Phân lập gen mã hóa laccase từ nấm fusarium oxysporum

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KHOA SINH – MÔI TRƯỜNG ĐỖ TRẦN HƯƠNG DUYÊN PHÂN LẬP GEN MÃ HOÁ LACCASE TỪ NẤM FUSARIUM OXYSPORUM Đà Nẵng – Năm 2019 ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KHOA SINH – MÔI TRƯỜNG ĐỖ TRẦN HƯƠNG DUYÊN PHÂN LẬP GEN MÃ HOÁ LACCASE TỪ NẤM FUSARIUM OXYSPORUM Ngành: Công nghệ Sinh học Người hướng dẫn: TS Nguyễn Đức Huy Đà Nẵng – Năm 2019 LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng Các số liệu, kết nêu nghiên cứu trung thực chưa cơng bố cơng trình khác Các số liệu liên quan trích dẫn có ghi nguồn gốc Tơi xin chịu hồn tồn trách nhiệm kết sản phẩm kế thừa công bố người khác Người cam đoan Đỗ Trần Hương Duyên i LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này, em xin bày tỏ lời biết ơn chân thành đến TS Nguyễn Đức Huy ThS Vũ Đức Hồng tận tình giúp đỡ, tạo điều kiện tốt suốt trình thực hồn thành khóa luận Em xin chân thành cảm ơn Kỹ sư Lê Kim Tuân, người trực tiếp hướng dẫn cho em, tận tình giúp đỡ em q trình nghiên cứu Đồng thời, em vơ biết ơn tất bạn sinh viên, anh chị nhân viên thuộc Bộ môn Công nghệ Vi Sinh Bộ môn Công nghệ Gen, Viện Công nghệ Sinh học, Đại học Huế quan tâm, giúp đỡ bảo tận tình cho em q trình hồn thành khóa luận tốt nghiệp Ngồi ra, em nhận giúp đỡ nhiệt tình thầy giáo Khoa Sinh – Môi trường, Trường Đại học Sư phạm, Đại học Đà Nẵng tạo điều kiện tốt để em thực đề tài, em xin chân thành cảm ơn Cuối cùng, em xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến gia đình, người thân khích lệ, động viên tinh thần cho em suốt thời gian học tập làm việc Trong trình làm việc, bước đầu làm quen với chun mơn mắc nhiều sai sót, em cố gắng tìm tịi học hỏi để ngày trưởng thành Em xin chân thành cảm ơn! Đà Nẵng, ngày 27 tháng năm 2019 Sinh viên Đỗ Trần Hương Duyên ii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT v DANH MỤC CÁC BẢNG vi DANH MỤC CÁC HÌNH vii MỞ ĐẦU 1 Lý chọn đề tài Mục tiêu nghiên cứu Nội dung nghiên cứu Ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài nghiên cứu CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan laccase 1.1.1 Giới thiệu laccase 1.1.2 Cấu tạo laccase 1.1.3 Cơ chế xúc tác laccase 1.1.4 Nguồn thu nhận laccase 1.1.4.1 Laccase từ thực vật 1.1.4.2 Laccase từ vi khuẩn 1.1.4.3 Laccase từ nấm 1.1.4.4 Hệ laccase Fusarium oxysporum 1.1.5 Ứng dụng laccase 1.1.5.1 Ứng dụng công nghiệp giấy 1.1.5.2 Ứng dụng công nghiệp thực phẩm 10 1.1.5.3 Ứng dụng xử lý nước thải môi trường 10 1.1.5.4 Một số ứng dụng khác 11 1.2 Tình hình nghiên cứu laccase 11 1.2.1 Một số nghiên cứu nước 11 1.2.2 Một số nghiên cứu giới 13 CHƯƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19 2.1 Vật liệu nghiên cứu 19 iii 2.2 Phương pháp nghiên cứu 19 2.2.1 Tách RNA tổng số 19 2.2.2 Sinh tổng hợp cDNA 20 2.2.3 Khuếch đại gen lac1 phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu 20 2.2.4 Gắn sản phẩm PCR vào vector tạo dòng 21 2.2.5 Biến nạp vào E coli TOP10 chọn lọc thể biến nạp 21 2.2.6 Giải trình tự gen laccase 22 2.2.7 So sánh đối chiếu với số gen mã hóa laccase từ số chủng vi sinh vật khác 22 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 24 3.1 Tách RNA tổng số từ Fusarium oxysporum 24 3.2 Sinh tổng hợp cDNA gen mã hóa laccase khuếch đại gen mã hóa laccase Primer đặc hiệu 24 3.4 Tạo dòng gen lac1 vector tạo dịng pGEM®T-Easy 25 3.4.1 Phản ứng gắn biến