ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HCM
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA
VÕ TRẦN LÂM
KHẢO SÁT ẢNH HƯỞNG CỦA OLIGOCHITOSAN LÊN SỰ SINH TRƯỞNG CỦA LÚA IR64 TRONG ĐIỀU KIỆN MẶN
Chuyên nghành: Công nghệ Sinh học Mã số: 8420201
LUẬN VĂN THẠC SĨ
Trang 2CƠNG TRÌNH ĐƯỢC HỒN THÀNH TẠI TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA –ĐHQG -HCM
Cán bộ hướng dẫn khoa học: PGS.TS Lê Thị Thủy Tiên
Cán bộ chấm nhận xét 1: TS Bùi Thị Mỹ Hồng
Cán bộ chấm nhận xét 2: TS Trần Thị Thanh Hiền
Luận văn thạc sĩ được bảo vệ tại Trường Đại học Bách Khoa, ĐHQG Tp HCM Ngày 17 tháng 7 năm 2023
Thành phần Hội đồng đánh giá luận văn thạc sĩ gồm: 1 Chủ tịch: PGS.TS Nguyễn Thị Thúy Hương 2 Thư kí: TS Hoàng Mỹ Dung
3 Phản biện 1: TS Bùi Thị Mỹ Hồng 4 Phản biện 2: TS Trần Thị Thanh Hiền 5 Ủy viên: PGS.TS Lê Thị Thủy Tiên
Xác nhận của Chủ tịch Hội đồng đánh giá LV và Trưởng Khoa quản lý chuyên ngành sau khi luận văn đã được sửa chữa (nếu có)
CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG TRƯỞNG KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC
Trang 3ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA
CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM
Độc lập - Tự do - Hạnh phúc
NHIỆM VỤ LUẬN VĂN THẠC SĨ
Họ tên học viên: Võ Trần Lâm MSHV: 2070448
Ngày, tháng, năm sinh: 20/07/1998 Nơi sinh: Bến Tre
Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học Mã số: 8420201
I TÊN ĐỀ TÀI:
Khảo sát ảnh hưởng của oligochitosan lên sự sinh trưởng của lúa IR64 trong điều kiện mặn (Effects of oligochitosan on the growth of IR64 rice under saline conditions)
II NHIỆM VỤ VÀ NỘI DUNG :
1 Đánh giá khả năng tổng hợp các yếu tố điều hòa áp suất thểm thấu của cây mạ lúa trong điều kiện mặn với sự hỗ trợ của oligochitosan
2 Tìm hiểu các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt động đóng mở khí khẩu ở lá cây mạ lúa trong điều kiện mặn
III NGÀY GIAO NHIỆM VỤ: 06/02/2023
IV NGÀY HOÀN THÀNH NHIỆM VỤ: 06/07/2023 V CÁN BỘ HƯỚNG DẪN: PGS TS Lê Thị Thủy Tiên
Tp HCM, ngày 06 tháng 07 năm 2023
CÁN BỘ HƯỚNG DẪN
(Họ tên và chữ ký)
CHỦ NHIỆM BỘ MÔN ĐÀO TẠO
(Họ tên và chữ ký)
TRƯỞNG KHOA KỸ THUẬT HÓA HỌC
Trang 4LỜI CẢM ƠN
Trong thời gian thực hiện đề tài tôi đã nhận được sự giúp dỡ tận tình và động viên từ thầy cơ, anh chị và các bạn cũng như từ phía gia đình Tơi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến
Toàn thể thầy, cô trường đại học Bách Khoa thành phố Hồ Chí Minh; đặc
biệt là các thầy cơ, cán bộ Phịng thí nghiệm Cơng nghệ Sinh học, Bộ mơn Cơng nghệ sinh học, Khoa Kĩ thuật Hóa học đã tạo điều kiện và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập, thực hiện luận văn tốt nghiệp
Cô Lê Thị Thủy Tiên đã giảng dạy, tận tình hướng dẫn, truyền đạt kinh
nghiệm và ln động viên tơi trong q trình làm luận văn
Thầy Trần Trọng Tuấn đã cho phép tôi mượn và hướng dẫn tôi sử dụng thiết bị tại Viện Sinh học Nhiệt đới
Các thầy, cô trong hội đồng đã dành thời gian đọc và đóng góp nhiều ý kiến
cho luận văn
Cuối cùng, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn với gia đình, bạn bè, những người đã luôn động viên, giúp đỡ trong cuộc sống và xuyên suốt quá trình thực hiện luận văn
Một lần nữa, tôi xin được gửi lời chúc sức khỏe, lời cảm ơn chân thành nhất đến thầy cô, các anh chị và các bạn
Chúc mọi người gặt hái được nhiều thành công! Tôi xin chân thành cảm ơn! TP Hồ Chí Minh, ngày 06 tháng 07 năm 2023
Học viên thực hiện
Trang 5TÓM TẮT LUẬN VĂN
Trang 6ABSTRACT
Trang 7LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đề tài ‘‘Khảo sát ảnh hưởng của oligochitosan lên sự sinh trưởng của lúa IR64 trong điều kiện mặn’’ là cơng trình nghiên cứu độc lập được thực hiện bởi chính bản thân tôi Số liệu và tài liệu dẫn chứng trong luận văn có nguồn gốc rõ ràng, công bố đúng quy định Các kết quả thu được của luận văn phản ánh khách quan, trung thực, hồn tồn khơng sao chép và chưa từng được công bố trong bất kỳ nghiên cứu nào khác Nếu phát hiện có gian dối, tơi xin chịu mọi trách nhiệm
Tp Hồ Chí Minh, ngày 6 tháng 7 năm 2023 Tác giả đề tài
Trang 8MỤC LỤC
DANH MỤC HÌNH ẢNH viii
DANH MỤC BẢNG ix
DANH MỤC VIẾT TẮT x
MỞ ĐẦU 1
CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2
1.1 Cây lúa 2
1.1.1 Nguồn gốc phân bố 2
1.1.2 Đặc điểm sinh học cây lúa 3
1.1.3 Giống lúa IR64 5
1.2 Tình hình nhiễm mặn ở đồng bằng sơng Cửu Long 5
1.3 Stress mặn 6
1.3.1 Stress ở thực vật 6
1.3.2 Stress phi sinh học và phản ứng của thực vật 7
1.3.3 Stress mặn và phản ứng của thực vật 11
1.4 Vai trò của PP2CA (clade A type 2C protein phosphatases) với đóng mở khí khẩu 171.4.1 SLAC 171.4.2 SAPK 181.4.3 PP2CA 181.5 Chitosan 191.5.1 Đặc điểm cấu trúc 19
1.5.2 Các con đường tín hiệu của chitosan trên thực vật 19
Trang 9CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU PHƯƠNG PHÁP 24
2.1 Vật liệu 24
2.1.1 Giống lúa IR 64 (OM 89) 24
2.1.2 Oligochitosan 24
2.2 Phương pháp 24
2.2.1 Tạo hạt lúa nảy mầm in vitro 25
2.2.2 Thủy canh cây mạ lúa in vivo 26
2.2.3 Khảo sát chỉ tiêu sinh trưởng 26
2.2.4 Nồng độ sắc tố quang hợp (Chlorophyll a, b và carotenoid) 26
2.2.5 Nồng độ proline 27
2.2.6 Nồng độ đường tổng, đường tan 28
2.2.7 Nồng độ protein tổng 29
2.2.8 Đặc điểm bề mặt lá và khí khẩu 30
2.2.9 Yếu tố điều khiển đóng mở khí khẩu 31
2.2.10 Phương pháp phân tích thống kê 32
CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 33
3.1 Kết quả 33
3.1.1 Sự sinh trưởng của cây mạ lúa trong điều kiện mặn 33
3.1.2 Nồng độ sắc tố quang hợp 34
3.1.3 Nồng độ proline 35
3.1.4 Nồng độ đường 35
3.1.5 Nồng độ protein tổng 36
3.1.6 Đặc điểm bề mặt lá và khí khẩu 37
Trang 11DANH MỤC HÌNH ẢNH
Hình 1.1 Sơ đồ cây lúa [7] 3
Hình 1.2 Căng thẳng thẩm thấu và con đường tín hiệu ABA [46] 12
Hình 1.3 Con đường tín hiệu stress ion [51] 14
Hình 2.1 Qui trình thực hiện thí nghiệm 25
Hình 3.1 Cây mạ lúa sau 14 ngày được trồng trong vườn ươm (thước đo 5cm) 33
