Đang tải... (xem toàn văn)
KiÓm tra ho¹t tÝnh kh¸ng sinh cña dung m«i chiÕt tõ sinh khèi, dung m«i chiÕt tõ dÞch läc vµ dÞch ®M chiÕt dung m«i... Hai chñng x¹ khuÈn Streptomyces cyaneogriceus HD54 vµ S.[r]
(1)29(1): 89-94 T¹p chÝ Sinh häc 3-2007
ảNH HƯởNG CủA CáC ĐIềU KIệN LÊN MEN LÊN KHả NĂNG SINH CHấT KHáNG SINH KHáNG NấM FUSARIUM OXYSPORUM CđA HAI CHđNG X¹ KHN STREPTOMYCES CYANEOGRICEUS HD54
Và STREPTOMYCES HYGROSCOPICUS HD58
Lê Thị Thanh Xuân Viện Công nghệ sinh học
Tăng Thị Chính Viện Công nghệ môi trờng
Việt Nam, n−ớc nhiệt đới nóng ẩm, bệnh nấm gây gây thiệt hại nghiêm trọng cho mùa màng Việc sử dụng thuốc hóa học để trừ nấm th−ờng độc, thuốc tồn d− đất, n−ớc nông sản ảnh h−ởng đến sức khỏe ng−ời, gây ô nhiễm môi tr−ờng sống làm cân sinh thái Vì vậy, đấu tranh sinh học (Biocontrol) chống bệnh thực vật đM đ−ợc Hội nghị t− vấn khu vực châu - Thái Bình D−ơng FAO năm 1992 khẳng định tảng Ch−ơng trình quản lý thống bệnh dịch Một biện pháp đấu tranh sinh học sử dụng hay nhiều loại vi sinh vật để kiềm chế bệnh thực vật sinh từ đất [4, 5, 6]
ở Việt Nam, đM có nhiều cơng trình khoa học nghiên cứu ứng dụng biện pháp đấu tranh sinh học bảo vệ thực vật [2] Trong báo này, chúng tơi trình bày kết nghiên cứu ảnh h−ởng số điều kiện lên men đến sinh tr−ởng, phát triển khả sinh chất kháng sinh kháng nấm Fusarium oxysporum gây bệnh thối cổ rễ thực vật hai chủng xạ khuẩn Streptomyces cyaneogriceus HD54 S hygroscopicus HD58 phân lập từ mẫu đất Vit Nam
I PHƯƠNG PHáP NGHIÊN CứU
1. Vi sinh vËt
- Hai chủng xạ khuẩn S cyaneogriceus HD54 S hygroscopicus HD58 đ−ợc phân lập từ mẫu đất tỉnh Hải D−ơng [1]
- Nấm Fusarium oxysporum Fo47, đợc nhận từ phòng Công nghệ lên men - Viện Công nghệ sinh học, loài nấm gây bệnh thối cổ rễ thực vËt
2. M«i tr−êng
Grauze 1, A-4, A-4H, A-9, A-12, Czapek, Czapek-Dox
3. Phơng pháp
- Xác định hoạt tính kháng sinh [2]
- Định l−ợng kháng sinh theo bảng xác định hoạt tính sinh học chất kháng sinh Dmitrieva [3]
- Xác định chất kháng sinh nội bào, ngoại bào [2]: lấy 10 ml dịch nuôi cấy để ly tâm 3000 vòng/phút 20 phút; phần sinh khối d−ới đ−ợc chiết lần (mỗi lần ml) dung môi a-xê-ton 45oC 30 phút Sau đó, ly
tâm để loại sinh khối trộn lần chiết thành 10 ml dung môi loại Dịch lọc đ−ợc bổ sung loại dung mơi khơng hồ tan nh− bu-ta-nol, clo-rơ-phc với tỷ lệ 4: lắc định kỳ; sau 24 dùng phễu chiết tách dung mơi Kiểm tra hoạt tính kháng sinh dung môi chiết từ sinh khối, dung môi chiết từ dịch lọc dịch đM chiết dung mụi
II KếT QUả Và THảO LUậN
(2)Để nghiên cứu ảnh h−ởng nhiệt độ lên sinh tr−ởng, phát triển khả sinh chất kháng sinh chủng HD54 HD58, sử dụng thang nhiệt độ nh− sau: 20oC,
30oC, 37oC 45oC Hai chủng xạ khuẩn đợc
nuôi môi trờng Gauze1 lỏng máy lắc tròn 220 vòng/phút, 300C kéo dài 120
giờ Kết xác định sinh khối khơ hoạt tính kháng sinh ph−ơng pháp giếng thạch đ−ợc trình bày bảng
B¶ng
ảnh h−ởng nhiệt độ lên sinh tr−ởng, phát triển khả sinh tổng hợp chất kháng sinh hai chủng xạ khuẩn HD54 HD58
Sinh khèi kh«
(mg/ml)
Đờng kính vòng ức chế F oxysporum Fo.47 (D - d) mm
Nhiệt độ
nu«i cÊy HD54 HD58 HD54 HD58
