Nghiên cứu biến nạp gen kháng sâu cry1b vào đậu tương (glycine max (l ) merrill) thông qua vi khuẩn agrobacterium tumefaciens

Số hóa trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT VIỆN DI TRUYỀN NÔNG NGHIỆP -   TRẦN THU CÚC “NGHIÊN CỨU BIẾN NẠP GEN KHÁNG SÂU CRY1B VÀO ĐẬU TƢƠNG (Glycine max (L.) Merrill) THÔNG QUA VI KHUẨN Agrobacterium tumefaciens” LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Hà Nội, 2012 Tai ngay!!! Ban co the xoa dong chu nay!!! Số hóa trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT VIỆN DI TRUYỀN NÔNG NGHIỆP -   TRẦN THU CÚC “NGHIÊN CỨU BIẾN NẠP GEN KHÁNG SÂU CRY1B VÀO ĐẬU TƢƠNG (Glycine max (L.) Merrill) THÔNG QUA VI KHUẨN Agrobacterium tumefaciens” Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60 42 30 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: Ts Nguyễn Văn Đồng Hà Nội, 2012 Số hóa trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ MỤC LỤC MỞ ĐẦU Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan đậu tƣơng 1.1.1 Nguồn gốc phân loại đậu tƣơng 1.1.2 Đặc tính chống chịu đậu tƣơng 1.1.3 Tình hình sản xuất nhu cầu tiêu thụ đậu tƣơng 10 1.1.4 Tình trạng sâu hại đậu tƣơng 14 1.2 Agrobacterium tumefaciens tƣợng biến nạp gen thực vật 15 1.2.1 Giới thiệu chung A.tumefaciens 15 1.2.2 Cấu trúc chức Ti-plasmid 16 1.2.3 Cấu trúc chức đoạn T-DNA 17 1.2.4 Cơ chế phân tử việc biến nạp gen thông qua A tumefaciens 17 1.3 Hệ thống vector sử dụng để biến nạp gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens 19 1.3.1 Các vector sử dụng biến nạp gen thực vật 19 1.3.2 Gen thị gen kháng côn trùng 23 1.3.3 Promoter nghiên cứu biến nạp gen 28 1.4 Hệ thống tái sinh biến nạp gen đậu tƣơng 29 1.4.1 Hệ thống tái sinh đậu tƣơng 29 1.4.2 Phƣơng pháp biến nạp gen đậu tƣơng 31 Chƣơng 2: VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 35 2.1 Vật liệu thiết bị, dụng cụ, hóa chất thí nghiệm 35 2.1.1 Vật liệu 35 2.1.2 Thiết bị , dụng cụ hóa chất thí nghiệm 36 2.1.3 Địa điểm nghiên cứu 36 2.2 Nội dung nghiên cứu 36 2.3 Phƣơng pháp nghiên cứu 37 2.3.1 Chuẩn bị tế bào khả biến 37 2.3.2 Biến nạp plasmid vào tế bào vi khẩn 37 2.3.3 Phƣơng pháp tách chiết DNA plasmid từ vi khuẩn 37 2.3.4 Phƣơng pháp tách chiết DNA tổng số 38 Số hóa trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ 2.3.5 Phƣơng pháp điện di gel agarose 39 2.3.6 Phƣơng pháp nuôi cấy tái sinh hoàn chỉnh 39 2.3.7 Phƣơng pháp biến nạp gen vào giống đậu tƣơng 41 2.3.8 Sàng lọc, phân tích chuyển gen 42 2.3.9 Phƣơng pháp bố trí, theo dõi đánh giá thí nghiệm 43 2.3.9 Các tiêu đánh giá 44 Chƣơng 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 46 3.1 Kết biến nạp plasmid pX2 – mpi:Cry1B:nos vào số chủng vi khuẩn để biến nạp vào đậu tƣơng 46 3.2 Kết đánh giá khả tái sinh hoàn chỉnh số giống đậu tƣơng 47 3.1.1 Khả phát sinh chồi số giống đậu tương 47 3.1.2 Khả kéo dài chồi, rễ tạo hoàn chỉnh giống đậu tương nghiên cứu 49 3.3 Kết lựa chọn chủng vi khuẩn thích hợp cho chuyển gen đậu tƣơng 49 3.4.Tối ƣu hóa yếu tố ảnh hƣởng đến hiệu biến nạp gen 51 3.4.1.Ảnh hưởng mật dộ tế bào vi khuẩn lây nhiễm 51 3.4.2 Ảnh hưởng phương thức tăng cường khả lây nhiễm 53 3.4.3 Ảnh hưởng thời gian lây nhiễm 53 3.4.4 Ảnh hưởng thời gian đồng nuôi cấy 54 3.4.5 Ảnh hưởng nồng độ Acetosyringon (AS) 55 3.4.6 Ảnh hưởng hygromycin đến khả chọn lọc sau chuyển gen 56 2.5 Đánh giá chuyển gen 57 2.5.1 Đánh giá hiệu biến nạp gen cry1B vào giống đậu tƣơng chọn lọc 57 2.5.2 Đánh giá khả phân ly gen kháng sâu cry1B gen chọn lọc hpt (kháng kháng sinh) dòng đậu tƣơng chuyển gen 60 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 62 TÀI LIỆU THAM KHẢO 63 PHỤ LỤC 70 Số hóa trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ MỞ ĐẦU Tính cấp thiết đề tài Đậu tƣơng có tên khoa học Glycin max (L) Merril, công nghiệp thực phẩm quan trọng, nguồn cung cấp chủ lực protein dầu thực vật giới Hạt đậu tƣơng chứa hàm lƣợng protein từ 38 - 45%, cao loài thực vật, lipit từ 18 - 26% có muối khống Ca, Fe, Mg, P, K, Na, S; vitamin A, B1, B2, D, E, F; enzyme, sáp, nhựa, cellulose Đậu tƣơng đƣợc coi nguồn cung cấp protein hồn chỉnh chứa lƣợng đáng kể amino acid không thay cần thiết cho thể nhƣ isoleucin, leucin, lysin, metionin, phenylalanin, tryptophan, valin Ngoài giá trị dinh dƣỡng đậu tƣơng cịn ngun liệu cho ngành cơng nghiệp chế biến thực phẩm, chế biến thức ăn chăn nuôi, chế biến dƣợc phẩm Ngồi đậu tƣơng cịn trồng sử dụng để cải tạo đất có cộng sinh với vi khuẩn nốt sần Rhizobium Japoricum Ngày nay, tiêu thụ sản phẩm từ đậu tƣơng tăng lên tồn cầu, đậu tƣơng có nhiều lợi ích, làm giảm lƣợng cholesterol, phòng chống bệnh ung thƣ, đái tháo đƣờng, béo phì bảo vệ thể chống lại bệnh đƣờng ruột thận [1] Mặc dù đậu tƣơng mang lại nhiều lợi ích nhƣ vậy, nhƣng hàng năm giới tổn thất sâu hại đậu tƣơng gây ƣớc tính đạt khoảng 32% suất [130] Ở nƣớc ta năm gần diện tích trồng đậu tƣơng 170.000 ha, suất bình quân xấp xỉ 1,5 tấn/ha, sản lƣợng hạt 210 nghìn tấn, thấp nhiều so với suất bình quân giới [17] Việt