Hình 3.2 Hình ảnh mặt dưới lá lúa dưới kính hiển vi điện tử soi nổi, độ phóng đại x164 38
Hình 3.3 Hình ảnh lớp sơn mặt dưới lá lúa dưới kính hiển vi quang học, độ phóng đại x 400 39
Hình 3.4 Hình ảnh mặt dưới lá lúa dưới kính hiển vi điện tử quét 40
Trang 12DANH MỤC BẢNG
Bảng 2.1 Trình tự cặp mồi [86] 31
Bảng 3.1 Các chỉ tiêu sinh trưởng của cây mạ lúa trong điều kiện mặn 34
Bảng 3.2 Nồng độ sắc tố quang hợp của cây mạ lúa trong điều kiện mặn (µg/g) 34
Bảng 3.3 Nồng độ proline của cây mạ lúa trong điều kiện mặn (µg/g) 35
Bảng 3.4 Nồng độ đường của cây mạ lúa trong điều kiện mặn (mg/g) 36
Bảng 3.5 Nồng độ protein của cây mạ lúa trong điều kiện mặn (µg/g) 36
Bảng 3.6 Mật độ khí khẩu (/mm2) 37
Bảng 3.7 Nồng độ ABA của cây mạ lúa trong điều kiện mặn (µg/g) 41
Trang 13DANH MỤC VIẾT TẮT
ABA: acid abscisic
ABF: ABRE binding factor ABRE: ABA-responsive element AMY3: α-amylase3
BAM1: β-amylase1 CAT: catalase
COLD1: chilling-tolerance divergence 1 CPK: calcium-dependent protein kinases GA: gibberellic acid
MAPK: mitogen-activated protein kinase MDA: malondialdehyde
NCA1: no catalase activity1 NO: nitric oxide
OSCA1: reduced hyperosmolality - induced calcium increase 1 PAL: phenylalanine amoniac lyase
PLD: phospholipase POD: peroxidases
PP2CA: clade A type 2C protein phosphatases Rboh: respiratory burst oxidase homologs RLK: receptor-like kinases
ROS: reactive oxygen species
SAPK: osmotic Stress/ABA-activated protein kinases SLAC1: slow-type anion channel
SNF1: sucrose non-fermenting 1 SnRK: SNF1-related protein kinases SOD: superoxide dismutase
Trang 14MỞ ĐẦU
Đồng bằng sông Cửu Long là nơi sản xuất lúa chính của Việt Nam Trong những năm gần đây, tình hình biến đổi khí hậu ngày càng nghiêm trọng dẫn đến sự nhiễm mặn hàng năm ở vùng hạ lưu sông Mekong [1] Sự gia tăng lượng muối trong đất hạn chế hoạt động trao đổi chất của rễ, từ đó làm giảm năng suất cây trồng Lúa là loại cây mẫn cảm với mặn, chỉ có thể tồn tại trong điều kiện mặn thấp Khi độ muối trong đất tăng, sự sinh trưởng và và phát triển của lúa bị ức chế dẫn đến sự giảm mạnh năng suất [2]
Chitosan - một loại polymer sinh học, là mạch dài không phân nhánh hình thành từ hai tiểu đơn vị D-glucosamine và N-acetyl-D-glucosamine liên kết với nhau bằng cầu nối glycoside, có nguồn gốc từ vỏ tôm, cua, mai mực, một số loại nấm … Những ứng dụng của chitosan trong nông nghiệp được nghiên cứu từ năm 1979 và được chứng minh là yếu tố giúp thực vật chống stress sinh học như bệnh do vi khuẩn, nấm hay virus cũng như stress phi sinh học như mặn, hạn hán, kim loại nặng … [3] Chitosan giúp tăng cường phản ứng sinh lý và làm giảm tác động bất lợi của stress phi sinh học thông qua các con đường truyền tín hiệu thứ cấp Gần đây, oligochitosan được quan tâm nghiên cứu do có khả năng hòa tan trong nước cùng với các hoạt tính sinh học vượt trội so với chitosan [4]
Nhằm tiếp tục các nghiên cứu về tác động hỗ trợ của oligochitosan với stress mặn của lúa, đề tài này thực hiện trên cây lúa IR64 14 ngày tuổi trong vườn ươm với phân đoạn oligochitosan 5.994 Da, nồng độ 75 ppm Mục tiêu đề tài:
1 Khảo sát ảnh hưởng của muối lên sự sinh trưởng cây lúa
2 Vai trò của oligochitosan lên sự sinh tổng hợp các chất điều hoà thẩm thấu của cây mạ lúa trong điều kiện mặn
3 Ảnh hưởng của stress mặn lên bề mặt lá ở cây mạ lúa
4 Ảnh hưởng của stress mặn lên hoạt động của khí khẩu ở cây mạ lúa
Trang 15CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1 Cây lúa
1.1.1 Nguồn gốc phân bố
Lúa trồng (Oryza sativa L.) là cây trồng có từ lâu đời và gắn liền với quá
trình phát triển của xã hội loài người, nhất là vùng châu Á Lúa trồng hiện nay có
nguồn gốc từ lúa dại (Oryza fatua, Oryza offcinalis, Oryza minuta) do quá trình
chọn lọc tự nhiên và chọn lọc nhân tạo lâu dài tạo nên [5]
Lúa thuộc ngành thực vật có hoa (Angiospermes), lớp một lá mầm (Monocotyledones), bộ hồ thảo có hoa (Poales), họ hồ thảo (Proaceae) Lúa trồng thuộc chi Oryza, chi Oryza có 23 loài phân bố rộng khắp thế giới Loài Oryza sativa
L được trồng phổ biến ở khắp các nước trên thế giới và phần lớn tập trung ở châu
Á Loài Oryza gluberrima S được trồng một diện tích nhỏ ở một số nước thuộc
châu Phi [5]
Loài Oryza sativa L được chia làm ba loài phụ: japonica, indica, javanica Loài phụ japonica phân bố ở những nơi có vĩ độ cao (bắc Trung Quốc, Nhật Bản,
Triều Tiên), có những đặc điểm như chịu rét cao, nhưng ít chịu sâu bệnh Lồi phụ
indica được trồng ở các nước nhiệt đới và cận nhiệt đới (Việt Nam, Ấn Độ,
Mianma, Philippines) Lồi phụ indica có đặc điểm: hạt dài, thân cao, mềm, dễ đổ, chịu sâu bệnh khá, năng suất thấp, mẫn cảm với chu kỳ ánh sáng Lồi phụ javanica
có hình thái trung gian Hạt dài nhưng dày và rộng hơn hạt của Indica, chỉ được trồng ở một vài nơi thuộc Indonesia [5]
Ở Việt Nam, các kết quả khảo sát nguồn gen cây lúa trong những năm gần
đây ghi nhận được các loài là các loài O.granulata, O.nivara, O.ridleyi,
O.rufipogon Với điều kiện khí hậu nhiệt đới, Việt Nam cũng có thể là cái nơi hình
Trang 161.1.2 Đặc điểm sinh học cây lúa
Mục này được trích từ Giáo trình sinh lý thực vật [6]
Hình 1.1 Sơ đồ cây lúa [7]
1.1.2.1 Rễ lúa
Cây lúa có 2 loại rễ: rễ mầm và rễ phụ Rễ mầm là rễ mọc ra đầu tiên khi hạt lúa nảy mầm Thường mỗi hạt lúa chỉ có một rễ mầm Rễ mầm khơng ăn sâu, ít phân nhánh, chỉ có lơng ngắn, thường dài khoảng 10 - 15 cm Rễ mầm giữ nhiệm vụ chủ yếu là hút nước cung cấp cho phôi phát triển và sẽ chết sau 10 - 15 ngày, lúc cây mạ được 3 - 4 lá Rễ phụ (còn gọi là rễ bất định) mọc ra từ các mắt (đốt) trên thân lúa Mỗi mắt có từ 5 - 25 rễ phụ, rễ phụ mọc dài, có nhiều nhánh và lơng hút Tại mỗi mắt có 2 vịng rễ: vịng rễ trên to và khỏe, vòng rễ dưới nhỏ và kém quan trọng hơn Trong giai đoạn tăng trưởng, các mắt này thường rất khít nhau và nằm ở dưới mặt đất, nên rễ lúa tạo thành một chùm, do đó, rễ lúa còn gọi là rễ chùm Tầng rễ phụ đầu tiên mọc ra ở mắt đầu tiên ngay trên trục trung diệp
