3. Đo OD600nm đạt 0,4- 0,6 thì chuyển dịch nuôi cấy sang ống ly tâm, để 15 phút ở trong đá (hoặc ở 40
C).
4. Ly tâm 4000v/p, ở 40C, trong 15 phút (lặp lại ba lần, để trong đá lần thứ hai 30 phút, lần thứ ba 60 phút).
5. Đổ dịch CaCl2, hòa tan trong 1ml CaCl2/100ml LB ban đầu. 6. Bổ sung 15- 20% glycerol.
7. Chia 50µl dịch tế bào khả biến vào mỗi ống eppendorf 1,5ml. Bảo quản tế bào khả biến trong tủ lạnh -840
C.
- Biến nạp: Sau khi đã gắn DNA vào vector pBT, tiến hành biến nạp vào tế bào
khả biến E.coli DH5α đã được chuẩn bị ở trên, gồm các bước sau:
1. Lấy tế bào khả biến từ tủ -840C đặt vào trong đá từ 15 đến 30 phút. 2. Bổ sung 20 µl hỗn hợp phản ứng lai vào ống đựng tế bào khả biến và trộn nhẹ, hỗn hợp được đặt trong đá 30 phút, sau đó ủ ở 420
C trong 1 phút 30 giây.
3. Đặt vào đá 5 phút.
4. Bổ sung 400 µl LB lỏng vào ống biến nạp và nuôi ở 370C lắc 220 vòng/phút trong 1 giờ.
5. Sử dụng que cấy trải dịch khuẩn lên đĩa môi trường LB đặc có chứa ampicilin nồng độ 100 mg/l, X-gal 40 ml/l và IPTG 100 µmol.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
6. Ủ ở 370C trong 16 giờ.
2.3.8. Phƣơng pháp colony-PCR
Sau khi nuôi khuẩn trên môi trường chọn lọc, những khuẩn lạc trắng của mỗi mẫu được chọn lọc bằng phản ứng colony-PCR với cặp mồi pUC 18-F1 và pUC 18-R1 nằm trên vector để xác định khuẩn lạc có plasmid mang gen mong muốn. Thành phần phản ứng colony-PCR trong Bảng 2.6.
Bảng 2.6. Thành phần phản ứng Colony - PCR STT Thành phần Thể tích (µl) 1 H20 11,7 2 Buffer 10X 2 3 MgCl2 2 4 dNTPs 2 5 CymMV – CP – F/ ORSV – CP – F 0,8 6 CymMV – CP - R/ ORSV – CP – R 0,8
7 Taq DNA polymerase 0,7
8 Khuẩn lạc
Chu kỳ nhiệt độ được tối ưu hóa trong Bảng 2.7:
Bảng 2.7. Chu kỳ nhiệt phản ứng Colony – PCR STT Nhiệt độ (0 C) Thời gian 1 94 3 phút 2 94 1 phút 3 55/ 52 30 giây 4 72 45 giây 5 Từ 1-4 lặp lại 32 chu kỳ 6 72 10 phút
Điện di kiểm tra sản phẩm colony-PCR trên gel Agarose 0,8% để chọn ra các khuẩn lạc mang gen có kích thước như mong muốn. Nuôi các khuẩn lạc này vào 3ml LB lỏng có bổ sung ampicillin 100mg/l để tách plasmid.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
2.3.9. Tách chiết plasmid
Các dòng khuẩn lạc trắng có sản phẩm colony-PCR như mong muốn được chọn lọc và nuôi trong 3 ml LB lỏng có bổ sung ampicillin 100 mg/l để tiến hành tách plasmid theo hướng dẫn bộ Kit Accuprep® Plasmid Extraction Kit (Bioneer). Phương pháp cụ thể như sau:
1. Lấy dịch khuẩn đã nuôi qua đêm cho vào ống eppendorf 2 ml, ly tâm 8000 vòng/phút trong 5 phút.
2. Bổ sung 250 µl đệm RS ly tâm nhanh.
3. Bổ sung 250 µl đệm BL và hoà trộn nhẹ, để ở nhiệt độ phòng 1 phút. 4. Bổ sung 350 µl đệm NE và đảo nhẹ nhàng.
5. Ly tâm 13000 vòng/phút trong 10 phút.
6. Chuyển hỗn hợp dung dịch qua cột tách plasmid, ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút, loại bỏ dịch nổi chảy qua cột. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
7. Thêm 500 µl DE, chờ trong 5 phút, ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút loại bỏ dịch.
8. Bổ sung 700 µl WP và ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút, loại bỏ dịch, ly tâm tiếp 1 phút.
9. Chuyển cột tách plasmid sang ống eppendorf mới, bổ sung 40 µl đệm EL cho vào giữa cột, chờ trong 2-3 phút, và ly tâm 13000 vòng/phút trong 1 phút.
Để khẳng định lại các plasmid này có chứa đoạn gen như dự tính, plasmid này được cắt kiểm tra bằng enzym cắt hạn chế BamHI.
2.3.10. Cắt plasmid bằng enzyme BamHI
Bảng 2.8. Thành phần phản ứng cắt plasmid bằng enzyme BamHI
STT Thành phần Thể tích (µl)
1 H20 3.5
2 Fast Digest Buffer 1
3 Plasmid 5
4 Enzym BamHI 0.5
Sau đó:
Hỗn hợp được cắt ở 370 C trong 2 giờ
Bất hoạt enzym ở 650
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Điện di để kiểm tra.
2.3.11. Xác định trình tự và so sánh trình tự gen thu đƣợc với các trình tự tƣơng ứng trên GenBank
Xác định trình tự nucleotide:
Chọn các mẫu plasmid tái tổ hợp có kích thước như mong muốn để tinh sạch và xác định trình tự trên máy đọc trình tự tự động ABI PRISM® 3100 Avant Gentic Analyzer. Sử dụng các phần mềm DNAstar, BioEdit và MEGA 4 để so sánh các trình tự gen và dựng cây phát sinh chủng loại theo phương pháp tối đa (Maximum Parsimony (MP)) trên cở sở các số liệu thu được qua so sánh các trình tự gen.
Phân tích trình tự nucleotide của các gen thu được:
So sánh các trình tự thu được với các trình tự gen trong BLAST của NCBI để xác nhận gen tách dòng được là đoạn gen quan tâm của CymMV và ORSV. Sau đó so sánh các trình tự của CymMV và ORSV ở các tỉnh thành khác nhau với nhau để đánh giá mức độ tương đồng di truyền giữa các cá thể phân lập ở các tỉnh khác nhau và so sánh với các trình tự tương ứng đã công bố trên Ngân hàng gen thế giới (GenBank).
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Chƣơng 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1. Kết qủa tách chiết RNA tổng số từ các mẫu lá lan bị nhiễm virus
Hình 3.1: Mẫu lá lan nghi ngờ nhiễm virus thu tại một số địa phương
a) Thu mẫu
Chúng tôi tiến hành thu mẫu lan tại một số vườn lan ở các tỉnh Hà Nội, Hà Tây cũ, Bắc Giang và Thái Nguyên. Tại mỗi tỉnh chúng tôi thu 2 mẫu tại 2 địa điểm khác nhau. Mẫu là những lá lan nghi ngờ nhiễm bệnh như trên hình 3.1. Mẫu được thu thập và bảo quản như đã nêu ở mục 2.4.1. Tiếp theo chúng tôi tiến hành tách chiết RNA tổng số của virus từ các mẫu lan thu được để phục vụ cho tách dòng gen quan tâm.
b) Kết quả tách RNA tổng số từ các mẫu lan
Để thực hiện phản ứng RT-PCR, chúng tôi đã tiến hành tách chiết RNA tổng số của virus từ các mẫu lá lan thu được tại 4 tỉnh thuộc khu vực Bắc Bộ nêu trên. Sau khi tách chiết dung dịch RNA tổng số đã được lấy điện di kiểm tra trên gel 1% để kiểm tra chất lượng và hàm lượng RNA trên bản điện di (hình 3.2).