nạp vào E coli TOP10 25 3.4.2 Tách DNA plasmid khuẩn lạc tạo dịng thành cơng kiểm tra phản ứng cắt với enzyme PCR 27 3.5 Giải trình tự gen laccase, so sánh đối chiếu với số gen mã hóa laccase từ số chủng vi sinh vật khác 29 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 34 Kết luận 34 Kiến nghị 34 TÀI LIỆU THAM KHẢO 35 PHỤ LỤC 40 iv DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT 2,4,5-T 2,4,5- trichlorophenoxyacetic acid 2,4-D 2,4-dichlorophenoxyacetic acid ABTS 2,2'-azino-bis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid) Amp Ampicillin bp Base pair CHCl3 Chloroform DDT Dichloro diphenyl trichloroethane DMP 2,6-dimethoxyphenol DNA Deoxyribonucleic acid dNTP 3’-deoxynucleotide-5’-triphosphate DW Nước cất vô trùng EDTA Ethylenediaminetetracetic acid EP Eppendorf EtOH Ethanol HCH Hexacyclohexan kDa Kilodalton Lac Gen lacase LB Lysogeny Broth LiP Lignin peroxidase (ligninase) MnP Manganese peroxidase NCBI National Center for Biotechnology Information PAH Polycyclic aromatic hydrocarbon PCB Polychlorinated biphenyl PCI Phenol: chloroform : isoamylalcohol PCR Polymerase chain reaction TAE Tris-acetate-EDTA TNT 2,4,6-trinitrotoluen Cs cộng v DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng Tên bảng Trang Trình tự mồi dùng để khuếch đại gen lac1 21 vi DANH MỤC CÁC HÌNH Số hiệu hình Tên hình Trang 1.1 Cấu trúc khơng gian bậc ba laccase từ Melanocarpus albomyces 1.2 Trung tâm hoạt động laccase 1.3 Cơ chế xúc tác laccase 1.4 Các kiểu xúc tác laccase 2.1 Vector pGEM®-T Easy 19 3.1 Hình ảnh điện di RNA tổng số từ F oxysporum 24 3.2 Hình ảnh điện di sản phẩm khuếch đại gen lac1 25 3.3 Thể biến nạp môi trường LB rắn có bổ sung Amp, IPTG, X-gal 26 3.4 Hình ảnh điện di sản phẩm PCR khuẩn lạc 27 3.5 Hình ảnh điện di kiểm tra vector tái tổ hợp pGEM®Tlac1 28 3.6 So sánh trình amino acid suy diễn gen lac1 chủng F oxysporum HUIB02 chủng F oxysporum f sp lycopersici 4287, F fujikuroi IMI 58289, F cf proliferatum NRRL 3107, N haematococca mpVI 7713-4, F proliferatum NRRL 31071 31 3.7 Cây phát sinh chủng loài xây dựng dựa tương đồng trình tự amino acid cấu trúc nên enzyme laccase lồi so sánh 32 3.8 Mơ hình cấu trúc không gian chiều Lac1 F oxysporum HUIB02 mô phần mềm Protein Homology/analogy Recognition Engine V 2.0 32 vii MỞ ĐẦU Lý chọn đề tài Sử dụng enzyme sản xuất đời sống vấn đề nhà khoa học trọng từ lâu Ngày nay, việc nghiên cứu để khám phá ứng dụng vai trò enzyme đem lại lợi ích kinh tế lớn, đóng vai trị quan trọng khơng thể sống mà lĩnh vực: chế biến thực phẩm, công nghệ sinh học, bảo vệ môi trường… Hiện nay, người ta biết nhiều loại enzyme khác thực vật, động vật vi sinh vật Số lượng enzyme biết đạt tới số 3000 enzyme Các enzyme, đặc biệt hydrolases oxidoreductases có tác dụng đặc thù xử lý nhiễm cách kết tủa chuyển hóa sản phẩm phân hủy chất thải Enzyme có nhiều triển vọng ứng dụng tương lai Một số enzyme ứng dụng thành công việc xử lý chất thải Tuy nhiên cần có nghiên cứu để tìm enzyme có hoạt độ tốt tối ưu thực tế sử dụng, đặc biệt enzyme có khả phân hủy hợp chất thơm đa vòng laccase Laccase (EC 1.10.3.2, p-diphenol oxidase) enzyme thuộc nhóm enzyme thủy phân lignin polyphenol oxydase, phân tử có chứa nguyên tử đồng (Cu) có khả oxy hóa chất sử dụng phân tử oxy làm chất nhận điện tử Khác với phần lớn enzyme khác, laccase có phổ chất đa dạng, bao gồm diphenol, polyphenol, dẫn xuất phenol, diamine, amine