Nam đặt mục tiêu tăng sản lƣợng đậu tƣơng lên đến 500 triệu tấn/năm vào năm 2010 Tuy nhiên, sản lƣợng đậu tƣơng khó tăng nhanh năm tới suất cịn thấp, chi phí cho hóa chất trừ sâu hại cao, làm hạn chế khả tăng suất, tăng mùa vụ diện tích gieo trồng đậu tƣơng Trong sản xuất đậu tƣơng Việt Nam thƣờng đối mặt với nhiều lồi sâu gây hại Cơng nghệ sinh học đại trồng biến đổi di truyền đƣợc ứng dụng rộng rãi nhƣ có nhiều đóng góp giá trị cho sản xuất nông nghiệp, đặc biệt lĩnh vực tạo giống trồng Công nghệ sinh học với tiến kỹ thuật DNA tái tổ hợp chuyển gen thực vật, gen đƣợc phân lập từ sinh vật khác loài, thực vật, vi sinh vật động vật đƣợc đƣa vào trồng Với khả tuyệt vời cho phép tạo hàng loạt trồng mang gen hữu ích, có đặc tính nông học quan trọng nhƣ kháng sâu, kháng thuốc diệt cỏ, chín sớm đặc tính có lợi khác, điều mà nhà chọn giống truyền thống chƣa làm đƣợc Theo tính tốn gần đây, giai đoạn 1996 – 2012 diện tích trồng biến đổi gen tăng 87 lần, điều cho thấy công nghệ trồng biến đổi gen cơng Số hóa trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ nghệ đƣợc chấp nhận nhanh lịch sử nông nghiệp đại Từ năm 1996 đến năm 2009, trồng biến đổi gen góp phần tạo nên tính bền vững giảm biến đổi khí hậu Điều đƣợc thấy thơng qua sản lƣợng trồng ngày tăng trị giá 65 tỷ USD, tiết kiệm 393 triệu thuốc trừ sâu, tính năm 2009 giảm phát thải 18 tỷ kg khí CO2, tƣơng đƣơng giảm gần triệu xe đƣờng – tạo môi trƣờng hơn, bảo tồn đa dạng sinh học cách tiết kiệm 15 triệu đất hỗ trợ giảm ngèo cách giúp 14,4 triệu hộ nông dân nhỏ, số có hộ nơng dân ngƣời nghèo giới Cùng với trạng xu phát triển giới, Việt Nam triển khai nghiên cứu trồng chuyển gen nói chung nhƣ đậu tƣơng chuyển gen nói riêng, có kết ban đầu đáng ghi nhận [6], [11], [12], Trên sở thực tiễn này, chúng tơi thiết kế thí nghiệm nghiên cứu chuyển nạp gen kháng sâu đậu tƣơng Trong phạm vi đề tài, tiến hành: “Nghiên cứu biến nạp gen kháng sâu cry1B vào đậu tƣơng (Glycine max (L.) Merrill) thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumeficens” Mục tiêu nghiên cứu Nghiên cứu biến nạp gen kháng sâu cry1B vào số dòng/giống đậu tƣơng Việt Nam Yêu cầu nghiên cứu - Đánh giá khả tái sinh hoàn chỉnh số giống đậu tƣơng nghiên cứu, lựa chọn giống làm vật liệu cho thí nghiệm chuyển gen - Chọn chủng vi khuẩn Agrobacterium tumeficens phù hợp cho chuyển gen vào giống đậu tƣơng nghiên cứu - Tối ƣu hóa số yếu tố ảnh hƣởng đến hiệu biến nạp giống đậu tƣơng nghiên cứu - Đánh giá hiệu biến nạp gen cry1B vào số dịng/giống đậu tƣơng Việt Nam thơng qua vi khuẩn Agrobacterium tumeficens mang hệ thống vector pX2C1mpi:Cry1B:nos - Xác định có mặt gen kháng sâu cry1B gen thị chọn lọc hpt (kháng kháng sinh) dòng đậu tƣơng chuyển gen T1 Số hóa trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ Chƣơng TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan đậu tƣơng 1.1.1 Nguồn gốc phân loại đậu tƣơng Nguồn gốc: Đậu tƣơng loại trồng mà loài ngƣời biết sử dụng trồng trọt từ lâu đời, nguồn gốc đậu tƣơng sớm đƣợc xác minh Những chứng lịch sử, địa lý khảo cổ học công nhận đậu tƣơng có nguyên sản Châu Á có nguồn gốc từ Trung Quốc Cây đậu tƣơng đƣợc hóa Trung Quốc qua nhiều triều đại tiền phong kiến đƣợc đƣa vào trồng trọt, khảo sát triều đại Shang (năm 1700 – 1100 B.C) trƣớc cơng ngun[2] Phân loại: Có nhiều cách phân loại đậu tƣơng dựa yêu cầu, tiêu chí phân loại khác Hệ thống phân loại theo khóa phân loại Hymowitz, T C.A Newell vào đặc điểm hình thái, phân bố địa lý số lƣợng nhiễm sắc thể đƣợc nhiều ngƣời sử dụng [80] Theo đó, đậu tƣơng hay đỗ tƣơng, đậu nành có tên khoa học Glycine max (L.) Merr, thuộc: Bộ đậu : Fabales Họ đậu : Fabaceae Phân họ : Leguminosae Chi : Glycine Số lƣợng nhiễm sắc thể 2n = 40 Ngồi chi Glycine cịn có thêm chi phụ Soja Chi Glycine đƣợc chia thành loài hoang dại lâu năm, chi phụ Soja đƣợc chia làm loài: loài đậu tƣơng trồng Glycine (L.) Merrill loài hoang dại hàng năm G Soja Sieb Zucc 1.1.2 Đặc tính chống chịu đậu tƣơng Những bƣớc tiến Công nghệ sinh học đại bƣớc tạo trồng mang đặc tính hay phát huy mạnh đặc tính vốn có phục vụ nhu cầu sản xuất, kinh doanh tiêu dùng ngƣời Đậu tƣơng vậy, trồng quan trọng bậc – mối quan tâm ngƣời dân, nhà kinh tế, nhƣ nhà khoa học Và, vậy, đặc tính đậu tƣơng có nhiều thay đổi tích cực với đặc tính sẵn có nhờ có cơng nghệ sinh học đại Đặc tính kháng trùng, sâu, bệnh hại Tính kháng sâu hại đặc tính giống trồng có khả chống lại cơng loài sâu hại làm giảm tác hại sâu hại gây Tính kháng bệnh hại khả trồng chống đối, ngăn chặn xâm nhập, lây lan vật gây bệnh vào trồng Tính kháng bệnh biểu trồng khơng Số hóa trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ bị nhiễm bệnh hay bị nhiễm bệnh mức thấp, không gây ảnh hƣởng tới sinh trƣởng, suất trồng Đối với đậu tƣơng, số dòng/giống đƣợc đánh giá có khả kháng bệnh rỉ sắt nấm Phakopsora pachyrhizi gây Graham cộng sàng lọc 15.000 mẫu sƣu tập gen đậu tƣơng cho thấy có 5% mẫu có khả kháng bệnh giải trình tự locus Rpp4, xác định đƣợc nhóm gen