PHÂN lập GENE mã hóa PROTEIN vỏ của 2 LOẠI VIRUS KHẢM HOA LAN CymMV và ORSV

Họ lan có tên khoa học là Orchidales, lớp thực vật một lá mầm. Các họ lanđược đánh giá là một trong những loài hoa cao cấp trong vương quốc thảo mộc,bao gồm 1. Lí do chọn đề tàihơn 25.000 loài khác nhau, cùng với những loài mới được khám phá vàmô tả theo từng năm.Ngày nay nghề trồng lan không những là thú vui nghệ thuật, mà còn đemlại giá trị kinh tế cao. Hoa lan đang rất được ưa chuộng, hiện đang có thị trườngtiêu thụ mạnh trong nước cũng như xuất khẩu, ngoài ra hoa lan còn được sử dụnglàm nguồn hương liệu cho sản xuất nước hoa, nguyên liệu để điều chế keo, chấtthuộc da...đặc biệt một số loài được biết đến như nguồn dược liệu có giá trị.Đối với các nhà vườn lan, thì việc khó khăn và nguy hại nhất là sự gây hạinghiêm trọng của các tác nhân gây bệnh cho cây lan, gồm có côn trùng, nấm, vikhuẩn, virus. Trong đó, mức độ tác hại do virus gây ra là nghiêm trọng nhất vì khóphát hiện sớm ở giai đoạn đầu và mức độ lây lan cao. Mặt khác, bệnh do virus gâyra đến nay vẫn chưa có thuốc đặc trị, do đó gây tổn thất lớn về mặt kinh tế đối vớingười trồng lan, đặc biệt trong lĩnh vực lan cắt cành. Biện pháp chính trong việcquản lý bệnh này vẫn là phòng bệnh. Vị vậy, việc phát hiện sớm và chính xácbệnh virus để ngăn ngừa và kiểm soát virus gây nhiễm là vấn đề then chốt đặt racho nhà nông cũng như các nhà nghiên cứu nuôi trồng lan.Hiện nay, nhờ những ứng dụng tiến bộ mới trong kỹ thuật di truyền, tạocây chuyển gen kháng lại virus được coi là biện pháp hữu hiệu nhất để ngăn chặnvà hạn chế tác hại do virus gây ra. Người ta đã tạo ra các giống cây trồng có khảnăng kháng lại bệnh do virus gây ra bằng cách đưa gen mã hóa protin vỏ (coatprotein gene) của virus vào genome của thực vật. Vấn đề đặt ra là các giống câychuyển gen được tạo ra bằng cách sử dụng các vật liệu di truyền từ các virus gâybệnh (gen CP, gen mã hóa replicase...) chỉ kháng lại được các dòng virus gây bệnhcó gen được sử dụng để tạo cây chuyển gen hoặc là các dòng virus có quan hệ ditruyền gần gũi. Hay nói một cách khác, tính kháng của cây trồng chuyển gen nóichung và một số loài lan nói riêng chỉ có hiệu quả đối với các chủng virus của mộtvùng nhất định mà không kháng với các chủng virus từ các vùng khác. Chính vìvậy mà cần phải tách dòng gen mã hóa protein vỏ (coat protein - CP) từ chính cácvirus gây bệnh của vùng đó thì mới có khả năng tạo ra cây kháng bệnh.Xuất phát từ thực tế trên, chúng tôi chọn đề tài nghiên cứu “Phân lập genmã hóa protein vỏ của 2 loại virus gây bệnh trên hoa lan CymMV và ORSV” tạiViệt Nam nhằm tách dòng gen CP (coat protein gene) mã hóa protein vỏ của virusCymMV và ORSV là hai loại virus chính gây hại trên nhiều loài lan khác nhau,làm nguyên liệu phục vụ cho công tác nghiên cứu tạo cây hoa lan chuyển genkháng các loại virus này tại Việt Nam.2. Mục tiêu nghiên cứu- Tách dòng và xác định trình tự nucleotide gen CP (coat protein gene) của 2loại virus CymMV và ORSV gây bệnh trên hoa lan tại một số tỉnh thành của ViệtNam, làm nguyên liệu phục vụ chuyển gen tạo cây hoa lan kháng 2 loại virus này.