Nghiên cứu biến nạp gen vào đậu tương glycine max l merrill thông qua vi khuẩn agrobacterium tumefaciens

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM -   NGUYỄN TIẾN DŨNG Tên đề tài: “NGHIÊN CỨU BIẾN NẠP GEN VÀO ĐẬU TƯƠNG (Glycine max (L.) Merrill) THÔNG QUA VI KHUẨN Agrobacterium tumefaciens” LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Thái Nguyên-2010 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM -   NGUYỄN TIẾN DŨNG Chuyên ngành : Sinh học thực nghiệm Mã số : 60.42.30 Tên đề tài: “NGHIÊN CỨU BIẾN NẠP GEN VÀO ĐẬU TƯƠNG (Glycine max (L.) Merrill) THÔNG QUA VI KHUẨN Agrobacterium tumefaciens” LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Người hướng dẫn khoa học: T.S Nguyễn Văn Đồng PGS.TS Ngơ Xn Bình Thái Ngun-2010 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 1.1 Các quốc gia sản xuất đậu tương nhiều giới năm 2008 Bảng 1.2 Số liệu thống kê sản xuất đậu tương qua vùng khác Bảng 1.3 Tình hình sản xuất đậu tương Việt Nam Bảng 1.4 Các thị chọn lọc dùng cho biến nạp gen 17 Bảng 1.5 Các gen thơng báo thị sinh hóa 20 Bảng 2.1 Thành phần môi trường nuôi cấy 38 Bảng 3.1 Khả phát sinh chồi số giống đậu tương sau 10 ngày 45 Bảng 3.2 Khả kéo dài chồi rễ tạo hoàn chỉnh 47 Bảng 3.3 Kết lựa chọn chủng vi khuẩn thích hợp cho biến nạp gen 48 Bảng 3.4 Ảnh hưởng mật độ vi khuẩn biến nạp đến hiệu biến nạp gen 53 Bảng 3.5 Ảnh hưởng phương thức tăng cường khả lây nhiễm 54 Bảng 3.6 Ảnh hưởng thời gian đồng nuôi cấy đến hiệu biến nạp gen 56 Bảng 3.7 Ảnh hưởng nồng độ AS đến khả biến nạp gen 57 Bảng 3.8 Ảnh hưởng L-cystein đến hiệu biến nạp gen 58 Bảng 3.9 Ảnh hưởng hygromycin đến khả chọn lọc sau chuyển gen 59 Bảng 3.10 Hiệu chuyển gen vào số giống đậu tương 62 Bảng 3.11 Số sau chọn lọc số giống đậu tương 63 Bảng 3.12 Kết phân tích PCR dịng đậu tương chuyển gen với cặp mồi 65 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn DANH MỤC CÁC HÌNH Trang Hình 1.1 Sơ đồ cấu trúc Ti-plasmid dạng octopin 10 Hình 1.2 Sự tương tác Agrobacterium với tế bào thực vật 12 Hình 1.3 Sơ đồ cấu trúc vector nhị thể 15 Hình 1.4 Sơ đồ cấu trúc vector liên hợp 16 Hình 2.1 Sơ đồ cấu trúc vector pX2-H 31 Hình 2.2 Sơ đồ quy trình tái sinh đậu tương 35 Hình 2.3 Sơ đồ quy trình biến nạp gen vào đậu tương 37 Hình 3.1 Phát sinh tạo đa chồi số giống đậu tương nghiên cứu 46 Hình 3.2 Phát sinh rễ số giống đậu tương 48 Hình 3.3 Biểu gus đậu tương lây nhiễm với chủng vi khuẩn 49 Hình 3.4 Mẫu biến nạp plasmid pX2-H::gfp Agrobacterium chủng AGL1 51 Hình 3.5 Kết điện di sản phẩm PCR khuẩn lạc với cặp mồi gfp 52 Hình 3.6 Chọn lọc chồi chuyển gen môi trường SIM 60 Hình 3.7 Biểu gen gfp chuyển vào giống đậu tương 63 Hình 3.8 Kết điện di DNA tổng số dịng đậu tương 64 Hình 3.9 Kết điện di sản phẩm PCR 65 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT AS : Acetosyringone BAP : - Benzylaminopurine bp : base pair (cặp bazơ) GFP : Green Fluorescent Protein DNA EDTA : : Deoxyribo Nucleic Acid Ethylene Diamine Tetraacetace Axit Et-Br gus : : Ethidium Bromide hpt MSC NAA MS : : : : Gen mã hóa hygromycin phosphotransferase Multi - Cloning Site α -Napthalene acetic acid Murashige and Skoog, 1962 LB NOS : : Luria Bertani Nopalin Sythetase OD PCR : : Optical Density (mật độ quang học) Polymerase Chain Reaction SDS TAE : : Sodium Dodecyl Sulfate Tris-Acetate-EDTA TE : Tris-EDTA T- DNA Ti-Plasmid : : Transfer DNA (ADN chuyển) Tumor inducing plasmid (plasmit gây khối u thực vật) VIR X-gluc : : Virulence region (vùng gây độc có khả tạo khối u) 2,4-D : Dichlorophenoxy acetic acid & cs : cộng -Glucuronidase gene (gen mã hóa -glucuronidase) 5-bromo-4-chloro-3-indolyl--D-glucuronodase acid Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn MỤC LỤC Trang MỞ ĐẦU 1 Tính cấp thiết đề tài Mục tiêu nghiên cứu Yêu cầu nghiên cứu Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Nguồn gốc phân loại đậu tƣơng 1.2 Đặc tính chống chịu đậu tương 1.3 Tình hình sản xuất đậu tƣơng giới Việt Nam 1.3.1.Trên giới 1.3.2 Ở Việt Nam 1.4 Vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens trình chuyển gen 1.4.1 Agrobacterium tumefaciens tượng biến nạp gen thực vật tự nhiên 1.4.2 Cấu trúc chức Ti-plasmid 1.4.3 Cấu trúc chức đoạn T-DNA 11 1.4.4 Cơ chế phân tử việc chuyển gen 11 1.4.5 Tương tác T-DNA genome tế bào thực vật 13 1.5 Hệ thống vector sử dụng để biến nạp gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens 14 1.5.1 Vector nhị thể 14 1.5.2 Hệ vector liên hợp 16 1.6 Gen thị 17 1.6.1 Chỉ thị chọn lọc 17 1.6.2 Chỉ thị sàng lọc 18 1.7 Hệ thống tái sinh biến nạp gen giống đậu tƣơng 20 1.7.1 Hệ thống tái sinh đậu tương 20 1.7.2 Phương pháp biến nạp gen đậu tương 21 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Chƣơng 2: VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 30 2.1 VẬT LIỆU 30 2.1.1 Các thiết bị dụng cụ thí nghiệm 30 2.1.2 Hóa chất 30 2.1.3 Plasmid, primers vi khuẩn 30 2.1.4 Vật liệu thực vật 31 2.1.5 Địa điểm nghiên cứu 32 2.2 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 32 2.3 Ph-¬ng pháp nghiên cứu 32 2.3.1 Biến nạp plasmid vào tế bào E.coli phƣơng pháp sốc nhiệt 32 2.3.2 Biến nạp plasmid vào tế bào Agrobacterium tumefaciens phƣơng pháp xung điện 33 2.3.3 Phƣơng pháp tách chiết DNA plasmid từ vi khuẩn 33 2.3.4 Phƣơng pháp PCR 34 2.3.5 Ph-ơng pháp điện di gel agarose 2.3.6 Phng pháp ni cấy tái sinh hồn chỉnh 35 2.3.7 Phƣơng pháp biến nạp gen vào giống đậu tƣơng 39 2.3.8 Sàng lọc, phân tích chuyển gen 39 2.3.8.1 Sàng lọc thông qua gen thị GFP 39 2.3.8.2 Phân tích PCR 39 2.3.9 Phƣơng pháp bố trí thí nghiệm, theo dõi, đánh giá sử lý kết 41 2.3.9.1 Phương pháp bố trí thí nghiệm………………………………………… 41 2.3.9.2 Phương pháp theo dõi, đánh giá .42 Chƣơng 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 44 3.1 Kết đánh giá khả tái sinh hoàn chỉnh số giống đậu tƣơng 44 3.1.1 Khả phát sinh chồi số giống đậu tương 44 3.1.2 Khả kéo dài chồi, rễ tạo hoàn chỉnh giống đậu tương nghiên cứu 46 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 3.2 Kết lựa chọn chủng vi khuẩn thích hợp cho chuyển gen đậu tƣơng 48 3.3 Kết biến nạp plasmid vector pX2-H::gfp vào chủng vi khuẩn thích hợp để biến nạp vào đậu tƣơng 51 3.4 Tối ƣu hóa yếu tố ảnh hƣởng đến hiệu biến nạp gen 52 3.4.1 Ảnh hưởng nồng độ vi khuẩn lây nhiễm 52 3.4.2 Ảnh hưởng phương thức tăng cường khả lây nhiễm 54 3.4.3 Ảnh hưởng