đƣợc xem có khả kháng bệnh rỉ sắt (ASR) Khi so sánh dòng đậu tƣơng mẫn cảm với dịng có khả kháng bệnh ngƣời ta xác định gen Rpp4C4 Gen chịu trách nhiệm định khả kháng bệnh đậu tƣơng Rpp4C4 gen nằm cạnh locus Rpp4 Ở Việt Nam, T.A Pham cộng (2009) đánh giá khả kháng bệnh rỉ sắt 63 giống đậu tƣơng (trong có giống Việt Nam) qua năm mùa vụ khác từ 2005 đến 2009 xác định đƣợc giống DT2000 Vàng Hà Giang giống có khả kháng bệnh rỉ sắt tốt [134] Song, thống kê nƣớc trồng đậu tƣơng giới xác định suất đậu tƣơng bị suy giảm loại bệnh rỉ sắt gây khoảng từ 10 đến 80% tùy mùa vụ, điều kiện thời tiết, kỹ thuật canh tác giống đậu tƣơng gieo trồng Công tác nghiên cứu lai tạo đậu tƣơng kháng sâu hại, đặc biệt sâu thuộc cánh vảy (Lepidoptera), phƣơng pháp lai chọn hai hay nhiều giống đậu tƣơng với gặp nhiều khó khăn khơng thành công Nguyên nhân nguồn gen kháng với sâu cánh vảy đậu tƣơng lai tạo đƣợc từ nguồn bố mẹ mang tính kháng sâu hại nhƣ PI171451, PI229358 có thời gian sinh trƣởng dài, suất thấp, dễ đổ ngã kháng sâu mức độ trung bình nên khơng thích hợp cho sản xuất Các tiến gần công nghệ sinh học thực vật, đặc biệt việc sử dụng chuyển gen đánh dấu phân tử chọn tạo giống trồng mở hƣớng công tác lai tạo giống đậu tƣơng kháng sâu Năm 1994, Parrott cộng thực thí nghiệm chuyển gen Bt vào đậu tƣơng Tác giả sử dụng gen cry1Ac đƣợc phân lập từ chủng Bacillus thuringiensis var.kurstaki để tạo đậu tƣơng chuyển gen Bt Các chuyển gen Bt đƣợc dùng làm thức ăn cho sâu ăn Velvetbean (Anticarsia gemmatalis), làm sâu biếng ăn, chậm phát triển tỷ lệ sống sót giảm, kết biểu tính kháng tƣơng đƣơng với giống đậu tƣơng chuẩn kháng CatIR81-296 có tính kháng cao sâu cánh vảy Độ độc không cao đậu tƣơng chuyển gen Bt đƣợc xác định mức biểu thấp Bt protein (ít 1ng Bt protein/mg protein tổng số) đậu tƣơng [51] Để gia tăng tính kháng sâu nhƣ an tồn sinh học đậu tƣơng chuyển gen kháng sâu, nhiều nghiên cứu đƣợc tiến hành có thành cơng định Số hóa trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ Đặc tính tránh chịu hạn Các họ đậu nói chung, đậu tƣơng nói riêng có nhu cầu nƣớc cao loại khác, đậu tƣơng có hàm lƣợng protein lipit cao, để tổng hợp kg chất khô cần 500-530 kg nƣớc Trong trình nảy mầm nhu cầu nƣớc đậu tƣơng chiếm 50% khối lƣợng hạt, ngơ 30%, lúa 26% Tính tránh chịu hạn đậu tƣơng phân loại nhƣ sau: - Tránh hạn: chế số thời kỳ sinh trƣởng phát triển nhạy cảm đậu tƣơng tránh thoát ảnh hƣởng trực tiếp khô hạn - Chịu hạn giảm nƣớc, chịu đƣợc nƣớc Những cơng trình nghiên cứu chế phân tử khả chịu hạn thực vật năm gần rằng: gene tham gia vào trình chịu hạn thực vật đƣợc chia thành hai nhóm: Nhóm1- gen điều khiển (gen tổng hợp protein điều khiển trình phiên mã - transcription factor, kinase ) Nhóm 2- gen chức (gen tham gia vào trình tổng hợp photphatase, protease, late embryogenesis abundant (LEA), protein sinh tổng hợp amino acid, đƣờng: proline, mannitol, sorbitol làm cho thực vật tạo hàng loạt phản ứng sinh hoá sinh lí để tồn thích nghi Ngƣời ta chứng đƣợc rằng: gặp điều kiện bất lợi (hạn, mặn…), cần gen điều khiển hoạt động kích hoạt hàng loạt gen chức hoạt động nhằm trì sống sót trồng Gần đây, cơng trình nghiên cứu Trần cộng (2009) đậu tƣơng số 31 gen điều khiển GmNAC thuộc nhóm gen điều khiển NAC (DNA-binding transcriptional dual regulator of nitrogene assimilation) đƣợc kiểm tra, có gen liên quan đến khả chịu hạn, mặn lạnh Ở Việt Nam có số tác giả nghiên cứu khả chịu nóng, chịu hạn đậu tƣơng, tiêu biểu cơng trình đánh giá khả chịu hạn giống đậu tƣơng nhập nội Nguyễn Huy Hoàng (1992), nghiên cứu phân lập, xác định trình tự gen chaperonin tế bào chất từ giống đậu tƣơng đột biến M103 Phân lập gen dehydrin liên quan đến khả chịu hạn đậu tƣơng Trần Thị Phƣơng Liên (1999), Nguyễn Thu Hiền cộng (2003) Nâng cao tính chịu hạn đậu tƣơng phƣơng pháp đột biến thực nghiệm Chu Hoàng Mậu (2001) Tính chịu lạnh Nhiệt độ dƣới 150C có ảnh hƣởng xấu đến nảy mầm hạt hút nƣớc Nhiệt độ dƣới 13-150C, giảm hoa, đậu ảnh hƣởng tới quang hợp toàn máy quang hợp Tổn thƣơng lạnh thƣờng gây hại màng tế bào,do màng tế bào khơng có khả giữ cấu trúc nhiệt độ thấp Các mơ, chẳng hạn nhƣ hạt phấn lớn dễ nhạy cảm với nhiệt độ thấp mô khác dẫn đến bất dục đậu tƣơng [4] Số hóa trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ Đặc tính kháng thuốc diệt cỏ Bằng công nghệ sinh học ngƣời ta tạo giống trồng kháng thuốc diệt cỏ, cho phép loại trừ đƣợc cỏ dại cách chọn lọc Nhìn chung, sản xuất trồng kháng thuốc diệt cỏ đƣợc tiến hành việc chuyển gen mã hóa enzyme gây bất hoạt thuốc diệt cỏ vào trồng Gen mã hóa enzyme tổng hợp 5-enolpyruvyl3-phosphoshikimic (EPSPS), gen mã hóa enzyme phosphinothricin acetyl transerase (PAT) đƣợc chuyển vào đậu tƣơng tạo dòng đậu tƣơng chuyển gen kháng thuốc diệt cỏ glyphosate /glufosinate Theo Lawton (1999) có khoảng 1000 giống đậu tƣơng kháng thuốc diệt cỏ glyphosate đƣợc bán 200 công ty giới Monsanto, công ty giữ quyền giống đậu tƣơng chuyển gen kháng cỏ “Round up” thống kê cho thấy năm 1996 có