thơm, benzenethiol, PCB, dioxin hợp chất vô iot [24] [27] Trong năm gần đây, laccase ứng dụng nhiều lĩnh vực khác tẩy trắng bột giấy, tẩy màu thuốc nhuộm vải, chế biến thực phẩm thơng qua việc đưa vào quy trình xử lý sinh học Ngồi ra, laccase cịn sử dụng tổng hợp chất hữu cơ, xử lý nguồn nước thải bị ô nhiễm việc loại bỏ hợp chất phenol; xử lý phụ phẩm nông nghiệp để tạo ngun liệu cho q trình khác [24] Laccase thu từ nguồn khác thực vật, vi khuẩn, côn trùng phổ biến nấm mốc [6] [10] Hiện nhiều chủng nấm mốc phát cho thấy khả tổng hợp laccase tốt Ở nấm mốc, enzyme Hình 3.4: Hình ảnh điện di sản phẩm PCR khuẩn lạc M: GeneRuler kb DNA Ladder, từ đến 15: sản phẩm plasmid từ mẫu khuẩn lạc từ đến 15 chọn ngẫu nhiên từ đĩa petri biến nạp Kết cho thấy giếng số 3, 5, 8, 13, 14 sản phẩm PCR có băng với kích thước khoảng kb chứng tỏ khuẩn lạc có mang DNA plasmid tái tổ hợp gen mã hóa laccase Cịn giếng 1, 2, 4, 6, 7, 9, 10, 11, 12, 15 khơng có băng tương ứng vị trí 2kb nên khuẩn lạc khơng có mang DNA plasmid tái tổ hợp 3.4.2 Tách DNA plasmid khuẩn lạc tạo dịng thành cơng kiểm tra phản ứng cắt với enzyme PCR Sau chọn khuẩn lạc mang DNA plasmid tái tổ hợp, khuẩn lạc cấy lên môi trường LB lỏng thể tích 5mL có bổ sung nhân tố chọn lọc kháng sinh Amp nồng độ 50µg/ mL nuôi qua đêm 370C để nhân tăng sinh khối Sau đó, tế bào tách DNA plasmid dung dịch Sol I, Sol II, Sol III, kết tủa DNA ethanol, hòa tan trở lại 30µL nước cất vơ trùng kiểm tra điện di gel agarose 1% mô tả phần phương pháp nghiên cứu Các DNA plasmid tách kiểm tra lại phản ứng cắt với enzyme EcoRI PCR, kết hình 3.5 27 Hình 3.5: Hình ảnh điện di kiểm tra vector tái tổ hợp pGEM®T-lac1 gel agarose 1% M: GeneRuler kb DNA Ladder (Thermo Scientific, Mỹ); 1: vector tái tổ hợp pGEM®T-lac1 tách chiết từ E coli TOP10; 2: sản phẩm PCR gen lac1 DNA khuôn mẫu vector tái tổ hợp pGEM®T-lac1; 3: sản phẩm phản ứng cắt vector tái tổ hợp pGEM®T-lac1 enzyme EcoRI Kết trình bày Hình 3.5 cho thấy vector tái tổ hợp dạng đóng vịng có kích thước khoảng kb, bên cạnh có band với kích thước khác kb Sự sai khác plasmid trạng thái siêu xoắn khác dẫn đến tốc độ dịch chuyển gel khác Phản ứng khuếch đại PCR với cặp mồi lac1 sử dụng DNA vector tái tổ hợp làm khn mẫu cho băng DNA với kích thước xấp xỉ kb Bên cạnh đó, cắt vector tái tổ hợp enzyme cắt hạn chế EcoRI cho băng DNA, băng có kích thước kb tương ứng với kích thước vector pGEM®TEasy, băng có kích thước kb tương ứng gen lac1 băng có kích thước khoảng 4kb lượng plamid cịn dư sau phản ứng cắt hạn chế Do vector pGEM®T-Easy có vị trí nhận biết enzyme cắt hạn chế EcoRI nằm đầu đoạn chèn, sử dụng EcoRI để cắt vector tái tổ hợp cho kết DNA có băng có kích thước khoảng kb Các kết chứng minh gen lac1 tạo dịng thành cơng vào vector pGEM ®T-Easy 28 3.5 Giải trình tự gen laccase, so sánh đối chiếu với số gen mã hóa laccase từ số chủng vi sinh vật khác Trình tự amino acid suy diễn thu từ kết giải trình tự plasmid tái tổ hợp mang gen lac1 tiến hành so sánh với trình tự thu lồi F oxysporum f sp lycopersici 4287: XM_018392548.1, F fujikuroi IMI 58289: XM_023580876.1, F cf proliferatum NRRL 3107: AY008438.1, N haematococca mpVI 77-13-4: XM_003043035.1, F proliferatum NRRL 31071: AY008439.1, từ liệu ngân hàng Genbank cơng cụ Clustal Omega Gen lac1 mã hóa protein có chiều dài 665 amino acid (aa), tỉ lệ tương đồng F oxysporum HUIB02 với loài 89.36%, 87.47%, 69.49%, 87.16%, 