25oC 14,54 15,23 15 20
30oC 18,4 19,0 22 25
37oC 11,20 12,45 13 8
45oC 0 0 0 0
Kết bảng cho thấy chủng xạ khuẩn HD54 HD 58 sinh tr−ởng phát triển tốt 30oC, 25oC 37oC chúng
phát triển yếu khơng có khả sinh tr−ởng 45oC Điều cho thấy chủng xạ
khuẩn HD54 HD 58 thuộc nhóm vi sinh vật −a ấm Hoạt tính kháng sinh chủng phụ thuộc vào nhiệt độ nuôi cấy, nuôi 30oC, chủng xạ khuẩn sinh chất kháng
sinh ức chế nấm F oxysporum Fo.47 mạnh Nh− vậy, nhiệt độ 30oC nhiệt độ thích
hợp cho sinh tr−ởng khả sinh chất kháng sinh ức chế nấm F oxysporum Fo.47 chủng xạ khuẩn Vì vậy, chúng tơi chọn nhiệt độ 30oC để ni cấy nghiên
cøu tiÕp theo
2. ¶nh h−ëng cđa pH
Thang pH đ−ợc lựa chọn để nghiên cứu từ pH5 đến pH10 Các chủng xạ khuẩn đ−ợc nuôi môi tr−ờng Gauze1 lỏng máy lắc tròn 220 vòng/phút, nhiệt độ 30oC 120 Xác định thông số lên men khả sinh chất kháng sinh kháng nấm F oxysporum Fo.47 ph−ơng pháp giếng thạch Kết đ−ợc trình bày bảng hình
KÕt hình bảng cho thấy chủng xạ khuẩn HD54 HD58 sinh trởng mạnh pH = giá trị pH cao khả sinh trởng chúng yếu Tuy nhiên, chủng có khả phát triển đợc môi trờng kiềm (pH = 9)
0 10 15 20 25
5 10 11
pH Si n h k h o i k h o ( m g /m l) HD54 HD58
Hình1 ảnh hởng cđa pH tíi sù sinh tr−ëng cđa chđng HD 54 vµ HD 58
Kết bảng cho thấy nuôi chủng xạ khuẩn mơi tr−ờng có pH khác khả sinh chất kháng sinh kháng nấm F oxysporium Fo.47 khác nhau; môi tr−ờng pH = 7, chúng sinh chất kháng sinh ức chế nấm mạnh hoạt tính kháng nấm giảm dần pH tăng dần giảm dần Đối với chủng HD54, tăng pH ban đầu mơi tr−ờng đến hoạt tính kháng nấm khơng cịn; cịn chủng HD58, hoạt tính kháng nấm giảm, nh−ng cịn mức cao Điều chứng tỏ chủng HD58 có khả chịu kiềm tốt chủng HD54 Từ kết nghiên cứu trên, pH ban đầu môi tr−ờng
(3)nuôi cấy thích hợp cho sinh trởng, phát triển khả sinh kháng sinh chủng
xạ khuẩn pH = Vì vậy, chọn pH = cho nghiên cứu
Bảng
ảnh hởng pH lên sinh trởng khả sinh chất kháng sinh kháng F oxysporium Fo.47 chủng xạ khuẩn HD54 HD58
Sinh khối khô
(mg/ml)
Đờng kính cđa vßng øc chÕ nÊm F oxysporium Fo.47
(D - d) mm
pH
HD54 HD58 HD54 HD58
5 7,55 6,78 10 13
6 16,55 15,15 28 32
7 19,05 19,7 32 35
8 15,9 12,45 17 30
9 11,15 10,25 27
pH 6,45 4,57 0
3. Lùa chọn môi trờng lên men thích hợp của chủng xạ khuẩn HD54 HD58
Theo kt nghiên cứu nhiều năm xạ khuẩn sinh chất kháng sinh Porter, ông đM lựa chọn môi tr−ờng lên men để nghiên cứu khả sinh tổng hợp chất kháng sinh chủng xạ khuẩn là: A-4, A-4H, A-9 A-12 [3] Từ mơi tr−ờng sở này, lựa chọn mơi tr−ờng thích hợp cho chủng xạ khuẩn HD54 HD58 Dựa vào kết nghiên cứu pH nhiệt độ chủng này, tiến hành lên men môi tr−ờng sở để
chọn môi trờng lên men thích hợp
Chng x khuẩn đ−ợc hoạt hố mơi tr−ờng thạch nghiêng nhân giống môi tr−ờng Gause dịch thể Sau 48 ni máy lắc trịn, giống phát triển tốt đ−ợc cấy truyền 5% sang môi tr−ờng lên men bản: A-4, A-4H, A-9 A-12 Tiếp theo đó, bình lên men đ−ợc ni máy lắc trịn 220 vòng/phút kéo dài 120 Kết xác định pH, l−ợng sinh khối hoạt tính kháng nấm F oxysporum Fo.47 chủng xạ khuẩn HD54 HD58 đ−ợc trình bày bảng
B¶ng
Khả sinh trởng hoạt tính kháng nấm