khoảng 0,4 triệu hecta trồng đậu tƣơng kháng thuốc diệt cỏ, năm 1997 tăng lên 3,6 triệu hecta năm 1998 đạt 11,3 triệu hecta [38] Các giống đậu tƣơng chuyển gen kháng thuốc diệt cỏ glufosinate, Roundup imidazoline đƣợc thƣơng mại hóa Năm 2004, hàng loạt giống đậu tƣơng chuyển gen kháng loại thuốc diệt cỏ khác đƣợc trồng chủ yếu Mỹ chúng đƣợc nhập vào cộng đồng chung Châu Âu, tồn nhiều tranh cãi Trong thập kỷ qua (1995-2006), chuyển gen, đặc tính kháng thuốc diệt cỏ liên tục tính trạng bật (chiếm 71%), tiếp sau đặc tính kháng sâu bệnh (chiếm 18%), mang hai đặc tính (chiếm 11%) 1.1.3 Tình hình sản xuất nhu cầu tiêu thụ đậu tƣơng Cây đậu tƣơng trồng cạn, ngắn ngày, dễ trồng, có tác dụng cải tạo đất, tăng suất trồng khác hoạt động cố định đạm loài vi khuẩn Rhizobium cộng sinh rễ đậu Đậu tƣơng nguồn thực phẩm có giá trị kinh tế cao, giàu đạm, giàu chất béo, giàu chất khoáng, vitamin đƣợc ƣu gọi “ Ơng Hồng lồi đậu” Tình hình sản xuất đậu tƣơng: Trên giới: Quê hƣơng đậu tƣơng Đông Nam châu Á, nhƣng 45% diện tích trồng đậu tƣơng 55% sản lƣợng đậu tƣơng giới nằm Mỹ Do khả thích ứng rộng đậu tƣơng đƣợc trồng khắp châu lục, tập trung nhiều châu Mỹ (73,03%), tiếp đến châu Á (23,15%) số nƣớc khác giới (nguồn UNFood & Agriculture Organisation, FAO) Năm 2009, tổng sản lƣợng đậu tƣơng đƣợc sản xuất giới 210,9 triệu Mỹ nƣớc dẫn đầu với sản lƣợng 80,7 triệu (chiếm 38% so với toàn giới) Brazil xếp thứ với 57 triệu chiếm 27%, Argentina 15% (32 triệu tấn), Trung Quốc 7% (15,5 triệu tấn)… 10 Số hóa trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ 5mg/l 20 mg/l 30 mg/l Hình 3.4 : Chọn lọc mẫu môi trƣờng bổ sung hygromycin nồng độ 2.5 Đánh giá chuyển gen Để đánh giá hiệu biến nạp gen hệ thống vector pX2 mang đoạn TDNA đậu tƣơng Chúng tiến hành thí nghiệm chuyển gen đồng thời vào giống đậu tƣơng chọn lọc ĐT 22, DT2008 DT84 phƣơng pháp nốt mầm thông qua vi khuẩn Agrobacterium, chủng EHA105 Quy trình phƣơng pháp biến nạp đƣợc tiến hành dựa yếu tố đƣợc tối ƣu 2.5.1 Đánh giá hiệu biến nạp gen cry1B vào giống đậu tƣơng chọn lọc Các thí nghiệm chuyển gen đƣợc tiến hành theo tiến trình nhƣ nêu, đến giai đoạn thu đƣợc 39 từ giống ĐT 22, từ giống DT 2008, 10 từ giống DT 84 sống sót Sau tách DNA tổng số (hình 3.4) mẫu lá, phân tích PCR kiểm tra có mặt gen cry1B, hpt dòng đậu tƣơng hệ To, thấy đƣợc: DT 2008 khơng có biểu gen hpt cry1B, 10 DT 84 có dƣơng tính với cry1B dƣơng tính với hai gen cry1B hpt, ĐT 22 thu đƣợc số dƣơng tính với gen chuyển nhiều nhất, có dƣơng tính với gen cry1B, dƣơng tính với gen hpt, dƣơng tính với hai gen cry1B hpt, 18 âm tính Hiệu biến nạp gen cry1B đậu tƣơng ĐT 22 cao số giống nghiên cứu (ĐT 22, DT2008, DT84) đạt 0,42 % Nhƣ vậy, với kết nhƣ trên, nói quy trình phƣơng pháp chuyển gen kháng sâu cry1B giống đậu tƣơng ĐT22 đƣợc đánh giá tối ƣu hóa phần cải thiện đƣợc hiệu biến nạp gen Hinh 3.5: Kết điện di DNA tổng số To 57 Số hóa trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ Ghi chú: 1-3: DNA tổng số từ mẫu dòng ĐT 22 4-6: DNA tổng số từ mẫu dòng DT 2008 7-10: DNA tổng số từ mẫu dòng DT 84 Bảng 3.10:Kết phân tích PCR dịng đậu tƣơng chuyển gen với cặp mồi cry1B Tên giống ĐT22 DT2008 DT84 Số lƣợng hạt giống (hạt) 50 50 50 Số mẫu ban đầu (mẫu) Số sống sót (cây) 100 100 100 39 10 Cry1B hpt Hiệu suất biến nạp gen cry1B (%) 16 17 0,41 0,00 0,10 PCR (+) (cây) Các dòng To đƣợc ký hiệu để thuận tiện theo dõi nhƣ sau: Các dòng giống ĐT22: C22.1 đến C22.39 (C22.1 – C22.18 dòng khơng mang gen chuyển, C22.19 – C22.38 dịng mang gen kháng sâu cry1B, C22.19 – C22.39 dòng mang gen hpt) Các dòng giống DT 2008: C08.1 đến C08.7, dòng giống ĐT 84: C84.1 đến C84.10, khơng có dƣơng tính với gen chuyển Các dòng giống DT 84: C84.1 đến C84.10 (C84.1 dƣơng tính với hai gen cry1B hpt, cịn lại dịng khơng mang gen chuyển) 556 bp Hình 3.6: Kết điện di sản phẩm PCR gen hpt dòng giống đậu tƣơng ĐT 22 hệ T0 Ghi chú: M: Maker ( kích thước 1kb) 1: Đối chứng (+) (kích thước 556 bp) 2: Đối chứng (-): H2O 3: Dòng đậu tương C22.27 4: Dòng đậu tương C22 5: Dòng đậu tương C22 6: Dòng đậu tương C22.15 7: Dòng đậu tương C22 31 58 Số hóa trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ 642 bp Hình 3.7: Kết điện di sản phẩm PCR gen cry1B dòng giống đậu tƣơng ĐT 22 hệ T0 Ghi chú: M: Maker ( kích thước 1kb) 1: Đối chứng (+) (kích thước 642 bp) 2: Dòng đậu tương C22.31 3: Dòng đậu tương C22 15 4: Dòng đậu tương C22 39 5: Đối chứng (-): H2O Hình 3.8: Một số hình ảnh cây, thu hoạch dòng đậu tƣơng ĐT 22 hệ T0 59 Số hóa trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ 2.5.2 Đánh giá khả phân ly gen kháng sâu cry1B gen chọn lọc hpt (kháng kháng sinh) dòng đậu tƣơng chuyển gen Vector pX2-C1mpi:Cry1B:nos vector nhị thể mang T-DNA, gen kháng sâu gen kháng kháng sinh nằm hai T-DNA, nên có khả gen phân ly hệ T1 nhƣ vậy, đánh giá trồng chuyển gen phƣơng diện an tồn sinh học Trong thí nghiệm chúng tơi, dịng đậu tƣơng T0 giống ĐT22 trì đƣợc đến thu hoạch 15 dòng, dòng giống DT2008, khơng có dịng DT 84 