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
(adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Hình 3.2. RNA tổng số tách chiết từ các mẫu lá lan nghi nhiễm virus (CymMV và ORSV)
M: Thang DNA chuẩn 1Kb; Giếng 1, 2, 3, 4 - RNA tổng số tách chiết từ 4 mẫu lan nhiễm virus tương ứng thu thập tại Hà Nội, Hà Tây, Bắc Giang và Thái nguyên.
Kết quả trên hình 3.2 cho thấy: Ở cả 4 giếng từ 1÷4 tương ứng 4 tỉnh Hà Nội, Hà Tây (cũ), Bắc Giang và Thái Nguyên, các mẫu RNA tổng số của các mẫu lan đã được tách chiết thành công, băng vạch RNA tách được rõ ràng và đậm với kích thước tương ứng với các loại RNA khác nhau là 5S, 16S và 28S. Thông qua các mẫu RNA tổng số tách chiết được từ mẫu lá lan, nhận định rằng cũng đã tách chiết được RNA của virus. Như vậy, chất lượng RNA là rất tinh sạch, không bị phân cắt và có nồng độ cao đáp ứng được cho các thí nghiệm tiếp theo.
3.2. Kết quả tách dòng gen CP- CymMV và CP-ORSV 3.2.1. Kết quả tổng hợp cDNA và nhân gen CP
Sau khi tách được RNA tổng số của virus từ lá lan, RNA tổng số được sử dụng để thực hiện phản ứng RT-PCR nhân đoạn gen CP của CymMV (CP- CymMV) và gen CP của ORSV (CP-ORSV) với các cặp mồi đặc hiệu tương ứng. Nếu phản ứng xảy ra đặc hiệu theo lý thuyết sẽ thu được một băng DNA duy nhất xuất hiện trên các bản điện di có kích thước dự kiến khoảng 672 bp (gen CP của CymMV) và 477 bp (gen CP của ORSV).
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
a) Kết quả tổng hợp cDNA và nhân gen CP-CymMV
Hiệu quả của phản ứng RT-PCR có thể giảm do những nguyên nhân như: lượng RNA virus quá ít hoặc quá nhiều, nồng độ mồi quá cao hoặc quá thấp, nhiệt độ bắt cặp mồi, số chu kỳ phản ứng chưa phù hợp,… Vì vậy, trong quá trình thực hiện các phản ứng chúng tôi tiến hành điều chỉnh lượng mẫu, nồng độ mồi, lượng Mg2+, nhiệt độ bắt cặp mồi, thành phần hỗn hợp phản ứng và chu kỳ nhiệt của phản ứng được tối ưu hoá, để đảm bảo cho cho phản ứng RT-PCR xảy ra đặc hiệu và đạt hiệu quả cao nhất (như đã nêu ở 2.4.3). Sản phẩm RT-PCR được điện di kiểm tra trên gel agarose 1% (hình 3.3 và hình 3.4).
Hình 3.3. Kết quả điện di sản phẩm RT-PCR gen CP của CymMV
M: Thang DNA chuẩn 1 Kb; (1) - HN1; (2) - HN2; (3) - HT1; (4) - HT2; (5) – BG1; (6) - BG2; (7) - TN1; (8) - TN2.
Kết quả ở hình 3.3 cho thấy, khi điện di sản phẩm RT-PCR nhân gen CP của CymMV tại các giếng số 1(HN1), 5(BG1) và số 7(TN1) xuất hiện một băng duy nhất, đặc hiệu có kích thước khoảng 672 bp tương đương với kích thước của gen CP-CymMV như dự kiến. Tại các giếng số 2, 3, 4, 6 và 8 tương ứng với các mẫu HN2, HT1, HT2, BG2 và TN2 không lên băng, như vậy các mẫu này có khả năng không bị nhiễm CymMV.