của chủng xạ khuẩn HD54 HD58 lên men môi trờng Sinh khối khô
(mg/ml)
Đờng kÝnh cđa vßng øc chÕ nÊm F oxysporum Fo.47
(D - d) mm
Môi trờng lên men
HD54 HD58 HD54 HD58
A- 12,23 17,592 20 25
A- 4H 10,83 13,304 22 24
A- 7,35 8,43 10 10
A-12 15,56 20,32 28 30
Kết trình bày bảng cho thấy chủng xạ khuẩn HD54 HD58 lên men môi tr−ờng A-12 phát triển tốt sinh chất kháng sinh kháng nấm F oxysporum Fo.47 mạnh Vì vậy, chúng tơi lựa chọn môi tr−ờng A-12 để tiếp tục nghiên cứu thu nhận
chất kháng sinh
4. Động thái lên men chủng xạ khuẩn HD54 HD58 môi trờng A-12
(4)220 vòng/phút nhiệt độ 30oC để nghiên cứu
động thái lên men sinh chất kháng sinh kháng
nÊm F oxysporum Fo.47 cđa chđng HD54 vµ HD58 Kết đợc trình bày bảng
Bảng
Động thái lên men chủng xạ khuẩn HD54 HD58 môi trờng A-12 Thời gian lên men (giờ)
Chủng xạ khuẩn
0 24 48 72 96 120 144 168
pH dịch
nuôi cấy 7,0 6,23 6,18 6,54 6,51 6,59 6,77 5,56
Hoạt tính kháng
nÊm Fo.47 - - - 15,6 27,5 34 30,8 26
HD54
Sinh khèi kh«
(mg/ml) - 10,73 14,13 19,59 24,03 17,12 16,74
16,64 pH dịch
nuôi cấy 7,0 6,72 6,64 6,68 7,05 7,23 6,00 5,67
Hoạt tính kháng
nấm Fo.47 - - - 22,5 33 35,5 30,5 28
HD58
Sinh khèi kh«
(mg/ml) - 13,27 18,33 24,32 32,93 30,77 27,1 23,36
Hình Hoạt tÝnh kh¸ng nÊm F oxysporum Fo.47 cđa chđng HD58 trình lên men Nh đM biết, sinh trởng phát
trin ca cỏc chng x khuẩn q trình lên men mang đặc tính chủng có liên quan chặt chẽ đến khả sinh tổng hợp kháng sinh chúng Kết bảng cho thấy sinh khối chủng xạ khuẩn HD54 HD58 bắt đầu tăng nhanh từ thứ 24 trình lên men đạt cực đại thứ 96, sau giảm dần Điều liên quan chặt chẽ đến hình thành axit hữu môi tr−ờng sinh tr−ởng xạ khuẩn Sự sinh tr−ởng xạ khuẩn đạt cực đại thứ 96 giảm dần trình lên men tiếp theo, sau 96 lên men, khuẩn ty xạ khuẩn bị phân đoạn tự phân, dẫn đến l−ợng sinh khối gim
Hai chủng xạ khuẩn HD54 HD58 bắt ®Çu
sinh tổng hợp chất kháng sinh kháng nấm F oxysporum Fo.47 sau 48 lên men tăng nhanh từ 72 đến 96 giờ, đạt cực đại thứ 120, sau giảm dần tiếp tục nuôi cấy Nh− vậy, pha sinh chất kháng sinh xảy chậm so với pha sinh tr−ởng chủng xạ khuẩn
Trong trình lên men, pH dịch nuôi cấy giảm dần 48 đầu bắt đầu tăng dần từ 48 đến 120 giờ, sau lại giảm dần kết thúc trình lên men
5. Tính chất kháng sinh chủng xạ khuÈn HD54 vµ HD58
(5)đem ly tâm để thu sinh khối dịch ly tâm Chúng dùng bu-ta-nol để chiết rút chất kháng sinh từ dịch ly tâm dùng a-xê-ton để chiết rút chất kháng sinh từ sinh khối xạ
khuẩn Kết xác định hoạt tính kháng nấm F oxysporum Fo.47 chất kháng sinh đ−ợc chiết rút từ dịch nuôi cấy từ sinh khối chủng xạ khuẩn đ−ợc trình bày bảng
Bảng
Hoạt tính chất kháng sinh kháng nấm F oxysporum Fo.47
đợc tách chiết từ sinh khối từ dịch nuôi cấy chủng xạ khuẩn HD54 HD58 Đờng kính vòng øc chÕ nÊm F oxysporum Fo.47
(D - d) mm
Chđng x¹ khn
Sinh khèi Dịch nuôi cấy
HD 54 33
HD 58 35,5
KÕt qu¶ ë b¶ng cho thÊy chÊt kh¸ng sinh kh¸ng nÊm F oxysporum Fo.47 cđa chđng HD54 vµ HD58 chØ cã dịch tách chiết từ sinh khối xạ khuẩn, dịch nuôi cấy xạ khuẩn Nh vậy, chất kh¸ng sinh kh¸ng nÊm F oxysporum Fo.47 chØ n»m sinh khối chủng xạ khuẩn