thời gian đồng nuôi cấy đến hiệu biến nạp gen 55 3.4.4 Ảnh hưởng nồng độ Acetosyringon (AS) 56 3.4.5 Ảnh hưởng L-cystein đến khả biến nạp 57 3.4.6 Ảnh hưởng hygromycin đến khả chọn lọc sau chuyển gen 59 3.5 Đánh giá hiệu chuyển gen số giống đậu tƣơng 61 3.5.1 Hiệu chuyển gen thông qua gen thị sàng lọc gfp 61 3.5.2 Kết tách chiết DNA tổng số phân tích PCR dịng đậu tƣơng chuyển gen 63 LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 67 DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH CƠNG BỐ 68 TÀI LIỆU THAM KHẢO 69 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CƠNG BỐ Nguyễn Tiến Dũng, Nguyễn Văn Đồng, Ngơ Xn Bình, Hà Văn Chiến (2010), Nghiên cứu khả tiếp nhận gen số giống đậu tương (Glycine max (L.) Merrill) Việt Nam thông qua vi khuẩn Agrobacterium.tumefaciens, Tạp chí NN&PTNT (10), Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 68 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Ngô Thế Dân, Trần Đình Long, Trần Văn Lài, Đỗ Thị Dung, Phạm Thị Đào (1999), Cây đậu tương, NXB Nông nghiệp, Hà Nội Trần Văn Điền (2007), Cây đậu tương, NXB Nông nghiệp, Hà Nội Nguyễn Thúy Điệp, Kiều Thị Dung, Đặng Minh Trang, Lê Việt Chung, Đặng Trọng Lương, Trương Thị Thanh Mai (2005), “Kết nghiên cứu ban đầu khả tái sinh số giống đậu tương phục vụ kỹ thuật chuyển gen”, Tạp chí Nông nghiệp phát triển nông thôn, 20: 35-38 Nguyễn Văn Đồng, Phạm Thị Lý Thu, Tạ Kim Nhung, Trịnh Thị Minh Thùy, Hà Văn Chiến, Lê Thanh Nga, Lê Thị Thu Về, Lê Thị Thu Hiền, Nông Văn Hải, Lê Huy Hàm (2010), “Kết bước đầu nghiên cứu chuyển gen kháng sâu cry1Ac vào phôi non dịng ngơ mơ hình”, Tạp chí Cơng nghệ Sinh học 8(1):1-8 Nguyễn Thu Hiền, Chu Hoàng Mậu, Nguyễn Phú Hùng, Lê Thị Thanh Hương (2005), “Nghiên cứu đặc điểm hình thái, sinh hóa nhân gen dehydrin số giống đậu tương địa phương vùng núi phía Bắc Việt Nam” Báo cáo khoa học Hội nghị toàn quốc – Nghiên cứu khhoa học sống - Đại học Y Hà nội NXB KHKT Hà nội, 2224 – 2227 Lê Thị Thu Hiền, (2003), Tạo chủng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens mang gen kháng côn trùng để chuyển vào trồng, Luận án Tiến sĩ Sinh học, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Khoa học Cơng nghệ Việt Nam Trần Thị Cúc Hịa (2007), “Nghiên cứu khả đáp ứng chuyển nạp gen giống đậu tương trồng Việt Nam”, Tạp chí Nơng nghiệp & phát triển nơng thơn 18: 9-14 Trần Thị Cúc Hòa (2008), “Hiệu tạo dòng đậu tương biến đổi gen từ giống MTĐ 176, HL 202, Maverick William 82 phương pháp nốt mầm qua trung gian Agrobacterium tumefaciens”, Tạp chí Nơng nghiệp & Phát triển nơng thơn, 1: 14-19 71-76 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 69 Nguyễn Huy Hoàng (1992), Nghiên cứu khả chịu hạn giống đậu tương nhập nội miền Bắc Việt Nam, Luận án phó tiễn sỹ, Hà nội 10 Trần Thị Phương Liên (1999), Nghiên cứu đặc tính hóa sinh sinh học phân tử số giống đậu tương có khả chịu nóng, chịu hạn Việt Nam, Luận án tiến sỹ sinh học, Viện công nghệ sinh học, Hà nội 11 Trần Đình Long (2000), Cây đậu tương, NXB Nơng nghiệp, Hà Nội 12 Chu Hoàng Mậu (2001), Sử dụng phương pháp đột biến thực nghiệm để tạo dòng đậu tương đậu xanh thích hợp cho miền núi Đơng Bắc Việt Nam, Luận án