Như vậy, khi thực hiện phản ứng RT-PCR bằng cặp mồi đặc hiệu để nhân gen CP - CymMV với mẫu RNA tách chiết từ các mẫu lan nghi ngờ nhiễm virus của Hà Nội, Bắc Giang và Thái Nguyên, đoạn DNA đã được nhân lên một cách đặc hiệu, chỉ tạo ra một sản phẩm duy nhất, không có các sản phẩm phụ. Đối
M 1 2 3 4 5 6 7 8
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
chiếu với thang DNA chuẩn, chúng tôi thấy kích thước sản phẩm PCR ở khoảng 672 bp. Kích thước này hoàn toàn phù hợp với kích thước gen CP của CymMV. Theo kết quả trên, chúng tôi sơ bộ kết luận đã nhân được gen CP-CymMV từ RNA tổng số của các mẫu lan nhiễm bệnh HN1, BG1 và TN1. Đoạn gen CP của CymMV đã được nhân lên với cặp mồi CymMV-CP-F (mồi xuôi) và CymMV- CP-R (mồi ngược), nhiệt độ gắn mồi là 55oC. Phản ứng RT – PCR được thực hiện với 32 chu kỳ.
Để có kết luận chính xác đó là đoạn gen quan tâm hay không, chúng tôi đã tiến hành tách dòng và đọc trình tự gen CP của CymMV.
b) Kết quả tổng hợp cDNA và nhân gen CP của ORSV
Hình 3.4. Kết quả điện di sản phẩm RT-PCR gen CP của ORSV
M: Thang DNA chuẩn 1 Kb; (1) - HN1; (2) - HN2; (3) - HT1; (4) - HT2; (5) – BG1; (6) - BG2; (7) - TN1; (8) - TN2.
Kết quả thể hiện trên hình 3.4 cho thấy, tại các giếng số 1(HN1), 4(HT2), 5(BG1), 6(BG2) đoạn DNA đã được nhân lên một cách đặc hiệu, có kích thước khoảng 477 bp phù hợp với kích thước đoạn gen CP - ORSV là 477 bp quan tâm. Các giếng 2, 3, 7 và 8 tương ứng với các mẫu HN2, HT1, TN1, TN2 không lên băng chứng tỏ các mẫu này có khả năng không bị nhiễm ORSV.
Như vậy, khi thực hiện phản ứng RT-PCR bằng cặp mồi đặc hiệu để nhân gen CP - ORSV với mẫu RNA tách chiết từ các mẫu lan nghi ngờ nhiễm virus của Hà Nội, Hà Tây, Bắc Giang đoạn DNA đã được nhân lên một cách đặc hiệu, chỉ
M 1 2 3 4 5 6 7 8
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
tạo ra một sản phẩm duy nhất, không có các sản phẩm phụ. Đối chiếu với thang DNA chuẩn, cho thấy kích thước sản phẩm PCR hoàn toàn phù hợp với kích thước gen CP của ORSV như dự tính theo lý thuyết khi thiết kế mồi. Từ kết quả trên, chúng tôi sơ bộ kết luận đã nhân được gen CP-ORSV từ RNA tổng số của các mẫu lan nhiễm bệnh nêu trên. Đoạn gen CP của ORSV đã được nhân lên với cặp mồi ORSV-CP-F (mồi xuôi) và ORSV-CP-R (mồi ngược), nhiệt độ gắn mồi là 52oC. Trong nghiên cứu này các phản ứng RT – PCR được thực hiện với 32 chu kỳ.
Để có kết luận chính xác chúng tôi đã tiến hành tách dòng và đọc trình tự gen CP-ORSV.
Qua các kết quả nhân gen CP -CymMV và CP-ORSV, trong số 8 mẫu lan nghi ngờ nhiễm virus thu được tại 4 tỉnh Hà Nội, Hà Tây (cũ), Bắc Giang và Thái Nguyên (hình 3.3, hình 3.4), có hai mẫu lan thu tại Hà Nội (HN1) và Bắc Giang (BG1) có thể đã bị nhiễm đồng thời hai loại virus này.