- Đánh giá đa dạng di truyền ở mức độ phân tử của 2 loại virus CymMV vàORSV từ các mẫu lan nhiễm virus thu được ở các địa phương thông qua so sánhtrình tự nucleotide gen CP, làm cơ sở khoa học để lựa chọn trình tự bảo thủ thiếtkế vector chuyển gen kháng 2 loại virus CymMV và ORSV ở phổ rộng.3. Nội dung nghiên cứu- Thu thập mẫu lan nghi ngờ nhiễm bệnh từ một số địa phương khác nhau- Tách dòng và xác định trình tự nucleotide của gen CP-CymMV và CP-ORSV- So sánh các trình tự nucleotit của gen CP-CymMV, CP-ORSV giữa một sốtỉnh của Việt Nam và các trình tự trên Thế giới đã công bố trong GenBank đểđánh giá độ tương đồng về mặt di truyền giữa các chủng virus gây bệnh trên lan.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn BỘ GIÁO DỤC ĐÀO TẠO VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT NGUYỄN THỊ MINH HẰNG “PHÂN LẬP GENE MÃ HÓA PROTEIN VỎ CỦA 2 LOẠI VIRUS KHẢM HOA LAN CymMV và ORSV” LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC Hà Nội, 2010 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn BỘ GIÁO DỤC ĐÀO TẠO VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT NGUYỄN THỊ MINH HẰNG “PHÂN LẬP GENE MÃ HÓA PROTEIN VỎ CỦA 2 LOẠI VIRUS KHẢM HOA LAN CymMV và ORSV” Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã số: 60 42 40 LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC Người hướng dẫn khoa học: PGS. TS. Chu Hoàng Hà Hà Nội, 2010 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn DANH MỤC T Ừ VIẾ T T Ắ T µg microgram µl microlitre µm micrometer bp base pair cDNA Complementary DNA (DNA bổ sung được tổng hợp nhờ enzym phiên mã ngược từ RNA thông tin) cs Cộng sự CymMV Cymbidium mosaic virus CP/ NCP Coat protein/ Nucleocapsid Protein (Protein vỏ) Đ/c Đối chứng DEPC Diethyl pyroCarbonate DNA Deoxyribonucleic acid EDTA Ethylene Diamine Tetra-acetic Acid ELISA Enzyme linked immunsorbent assay (kỹ thuật hấp thụ miễn dịch gắn enzym). g gram ORSV Odontoglossum ringspot virus IPTG Isopropylthio-β-D-galactoside Kb Kilobase LB Luria và Bertani M Nồng độ mol/lit ml mililitre mm milimeter Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn NCBI National Center for Biological Information (Trung tâm Quốc gia về thông tin Sinh học), http://www.ncbi.nlm.nih.gov ng Nanogram nm Nanometer PCR Polymerase Chain Reaction (Phản ứng chuỗi polymerase) PEG Polyethylene glycon RdRp RNA dependent RNA polymerase (RNA polymerase phụ thuộc RNA) RNA Ribonucleic acid RNase Ribonuclease RT- PCR Reverse transcription polymerase chain reaction (phản ứng PCR phiên mã ngược) TAE Tris - Acetate – EDTA Taq Thermus aquaticus v/p vòng/phút X-gal 5-brom-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactosidase Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn DANH MỤC CÁC HÌNH Trang Hình 1.1. Lá lan bị nhiễm virus ………………………………… ………….…… .6 Hình 1.2. Hoa lan bị nhiễm virus ………………………………… .7 Hình 1.3. Triệu chứng khảm vàng trên lá lan Hồ điệp …………………… .8 Hình 1.4. Triệu chứng vệt hoại tử trên hoa lan Cattleya ………………… .8 Hình 1.5. Ảnh chụp dưới kính hiển vi điện tử của CymMV ………….… .…………9 Hình 1.6. Cấu trúc genome của CymMV ………………………… .……………… 9 Hình 1.7. Triệu chứng do ORSV gây ra trên lá và hoa lan ……… .