucleotide sequence and genome organization of Odontoglossum ringspot tobamovirus RNA Arch Virol, 140, p 1577-1587 14 Tiiu Kull, Joseph Arditti, Sek Man Wong, 2005 Orchid Biology 15 K Yamane, K Oyama, E Iuchi, H Ogawa, T Suzuki and T Natsuaki, 2008 RT-PCR Detection of Odontoglossum ringspot virus, Cymbidium mosaic virus and Tospoviruses and Association of Infections with Leaf-Yellowing Symptoms in Phalaenopsis Journal of Phytopathology Volume 156 Issue 5, Pages 268 – 273 16 A.R Sherpa1, V Hallan1, R Ram1, S.P Vij2, P Pathak2, I.D Garg3 and A.A.Zaidi1, 2003 The first report of Cymbidium mosaic virus (CymMV) in orchids from India 17 J S Hu, S Ferreira, M Wang and M Q Xu, 1993 Detection of Cymbidium Mosaic Potexvirus, Odontoglossum Ringspot virus, Tomato spotted wilt virus, and potyviruses infecting orchids in Hawaii Plant Disease / Vol 77 No 5, p.464-468 18 Murphy Fa, Fauquet CM, Bishop DHl, Ghabrial Sa, Jarvis AW, Martelli GP, Mayo MA, Summers MD, 1995, Virus Taxonomy Sixth report of the International Committee on Taxanomy of Viruses, 316-318 Vienna & New York: SpringerVerlag 19 Sambrook J, Russel D (2001), Cold Spring harbor laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY Molecular Cloning: a Laboratory manual, 3rd end 20 M Navalinskienë, J Raugalas, M Samuitienë Viral diseases of flower plants Identification of viruses affecting orchids (Cymbidium Sw.) BIOLOGIJA 2005 Nr P 29–34 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 55 21 S Tanaka, H Nishii, S Ito, and M Kameya-Iwaki, and P Sommartya, 1997 Detection of Cymbidium Mosaic Potexvirus and Odontoglossum Ringspot Tobamovirus from Thai Orchids by Rapid Immunofilter Paper Assay Plant Disease / Vol 81 No 2, p.167-170 22 Hull, R 2002 Matthews’ Plant Virology Academic Press, London, UK 23 Zettler FW, Ko NJ, Wisler GC, Chang CG, Elliot MS, Wong SM, 1990 Viruses of orchids and their control Plant Disease 74, 621-626 24 Seoh ML, Wong SM, Zhang L, 1998 Simultaneous TD/RT-PCR detection of Cymbidium mosaic potexvirus and Odontoglossum ringspot tobamovirus with a single pair of primers Journal of Virological Methods 72, 197-204 25 Chen Chang, Ying-Chun Chen (2005) Transgenic resistance to Cymbidium mosaic virus in Dendrobium expressing the viral capsid protein gene Transgenic Research, 14, 41–46 26 Rob Goldbach, Etienne Bucher, Marcel Prins (2003) Resistance mechanisms to plant viruses: an overview Virus Research, 92, 207-212 Các trang web: 27 http://www.hoalanvietnam.org/www.agdia.com 28 http://www.vaas.org.vn 29 http://www.baovecaytrong.com/kythuatcaytrongchitiet.php?Id=118&caytrongkyt huat=hoa%20lan 30 http://www.hcmbiotech.com.vn 31 http://www.hcmbiotech.com.vn/technology_detail.php?cateid=3&id=91 32 http://www.khuyennongtphcm.com/index.php?mnu=3&s=600007&id=87 33 http://www.caycanhthanglong.com/vietnam/news_printview.php?ID=1469 34 http://agriviet.com/nd/3727-ky-thuat-trong-lan/ 35 http://sokhoahoccn.angiang.gov.vn/xem.asp 36 http://www.rauhoaquavietnam.vn/ 37 - http://www.chonongnghiep.com/forum.aspx?g=posts&t=218 38 - http://irv.moi.gov.vn/News/PrintView.aspx?ID=15137 39 - http://www.ionopsis.com/pests/virus_spots.jpg Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 56 40 - http://i163.photobucket.com/albums/t292/donggia/Diseases/Vir/ 41 OdontoglossumRingSpotVirusORSV4.jpg 42 - http://www.apsnet.org/education/IllustratedGlossary/PhotosI-M/meristem.jpg Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn ... dịng gen mã hóa protein vỏ (coat protein - CP) từ virus gây bệnh vùng có khả tạo kháng bệnh Xuất phát từ thực tế trên, chọn đề tài nghiên cứu ? ?Phân lập gen mã hóa protein vỏ loại virus gây bệnh hoa. .. DỤC ĐÀO TẠO VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT NGUYỄN THỊ MINH HẰNG “PHÂN LẬP GENE MÃ HÓA PROTEIN VỎ CỦA LOẠI VIRUS KHẢM HOA LAN CymMV ORSV? ?? Chuyên ngành:... protein vỏ loại virus gây bệnh hoa lan CymMV ORSV? ?? Việt Nam nhằm tách dịng gen CP (coat protein gene) mã hóa protein vỏ virus CymMV ORSV hai loại virus gây hại nhiều lồi lan khác nhau, làm nguyên liệu