98.48% Kết so sánh trình bày Hình 3.6 mpVI MGLYEACRAFILCVATFFSIPLGQHD DSQQ 30 58289 MGFYNVCKSLIAYTATFFSLPLHEHTGGDSEQ 32 3107 31071 HUIB02 MTKLSLTPFCSLSFTILLKLQGSEPLPKMGFYSACKTFIVYTVTFFSLPFHEHIGGDSEQ 60 4287 MGFYSACKTFVVYTVTFFSLPFHEHIGGDSEQ 32 mpVI PIFSFDHN LPDYPKFPAPHGPDTV-KNFTCRYPELENDWVSCASETNRKCWLRNKHTQ 87 58289 PVLSFENDQISQNYPKFPAPNGPDSPDEDFICKYPELGNDWKSCSTPENRHCWLKSSD-G 91 3107 31071 HUIB02 PVLSFENGQISQNYPKFPAPNGPDSPDEDFTCKYPELGNDWKPCSTPENRHCWLKSSD-G 119 4287 PVLSFENGQISQNYPKFPAPNGPDSPDEDFTCKYPELGNDWKPCSTPENRHCWLKSSD-G 91 mpVI KEFNITTNYEIDAPPGVLREYWLVVDNMTINGDGVLNPEGKVFNQTYPGPWIQACWGDTI 147 58289 HNFSIHTDYETMYPPGVLREYWLVVDNKTINGDGIDNPYGKVFNQTYPGPWIKACWGDLI 151 3107 31071 HUIB02 HNFSIHTDYETMYPPGVLREYWLVVDNKTINGDGIDNPYGKVFNQTYPGLWIKACWGDLI 179 4287 HNFSIHTDYETMYPPGVLREYWLVVDNKTINGDGIDSPYGKVFNQTYPGPWIKACWGDLI 151 29 mpVI RVHVTNKLKYNGTTIHWHGLRQFETMEMDGVNGVTQCPIAPNDTFTYEFKALQYGTSWYH 207 58289 RVHVTNKLRYNGTTVHWHGIRQNGTMEMDGVNGVTQCPIAPEDTFTYEFRALQYGSSWYH 211 3107 -IRQNGTMEMDGVNGVTQCPIAPEDTFTYEFRALQYGSSWYH 41 31071 VSIHWHGIRQNGTMEMDGVNGVTQCPIAPEDTFTYEFRALQYGSSWYH 48 HUIB02 RVHVTNKLRYNGTTIHWHGTRQNGTMEMDGVNGVTQCPIAPNDTFTYELRALQYGSSWYH 239 4287 RVHVTNKLRYNGTTIHWHGIRQNGTMEMDGVNGVTQCPIAPNDTFTYEFRALQYGSSWYH 211 ** *****************:******::*****:**** mpVI SHYSLQYADGLAGPITIFGPSSADYDEAKDPILITDWNHRSAFQDWERELTRIPTFPRMN 267 58289 SHYSLQYADGLAGPITIFGPSSAHYDEAKDPILITDWNHRSAFQEWERELTGVPTRPEMN 271 3107 SHYSLQYADGLAGPITIFGPSSAHYDEAKDPILITDWNHRSAFQEWERELTGVPTRPEMN 101 31071 SHYSLQYADGLAGPITIFGPSSAHYDEAKDPILITDWNHRSAFQEWERELTGVPTRPEMN 108 HUIB02 SHYSLQYADGLAGPITIFGPSSAHYDEAKDPILITDWNHRSAFQEWERELTGLPTRPQMN 299 4287 SHYSLQYADGLAGPITIFGPSSAHYDEAKDPILITDWNHRSAFQEWERELTGVPTRPQMN 271 ***********************.********************:****** :** *.** mpVI SILINGVVVGNFAGSFPRERFNMTVTQGKKYLLRVINTSVDTTFVFSIDNHLFEVMSSDF 327 58289 SILMNG IGNFAGSFPRERYNITVTKGKKYLLRIINTSVDTTFLFGIDNHYFEVMSSDF 329 3107 SILMNG IGNFAGSFPRERYNITVTKGKKYLLRIINTSVDTTFVFGIDNHYFEVMSSDF 159 31071 SILMNG IGNFAGSFPRERYNITVTKGKKYLLRIINTSVDTTFVFGIDNHYFEVMSSDF 166 HUIB02 SILMNG IGNFAGSYPRERYNMTVTKGRKYLLRIINTSVDTTFLFSIDNHHFEVMSSDF 357 4287 SILMNG IGNFAGSFPRERYNMTVTKGKKYLLRIINTSVDTTFLFSIDNHHFEVMSSDF 329 ***:** :******:****:*:***:*:*****:*********:*.**** ******** mpVI VPIKPYKVSNVLIGIGQRYHIVLHANPINNITYPKSEDGNYWIRTVPADGCKGFEVGNEP 387 58289 VPIHPYTVDHILVGIGQRYHVVLHAKPRNDTKFPASNNGNYWIRTVAADGCKGFEDGNEP 389 3107 VPIHPYTVDHILVGIGQRYHVVLHAKPRNDTKFPASDNGNYWIRTVAADGCKGFEDGNEP 219 31071 VPIHPYTVDHILVGIGQRYHVVLHAKPRNDTKFPASDNGNYWIRTVAADGCKGFEDGNEP 226 HUIB02 VPIHPYTVDHILVGIGQRYHVVLHANPRNDTKFPASDNGNYWIRTVPADGCKGFEDGNEP 417 4287 VPIHPYTVDHILVGIGQRYHVVLHANPRNDTKFPASDNGNYWIRTVPADGCKGFEDGNEP 389 ***:**.*.::*:*******:****:* *: :* *::******** ******** **** mpVI DERQGILRYNASSTSVPTTWRDPYSLACRDEDYDKLVPIHKWNITQVNLTN WSQNFDI 445 58289 DERQGILRYQPVSTEVPQTWRDNWTKDCTDEKYENLKPILPWSIPTVKLDERDRSKDLEL 449 3107 DERQGILRYQPVSTEVPQTWRDNWTKDCTDEKYENLKPILPWSIPTVKLDERDRSKDLEL 279 31071 DERQGILRYQPVSTEVPQTWRDNWTKDCTDEKYENLKPILPWSIPTVKLDERDRSKDLEL 286 HUIB02 DERQGILRYEPVSTEVPQTWRGPWNKTCSDEKYENLKPVLPWSIPPVELYSRDKSKDLKL 477 4287 DERQGILRYEPVSSEVPQTWRGPWNKTCSDEKYENLKPVLPWSIPPVELYSRDKSKDLKL 449 *********: *:.** *** : * **.*::* *: 30 *.