……………….11 Hình 1.8. Hình dạng của ORSV …………………………………….……… 11 Hình 1.9. Cấu trúc genome của ORSV …………………………………………… 12 Hình 2.1. Cấu tạo vector pBT (Phan Trọng Hoàng và cs 2005) ………………… .23 Hình 3.1: Mẫu lá lan nghi ngờ nhiễm virus tại một số địa điểm thu mẫu… .………28 Hình 3.2. RNA tổng số tách chiết từ các mẫu lá lan nghi nhiễm virus (CymMV và ORSV) ……………………………………………………………… .29 Hình 3.3. Kết quả điện di sản phẩm RT-PCR gene CP của CymMV …… 30 Hình 3.4. Kết quả Điện di sản phẩm RT-PCR gen CP của ORSV ……… .31 Hình 3.5. Kết quả biến nạp plasmid tái tổ hợp vào tế bào khả biến E.coli chủng DH5α. …………………………………………………………………….….33 Hình 3.6. Kết quả điện di sản phẩm colony-PCR từ 9 dòng khuẩn lạc mang gen CP-CymMV với cặp mồi pUC18-F/R. ………………………….….……34 Hình 3.7. Kết quả điện di sản phẩm colony-PCR từ 12 dòng khuẩn lạc mang gen CP-ORSV bằng cặp mồi pUC18-F/R.………………………………35 Hình 3.8. Kết quả tách chiết plasmid tái tổ hợp pBT-CP-CymMV Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn (3.8A) và pBT-CP-ORSV (3.8B) …………………………………….…………… 36 Hình 3.9: Kết quả điện di sản phẩm cắt plasmid mang gen CP- CymMV bằng BamHI ………………………………………………………….37 Hình 3.10. Kết quả điện di sản phẩm cắt plasmid mang gen CP - ORSV bằng BamHI……………………………………………………………37 Hình 3.11. So sánh trình tự nucleotide của gen CP-CymMV phân lập tư các mẫu lan của Hà Nội, Bắc Giang và Thái Nguyên với các trình tự tương ứng trên GenBank ………………………………….…………………… 43 Hình 3.12. Cây phát sinh chủng loại xây dựng trên cơ sở so sánh 3 trình tự nucleotide của gen CP- CymMV phân lập từ các mẫu lan của Hà Nội, Bắc Giang và Thái Nguyên với các trình trên thế giới công bố trên GenBank. ………………………………………………………….……………45 Hình 3.13. So sánh trình tự nucleotide của gen CP-ORSV phân lập từ các mẫu lan của Hà Nội, Hà Tây và Bắc Giang với các trình tự tương ứng trên GenBank ……………………………………………………………48 Hình 3.14. Cây phát sinh chủng loại xây dựng trên cơ sở so sánh 4 trình tự nucleotide của gen CP- ORSV phân lập từ các mẫu lan của Hà Nội, Hà Tây và Bắc Giang (BG1,BG2) với các trình tự tương ứng trên GenBank…… ………………………………….…………… 50 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 2.1. Các điểm thu mẫu lan nghi nhiễm bệnh virus ………………………… 18 Bảng 2.2. Trình tự mồi sử dụng để nhân gen CP trong genome CymMV và ORSV ……………………………………………………………… ………… 19 Bảng 2.3. Thành phần phản ứng RT-PCR………………………………………… 21 Bảng 2.4. Chu kỳ nhiệt phản ứng RT-PCR………… .21 Bảng 2.5. Thành phần phản ứng gắn gen vào vector …………….…………………23 Bảng 2.6. Thành phần phản ứng Colony – PCR ……………………………………25 Bảng 2.7. Chu kỳ nhiệt phản ứng Colony – PCR ………….……………………….25 Bảng 2.8. Thành phần phản ứng cắt plasmid bằng enzyme BamHI …… …………26 Bảng 3.1. Hệ số tương đồng và sai khác giữa trình tự nucleotide của gen CP- CymMV phân lập từ các mẫu lan của Hà Nội, Bắc Giang và Thái Nguyên với các trình tự tương ứng trên thế giới (GenBank) …………………………….