1.1.2.2 Thân lúa
Trang 17triển nên các mắt rất khít nhau, chỉ có khoảng 3 - 8 lóng trên cùng bắt đầu vươn dài khi lúa trổ đòng (2 - 35 cm) Thiết diện của lóng có hình trịn hay bầu dục với thành lóng dày hay mỏng và lóng dài hay ngắn tùy từng loại giống và điều kiện môi trường, đặc biệt là nước
1.1.2.3 Lá lúa
Lúa là cây đơn tử diệp Lá lúa mọc đối ở 2 bên thân lúa, lá ra sau nằm về phía đối diện với lá trước đó Lá trên cùng (lá cuối cùng trước khi trổ bông) gọi là lá cờ hay lá đòng Lá lúa gồm phiến lá, cổ lá và bẹ lá (hình 1.1)
Phiến lá là phần lá phơi ra ngoài ánh sáng, bộ phận quang hợp chủ yếu của cây lúa nhờ vào các tế bào nhu mơ có chứa nhiều hạt diệp lạp Bẹ lá là phần ôm lấy thân lúa Bẹ lá có nhiều khoảng trống nối liền các khí khẩu ở phiến lá thơng với thân và rễ, dẫn khí từ trên lá xuống rễ giúp rễ có thể hơ hấp được trong điều kiện ngập nước Cổ lá là phần nối tiếp giữa phiến lá và bẹ lá Cổ lá to hay nhỏ ảnh hưởng tới góc độ của phiến lá Cổ lá càng nhỏ, góc lá càng hẹp, lá lúa càng thẳng đứng và càng thuận lợi cho việc sử dụng ánh sáng mặt trời để quang hợp
1.1.2.4 Bông lúa
Bông lúa là loại phát hoa chùm gồm một trục chính mang nhiều nhánh gié bậc nhất, bậc hai và đơi khi có nhánh gié bậc ba Hoa lúa được mang bởi một cuống hoa ngắn mọc ra từng nhánh gié này
Hạt lúa (trái lúa) gồm có: phần vỏ lúa và hạt gạo Vỏ lúa gồm 2 vỏ trấu ghép lại (trấu lớn và trấu nhỏ) Ở gốc 2 vỏ trấu chỗ gắn vào đế hoa có mang hai tiểu dĩnh Phần vỏ chiếm khoảng 20 % trọng lượng hạt lúa Hạt gạo ở bên trong vỏ lúa Hạt gạo gồm 2 phần: phần phôi hay mầm (embryo) và phôi nhũ Phôi nằm ở góc dưới hạt gạo, chỗ đính vào đế hoa, ở về phía trấu lớn Phơi nhũ chiếm phần lớn hạt gạo chứa chất dự trữ, chủ yếu là tinh bột Bên ngoài hạt gạo được bao bọc bởi một lớp vỏ lụa mỏng chứa nhiều vitamin, nhất là vitamin nhóm B
1.1.2.5 Các giai đoạn sinh trưởng cây lúa
Trang 18Đời sống cây lúa bắt đầu từ lúc hạt nẩy mầm cho đến khi lúa chín Có thể chia làm 3 giai đoạn chính: giai đoạn tăng trưởng (sinh trưởng dinh dưỡng), giai đoạn sinh sản (sinh dục) và giai đoạn chín
Giai đoạn tăng trưởng bắt đầu từ khi hạt nảy mầm đến khi cây lúa bắt đầu phân hóa địng Giai đoạn này, cây phát triển về thân lá, chiều cao tăng dần và ra nhiều chồi mới (nở bụi) Cây ra lá ngày càng nhiều và kích thước lá ngày càng lớn giúp cây lúa nhận nhiều ánh sáng mặt trời để quang hợp, hấp thụ dinh dưỡng, gia tăng chiều cao, nở bụi và chuẩn bị cho các giai đoạn sau
Giai đoạn sinh sản bắt đầu từ lúc phân hóa địng đến khi lúa trổ bông Giai đoạn này kéo dài khoảng 27 – 35 ngày, trung bình 30 ngày và giống lúa dài ngày hay ngắn ngày thường không khác nhau nhiều
Giai đoạn chín bắt đầu từ lúc trổ bơng đến lúc thu hoạch Giai đoạn này trung bình khoảng 30 ngày đối với hầu hết các giống lúa ở vùng nhiệt đới Tuy nhiên, nếu đất ruộng có nhiều nước, thiếu lân, thừa đạm, trời mưa ẩm, ít nắng trong thời gian nầy thì giai đoạn chín sẽ kéo dài hơn và ngược lại
1.1.3 Giống lúa IR64
Thời gian sinh trưởng 105 - 115 ngày Chiều cao cây trung bình 95 - 105 cm Dạng hạt dài (7,5 mm), khối lượng 1000 hạt trong khoảng 26 – 27 g Tỷ lệ gạo trên 70%, không bạc bụng, gạo trắng, cơm dẻo, ngon, đạt tiêu chuẩn xuất khẩu, được nhiều nước ưa chuộng Năng suất trung bình: vụ Hè thu 40 - 50 tạ/ha, vụ Đông xuân 60 – 65 tạ/ha, nếu thâm canh tốt có thể đạt 70 - 80 tạ/ha Kháng rầy nâu (cấp 3 - 5), rất kháng đạo ôn (cấp 1), hơi kháng bạc lá (cấp 3 - 5), nhiễm khô vằn (cấp 5 - 7), chịu phèn nhẹ
1.2 Tình hình nhiễm mặn ở đồng bằng sông Cửu Long
Trang 19Mùa mưa năm 2019 trên lưu vực sông MeKong xuất hiện muộn, thời gian mùa mưa ngắn, tổng lượng dòng chảy năm chỉ ở mức trung bình - thấp Dịng chảy về đồng bằng từ đầu mùa khô đến nay giảm nhanh, đang xuống ở mức rất thấp so với tài liệu trung bình nhiều năm từ 1980 đến nay
Hai yếu tố thượng lưu quan trọng chi phối chủ đạo đến nguồn nước, xâm nhập mặn mùa khô 2019 - 2020 ở vùng đồng bằng sông Cửu Long là lượng trữ trong Biển Hồ (TonleSap) và dòng chảy đến Kratie (đầu châu thổ MeKong) Lưu lượng về đồng bằng sông Cửu Long bị thiếu hụt nghiêm trọng so với trung bình nhiều năm, thậm chí thấp hơn cả năm 2015 - 2016 (năm xuất hiện xâm nhập mặn kỷ lục) Đây là nguyên nhân chính gây xâm nhập mặn sớm, sâu và kéo dài trong mùa khô 2019 - 2020
Theo báo cáo của Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn, xâm nhập mặn đã ảnh hưởng đến sản xuất và dân sinh từ tháng 12/2019 và liên tục tăng cao, đã ảnh hưởng đến 10/13 tỉnh ở đồng bằng sông Cửu Long (trừ An Giang, Đồng Tháp và Cần Thơ) Trong tháng 2/2020, xâm nhập mặn tăng cao từ ngày 8/2 đến 16/2/2020, với ranh mặn 4 g/L tại vùng 2 sông Vàm Cỏ từ 100 - 110 km, sâu hơn cùng kỳ năm 2016 từ 4 - 6 km; vùng cửa sông Cửu Long từ 66 - 75 km, sâu hơn cùng kỳ năm 2016 từ 3 - 10 km
1.3 Stress mặn
1.3.1 Stress ở thực vật
Trang 20nghiệp cũng như tính bền vững của mơi trường vì cây trồng có khả năng chống chịu căng thẳng kém sẽ tiêu thụ quá nhiều nước, phân bón, thuốc bảo vệ thực vật do đó tạo gánh nặng lớn cho mơi trường…
1.3.2 Stress phi sinh học và phản ứng của thực vật
Các yếu tố môi trường bao gồm nước, muối, ánh sáng, nhiệt độ và chất dinh dưỡng khi thiếu hoặc dư thừa có thể gây căng thẳng phi sinh học, gây thiệt hại đáng kể đến sự tăng trưởng và năng suất cây trồng, và thậm chí làm giảm tỷ lệ sống của chúng Các tác động bất lợi của các căng thẳng phi sinh học này càng trở nên trầm trọng hơn do biến đổi khí hậu, được dự đoán là tần suất thời tiết cực đoan tăng lên trong tương lai [8]
Stress phi sinh học làm giảm sự phát triển của thực vật vì điều kiện mơi trường khơng tối ưu cho các quá trình tăng trưởng như phân chiavà gia tăng kích thước tế bào Ví dụ, hạn hán ức chế sự phát triển của thực vật vì gây thiếu hụt nước, yếu tố cần thiết cho sự trương lên của tế bào, từ đó cản trở quá trình tăng kích thước tế bào Stress lạnh cũng làm giảm sự phát triển của thực vật do hoạt động của các enzyme và protein bị ức chế ở nhiệt độ lạnh Lũ lụt và mưa lớn có thể gây ra sự nén chặt đất, làm giảm nồng độ oxy trong đất và dẫn đến căng thẳng do thiếu oxy gây ra thiệt hại cho cây trồng [9]