3.2.2. Biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến E.coli DH5α
Trước khi tách dòng, sản phẩm PCR có kích thước như mong muốn được điện di kiểm tra để tiến hành làm sạch (thôi gel) để loại bỏ tạp chất giúp cho bước chọn dòng được dễ dàng. Sản phẩm thôi gel được gắn vào vector tách dòng pBT và nhân trong chủng E.coli DH5α.
Quá trình tách dòng được thực hiện bằng cách gắn trực tiếp sản phẩm PCR (gen CP-CymMV và CP-ORSV) vào vector tách dòng pBT do phòng Công nghệ Tế bào thực vật cung cấp. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Sản phẩm ghép nối sau đó được biến nạp vào tế bào khả biến E.coli DH5α bằng phương pháp sốc nhiệt và được cấy trải trên môi trường LB đặc có bổ sung ampicyllin (100mg/l), X-gal (40µg/ml) và chất cảm ứng IPTG (100µmol), đĩa khuẩn được nuôi ở 370C trong 16 giờ. Kết quả chúng tôi thu được cả khuẩn lạc xanh và khuẩn lạc trắng (hình 3.5). Các khuẩn lạc xanh là do trong vector pBT có chứa gen lacZ nếu hoạt động bình thường sẽ tổng hợp enzyme β-galactosidase và enzyme này sẽ chuyển hóa cơ chất X-gal thành hợp chất có màu xanh. Các khuẩn
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
lạc trắng là do gen LacZ đã bị một đoạn DNA xen vào giữa dẫn đến không tổng hợp được enzyme β-galactosidase.
Để kiểm tra các khuẩn lạc trắng chứa plasmid mang đoạn DNA quan tâm, chúng tôi lựa chọn từ mỗi đĩa khuẩn một số khuẩn lạc trắng để thực hiện phản ứng colony-PCR với cặp mồi pUC18-xuôi và pUC18-ngược nằm trên vector pBT.
Hình 3.5. Kết quả biến nạp plasmid tái tổ hợp vào tế bào khả biến E.coli chủng DH5α. Các khuẩn lạc xanh mang plasmid pBT; Các khuẩn lạc trắng mang plasmid tái tổ hợp
3.2.3. Chọn lọc plasmid tái tổ hợp bằng kỹ thuật colony-PCR
Chọn 3 đến 5 khuẩn lạc trắng của mỗi mẫu để chạy phản ứng colony-PCR với cặp mồi pUC18-xuôi và pUC18-ngược để xác định khuẩn lạc có plasmid mang đoạn DNA mong muốn. Ở đây không chạy colony-PCR với cặp mồi CymMV-CP-R và CymMV-CP-F cũng như ORSV-CP-R và ORSV-CP-F đặc hiệu nằm trong đoạn gen CP bởi lý do: khi gắn đoạn gen CP vào vector pBT, có thể còn một lượng lớn đoạn DNA không được gắn vào vector vẫn tồn tại trong hỗn hợp phản ứng. Nên khi cấy trải dịch hỗn hợp lên đĩa thạch vẫn còn một lượng sản phẩm PCR nhất định xung quanh khuẩn lạc, vì vậy dễ chọn nhầm khuẩn lạc dương tính.
Cặp mồi pUC18-F/R nằm trên vector cách nhau khoảng 200 bp nên nếu khuẩn lạc có chứa plasmid mang gen thì sản phẩm PCR sẽ cho một băng kích thước
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
lớn hơn kích thước của gen khoảng 200 bp. Sản phẩm colony-PCR được điện di kiểm tra trên gel agarose 1% (hình 3.6 và hình 3.7).
a) Kết quả colony-PCR các dòng khuẩn lạc mang gen CP-CymMV
Hình 3.6. Kết quả điện di sản phẩm colony-PCR từ 9 dòng khuẩn lạc mang gen CP-CymMV với cặp mồi pUC18-F/R. M: Thang DNA chuẩn 1 Kb; Giếng 1,2,3 - mẫu
HN1; Giếng 4,5,6 - mẫu BG1; Giếng 7,8,9 – mẫu TN1.