… 44 Bảng 3.2. Hệ số tương đồng và sai khác giữa trình tự nucleotide của gen CP- ORSV phân lập từ các mẫu lan của Hà Nội, Hà Tây và Bắc Giang với các trình tự tương ứng trên GenBank …………………………………………… 49 1 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn MỞ ĐẦU 1. Lí do chọn đề tài Họ lan có tên khoa học là Orchidales, lớp thực vật một lá mầm. Các họ lan được đánh giá là một trong những loài hoa cao cấp trong vương quốc thảo mộc, bao gồm hơn 25.000 loài khác nhau, cùng với những loài mới được khám phá và mô tả theo từng năm. Ngày nay nghề trồng lan không những là thú vui nghệ thuật, mà còn đem lại giá trị kinh tế cao. Hoa lan đang rất được ưa chuộng, hiện đang có thị trường tiêu thụ mạnh trong nước cũng như xuất khẩu, ngoài ra hoa lan còn được sử dụng làm nguồn hương liệu cho sản xuất nước hoa, nguyên liệu để điều chế keo, chất thuộc da .đặc biệt một số loài được biết đến như nguồn dược liệu có giá trị. Đối với các nhà vườn lan, thì việc khó khăn và nguy hại nhất là sự gây hại nghiêm trọng của các tác nhân gây bệnh cho cây lan, gồm có côn trùng, nấm, vi khuẩn, virus. Trong đó, mức độ tác hại do virus gây ra là nghiêm trọng nhất vì khó phát hiện sớm ở giai đoạn đầu và mức độ lây lan cao. Mặt khác, bệnh do virus gây ra đến nay vẫn chưa có thuốc đặc trị, do đó gây tổn thất lớn về mặt kinh tế đối với người trồng lan, đặc biệt trong lĩnh vực lan cắt cành. Biện pháp chính trong việc quản lý bệnh này vẫn là phòng bệnh. Vị vậy, việc phát hiện sớm và chính xác bệnh virus để ngăn ngừa và kiểm soát virus gây nhiễm là vấn đề then chốt đặt ra cho nhà nông cũng như các nhà nghiên cứu nuôi trồng lan. Hiện nay, nhờ những ứng dụng tiến bộ mới trong kỹ thuật di truyền, tạo cây chuyển gen kháng lại virus được coi là biện pháp hữu hiệu nhất để ngăn chặn và hạn chế tác hại do virus gây ra. Người ta đã tạo ra các giống cây trồng có khả năng kháng lại bệnh do virus gây ra bằng cách đưa gen mã hóa protin vỏ (coat protein gene) của virus vào genome của thực vật. Vấn đề đặt ra là các giống cây chuyển gen được tạo ra bằng cách sử dụng các vật liệu di truyền từ các virus gây bệnh (gen CP, gen mã hóa replicase .) chỉ kháng lại được các dòng virus gây bệnh có gen được sử dụng để tạo cây chuyển gen hoặc là các dòng virus có quan hệ di truyền gần gũi. Hay nói một cách khác, tính kháng của cây trồng chuyển gen nói chung và một số loài lan nói riêng chỉ có hiệu quả đối với các chủng virus của một 2 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn vùng nhất định mà không kháng với các chủng virus từ các vùng khác. Chính vì vậy mà cần phải tách dòng gen mã hóa protein vỏ (coat protein - CP) từ chính các virus gây bệnh của vùng đó thì mới có khả năng tạo ra cây kháng bệnh. Xuất phát từ thực tế trên, chúng tôi chọn đề tài nghiên cứu “Phân lập gen mã hóa protein vỏ của 2 loại virus gây bệnh trên hoa lan CymMV và ORSV” tại Việt Nam nhằm tách dòng gen CP (coat protein gene) mã hóa protein vỏ của virus CymMV và ORSV là hai loại virus chính gây hại trên nhiều loài lan khác nhau, làm nguyên liệu phục vụ cho công tác nghiên cứu tạo cây hoa lan chuyển gen kháng các loại virus này tại Việt Nam. 2. Mục tiêu nghiên cứu - Tách dòng và xác định trình tự nucleotide gen CP (coat protein gene) của 2 loại virus CymMV và ORSV gây bệnh trên hoa lan tại một số tỉnh thành của Việt Nam, làm nguyên liệu phục vụ chuyển gen