Cả ba loại stress hạn, mặn và lạnh đều gây ra 2 loại stress sơ cấp là stress thẩm thấu, stress ion và stress thứ cấp là stress oxi hóa Nguyên nhân gây mất nước của tế bào khác nhau giữa các stress: (i) sự giảm nồng độ nước trong tế bào khi hạn hán là do thiếu nước trong đất hoặc/và trong khí quyển, (ii) khi bị stress do mặn, khả năng thẩm thấu hoặc nước của vùng rễ xung quanh bị giảm bởi các chất hòa tan Na+ và Cl−, do đó tạo ra nhiều bất lợi trong hoạt động hấp thu của rễ và chuyển nước đến các tế bào cho hoạt động trao đổi chất; (iii) áp suất thẩm thấu được tạo ra trong điều kiện căng thẳng lạnh chủ yếu là do nhiệt độ thấp làm tăng độ nhớt của nước, ở nhiệt độ đóng băng, các tinh thể băng được tạo ra trong không gian ngoại bào của tế bào thực vật, làm giảm khả năng dẫn nước
Trang 21(đặc biệt là Na+) và phá vỡ cân bằng ion nội môi (ionic homeostasis) Căng thẳng do thiếu nước gây hại vì ức chế hoạt động quang hợp do ảnh hưởng đến màng thylakoid Lục lạp là nơi sản sinh gốc tự do (reactive oxygen species – ROS) bao gồm các gốc anion superoxide (O2−), gốc hydroxyl (OH) và oxy nhóm đơn (singlet oxygen - 1O2, một sản phẩm phụ quá trình quang hợp) Do đó căng thẳng mơi trường tác động lên lục lạp sẽ làm trầm trọng thêm quá trình sản xuất ROS, lấn át hệ thống kiểm soát ROS và gây độc tế bào dưới dạng stress thứ cấp là stress oxi hóa (oxidative stress)
Trạng thái ngập lụt làm giảm nồng độ oxy trong đất, hạn chế sự khuếch tán khí và dinh dưỡng vào đất, đồng thời làm giảm sự sinh trưởng và phát triển của cây trồng [10] Khi thời gian ngập nước tăng lên thì số nhánh, số lá xanh và trọng lượng khô của lúa giảm Sự sống sót và sinh trưởng của cây lúa bị ảnh hưởng nghiêm trọng bởi tình trạng ngập nước [11, 12]
1.3.2.1 Tín hiệu thứ cấp và con đường tín hiệu
Khi tế bào thực vật cảm nhận được stress, tín hiệu được chuyển tiếp và khuếch đại bởi các chất truyền tin thứ cấp như calci, các loại ROS, phospholipid và nitric oxide (NO), cùng với các loại protein kinase khác nhau [13, 14] Sự gia tăng nồng độ calci do căng thẳng gây ra khác nhau về cường độ, tần suất và vị trí dưới tế bào Sự thay đổi nồng độ calci có thể được phát hiện trong các tế bào bảo vệ (guard
cell) của cây Arabidopsis trong vòng 15 giây sau khi xử lý gây áp suất thẩm thấu
Trang 22Arabidopsis với tốc độ ~8,4 cm mỗi phút [17] Các căng thẳng phi sinh học khác
nhau cũng tạo điều kiện cho việc sản xuất phosphatidic acid (PA), được xúc tác bởi phospholipase Ds (PLDs) và đóng vai trị tích cực hoặc tiêu cực trong các điều kiện căng thẳng khác nhau [18, 19] Trong tế bào bảo vệ, việc sản xuất PA do hạn hán gây ra cần thiết để tích lũy ROS qua trung gian RbohD/F và đóng khí khẩu [20] Tín hiệu căng thẳng ở thực vật cũng liên quan đến các họ kinase khác nhau, bao gồm cả những họ thuộc nhóm protein kinase hoạt hóa phân bào (mitogen-activated protein kinase - MAPK) [21], protein kinase liên quan đến SNF1 (SNF1-related protein kinases - SnRK), CDPK và RLK (receptor-like kinases) Chẳng hạn, MPK3, MPK4 và MPK6 có thể được kích hoạt trong vịng 2 phút khi tiếp xúc với hạn hán, muối hoặc nhiệt độ thấp [22-24]
Ethylene cũng góp phần vào phản ứng của thực vật đối với các căng thẳng sinh học và phi sinh học khác nhau như nhiễm côn trùng hoặc vi vật, hạn hán và điều kiện muối [25, 26] Một số nghiên cứu đã chứng minh protein trên lưới nội chất Ethylene Insensitive 2 (EIN2) hoạt động như một bộ chuyển đổi tín hiệu chính truyền tín hiệu kích hoạt downstream tới các thành viên của họ các yếu tố phiên mã Ethylene Insensitive 3 (EIN3) ở trong nhân EIN3 tiếp tục liên kết với các promoter của các gen kích hoạt bởi ethylene [27, 28] Trong điều kiện thiếu oxy, ethylene đóng vai trị chính trong việc điều hòa ABA và gibberellic acid (GA) để ảnh hưởng đến sự kéo dài của tế bào [29] Hydrogen peroxide (H2O2) đóng vai trị là chất truyền tin thứ cấp ở cuối con đường truyền tín hiệu liên quan đến tín hiệu ethylene để thúc đẩy sự hình thành khí mơ trong điều kiện thiếu oxy [30] H2O2 điều chỉnh việc tạo ra ethylene-responsive factor 73 (ERF73) và biểu hiện alcohol dehydrogenase 1 (ADH1) khi thiếu oxy [31]
1.3.2.2 Phản ứng của thực vật
Trang 23thấu này cũng hoạt động tích cực trong việc loại bỏ ROS, đặc biệt nếu chúng nhắm vào lục lạp [32, 33] Sự mất nước cũng có thể tạo ra những thay đổi sinh hóa cụ thể như vận chuyển các chất lưỡng cực (amphiphilic substances) như các glycosylated flavonol và hydroquinone vào màng, làm tăng tính linh động của màng [34, 35] Proline và đường có thể bao phủ các phân tử protein, loại bỏ chất tan khỏi bề mặt của chúng, và do đó làm giảm tốc độ tháo các nếp gấp của protein [34] Trong điều kiện khô hạn, trehalose được tổng hợp với một lượng lớn, có thể tạo liên kết hydro với các amino acid hữu cực trên bề mặt phân tử protein để duy trì cấu trúc và hoạt hoạt động của pretein [36]
Khả năng chịu hạn dường như dẫn đến cả việc nén chặt và giãn nở thành tế bào Có ý kiến cho rằng một trong những phản ứng vật lý và cơ học chính của cây đối với tình trạng căng thẳng do mất nước là tăng cường hoạt động ở các mô cần thiết nhất cho hoạt động sinh lý, và hạn chế tối đa các hoạt động ở những mô không cần thiết, điều này cho phép thực vật duy trì hoạt động sống trong điều kiện thiếu nước [37, 38] Các nghiên cứu về tế bào của rễ ngô đang chịu ảnh hưởng hạn nghiêm trọng đã ghi nhận thành tế bào của mô vùng chóp rễ (0–3 mm tính từ đỉnh chóp) rất linh hoạt dẫn đến sự phát triển liên tục của mô [38, 39] Tuy nhiên, thành tế bào của các mơ cách xa vùng chóp khơng được nới lỏng, điều này dẫn đến các mô này không kéo dài nữa [40]