sống sót Số lƣợng hạt thu đƣợc dịng đậu tƣơng hệ T0 tối đa 23 hạt dòng C22.7 số lƣợng hạt tối thiểu hạt dịng C22.33 Để xác định có mặt gen kháng sâu (cry1B) gen kháng kháng sinh hygromycine (hpt) giống ĐT 22 hệ sau, tiến hành gieo trồng hạt T1 dịng T0 dƣơng tính với hai gen cry1B gen hpt (C22.19 đến C22.38), dòng hạt Lá chét thứ T1 đƣợc sử dụng để tách DNA kiểm tra phân ly gen kháng sâu gen kháng kháng sinh thông qua PCR Kết thu đƣợc thông kê bảng 3.11, cho thấy: Ở hệ T1, xuất mang mang gen kháng sâu cry1B (chiếm tỉ lệ 3/18 = 16,7%), thuộc dòng C22.26.1, C22.30.1 C22.31.1 Bảng 3.11: Xác định có mặt gen cry1B gen kháng kháng sinh hpt hệ T1 thơng qua PCR Dịng C22.19.1 C22.20.1 C22.21.1 C22.22.1 C22.23.1 C22.24.1 C22.25.1 C22.26.1 C22.27.1 C22.28.1 C22.29.1 C22.30.1 C22.31.1 C22.32.1 C22.33.1 C22.34.1 C22.35.1 C22.36.1 Cry1B + + hpt + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + 60 Số hóa trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ 642 bp Hình 3.9: Kết điện di sản phẩm PCR gen cry1B dòng giống đậu tƣơng ĐT 22 hệ T1 Ghi chú: 5: Dịng C22 28.1 M: Maker ( kích thước 1kb) 6: Dòng C22 36.1 1: Đối chứng (-): H2O 7: Dòng C22.33.1 8: Dịng C22 34.1 2: Đối chứng (+) (kích thước 642 bp) 9: Dòng C22.33.1 3: Dòng đậu tương C22.31.2 10: Dòng C22.39.1 4: Dòng C22 26.1 11: Dòng đậu tương C22 30.1 Cho đến thời điểm tại, có nhiều cơng bố sử dụng vector 2T –DNA để biến nạp gen đích vào đối tƣợng quan tâm Năm 2003, Breitler J.C cộng sử dụng vector pX2 [22] cải tiến biến nạp vào lúa Kết phân tích cho thấy hệ chuyển gen ban đầu (T0) có tới 82-90% cá thể mang gen quan tâm (gen bar) gen kháng kháng sinh hygromycin đƣợc chuyển đồng thời vào Tuy nhiên, hệ T1, tỷ lệ kháng thuốc diệt cỏ hygromycin chiếm 14,3 17% Phân tích tính trạng hình thái T0 cho thấy, gen chọn lọc hygromycin gen kháng chất diệt cỏ nằm vị trí khơng liên kết locus nên bị phân tách hệ T1 Bằng phƣơng pháp lúa chuyển gen không mang gen kháng kháng sinh đƣợc tạo 61 Số hóa trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ KẾT LUẬN Từ kết thu đƣợc đƣa số kết luận sau: Trong giống khảo sát (ĐT 22, DT84, DT 2008, ), giống đậu tƣơng ĐT 22 cho hệ số nhân chồi cao (số chồi trung bình/mẫu = 4), chiếm 84,78%, khả kéo dài chồi, rễ sức sống tốt Chủng vi khuẩn thích hợp cho biến nạp gen đậu tƣơng ĐT 22 EHA105 Một số yếu tố ảnh hƣởng đến hiệu chuyển gen đậu tƣơng ĐT22 đƣợc tối ƣu hóa nhƣ sau: Nồng độ vi khuẩn (OD600) : 0,5-0,7 Gây tổn thƣơng dung dịch nuôi khuẩn cho hiệu chuyển gen cao Thời gian lây nhiễm tối ƣu: 1h Nồng độ AS 200mg/l làm tăng hiệu biến nạp gen Thời gian đồng nuôi cấy ngày, 240C tối Nồng độ hygromycin 20mg/l có hiệu chọn lọc dòng chuyển gen Hiệu biến nạp gen thông qua chủng vi khuẩn EHA105 mang vector pX2 – C1mpi:cry1B:nos vào giống đậu tƣơng ĐT22, đƣợc kiểm tra PCR gen kháng sâu cry1B 0,41% Đã thu đƣợc T1 mang gen cry1B qua kiểm tra PCR ĐỀ NGHỊ DT2008 DT84 hai giống tiềm năng, cần đƣợc nghiên cứu hoàn thiện quy trình tái sinh hồn chỉnh chuyển gen để tạo dịng đậu tƣơng ƣu tú vừa có khả chịu hạn tốt vừa có khả kháng sâu Tiến hành đánh giá có mặt gen kháng sâu Cry1B gen kháng kháng sinh hygromycin (hpt) hệ chuyển gen giống ĐT22 thơng qua Southern blot nhằm tăng mức độ xác số liệu nghiên cứu Tiến hành thí nghiệm với sâu hại đậu tƣơng để đánh giá xác thực khả kháng sâu dòng đậu tƣơng mang gen cry1B thu đƣợc, nhƣ biểu promoter cảm ứng C1mpi mặt hình thái Tiến hành thí nghiệm tối ƣu hóa yếu tố ảnh hƣởng đến trình chuyển gen khác để nâng cao hiệu biến nạp gen, yếu tố nhƣ: nồng độ L-cystein, DTT, Natri thiosunfat 62 Số hóa trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt Đặng Thị Dung (1999), Côn trùng ký sinh mối quan hệ chúng với sâu hại đậu tương vùng Hà Nội phụ cận, Tóm tắt luận án TS, Hà Nội Lƣơng Minh Khôi, Phạm Thị Vƣợng (1989), Một số kết nghiên cứu sâu hại đậu tương biện pháp phòng trừ, Kết nghiên cứu BVTV 1979-1989, Nxb Nông nghiệp, Hà Nội, tr.59-67 Nhà xuất thống kê Hà Nội, 2009 Niên Giám Thống Kê, 2008 Ngơ Thế Dân, Trần Đình Long, Trần Văn Lài, Đỗ Thị Dung, Phạm Thị Đào(1999), Cây đậu tương, Nhà xuất Nông nghiệp, Hà Nội Kiều Thị Dung, Đặng Minh Trang, Lê Việt Chung, Đặng Trọng Lƣơng, Trƣơng Thị Thanh Mai (2005), Kết nghiên cứu ban đầu khả tái sinh giống đậu tương phục vụ cho kỹ thuật chuyển gen, Tạp chí Nơng Nghiệp Phát Triển Nông Thôn, số 20, tr.35-38 Trần Đình Chiến (2002), Nghiên cứu trùng, nhện lớn bắt mồi sâu hại đậu tương vùng Hà Nội phụ cận; đặc tính sinh học bọ chân chạy Chlaenius bioculatus Chaudoir bọ rùa Menochilus sexmaculatus Fabr, Tóm tắt luận án TS, Hà Nội Trần Đình Long (2001), Cây đậu tương, Nhà xuất Nông nghiệp, Hà Nội Viện Bảo vệ thực vật (1976), Kết điều tra côn trùng 1967-1968, Nxb Nông thôn, Hà Nội, tr.451-455 Tài liệu tiếng Anh Adamczyk J.J., Adams L.C., Hardee D.D., (2001),“Field efficacy and seasonal profiles for terminal leaves of single and double Bacillus thuringiensis toxin cotton genotypes”, J Econ Entomol 94, p.1589-1593 10 Annette Droste, Giancarlo Pasquali