tạo cây hoa lan kháng 2 loại virus này. - Đánh giá đa dạng di truyền ở mức độ phân tử của 2 loại virus CymMV và ORSV từ các mẫu lan nhiễm virus thu được ở các địa phương thông qua so sánh trình tự nucleotide gen CP, làm cơ sở khoa học để lựa chọn trình tự bảo thủ thiết kế vector chuyển gen kháng 2 loại virus CymMV và ORSV ở phổ rộng. 3. Nội dung nghiên cứu - Thu thập mẫu lan nghi ngờ nhiễm bệnh từ một số địa phương khác nhau - Tách dòng và xác định trình tự nucleotide của gen CP-CymMV và CP-ORSV - So sánh các trình tự nucleotit của gen CP-CymMV, CP-ORSV giữa một số tỉnh của Việt Nam và các trình tự trên Thế giới đã công bố trong GenBank để đánh giá độ tương đồng về mặt di truyền giữa các chủng virus gây bệnh trên lan. 3 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Giới thiệu khái quát về cây Lan 1.1.1. Đặc điểm chung của họ Lan (Orchidaceae) Họ lan có tên khoa học là Orchidaceae, thuộc bộ Orchidales, lớp thực vật một lá mầm. Họ lan được đánh giá là một trong những loài hoa cao cấp trong vương quốc thảo mộc, bao gồm hơn 25.000 loài khác nhau, cùng với những loài mới được khám phá và mô tả theo từng năm. Chúng được phân bố rộng khắp thế giới từ 68 0 vĩ độ Bắc đến 56 0 vĩ độ Nam, tập trung chủ yếu ở khu vực nhiệt đới Châu Á và Châu Mỹ. Các loài lan chủ yếu mọc trên cây cao, sống biểu sinh lâu năm được gọi chung là Phong lan, các loài mọc trong đất được gọi là Địa lan, và một số loài mọc trên đá được gọi là Thạch lan. Loài lan được biết đầu tiên ở Phương Đông, từ đời vua Thần nông (2800 năm trước công nguyên) được dùng làm thuốc chữa bệnh [27]. 1.1.2. Đặc điểm hình thái của cây lan - Rễ lan: Lan là họ sống phụ (bì sinh) bám, treo lơ lửng trên các cây thân gỗ khác. Các dạng thân gỗ nạc dài, ngắn, mập hay mảnh mai đưa cơ thể bò đi xa hay chụm lại thành các bụi dày. Rễ làm nhiệm vụ hấp thu chất dinh dưỡng, chúng được bao bởi lớp mô hút dày, ẩm bao gồm những lớp tế bào chết chứa đầy không khí, do đó nó ánh lên màu xám bạc. Với lớp mô xốp, rễ có khả năng hấp thu nước mưa chảy dọc dài trên vỏ cây, lấy nước lơ lửng trên không khí [27]. - Thân cây lan: Thân cây có thể ngắn hoặc dài, mang lá hoặc không và được sắp xếp thành 3 nhóm: nhóm đơn thân thường tăng trưởng theo chiều cao và nhóm đa thân thường không tăng trưởng liên tục mà sau mùa tăng trưởng có thời gian để nghỉ ngơi, nhóm thứ ba là nhóm trung gian giữa 2 nhóm trên, thân của chúng thường biến động từ 0,1m – 4m. Ở các loài lan sống phụ có nhiều đoạn phình lớn thành củ giả (giả hành). Đó là bộ phận dự trữ nước và các chất dinh dưỡng để nuôi cây trong điều kiện khô hạn khi sống bám trên cao. Củ giả rất đa dạng: Hình cầu hoặc hình thuôn dài xếp sát nhau hay rải rác đều đặn hoặc hình trụ xếp chồng chất lên nhau thành một thân giả. Cấu tạo củ giả: Gồm nhiều mô mềm chứa đầy dịch . cứu Phân lập gen mã hóa protein vỏ của 2 loại virus gây bệnh trên hoa lan CymMV và ORSV tại Việt Nam nhằm tách dòng gen CP (coat protein gene) mã hóa protein. THỊ MINH HẰNG “PHÂN LẬP GENE MÃ HÓA PROTEIN VỎ CỦA 2 LOẠI VIRUS KHẢM HOA LAN CymMV và ORSV LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC Hà Nội, 20 10 Số hóa bởi Trung tâm