Để bảo vệ bản thân khỏi tác hại của ROS, thực vật đã phát triển một số chiến lược, bao gồm sản xuất các chất chống oxy hóa, chẳng hạn như ascorbic acid, glutathione và α-tocopherol Các hợp chất này hoạt động bằng cách giảm nồng độ của các điện tử nguy hiểm Ngoài ra, các enzyme peroxidase và superoxide dismutase, cũng được tiết ra để dọn sạch các gốc tự do [33, 35, 41, 42] Các enzyme này thường sử dụng các kim loại như sắt, kẽm, đồng hoặc mangan làm chất nhận điện tử Do đó, các ion kim loại phải có sẵn nếu quá trình giải độc ROS bằng enzyme được tiến hành
Trang 24thành mơ khí do sự chết tế bào (lysigenous arenchyma) để tăng cường trao đổi khí giữa chồi và rễ
1.3.3 Stress mặn và phản ứng của thực vật
1.3.3.1 Stress mặn
Đất mặn là loại đất chứa nồng độ muối cao (>0,2%) với nhiều ion độc Tuy nhiên, độ mặn cũng có thể biến thiên dựa vào nguồn gốc của mặn, pH đất, nồng độ các chất hữu cơ trong đất, chế độ tưới tiêu và nhiệt độ Thành phần các loại muối trong đất mặn phổ biến là NaCl, Na2SO2, Na2SO4, Na2CO3, MgCl2, MgSO4 các muối này ở nồng độ cao đều gây độc cho cây Cây lấy nước và khoáng chất trong đất nhờ vào sự chênh lệch áp suất thẩm thấu, áp suất thẩm thấu trong rễ cao hơn so với trong đất giúp cây lấy được nước và dưỡng chất Khi đất bị nhiễm mặn, áp suất trong đất tăng cao, vượt mức áp suất của cây, cây không thể hút được nước và khống chất nếu khơng có cơ chế thích nghi Bên cạnh đó hơi nước khơng ngừng thốt ra ở lá, gây nên hiện tượng hạn sinh lý
Quang hợp giảm mạnh do lá kém phát triển, sắc tố ít do các chất độc ức chế q trình tổng hợp sắc tố, các quá trình xảy ra trong quang hợp bị giảm sút do ảnh hưởng của chất độc và thiếu nước Hô hấp tăng mạnh, các cơ chất bị phân huỷ mạnh nhưng hiệu quả năng lượng thấp, phần lớn năng lượng của các quá trình phân huỷ đều thải ra dưới dạng nhiệt, đồng thời không hấp thu được P từ khoáng chất trong đất nên khơng thể phosphoryl hóa tạo năng lượng, làm cho tế bào thiếu ATP để hoạt động Chênh lệch áp suất thẩm thấu làm thất thốt một vài ion ra ngồi mơi trường, gây rối loạn q trình tổng hợp protein, cây sẽ tích tụ amino acid và các amide Sự vận chuyển và phân bố các chất đồng hóa trong mạch libe bị kìm hãm nên các chất hữu cơ tích trữ trên lá, ảnh hưởng đến q trình tích lũy của cơ quan dự trữ như quả, Cytokinin được tổng hợp nhờ vào hệ thống rễ Trên cây nguyên vẹn thì khi hệ rễ phát triển mạnh mẽ sẽ là lúc cây trẻ và sinh trưởng mạnh Nếu hệ thống rễ bị thương tổn thì cơ quan trên mặt đất sẽ chóng già, thối hóa và chết
Trang 25hoá, giảm khối lượng thân và rễ Đồng thời, thực vật khắc phục áp suất thẩm thấu của đất cao bằng cách nâng cao áp suất trong rễ Rễ thực hiện nhiều hoạt động nhưnhư tích lũy các ion Na+ và K+, hoặc tăng tích trữ các chất hữu cơ đơn giản, phân tử lượng thấp như acid hữu cơ, amino acid và các loại đường
1.3.3.2 Tín hiệu của thực vật dưới tác động stress mặn
Stress muối bao gồm 1 loạt tác động gây căng thẳng cho thực vật như stress thẩm thấu và stress do nồng độ ion hoặc do ion gây độc cho tế bào Các tác động thứ cấp của stress hạn và stress do muối rất phức tạp và bao gồm stress oxy hóa, tổn thương các thành phần tế bào như lipid màng, protein và acid nucleic, rối loạn chức năng trao đổi chất Một đặc điểm quan trọng của stress do mặn là tín hiệu tăng thẩm thấu gây ra sự tích tụ acid abscisic (ABA), từ đó tạo ra nhiều phản ứng thích nghi ở thực vật Các phản ứng thích nghi đối với stress do muối có thể được nhóm thành ba q trình: stress thẩm thấu, stress ion và phản ứng giải độc
a) Các con đường tín hiệu căng thẳng thẩm thấu
Trang 26Vì stress do muối cũng gây ra stress thẩm thấu trong tế bào thực vật, tín hiệu cần thiết để thiết lập lại trạng thái cân bằng thẩm thấu ở những cây này Một số protein gần đây đã được đề xuất đóng vai trị cảm nhận áp lực thẩm thấu ở thực vật
Trong điều kiện căng thẳng thẩm thấu, tất cả 10 đồng dạng SnRK2, ngoại trừ SnRK2.9 đều được kích hoạt Việc kích hoạt SnRK2.2/3/6/7/8 xảy ra qua trung gian con đường truyền tín hiệu phụ thuộc vào ABA [46] Cảm ứng hoạt động phiên mã của các tác nhân tác động xi dịng được trung gian bởi mô-đun báo hiệu SnRK2.2/3/6–yếu tố phản ứng ABA (ABA-responsive element - ABRE) gắn protein / ABRE binding factor (AREB/ABF) được kích hoạt ABA để đáp ứng với áp lực thẩm thấu [47]
Con đường truyền tín hiệu SnRK2 - AREB/ABF - BAM1/AMY3 (β-amylase1/α-amylase3) phụ thuộc vào ABA có liên quan đến việc điều chỉnh quá trình thối hóa tinh bột ở lá, điều này rất quan trọng đối với khả năng chống chịu áp lực thẩm thấu ở thực vật Với sự hiện diện của ABA, SnRK2 phosphoryl hóa và kích hoạt các yếu tố phiên mã ISB/ABF, liên kết với các ABRE trong các yếu tố thúc đẩy BAM1/AMY3 và kích hoạt biểu hiện của chúng BAM1/AMY3 sau đó phân hủy tinh bột thành đường và các chất thẩm thấu có nguồn gốc từ đường [48]
Một chiến lược chính để thích ứng với áp lực thẩm thấu là tổng hợp các chất thẩm thấu tương thích (compatible osmolyte) làm giảm áp suất thẩm thấu và ổn định cấu trúc tế bào và protein [49] Một trong những sản phẩm của các con đường truyền tín hiệu thẩm thấu ở thực vật dưới áp lực của muối là sự tích tụ các chất thẩm thấu tương thích, rất quan trọng đối với sự điều hòa thẩm thấu do muối gây ra, bao gồm các chất chuyển hóa tích điện (ví dụ: proline, hydroxyproline, glycine betaine, b-alanine betaine), polyol (ví dụ: mannitol, sorbitol), đường (ví dụ: sucrose, fructose), đường phức tạp (ví dụ: trehalose, raffinose) và các ion (ví dụ: K+) [50]
b) Các con đường tín hiệu ion stress
Trang 27Hình 1.3 Con đường tín hiệu stress ion [51]
Con đường tín hiệu stress ion đã được mô tả dựa trên việc phát hiện ra các gen SOS (Salt Overly Sensitive) [52] Trong điều stress muối, lượng Na+ nội bào hoặc ngoại bào dư thừa sẽ kích hoạt tín hiệu Ca2+ tế bào Các protein liên kết Ca2+với tay EF (The EF-hand Ca2+-binding proteins), SOS3 và SCaBP8 (SOS3-like calcium binding protein8)/CBL10, giải mã tín hiệu Ca2+ và dịch nó thành SOS2, một protein kinase serine/threonine [53, 54]