III KÕT LUËN
1 Hai chủng xạ khuẩn Streptomyces cyaneogriceus HD54 S hygroscopicus HD58 đ−ợc phân lập từ mẫu đất Việt Nam, thuộc nhóm vi sinh vật −a ấm sinh tr−ởng sinh tổng hợp chất kháng sinh kháng nấm Fusarium oxysporum Fo.47 nhiệt độ từ 25oC - 37oC
Nhiệt độ tốt cho sinh tr−ởng khả sinh tổng hợp chất kháng sinh chúng 30oC với pH ban đầu môi tr−ờng
2 Mơi tr−ờng lên men thích hợp cho sinh tr−ởng khả sinh tổng hợp chất kháng sinh kháng nấm F oxysporum Fo.47 hai chủng xạ khuẩn S cyaneogriceus HD54 S hygroscopicus HD58 môi tr−ờng A-12 Trong trình lên men, sinh khối hai chủng xạ khuẩn bắt đầu tăng nhanh từ thứ 24 đạt cực đại thứ 96, sau giảm dần Chúng bắt đầu sinh tổng hợp chất kháng sinh kháng nấm F oxysporum Fo.47 sau 48 lên men đạt cực đại thứ 120 Nh− vậy, pha sinh chất kháng sinh xảy chậm so với pha sinh tr−ởng chủng xạ khun ny
3 Trong trình lên men, pH dịch nuôi cấy giảm dần 48 đầu tăng dần
t 48 gi n 120 lên men, sau lại giảm dần kết thúc trình lên men (144 giờ)
4 ChÊt kh¸ng sinh kh¸ng nÊm F oxysporum Fo.47 chủng xạ khuẩn S. cyaneogriceus HD54 S hygroscopicus HD58chØ n»m sinh khèi cña chñng xạ khuẩn này.
Tài liệu tham khảo
1 Tăng Thị Chính cs., 2005: Tạp chí Sinh häc, 27(1): 39-43, Hµ Néi
2 Lê Gia Hy, 1994: Nghiên cứu xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces sinh chất kháng sinh chống nấm gây bệnh đạo ôn thối cổ rễ phân lập Việt Nam, Luận án Phó tiến sỹ
3 Porter N., 1975: Methods in Enzymology, XVIII: 3-23
4 Shen Y Ch., 1992: Development and application of agricultural antibiotic jinggangmycin in China FAO regional expert consultation on biologycal control of plan diseases, Hangzhou, China
5 Yuan-bod, 1992: Development of biological control of plant diseases in Asia-pacific region FAO regional axpert consultation of plant diseases, Hangzhou, China
(6)Influences of fermentation conditions on
the biosynthesy capacite of antibiotics against Fusarium oxysporum of two Streptomyces strains Streptomyces cyaneogriceus HD54 and Streptomyces hygroscopicus HD58
Le Thi Thanh Xuan, Tang Thi Chinh
Summary
Two strains Streptomyces cyaneogriceus HD54 and S hygroscopicus HD58 were isolated from soil
samples in Vietnam They produced antibiotic against the fungus F oxysporum Fo47 These strains were
mesophilic microorganisms and their growth temperature were about 25oC-37oC The optimum temperature
for their growth and their antibiotic biosynthesy was 30oC in the media with pH = The medium A-12 was
suitable for their growth and their antibiotic biosynthesy, with incubation temperature at 30oC and shaker rate
of 220 rpm/min The A-12 medium contained soluble starch, soybean powder, molasses, K2HPO4, CaCO3 and
NaCl These two strains HD54 and HD58 obtained maximum biomass at among 96h cultivation time They started to biosynthesize antibiotic after 48h of incubation and obtained maximum antibiotic activity against
fungus F oxysporum Fo47 after among 120h of incubation Their antibiotic activity was obtained only inner
their mycelium and non-extracted in the liquid medium
Ngµy nhËn bµi: 4-7-2006