* *:* *:::.: mpVI GLEKVENRPALGNNFSWWSFGDNPLWVDFSKPTITGLNRTDPWPKDYVVVPAENKDGWVY 505 58289 GIEKVKDRPHAGDRFSWWAFGERPLWLDFSNPTITLLEERKEWPDDYVIVPAENRDGWVY 509 3107 GIEKVKDRPHAGDRFSWWAFGERPLWLDFSNPTITLLEERKEWPDDYVIVPAENRDGWVY 339 31071 GIEKVKDRPHAGDRFSWWAFGERPLWLDFSNPTITLLEERKEWPDDYVIVPAENRDGWVY 346 HUIB02 GLQQEKNRPHLGDKFSWWAFGAQPLWLNFSEPTITLLDEKKEWPGDYVIVPAENRGGWVY 537 4287 GLQQEKNRPHLGDKFSWWAFGAQPLWLNFSEPTITLLDEKKEWPGDYVIVPAENRGGWVY 509 *::: ::** *:.****:** ***::**:**** *: ** ***:*****:.**** mpVI LVITAPNTTVAGKKKIFAPVAHPLHLHGHDFALLAQGNDSTRLGK GEVTLKFDNPPRR 563 58289 LVITAPSLDRIGTNKTFRSLAHPLHLHGHDFALLAQGTNSSQINDPNNPVTLKFDNPPRR 569 3107 LVITAPSLDRIGTNKTFRSLAHPLHLHGHDFALLAQGTNSSQINDPNNPVTLKFDNPPRR 399 31071 LVITAPSLDRIGTNKTFRSLAHPLHLHGHDFALLAQGTNSSQINDPNNPVTLKFDNPPRR 406 HUIB02 LVITAPATEELGNNRTFISLAHPLHLHGHDFALLAQGSDSSQIDDPDNPITLKFDNPPRR 597 4287 LVITAPATEELGNNRTFISLAHPLHLHGHDFALLAQGSDSSQIDDPDNPITLKFDNPPRR 569 ****** *.:: * :*****************.:*::: :********** mpVI DVALIPSGGYLVVAFKADNPGSWLFHCHIAWHASSGLALQIMEREEDLKKLMTEKRLRET 623 58289 DVALIPAGGYLIVAFKADNPGSWLFHCHIAWHASSGLALQIMEREEDLRKMMTSEKLKQV 629 3107 DVALIPAGGYLIVAFKADNPGSWLF - 424 31071 DVALIPAGGYLIVAFKADNPGSWLFHCHIAS - 437 HUIB02 DVALIPAGGYLIVAFKADNPGSWLFHCHIAWHASSGLALQIMEREEDLRKMMTPEKLKQV 657 4287 DVALIPAGGYLIVAFKADNPGSWLFHCHIAWHASSGLALQIMEREEDLRKMMTPEKLKQV 629 ******:****:************* mpVI RRICENWDLWYSNPKNHWNASGPFQDDSGV 653 5828 NDGCKKWKDWYGDRNNHWNPVGIFQDDSG- 658 3107 424 31071 437 HUIB02 NEGCKKWKDWYGDRKNHWNPVGIFQDDSGV 687 4287 NDGCKKWKDWYGDRKNHWNPVGIFQDDSGV 659 Hình 3.6: So sánh trình amino acid suy diễn gen lac1 chủng F oxysporum HUIB02 chủng F oxysporum f sp lycopersici 4287, F fujikuroi IMI 58289, F cf proliferatum NRRL 3107, N haematococca mpVI 77-13-4, F proliferatum NRRL 31071.Các vị trí amino acid tương đồng nhận biết ký tự hoa thị phía Các vị trí glycosyl hóa kiểu N đóng khung chữ nhật Mẫu F oxysporum HUIB02 với loài vi sinh vật tái dựng mối quan hệ di truyền phầm mềm MEGA X Mã số trình tự lồi cơng bố Genbank gồm: Fusarium oxysporum f sp lycopersici 4287: XM_018392548.1, Fusarium fujikuroi IMI 58289: XM_023580876.1, Fusarium cf proliferatum NRRL 3107: AY008438.1, Fusarium verticillioides 7600: XM_018900704.1, Nectria haematococca mpVI 77-13-4: XM_003043035.1, Fusarium proliferatum NRRL 31071: AY008439.1 31 Hình 3.7: Cây phát sinh chủng lồi xây dựng dựa tương đồng trình tự amino acid cấu trúc nên enzyme laccase lồi so sánh Phân tích tìm kiếm tín hiệu peptide Lac1 cho thấy có tồn tín hiệu peptide [29], điều cho thấy nhiều khả Lac1 mã hóa enzyme laccase ngoại bào F oxysporum Phân tích khả glycosyl hóa kiểu N cho thấy trình tự Lac1 có 11 vị trí Asn-Xaa-Ser/Thr vị trí có khả liên kết với gốc carbohydrate [4] Hình 3.8: Mơ hình cấu trúc khơng gian chiều Lac1 F oxysporum HUIB02 mô phần mềm Protein Homology/analogy Recognition Engine V 2.0 Mô hình cấu trúc khơng gian Lac1 xây dựng dựa mơ hình cấu trúc enzyme oxi hóa nhân đồng từ T arenaria Cấu trúc phiến β trình bày hình mũi tên dạng lát mỏng; cấu trúc cuộn xoắn α trình bày hình lát mỏng dạng cuộn Kết sử dụng phần mềm phân tích cấu trúc protein tương đồng nhận diện vùng chức cho thấy Lac1 có cấu trúc tương tự enzyme laccase từ Thielavia arenaria với độ tin cậy 100 % Dựa cấu trúc không gian protein TaLcc1 T 32 arenaria (mã số c3ppsD) cấu trúc không gian Lac1 xây dựng trình bày Hình 3.7 Kết cho thấy cấu trúc bậc dự đốn Lac1 có vị trí gập cuộn xoắn α 38 vị trí gập cuộn phiến β 33 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Từ kết thu được, em có kết luận sau: Khuếch đại thành công gen lac1 từ cDNA Fusarium oxysporum