SOS3 chủ yếu được biểu hiện ở rễ và SCaBP8 được ưu tiên biểu hiện ở các chồi [46, 54], nơi chúng tương tác và kích hoạt hoạt động SOS2 kinase trong màng sinh chất [53, 54] SOS2 được kích hoạt sau đó phosphoryl hóa và kích hoạt SOS1, một antiporter Na+/H+ trên màng sinh chất [53] Hoạt động của SOS1 tự động bị ức chế bởi sự tương tác giữa các phân tử ở nguyên sinh chất tế bào (cytosolic) và xuyên màng (transmembrane) của nó [55] Khả năng tự ức chế của SOS1 được giải tỏa và tự kích hoạt khi serine 1.044, trong đầu C miền tự ức chế của nó, bị SOS2 phosphoryl hóa [56, 57]
Trang 28(ATPase) [59] NHX là chất trao đổi Na+/H+ vận chuyển Na+ từ tế bào chất đến khơng bào, một q trình được điều khiển bởi gradient H+ được thiết lập bởi H+-pyrophosphatase và H+-ATPase của không bào [60]
c) Các con đường giải stress oxi hóa
Căng thẳng do muối gây ra sự tích tụ ROS, gây ảnh hưởng bất lợi đến thực vật Bên cạnh tác dụng bất lơi, ROS còn có chức năng như các phân tử tín hiệu để đáp ứng với các kích thích mơi trường ROS phải có mặt ở mức thích hợp trong tế bào thực vật Các đường truyền tín hiệu giải độc có liên quan đến việc kiểm soát cân bằng nội môi của các lượng ROS của tế bào trong các điều kiện căng thẳng khác nhau Tỉ lệ bị tổn thương do stress sẽ giảm đi khi cân bằng nội môi tế bào được thiết lập lại
Nhiều chất quét gốc tự do dưới dạng enzyme và khơng phải enzyme có liên quan đến việc giảm thiểu thiệt hại do ROS gây ra ở thực vật dưới áp lực của muối [61, 62] NCA1 (no catalase activity1) tương tác và tăng hoạt động của catalase2 (CAT2) để phân hủy H2O2, do đó kiểm sốt cân bằng nội môi của nồng độ H2O2 trong tế bào dưới áp lực phi sinh học [62] Protein chaperone, Hsp17.6CII, kích hoạt hoạt động CAT2 theo cách phụ thuộc vào NCA1 và tăng khả năng chống chịu stress phi sinh học ở cây Arabidopsis [63] Phosphoryl hóa CatC, một catalase (CAT) trong lúa, bởi kinase giống thụ thể STRK1 (Receptor-Like Cytoplasmic Kinase 1) rất quan trọng đối với khả năng chịu mặn của cây trồng [64]
Stress do muối gây ra phản ứng và truyền tín hiệu ROS trong tế bào thực vật Các tầng MAPK, bao gồm một con đường truyền tín hiệu giải độc quan trọng, có liên quan đến các phản ứng bảo vệ chống oxy hóa và điều chỉnh cân bằng nội mơi ROS để đối phó với stress do muối/oxy hóa Cascade MEKK1-MKK1/MKK2-MPK4 đóng một vai trị quan trọng trong việc truyền tín hiệu căng thẳng do ROS và
SA khởi xướng ở Arabidopsis Phân tích phiên mã của các đột biến mekk1, mkk1/2,
Trang 291.3.3.3 Phản ứng của thực vật dưới stress mặn
a) Dưới tác động stress thẩm thấu
Trong giai đoạn đầu tiên, giai đoạn thẩm thấu, bắt đầu ngay sau khi nồng độ muối xung quanh rễ tăng đến mức ngưỡng khiến rễ khó hút nước hơn, tốc độ phát triển của chồi giảm đáng kể Một phản ứng ngay lập tức đối với tình huống này là đồng thời làm giảm dịng ion đến chồi và đóng khí khẩu Tuy nhiên, do sự khác biệt về lượng nước giữa khí quyển và tế bào lá và nhu cầu cố định carbon, vì vậy, phương thức này không thể kéo dài [66] Sự phát triển của chồi nhạy cảm hơn so với sự phát triển của rễ đối với áp lực thẩm thấu do muối gây ra có lẽ vì sự giảm phát triển diện tích lá so với sự phát triển của rễ sẽ làm giảm lượng nước sử dụng của cây, do đó cho phép sự duy trì độ ẩm của đất và ngăn ngừa sự hấp thu lượng lớn muối vào cây [67]
b) Dưới tác động của stress ion
Ở phần lớn các loài thực vật khi ở trong điều kiện mặn, Na+ thường đạt đến nồng độ gây độc trước Cl−, và vì vậy hầu hết các nghiên cứu đều tập trung vào việc loại trừ Na+ và kiểm soát sự vận chuyển Na+ bên trong cây [67] Từ đó có thể thấy cơ chế chống chịu quan trọng khác liên quan đến khả năng giảm căng thẳng ion trên cây trồng là giảm thiểu lượng Na+ tích tụ trong nguyên sinh chất của tế bào đặc biệt ở lá, thông qua sự điều chỉnh tăng giảm hoạt động của các kênh ion và chất vận chuyển cụ thể, cho phép kiểm soát quá trình vận chuyển Na+ trong tồn bộ cây [67, 68] Việc hạn chế lượng Na+ dư thừa ở lá là một trong những cơ chế chống chịu mặn ở nhóm cây ngũ cốc bao gồm lúa, lúa mì cứng (durum wheat), lúa mì (bread wheat) và lúa mạch [69] Hạn chế lượng Na+ dư thừa ở lá được thực hiện bằng việc kiểm soát hấp thu Na+ với lượng thấp bởi các tế bào ở vỏ rễ và sự kiểm soát chặt chẽ việc nạp vào xylem qua các tế bào nhu mô xylem [70] Loại trừ Na+ từ rễ đảm bảo rằng Na+ khơng tích tụ đến nồng độ độc hại trong phiến lá [67]
Trang 30dịng nước chảy vào tế bào, do đó cho phép thực vật phát triển trong đất có độ mặn cao Kênh ngược dòng sử dụng động lực proton được tạo ra bởi các enzyme vận chuyển H+ ở không bào (vacuolar H+-translocating enzymes), H+-adenosine triphosphatase (ATPase) và H+- inorganic pyrophosphatase (PPiase) AtNHX1 là kênh ngược dòng Na+/H+, hiện diện ở tonoplast, được ghi nhận có liên quan đến
việc kiểm sốt tiềm năng thẩm thấu khơng bào ở cây Arabidopsis [71]
c) Dưới tác động stress oxi hóa
Ở thực vật, thành tế bào bao gồm các sợi cellulose được liên kết với nhau bằng hemicellulose, chẳng hạn như xyloglucan và arabinoxylan, và được gắn trong gel pectin [72] Thành tế bào cũng chứa phenolic; enzyme peroxidase, pectin esterase và các enzyme khác; protein nối dài (extensin), protein mở rộng (expansin) và các protein khác; và ion Ca2+ Muối, hạn hán và các căng thẳng thẩm thấu khác có thể gây ra sự tích tụ ROS và những thay đổi khác trong thành tế bào [72] Sự tích lũy ROS có thể gây ra liên kết ngang của phenolic và glycoprotein ở thành tế bào như extensin, dẫn đến cứng thành tế bào Mặt khác, stress làm tăng cường expansin và các enzyme biến đổi xyloglucan làm biến đổi cấu trúc thành tế bào [72] Ngoài ra, stress muối cịn có thể làm thành tế bào bị mất Ca2+ Thực vật có thể được bảo vệ khỏi bị tổn thương bằng cách tăng khả năng chịu đựng căng thẳng bằng cách loại bỏ gốc tự do thông qua ba loại enzyme: ascorbate peroxidase, glutathione peroxidase và glutathione reductase