and Maria Helena Bodanese-Zanettini (2000), “ Intergrated Bombardment and Agrobacterium Transformation System: an Alternative Method for Soybean Transformation”, Plant molecular Biology Reporter, 18, p.51 – 59 11 Arumin A (1978), Pests of soybean and their control in Thailand Pests of grain legumes Acad Press, London, New York, San Fransisco, p.43-46 12 Aswath C.M., Mo S.Y., Kim D.H and Park S.W., (2005), “Agrobacterium and biolistic transformation of onion using non-antibiotic marker phosphomannoes isomerase”, Plant Cell Rep 24, p.426-432 63 Số hóa trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ 13 Brian J Martinell and others ( 2006), Soybean transformation method, Monsanto LLC, US 14 Boethel D.J., (1999), Assessment of soybean germplasm for multipleinsect resistance In: Clement SL, Quisenbury SS (eds) Global plant genetic resources for insect resistant crops CRC, Boca Raton, p.101-129 15 Boscariol R.L., Almeida W.A., Derbyshire M.T., Mourao-Filho F.A and Mendes B.M (2003) The use of PMI/mannose selection system to recover transgenic sweet orangeplants (Citrus sinensis L Osbeck)”, Plant Cell Rep., 22, p.122-128 16 Clemente T., LaVallee B.J., Howe A.R., Ward D.C., Rozman R.J., Hunter P.E., Broyles D.L., Kasten D.S., Hinchee M.A (2000), “Progeny analysis of glyphosate selected transgenic soybeans derived from Agrobacterium-mediated transformation”, Crop Sci 40, p.797-803 17 David A Somers, Deborah A Samac and Paula M Olhoft (2003), “ Recent Advances in Legume Transformation”, Plant Physilogy, 131, p.892 - 899 18 Daley K., Knauf V.C., Summerfelt K.R and Turner J.C (1998), “Cotransformation with one Agrobacterium tumefaciens train containing two binary plasmids as a method for producing marker-free transgenic plants”, Plant Cell Reports, 17, p.489-496 19 De Block M and Debrouwer D (1991), “Two T-DNA‟s co-transformation into Brassica napus by a double Agrobacterium tumefaciens infectionare mainly integrated at the same locus”, Theor Appl Genet 82, p.257-263 20 Di R., Purcell V., Colin G.B., Ghabrial S.A., (1996),” A production of transgenic soybean line expressing the bean pod mottle virus coat protein precursor gene”, Plant Cell Rep ,7, p.399-402 21 Dufourmantel N., Tissot G., Goutorbe F., Garcon F., Muhr C., Jansens S., Pelissier B., Peltie G., Dubald M (2005), “Generation and analysis of soybean plastid transformants expressing Bacillus thuringiensis Cry 1Ab protoxin”, Plant Mol Biol 58, p.659-668 22 Estruch J.J., Warren G.W., Mullins M.A., Nye G.J., Craig J.A., Koziel M.G., (1996), “Vip3A, a novel Bacillus thuringiensis vegetative insecticidal protein with awide spectrum of activities against lepidopteran insects”, Proc Natl Acad Sci., 93, p 5338-5394 23 Gianessi L.P., Silvers C.S., Sankula S., Carpenter J.E., (2002) Plant biotechnology: current and potenyial impact for improving pest management in US agriculture and analysis of 40 case studies Pp 1-12 website:www.ncfap.org 24 Hinchee M., Connor-Ward D.V., Newell C.A., McDonnell R.E., Sato S.J., Gasser C.S., Fischhoff D.A., Re D.B., Fraley R.T., Horsch R.B (1988), “Production of 64 Số hóa trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ transgenic soybean plant using Agrobacterium-mediated DNA transfer”, Bio/Technology, 6, p.915-922 25 Hai Ping Hong, Hongyi Zhang, Paula Olhoft, Steve Hill, Hunt Wiley, Effie Toren, Helke Hillebrand, Todd Jones, and Ming Cheng (2007), “ Organogenic callus as the target for plant regeneration and transformation via Agrobacterium in soybean (Glycine max( L.) Merr.)”, In Vitro Cellular and Development Biology – Plant, 43(6), p.558 – 568 26 Hinson K., E.E Hartwig (1982), Soybean production in the tropics FAO, Rome, p.66-71 27 Hoa T.T.C and Bong B.B (2003), “Efficient Agrobacterium-mediated transformation of indica rice (Oryza sativa L) using mannose selection system”, Vietnam Journal of Agroculture & Rual Development, 1+2, p.60-63-18 28 Hoa T.T.C., AlBabili S., Schaub P., “Potrykus I and Beyer P (2003) Gol den indica japonica rice lines amemable to registration”, Plant Physiology 133, p.161-169 29 ISAAA (2009), ISAAA Celebrates the Life of its Founding Patron, Nobel Peace Laureate Dr Norman E Borlaug (1914-2009), ISAAA Brochure available at: http://www.isaaa.org/kc/cropbiotechupdate/tribute/borlaug/ISAAA-Tribute.pdf 30 James C (2008), Global Status of Commercialized Biotech/GM Crops: 2007 ISAAA Brief No 38 ISAAA: Ithaca, NY 31 James C (2009), Global Status of Commercialized Biotech/GM Crops: 2008 ISAAA Brief No 39 ISAAA: Ithaca, NY 32 Joersbo M., Peterson S.G and Okkels F.T., (1999), “Parameter interacting with mannose selection employed for the production of transgenic sugar beet”, Physiol Plant, 105, p.109-134 33 Kobayashi T (1972), “Insect pests of soybean and their control”, Res.Quart 6(4), p.212-218 34 Kobayashi T (1976), “Insect pests of soybean in Japan and their control”, Pest Articles and News Summaries (UK), 22(3), p.336-349 35 Koziel M.G., Beland G.L., Bowman