HUIB02 Tạo dịng thành cơng gen lac1 vào vector pGEM®T-Easy Chiều dài gen lac1 2064 nucleotide, mã hóa protein có chiều dài 665 aa Phân tích cấu trúc protein Lac1 cho kết protein ngoại bào có trình tự tín hiệu peptide có 11 vị trí glycosyl hóa kiểu N Cấu trúc bậc Lac1 bao gồm chuỗi xoắn α 38 phiến β, cấu trúc không gian Lac1 tương đồng cao với enzyme oxi hóa nhân đồng từ Thielavia arenaria Kiến nghị Trong nghiên cứu này, em tạo dịng thành cơng gen laccase vào vector pGEM®T-Easy Việc tạo dịng bước mở đầu để đến biểu gen tối ưu điều kiện Do đó, em xin kiến nghị: Biểu gen lac1 hệ thống biểu tái tổ hợp tương đồng nấm men Pichia pastoris Khảo sát đặc tính laccase tái tổ hợp ứng dụng số lĩnh vực xử lý thuốc nhuộm công nghiệp Tối ưu biểu gen lac1 nấm men Pichia pastoris 34 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu Tiếng Việt Nguyễn Khởi Nghĩa (2017) Phân lập tuyển chọn số dịng nấm từ gỗ mục có khả loại màu thuốc nhuộm Đồng sông Cửu Long Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ 53b: 79-87 Nguyễn Thị Phương Mai, Lê Quang Hịa, Tơ Kim Anh (2010) Phân lập Phomopsis sp N72 sinh tổng hợp laccase Tạp Chí Khoa Học Và Cơng Nghệ Tập 48, số 3, Tr 51-58 Nguyễn Thị Phương Mai, Lê Quang Hịa, Tơ Kim Anh (2012) Tinh xác định đặc tính laccase tái tổ hợp từ Aspergillus niger D15#26 lcc1 1.8B Tạp chí Khoa học Công nghệ 50(3) 297-307 Trần Thị Thu Hiền, Lê Thị Hiền, Nguyễn Văn Huynh, Đinh Thị Thu Hằng, Đặng Thị Cẩm Hà (2016) Phân lập, nghiên cứu môi trường thích hợp sinh tổng hợp laccase chủng nấm đảm thu thập từ vườn Quốc gia Bidoup- núi Bà khả loại màu thuốc nhuộm chủng Tạp chí Công nghệ Sinh học 14(2): 313-325 Trịnh Thu Thủy, Nguyễn Văn Giang, Nguyễn Ngọc Bằng, Phạm Thu Trang (2015) Phân lập tuyển chọn chủng nấm mốc sinh tổng hợp enzyme laccase từ gỗ mục Tạp chí Khoa học Phát triển, tập 13, số 7: 1173-1178 Tài liệu Tiếng Anh Baldrian P (2006), “Fungal laccases – occurrence and prooperties”, FEMS Microbiology reviews, 30(2), pp 215-242 Bao Zhen Feng; Peiqian Li (2014) Cloning, characterization and expression of a novel laccase gene Pclac2 from Phytophthora capsici Braz J Microbiol; 45(1): 351–357 Canero D C., Roncero M I (2008), Functional analyses of laccase genes from Fusarium oxysporum Phytopathology 98(5): 509-518 Chen S.C, Wu P.H, Su Y.C, Wen T.N, Wei Y.S, Wang N.C, Hsu C.A, Wang A.H, Shyur L.F (2012), “Biochemical characterization of a novel laccase from the basidiomycete fungus Cerrena sp WR1”, Protein Engineering, Design & Selection, 25(11), pp 761-769 35 10 Couto S.R and Toca Herrera J.L (2006), “Industrial and biotechnological applications of laccases: a review” Biotechnology Advances, vol 24, no 5, pp 500– 513 11 D M Soden, J O’Callaghan and A D W Dobson (2002) Molecular cloning of a laccase isozyme gene from Pleurotus sajor-caju and expression in the heterologous Pichia pastoris host Microbyology, 148, 4003- 4014 12 Faccelo J, Cruz O (2008) Banana skin: a novel material for a low-cost production of laccase Universitat Rovira I Virgili; M.S thesis 13 Forootanfar H, Faramarzi M.A (2015), “Insights into laccase producing organism, fermentation states, purification strategies, and biotechnological Applications”, Biotechnology Progress, 31(6), pp 1443-1463 14 G Ravikumar, M Kalaiselvi, D Gomathi, K Devaki and C Uma (2013) Cloning, expression in E coli and the enzymatic properties of laccase from Hypsizygus ulmarius