1.4 Vai trò của PP2CA (clade A type 2C protein phosphatases) với đóng mở khí khẩu
1.4.1 SLAC
Lỗ khí khẩu là một lỗ được bao quanh bởi hai tế bào bảo vệ, có thể mở rộng hoặc thu nhỏ do thay đổi áp suất trương Các kênh như kênh K+ - đưa K+ ra ngoài (K+-outward-rectifying channel - GORK), kênh K+- đưa K+ vào trong (K+-inward-rectifying channel - KAT1), kênh anion loại nhanh và kênh anion loại chậm (slow-type anion channel - SLAC1) điều chỉnh áp suất trương của các tế bào bảo vệ bằng cách vận chuyển các ion bao gồm K+, Cl− và malate [73-75] Trong số các kênh này,
Trang 31(Arabidopsis) SLAC1 được kích hoạt sẽ khử cực màng sinh chất để kích hoạt GORK và đẩy K+ ra khỏi tế bào bảo vệ, do đó làm giảm áp suất trương và đóng lỗ khí khẩu [76]
1.4.2 SAPK
Tín hiệu ABA và Ca2+ điều chỉnh hoạt động của SLAC1 thơng qua q trình phosphoryl hóa (phosphorylation) và khử phosphoryl hoá (dephosphorylation) Serine 120 (Ser120) của Arabidopsis SLAC1 được phosphoryl hóa và được kích hoạt khi có mặt ABA, chủ yếu bởi Open Stomata 1 (OST1; còn được gọi là SnRK2E hoặc SnRK2.6), một loại protein thuộc họ protein kinase2 (SnRK2) liên quan đến SNF1 [77-79] Ngoài ra, protein kinase phụ thuộc calcium 21/6/23 (calcium-dependent protein kinase 21/6/23 - CPK 21/6/23) và protein kinase tương tác CBL (cbl-interacting protein kinase - CIPK), đóng vai trị trong tín hiệu phụ thuộc Ca2+, kích hoạt SLAC1 bằng cách phosphoryl hóa Ser59 để đáp ứng với tín hiệu Ca2+ [80-82]
OST1 (SnRK2–6) là một chất điều chỉnh tích cực quan trọng đối với q trình truyền tín hiệu ABA trong các tế bào bảo vệ ở Arabidopsis [79, 82] Phiên bản của Arabidopsis SnRK2s trên cây lúa được gọi là Osmotic Stress/ABA-Activated Protein Kinases (SAPKs) và có mười SAPK có mặt trong bộ gen của cây lúa [83]
1.4.3 PP2CA
Các phosphatase protein loại 2C của nhánh A (clade A type 2C protein phosphatases - PP2CA) đóng vai trị kìm hãm việc đóng khí khẩu thơng qua tín hiệu ABA và Ca2+ [84, 85] PP2CA triệt tiêu tín hiệu ABA bằng cách tương tác và vơ hiệu hóa OST1 và CPK6 Mặt khác, các PP2CA tương tác trực tiếp và vô hiệu hóa SLAC1 bằng cách khử phosphoryl hoá, chống lại quá trình OST1 hoặc CPK phosphoryl hóa SLAC1 để đáp ứng với tín hiệu ABA hoặc Ca2+ [78, 79, 82]
Trang 32tác giữa các thành phần tín hiệu: một con đường tương tác phân cấp (hierarchical interaction pathway) bao gồm OsPP2C50 và OsPP2C53, SAPK10 và OsSLAC1; và một lộ trình tương tác phân nhánh (branched interaction pathway) trong đó OsPP2C50 và OsPP2C53 tương tác trực tiếp với OsSLAC1
1.5 Chitosan
1.5.1 Đặc điểm cấu trúc
Chitosan thu được từ chitin, được coi là polysaccharide tự nhiên phổ biến thứ hai sau cellulose [3] Về mặt cấu trúc, chitin bao gồm đơn vị lặp lại monosaccharide của N-acetylglucosamine Sau khi khử acetyl chitin, sản phẩm chitosan thu được là một polymer mạch thẳng bao gồm hai đơn vị là D-glucosamine và N-acetyl-D-glucosamine liên kết với nhau bằng liên kết glycoside Sự hiện diện của nhóm amine này tạo điều kiện sửa đổi cấu trúc và tổng hợp các dẫn xuất chức năng của thực vật [87] Về mặt thương mại, chitosan được điều chế bằng cách khử chitin bằng cách sử dụng acid sau đó là khử protein với base [88]
1.5.2 Các con đường tín hiệu của chitosan trên thực vật
Trang 33Tín hiệu nitric oxide đã được nghiên cứu ở cây cao lương được xử lý bằng chitosan, trong đó chất ức chế NO ngoại sinh LNAME (N-nitro-L-arginine methyl ester hydrochloride) hoặc chất loại bỏ NO c-PTIO [2- (4-carboxyphenyl) -4,4,5,5-tetramethylimidazoline-1-oxy-3-ox] được sử dụng cho kết quả khả năng tự vệ của cây khỏi sự tấn công của mầm bệnh Chitosan cũng tạo ra sự tích tụ acid jasmonic
(JA) trong lúa và Phaseolus vulgaris Phân tích RT-PCR microarray/bán định lượng cDNA về biểu hiện gen Brassica napus cho thấy JA/ethylene đóng vai trị tín hiệu
trong phản ứng bảo vệ thực vật qua trung gian chitosan Sự hoạt hóa phiên mã của gen mã hóa phenylalanine amoniac lyase (PAL) và chất ức chế protease kích hoạt bởi cả chitosan và acid jasmonic [91] Chitosan có thể kích hoạt tổng hợp JA và ABA JA và ABA có các hoạt động tương tự, đóng vai trị khơng nhỏ trong việc điều tiết sử dụng nước của thực vật Ở cây lúa, có sự gia tăng sự tích tụ JA và 12-oxophytodieonic thông qua con đường octadecanoid khi được xử lý bằng chitosan, trong khi ABA cũng được cảm ứng thông qua tín hiệu hydrogen peroxide dẫn đến đóng khí khẩu [92] Ngoài ra, ứng dụng chitosan dẫn đến các phản ứng phòng vệ nâng cao liên quan đến việc kích hoạt hydrogen peroxide thông qua con đường octadecanoid và NO trong lục lạp, kích hoạt MAP-kinase, bùng nổ oxy hóa và phản ứng siêu mẫn cảm [93] Tồn bộ các phân tử tín hiệu này góp phần vào cơ chế thích ứng ở các cây được xử lý bằng chitosan để phản ứng với stress
1.5.3 Phản ứng của thực vật dưới tác động chitosan trong điều kiện stress
Chitosan và các dẫn xuất của nó kích thích tổng hợp hợp chất hữu cơ trên thực vật [92] Dưới tác động của stress sinh học, thực vật thực hiện phản ứng phòng vệ bao gồm sản xuất phytoalexin, các protein đối kháng bệnh thực vật như chitinase và b-glucanase, ức chế proteinase, hình thành callose, sinh tổng hợp lignin và kích hoạt các gen phản ứng với stress Bên cạnh đó, khi được xử lí với chitosan và oligomer của nó, nồng độ hợp chất phịng thủ thực vật này được tăng lên, tạo điều kiện cho việc sử dụng chitosan và các dẫn xuất của nó như các hợp chất kháng khuẩn mạnh và chất kích kháng để bảo vệ thực vật [4] Việc tạo ra enzyme chitinase và glucanase bằng cách xử lý chitosan đã được ghi nhận ở một số cây trồng, bao