C., Carozzi N.B., Crenshaw R., Crossland L., Dawson J., Desai N., Hill M., Kadwell S., Launis K., Lewis K (1993), ”Field performance of elite transgenic maize plants expressing an insecticidal protein derived from bacillus thuringiensis”, Biotechnology, 11, p.194-200 36 Komari T., Hiei Y., Saito Y., Murai N and Kumashiro T (1996), “Vectors carrying two separate T-DNAs for co-transformation of higher plants mediated by Agrobacterium tumefaciens and segregation of transformants free from selection marker”, The Plant J., 10(1), p.165-174 65 Số hóa trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ 37 Ko T.S & Korban S.S., (2004), “Enhancing the frequency of somatic embtyonenesis following Agrobacterium-mediated transformation of mimmature cotylendons of soybean (Glycine max L Merrill)”, In vitro Cell Dev Biol-plant, 40, p.552-558 38 Lawton K (1999), Roundup of a market farm industry News, February, p 4-8 39 Lee M.K., Walter F.S., Hart H., Palekar N., Chen J.S (2003), “The mode of action of the Bacillus thuringiensis protein Vip3A differs from that of Cry1Ab delta-endotoxin”, Appl & Envir Micro, 69, p.4648-4657 40 L.L Loguercio, M.L Barreto , T.L Rocha , C.G Santos , F.F Teixeira and E Paiva (2002), “Combined analysis of supernatant-based feeding bioassays and PCR as a first-tier screening strategy for Vip -derived activities in Bacillus thuringiensis strains effective against tropical fall armyworm”, Journal of Applied Microbiology, 93(2), p.269 – 277 41 Martinell B.J., Julson L.S., Emler C.A., Yong H., McCabe D.E., Williams E.J., inventors Map (2002) Soybean Agrobacterium transformation method US Patent Application No 6384301 42 Maqbool S.B., Riazuddin S., Loc N.T., Gatehouse A.M.R., Gatehouse J.A., Christou P (2001), “Expression of multiple insecticidal genes confers broad resistance against a range of diffirent rice pests”, Mol Breed, 7, p.85-93 43 McCabe D.E., Swain W.F., Martinell B.J., “Christou P (1998) Factors effecting soybean cotylendonary node transformation”, Bio/Technology, 6, p.923-926 44 Miles JS and Guest JR (1984), “Nucleotide sequence and transcriptional start point of the phosphomannose isomerase gene (manA) of Escherichia coli”, Gene, 32(1-2), p 41-8 45 Naito A., I.A Harnoto, I Hatori (1983), Podborer Etiella hobani (Butler) of soybean in Indonesia, Central Res Inst for Food Crops, Indonesia 46 Olhoft P.M., Lin K., Galbraith J., Nielsen N.C., Somers D.A (2001), “The role of thiol comppounds in increasing Agrobacterium-mediated transformation of soybean cotylendonary node cells”, Plant Cell Rep., 20, p.731-737 47 Olhoft P.M., Somers D.A (2001), “L-Cysteine increases Agrobacteriummediated T-DNA delivery into soybean cotylendonary node cells”, Plant Cell Rep, 20, p.706-711 48 Olhoft P.M., Flagel L.E., Donovan C.M., Somers D.A (2003), “Efficient soybean transformation using hygromycine B selection in the cotylendonary node method”, Plant, 216, p.723-735 49 Ooi P.A.C (1973), Some insect pests of green gram Phaseolus aureus Malaysian Agricultural Journal, 49, p.131-142 66 Số hóa trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ 50 Owen M.D.K (1999) Current use of transgenic herbicide-resistant soybean and corn in the USA, p 1-6 51 Parrott W.A., Adang M.J., Bailey M.A., All J.N., Boerma H.R and Stewart N.S (1994), “Recovery and evaluation of soybean plants transgenic for a Bacillus thuringiensis var kurstaki insecticidal gene”, In Vitro Plant 30, p.144-149 52 Paula P.Chee, Krystal A Fober and Jerry L.Slightom (1989), “ Transformation of soybean (Glycine max) by infecting Germinating Seeds with Agrobacterium tumefaciens”, Plant Physiol, 91, p.1212 – 1218 53 Paul Christou, Jean E Murphy and William F.Swain (1987), “ Stable transformation of soybean by electroporation and root formation from transformed callus”, Proc Natl Acad Sci., 84, p.3962 – 3966 54 Paz M.M., Martinez J.C., Kalving A.B., Fonger T.M., Wang K (2006), “Improved cotylendonary node method using an alternative explants derived from mature seed for efficient Agrobacterium mediated soybean transformation" Plant Cell Rep., 25, p.206-213 55 Sharma H.C., K.K Sharma, N Seetharama, R Ortiz (2001), “Genetic transformation of crop plants: Risk and opportunities for the rural poor”, Current Science, 80(12), p.1495-1508 56 S.S.Bhojwani and M.K.Razdan (1996), Plant tissue culture: theory and practice, 57 Smith R.F., G.B Huffaker, P.L Adkisson, L.P New Som (1974), Progress achieved in the implementation of intergrated control projects in the USA and tropical countries, OEEPP/EPPO Bull., 4(3), p.221-239 58 Stewart C.N., Adang M.J., All J.N., Boerma H.R., Cardineau G., Tucker D., Trick H.N and Finer J.J (1998), “Sonication-assisted Agrobacterium mediated transformation of soybean (Glycine max L Merrill) embryogenic suspension culture tissue”, Plant Cell Rep., 17, p.482-488 59 Stewart C.N., Adang M.J., All J.N., Boerma H.R., Cardineau G., Tucker D., Trick H.N and Finer J.J.