World journal of pharmacy and pharmaceutical sciences, Volume 3, Issue 1, 493-505 15 Gavel Y., von Heijne G (1990), Sequence differences between glycosylated and non-glycosylated AsnX-Thr/Ser acceptor sites: implications for protein engineering Protein engineering 3(5): 433-442 16 Kelley L A., Mezulis S., Yates C M., Wass M N., Sternberg M J (2015), The Phyre2 web portal for protein modeling, prediction and analysis Nature protocols 10(6): 845-858 17 Huang SJ, Liu ZM, Huang XL, Guo LQ, Lin JF (2011) Molecular cloning and characterization of a novel laccase gene from a white-rot fungus Polyporus grammocephalus TR16 and expression in Pichia pastoris Letters in Applied Microbiology, Volume 52, Issue 3, 290-297 18 Jenq-Kuen Huang, Chia-Yu Kuo, Ka-Lai Pang, Lisa Wen, and Chi-Tsai Lin (2015) Molecular cloning and biochemical characterization of laccase from Rigidoporus vinctus [Institute of Marine Biology] Periodical Articles 23(5) pp.827835 36 19 Jie Yang, Wenjuan Li, Tzi Bun Ng, Xiangzhen Deng, Juan Lin and Xiuyun Ye (2017), “Laccases: Production, Expression Regulation, and Applications in Pharmaceutical Biodegradation”, frontiers in Microbiology, 1, pp 1-24 20 Jing Wu, Kyoung-Sook Kim, Jai-HeonLeeb, Young-Choon Lee (2010) Cloning, expression in Escherichia coli, and enzymatic properties of laccase from Aeromonas hydrophila WL-11 Journal of environmental sciences (China); 22(4):635-40 21 Joseph Needham, Ping-Yü Ho, Gwei-Djen Lu and Nathan Sivin Science and civilisation in China: Chemistry and chemical, Volume 5, Part By, p 209 22 Kenji Okamoto, Ichirou Shigematsu, Hideshi Yanase, Yasuhiro Ito, Sonoe Ochia Yanagi (2003) Cloning and characterization of a laccase gene from the whiterot basidiomycete Pleurotus ostreatus, Mycoscience, vol.44 (1) (p.11 - 17) 23 Kiiskinen L.L (2005), “Characteration and heterologuos production of novel laccase from Melanocarpus albomyces” 2005, VTT Publications 556 24 Kwiatos N., Ryngajllo M., Bielecki S (2015), Diversity of laccase-coding genes in Fusarium oxysporum genomes Frontiers in microbiology 6: 933 25 Kunamneni A, Ballesteros A, F Plou F.J, Alcalde M (2007), “Fungal laccasea versatile enzyme for biotechnological applications,” Communicating Current Research and Educational Topics and Trends in Applied Microbiology, A MendezVilas, Ed., vol 1, pp 233–245 26 Kunamneni A1, Plou FJ, Ballesteros A, Alcalde M Recent Pat (2008) Laccases and their applications: a patent review Biotechnol; 2(1):10-24 27 Minussi R.C, Pastore G.M, and Durán N (2002), “Potential applications of laccase in the food industry,” Trends in Food Science and Technology, vol 13, no 6-7, pp 205–216 28 Neha Garg, Nora Bieler, Tenzin Kenzom, Meenu Chhabra, Marion AnsorgeSchumacher, and Saroj Mishra (2012) Cloning, sequence analysis, expression of Cyathus bulleri laccase in Pichia pastoris and characterization of recombinant laccase BMC Biotechnology 12(1):75 29 Nielsen H (2017), Predicting Secretory Proteins with SignalP Methods in molecular biology 1611: 59-73 37 30 Orkun Pinar, Candan Tamerler, Ayten Yazgan Karataş (2017) Heterologous expression and characterization of a high redox potential laccase from Coriolopsis polyzona MUCL 38443 Turkish Journal of Biology, Vol 41 Issue 2, p278-291 18p 31 Piontek K, Antorini M, Choinowski T (2002), “Crystal structure of a laccase from the fungus Trametes versicolor at 1.90-A resolution