Trang 34Chitinase và glucanase là các hợp chất liên quan đến tính kháng mầm bệnh, tuy nhiên, trong cây lúa, chitosan có trọng lượng phân tử khác nhau thúc đẩy sự biểu hiện ở mức độ khác nhau của protein liên quan đến tình trạng cây, điều này cho thấy chitosan có chức năng khác nhau nguồn gốc của nó [94] Hơn nữa, chitosan trọng lượng phân tử thấp (5 kDa) có thể cảm ứng thực vật tạo ra phytoalexin và các hợp chất liên quan đến tình trạng bệnh lý của cây như chitinase, β-glucanase, lipoxygenase và kích hoạt sự tạo ra các gốc oxy hóa Xử lý hạt giống bằng các phân đoạn chitosan và dẫn xuất oligosaccharide của nó đã làm tăng hoạt tính chitinase trong cây con lên 30% - 50% [95]
1.5.3.1 Phản ứng của thực vật dưới tác động chitosan trong điều kiện stress mặn
Các nghiên cứu khác nhau đã phát hiện ra rằng sự tích lũy MDA (malondialdehyde) ở cây bị ảnh hưởng bởi muối chủ yếu là do sự peroxy hóa lipid của màng gây ra bởi độc tính ion Tuy nhiên, một số nhà nghiên cứu đã cho rằng xử lí bằng chitosan ở nồng độ thấp có thể làm giảm bớt các tác động tiêu cực do stress
muối gây ra Hạt nghệ (Carthamus tinctorius L.) và hướng dương (Helianthus
annuus L.) được xử lý bằng chitosan nồng độ thấp có thể làm giảm stress oxy hóa
Trang 351.5.3.2 Chitosan ảnh hưởng đến hoạt động sinh hóa của thực vật trong điều kiện stress mặn
Trang 37CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
2.1 Vật liệu
2.1.1 Giống lúa IR 64 (OM 89)
Giống được chọn lọc từ tập đoàn giống nhập nội của IRRI, được công nhận giống theo quyết định số 402 BNN, ngày 27 tháng 11 năm 1986 Hạt giống được sử dụng trong thí nghiệm được cung cấp bởi Cơng ty Cổ phần Giống nông nghiệp Điện Biên
2.1.2 Oligochitosan
Oligochitosan phân đoạn 5.994 Da được cắt bởi bức xạ gamma liều xạ 150 kGy từ chitosan 5%, kích thước phân tử 573.170 Da (Funakoshi - Tokyo, Japan) với độ deacetyl hố 80% (cung cấp bởi phịng thí nghiệm Cơng nghệ Sinh học Vật liệu
và Nano thuộc Trung tâm Công nghệ Sinh học thành phố Hồ Chí Minh) 2.2 Phương pháp
Trang 38Hình 2.1 Qui trình thực hiện thí nghiệm
2.2.1 Tạo hạt lúa nảy mầm in vitro
Hạt lúa giống IR64 khử trùng với javel 15% trong 20 phút Đặt trên giấy thấm (đã làm ẩm với nước cất) trên đĩa petri đường kính 15 cm ở điều kiện tối trong 3 ngày Khi hạt lúa nảy mầm (diệp tiêu cao khoảng 1 cm, rễ nhô ra khỏi vỏ trấu 2-3 cm), lúc này các hạt lúa sẵn sàng chuyển sang điều kiện thủy canh
Hạt lúa Khử trùng Ngâm trong nước
Nảy mầm Chọn cây mầm Thủy canh trong nhà lưới
Trong javel 15% (15 phút) (1 ngày)
Trong đĩa petri 15 cm lót giấy thấm ẩm (3 ngày) Mầm cao 1 cm, rễ dài khoảng 2 - 3 cm
Cây con 7 ngày tuổi
Dd Yoshida (đối chứng)
Dd Yoshida + NaCl 0,6% + OC 5.994 Da 75 ppm (xử lí) Dd Yoshida + 0,6%NaCl (mặn) Dung dịch Yoshida (7 ngày)
Xử lí (7 ngày)
Khảo sát
Chỉ tiêu sinh trưởng
Hàm lượng proline
Hàm lượng sắc tố quang hợp
Hàm lượng protein
Hàm lượng đường tổng, đường tan Đặc điểm bề mặt lá và khí khẩu Yếu tố điều khiển đóng mở khí khẩu
Trang 392.2.2 Thủy canh cây mạ lúa in vivo
Hạt nảy mầm (rễ nhú ra khỏi hạt – 3 ngày sau khi gieo) được chuyển qua hệ thống thủy canh với dung dịch Yoshida [102] trong 7 ngày Hệ thống thủy canh bào gồm chậu nhựa chứa dịch (12 x 18 x 6 cm) và phần nổi bằng xốp có lớp lưới bên dưới để đỡ hạt Sau 7 ngày, cây con được xử lý với các điều kiện khác nhau như sau: (1) đối chứng (dung dịch Yoshida); (2) stress mặn (dung dịch Yoshida + NaCl 0,6%); (3) stress mặn kết hợp với xử lý oligochitosan Oligochitosan 5.994Da 75 ppm sẽ được phun vào ngày 1 và ngày 4 (ngày 1 là ngày bắt đầu xử lí) Cây con được ni trong điều kiện trên trong 7 ngày trước khi được thu nhận và phân tích các chỉ tiêu về sinh trưởng, sinh lý, sinh hố… Thí nghiệm được bố trí theo kiểu hồn toàn ngẫu nghiên, mỗi nghiệm thức được lặp lại 3 lần, mỗi lần lặp lại gồm 20 cây
2.2.3 Khảo sát chỉ tiêu sinh trưởng
• Số lượng lá: đếm tất cả lá hiện diện trên cây
• Chiều cao cây: duỗi lá thẳng theo gốc cây, đo từ điểm bắt đầu ra rễ đến điểm lá dài nhất sau khi duỗi thẳng
• Chiều dài rễ: tương tự duỗi thẳng bộ rễ, đo từ điểm bắt đầu ra rễ đến điểm rễ dài nhất sau khi duỗi thẳng
• Hình thái rễ: độ dày bộ rễ, sự tồn tại của lơng hút
• Khối lượng tươi, khối lượng khô: cân khối lượng tươi cây 14 ngày tuổi, sau đó sấy khơ ở 70oC đến khối lượng không đổi, cân thu số liệu khối lượng khô
2.2.4 Nồng độ sắc tố quang hợp (Chlorophyll a, b và carotenoid)
Cơ sở phương pháp:
Sắc tố quang hợp được xác đinh nồng độ bằng phương pháp đo quang theo Wellburn [103] dựa vào tính chất hấp thụ năng lượng ánh sáng chọn lọc của chlorophyll (vùng ánh sáng xanh λ: 430 – 460 nm; vùng ánh sáng đỏ λ: 620 - 700 nm) và khả năng hòa tan trong dung môi ethanol
Tiến hành:
Trang 40Cân 0,2 gram lá lúa sau 14 ngày thủy canh, nghiền nát trong cối với 10 mL dung dịch ethanol 96%, lọc nhanh dịch chiết vào bình định mức và định mức thành 25 mL
Bước 2 – Định lượng sắc tố trong dịch thu được
Dung dịch sau khi định mức được tiến hành đo OD ở các bước sóng lần lượt là 470 nm, 649 nm, 665 nm sử dụng công thức phụ lục 1 mục 1 để tính nồng độ diệp lục tố và carotenoid
2.2.5 Nồng độ proline
Nồng độ proline trong rễ và lá lúa được xác định bằng phương pháp đo quang theo Carillo [104]
Cơ sở phương pháp:
Phương pháp sử dụng ninhydrin (2,2- dihydroxyindane-1,3-dione, số hiệu CAS 485-47-2) và máy đo quang phổ cuvette để xác định nồng độ proline có trong các mẫu mô thực vật trong điều kiện stress Dưới tác động của stress, nồng độ proline có trong mẫu thực vật tăng cao đáng kể (gấp khoảng 100 lần so với bình thường) trong khi nồng độ các amino acid khác có khả năng tương tác với ninhydrin (đối tượng gây nhiễu) giảm, như vậy xem như đối tượng gây nhiễu không đáng kể và không ảnh hưởng đến phép đo
Đối với phản ứng định lượng proline, ở pH thấp (pH acid), sản phẩm có màu vàng nhạt và độ hấp thụ lớn nhất ở bước sóng 520 nm Thuốc thử: ninhydrin 1% (w/v) trong acetic acid 60% (v/v), ethanol 20% (v/v) Dung dịch cần tránh ánh sáng và ổn định trong 24 giờ
Tiến hành:
Bước 1 – Xử lý mẫu và chiết proline:
Proline có thể được chiết xuất bằng cách đun 0,4 g lá lúa sau 14 ngày thủy canh trong ethanol nguyên chất trong 20 phút
Bước 2 – Định lượng proline trong dịch thu được