(1998), “Sonication-assisted Agrobacterium mediated transformation of soybean (Glycine max L Merrill) embryogenic suspension culture tissue” Plant Cell Rep 17, p.482-488 60 Talekar N.S.(1989), “Characteristic of Melanagromyza sojae (Dipterra: Agromyzidae) damage in soybean”, Jour of Econo Entomol., 82, p 584-588 61 Turnipseed S.G., M Kogan (1976), “Soybean entomology,”Ann Rev Entomol., 21, p.247-282 67 Số hóa trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ 62 Waterhouse D.F.(1993), The major arthropod pests and weeds of agriculture in Southeast Asia, The Australian Centre for International Agricultural Research, Canberra, p.141 63 Walker D.R., Boerma H.R., All J.N and Parrott W.A (2002), “Combining cry1Ac with QTL alleles from PI 229358 to improve soybean resistance to lepidopteran pests”, Mol Breed, 9, p.43-51 64 Walker D.R., Narvel J.M., Boerma H.R., All J.N., Parrott W.A (2004), “A QTL that enhances and broadens Bt insect resistance in soybean”, Theor Appl Genet, 109, p.1051-1057 65 WANG Ping, WANG gang, JỊ Jing, WU Ying, “A Novel System for proliferation, Maintenance and Plantlet Germination from somatic embryo of soybean”, Journal of Intergrative Plant Biology, 46(2) 66 Wright M., Dawwon J., Dunder E., Sutie J., Reed J., Kramer R., Chang Y.F., Novitzky R., Wang H and Artim-Moor L (2001),“Efficient biolistic transformation of maize (Zea mays L.) and wheat (Triticum eastivum L.) using the phoshomannose isomerase gene , pmi, as the selectable marker”, Plant Cell Rep., 20, p.429-436 67 Xing A., Zhang Z.Y., Sato S., Staswick P and Clemente T (2000), “The use of the two T-DNA binary system to derive marker-free transgenic soybeans In vitro Cell”, Dev Biol Plant 36, p.456-463 68 Yan B., Reddy M.S.S., Collins G.B., Dinkins R.D (2000), “Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of soybean (Glycine max L Merrill) using immature zygetic cotylendon explants”, Plant Cell Rep., 19, p.1090-1097 69 Yinghui Dan, Nancy A Reichert (1999), Soybean transformation and regeneration methods, Missisippi State University, US 70 Young Jin Kim, Tae ll Park, Hyun Soon Kim, Ho Ki Park, Sang Uk Chon, Song Joong Jun (2004), “ Factors Affecting Organogenesis from Mature Cotylendon Explants and Regeneration in Soybean”, Journal of Plant Biotechnology, 6(1), p.39-43 71 Young Jin Kim, Tae ll Park, Hyun Soon Kim, Ho Ki Park, Sang Uk Chon, Song Joong Jun (2004), “Factors Affecting Somatic Embryogenesis from Immature Cotyledon of Soybean”, Journal of Plant Biotechnology, 6(1), p 45-50 72 Young Jin Kim, Tae ll Park, Hyun Soon Kim, Ho Ki Park, Sang Uk Chon, Song Joong Jun, “ Efficient Nutrient Solution Culture for Acclimation of Plant Regenerated in Vitro of Soybean ( Glycine max)”, Korean, truy cập từ trang http://www.nics.go.kr/nComzone/nFdown.asp?fd_name=nNonF&fnName=535.p df 68 Số hóa trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ 73 Yu C.G., Mullins M.A., Warren G.W., Koziel M.G., Estruch J.J (1997), “The Bacillus thuringiensis vegetative insecticidal protein Vip3A lyses midgut Epithelium cells of susceptible insects”, Appl & Envir Mcro, 63 74 Zenglu Li, Randall L Nelson, Jack M Widholm and Andrew Bent ( 2003), “Soybean transformation vis the pollen tube pathway”, Soybean Genetics Newsletter, 29 75 Zhu Y.J., Agbayani R., McCafferty H., Alber H.H and Moore P.H (2005), “Effictive selection of transgenic paypaya plants with the PMI/Man selection system”, Plant Cell Rep., 24, p.426-432 69 Số hóa trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ PHỤ LỤC 1.Môi trƣờng MS (PH=5,6-5,8) Bảng P1: Môi trƣờng MS (PH=5,6-5,8) Lƣợng lấy STT Thành phần (g/l) KNO3 1900 20 NH4NO3 1650 20 KH2PO4 170 10 MgSO4.7H2O 370 10 CaCl2.2H2O 440 10 FeSO4.7H2O 27,8 Na2EDTA 37,3 H3BO3 0,76 ZnSO4.7H2O 0,2 KI Na2MoO4.2H2O CuSO4 0,075 10 0,025 0,0025 CoCl2.6H2O (B5 Vitamins) 10 0,3 MnSO4.H2O (B5 Minor) (ml) 0,0025 Myo-inositol 10 Nicotinic acid 0,1 Pyridoxin-HCl 0,1 Thiamin-HCl 70 20 Số hóa trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/ Mơi trƣờng LB (PH = 7) Bảng P2: Môi trƣờng LB (PH = 7) Thành phần g/l Pepton (trypton) 10 Yeast extract NaCl 10 Môi trƣờng sử dụng nuôi cấy mẫu Bảng P3 Môi trƣờng sử dụng nuôi cấy mẫu Thành phần MS Môi Môi trƣờng Môi trƣờng Môi trƣờng trƣờng Môi trƣờng lây nhiễm tạo chồi kéo dài nẩy mầm tạo rễ (RM) (CCM) (SIM) lóng (SEM) (BGM) x x x Indole-3-butyric acid x x 1,5 mg/l 6-benzyl- aminopurine 111 mg/l mg/l 11,1 mg/l 0,5 mg/l MES* - 3,9g/l 0,59g/l 0,59g/l 0,59g/l 3% 3% 3% 3% 3% 0,7% 0,7% 0,7% 0,7% 0,7% 5,6-5,8 5,6-5,8 5,6-5,8 5,6-5,8 5,6-5,8 6-benzyl- aminopurine - 1,5 mg/l 1,5 mg/l - - Gibberrellic acid (GA3) - - - 1,5 mg/l - Acetosyringone* - x - - - Cefotaxim* - - 200 mg/l 200 mg/l - hygromicin* - - x x - Sucrose Agar pH Ghi chú: (*) = Lọc qua màng lọc bổ sung sau khu khử trùng môi trường Môi trường lây nhiễm (IM) = CCM lỏng bổ sung dịch vi khuẩn Môi trường rửa (WS) = SIM lỏng bổ sung 200 mg/l cefomycin Môi trường chứa kháng sinh hygromycin: SIM II, SEM I, SEM II 71