containing a full complement of coppers”, The Journal of Biological Chemistry, 277(40), pp 3766337669 32 Rebecca J Pinkelman, Stephen R Hughes, Hyoung-Tae Choi, and Sookie S Bang (2009) Cloning and Expression of Laccase from Trametes versicolor in Saccharomyces cerevisiae Using a Novel Vector System 33 Ruggaber T.P, Talley J.M (2006), “Enhancing Bioremediation with enzymatic Processes”, American Society of Civil Engeneers, 2(73), pp.10 34 Santhanam N, Vivanco J.M, Decker SR (2011), “Expression of industrially relevant laccases: prokaryotic style”, Trends in Biotechnology, pp 480-489 35 Shraddha, Shekher R, Sehgal S, Kamthania M, Kumar A (2011), “Laccase: Microbial sources, production, purification, and potential biotechnological applications”, Enzyme Research, 217861, pp 11 36 Sergio R (2006), “Laccase: blue enzymes for gree chemistry”, Trends in Biotechnology 24(5), pp 219-226 37 Soonja Kim, Youngeun Leem, Kyunghoon Kim, Hyoung T Choi (2001) Cloning of an acidic laccase gene (clac2) from Coprinus congregatus and its expression by external pH FEMS Microbiology Letters, Volume 195, Issue 2, Pages 151–156 38 Sosna M, Chrétien J.M, Kilburn J.D, Bartlett P.N (2010), “Monolayer anthracene and anthraquinon modified electrodes as platforms for Trametes hirsuta laccase immobilisation”, Physical Chemistry Chemical Physics, 12: pp 1001810026 39 Thurston C.F (1994), “The structure and function of fungal laccases”, Microbiology, 140, pp 19-26 40 Yagüe S, Terrón M.C, González T (2000), “Biotreatment of tannin-rich beerfactory wastewater with white-rot basidiomycete Coriolopsis gallica monitored by 38 pyrolysis/gas chromatography/mass spectrometry,” Rapid Communications in Mass Spectrometry, vol 14, no 10, pp 905–910 41 Yaver DS, Xu F, Golightly EJ, Brown KM, Brown SH, Rey MW, Schneider P, Halkier T, Mondorf K, Dalboge H Purification, characterization, molecular cloning, and expression of two laccase genes from the white rot basidiomycete Trametes villosa Appl Environ Microbiol 1996 Mar;62(3):834-41 39 PHỤ LỤC Bảng 1: môi trường BSM KH2PO4 0,2g MgSO4.7H2O 0,05g CaCl2.2H2O 0,01g CuSO4.5H2O 0,08g Na2MoO4.2H2O 0,05g MnSO4.H2O 0,033g ZnSO4.7H2O 0,043g FeSO4.7H2O 0,05g Nước cất 1L Bảng 2: Môi trường LB Môi trường LB rắn Môi trường LB lỏng NaCl 10g NaCl 10g Yeast extract 5g Yeast extract 5g Tryptone 10g Tryptone 10g Bacto agar 15g Nước cất 1L Nước cất 1L Bảng 3: Môi trường PD Môi trường PDA Môi trường PD lỏng Dextrose 20g Dextrose 20g Dịch chiết khoai tây 200g Dịch chiết khoai tây 200g Bacto agar 20g Nước cất 1L Nước cất 1L 40 Bảng 4: Công thức đệm CTAB Tris-HCl 1M EDTA 0,5M CTAB 1,4M NaCl 1,4M Hình 1: Thermo Scientific GeneRuler kb DNA Ladder (Nguồn: https://assets.thermofisher.com/TFSAssets/LSG/manuals/MAN0013004_GeneRuler_1kb_DNALadder_250ug_UG.pdf) 41 ... tự gen mã hóa laccase từ mRNA tổng số F oxysporum HUIB02 Tạo dịng giải trình tự gen lac1 mã hóa enzyme laccase vector tạo dịng pGEM®T-Easy So sánh đối chiếu trình tự gen laccase từ Fusarium oxysporum. .. khác nhau, gen mã hóa cho nhiều laccase tách dịng xác định trình tự, giúp cho việc phân lập gen mã hóa laccase trở nên dễ dàng Xuất phát từ nhu cầu thực tiễn, ứng dụng quan trọng mà laccase mang... biểu gen laccase từ nấm thối trắng Pleurotus ostreatus .Gen lccK mã hóa laccase tạo dịng, giải trình tự, biểu Gen bao gồm 2929 bp với vùng mã hóa bị gián đoạn 19 intron Hai địa điểm N-glycosyl hóa