tiến sỹ sinh học, Viện công nghệ sinh học, Hà nội 13 Nguyễn Đức Thành (2003), Chuyển gen thực vật, NXB KHKT, Hà Nội 14 Tổng cục thống kê (2010), Niên giám thống kê 2009, NXB Thống kê, Hà Nội 15 Phạm Thị Lý Thu (2007), Nghiên cứu xây dựng hệ thống tái sinh từ phơi non xác định phương pháp chuyển gen thích ngô, Luận án tiến sĩ Sinh học, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam Tiếng Anh 16 A F Garay Wallace Wilhelm (1983), “Root System Characteristics of Two Soybean Isolines Undergoing Water Stress Condition”, Agronomy Journal, Vol 75 17 Aiqiu Xing, Zhang Yuan Zhang, Shirley Sati, Paul Staswick and Tom Clemente (2000), “The use of the two T-DNA binary system to derive marker-free transgenic soybean”, InVitro Cell Dev Biol.Plant 36:456-463 18 Birch R.G (1997), “Plant transformation- problems and strategies for practical application” Ann Rev Plant Physiol Plant (48), pp 297–326 19 Bravo Angel A.M., Hohn B., Tinland B (1998), “The omega sequence of virD2 is important but not essential for efficient of the T-DNA by Agrobacterium tumefaciens”, Molecular Plant Microbe Interactions (11), pp 57-63 20 Breitler J-C., Maynard D., Boxte J.V., Royer M., Bonot F., Cambillau L., Guiderdoni E (2004), “A novel two T-DNA binary vecror allows efficient generation of marker- Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 70 free transgenic plant in three elite cultivars of rice (Oryza sativa L.), Transgenic Research.13: 271-278 21 C A Meurer, R D Dinkins and G B Collins (1998), “Factors affecting soybean cotyledonary node transformation”, Plant Cell Reports, 18: 180–186 22 Calvo, E.S., Kiihl, R.A.S., Garcia, A., Harada, A., Hiromoto, D.M (2008) “Two major recessive soybean genes conferring soybean rust resistance” Crop Science 48, 1350–1354 23 Chalfie M., Y Tu, G Euskirchen, W W Ward, and D C Prasher (1994), “Green fluorescent protein as a marker for gene expression” Science 263: 802 – 805 24 Chao Yang, Tuanjie Zhao, Deyue Yu and Junyi Gai (2009), “Somatic embryogenesis and plant regeneration in Chinese soybean (Glycine max (L.) Merr.) impacts of mannitol, abscisic acid, and explant age”, In Vitro Cell.Dev.Biol.-Plant 45:180–188 25 Charest P J., V N Iyer, and B L Miki (1989), “Factors affecting the use of chloramphenicol acetyltransferase as a marker for Brassica genetic transformation” Plant Cell Reports 7: 628-631 26 Chen WS, Chiu CC, Liu HY, Lee TL, Chen JT, Lin CC, Wu YJ, and Chang HY (1998), “Gene transfer via pollen-tube pathway for anti-fusarium wilt in watermelon” Biochem Mol Biol Int 46: 1201-1209 27 Cheng M., Lowe B.A., Michael S.T., Ye X.X and Armstrong C.L.(2004), “Factors influencing Agrobacterium-mediated transformation of monocotyledonous species”, In vitro Cel & Dev Bio-plant 40 (1): 31-45 28 Chowrira, G.M., Akella, V., and Lurquin, P.F (1995), “Electroporation-mediated gene transfer into intact nodal meristems in planta” Mol.Biotechnol.3: 17-23 29 Christianson, M.L., Warnick, D.A., Carlson, P.S (1983), “A morphogenetically competent soybean suspension culture” Science 222:632-634 30 Chumakov M.I., Rozhok N.A., Velicov V.A., Tyrnov V.S, Volokhina I.V (2006), "Agrobacterium - Mediated in planta transformation of maize via pistil filaments" Russian Journal of genetics 42 (8): 893-897 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 71 31 Cohen J D., T R Eccleshall, R B Needleman, H Federoff, B A Bucferer, and J Marmur (1980), “Functional expression in yeast of the Escherichia-coli plasmid gene coding for chloramphenicol acetyl transferase” Proceedings of the National Academy of Sciences 77: 1078-1082 32 Corinne Zurbrugg, Wolfgang Netwig (2009), “Ingestion and excretion of two transgenic BT corn varieties by slugs”, Transgenic Res., 18: 215-225 33 Cristia V and Cachita-Cosma D (1992), “Studies on the reactivity of different soybean explants types (Glycine max L Merr.) to in vitro culture conditions” Revue Roumaine de Biologie Serie Vegetale 37: 73-81 34 Daley M, Knauf VC, Summerfelt KR and Turner JC (1998), “Co-transformation with one Agrobacterium tumefaciens strain containing two binary plasmids as a method for producing marker-free transgenic plants” Plant Cell Rep 17: 489–496 35 DeCleene, M., and DeLay, J (1976) “The hot range of crown gall” Bot Gaz 42: 389466 36 Delzer, B.W., Somers, D.A., and Orf, J.H (1990), “Agrobacterium tumefaciens susceptibility and plant regeneration of 10 soybean genotype in maturity group 00 to II” Crop Sci 30: 320-322 37 Di Nocera P P and I B Dawid (1983), “Transient expression of genes introduced into cultured cells of Drosophila” Proc Natl Acad Sci 80: 7095-7098 38 Di, R., Purcell, V., Collins, G.B., and Ghabrial, S.A (1996), “Production of transgenic soybean lines expressing the bean pod mottle virus coat protein precursor gene” Plant Cell Rep 15: 746-750 39 Droste, A., Bodanese Zanetti, M.H., Mundstock, E., and Hu, C.Y., (1994), “Susceptibility of Brazil soybean cultivars to Agrobacterium tumefaciens” Rev Brail Genet 17:83-88 40 Duan XL and Chen SB (1985), “Variation occurring by introduction of the exogenous DNA into rice” Sci Agric Sin 18: 6-10 41 Ebinuma H., and Komanima A (2001), “MAT (Multi-auto-transformation) vector system The oncogenes of Agrobacterium tumefaciens strain contaning two binary Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 72 plasmid as a method for producing marker-free transgenic plant”, Plant Cell Rep 17: 489-496 42 FAOSTAT (2009) http://faostat.fao.org/faostat/notes/citation.htm/online 43 Fernandez D., Spudich G.M., Zhou X.R., Berger B.R., Christie P.J (1996), “Agrobacterium tumefaciens VirB7 lipoprotin is required for stabilization of VirB proteins during assembly of the T-complex transport apparatus”, Journal of Bacteriology (178), pp 3168-3176 44 Finer, J.J (1988), “Apical proliferation of embryogenic suspension culture of soybean (Glycine max Merrill)”, Plant Cell Tissue Organ Cult 15: 125-136 45 Finer, J.J McMullen, M.D (1991), “Transformtion of soybean via particle bombardment of embryogenic suspension culture tissue” Invitro Cell Dev.Biol 27p:175-182 46 Fromm, M., Taylor, L.P., and Walbot, V (1985), “Expression of gene transferred into monocot and dicot plant cells by electroporation” Proc.Natl.Acad Sci.USA 82: 58245828 47 Genlvin S.B (2000), “Agrobacterium and plant genes involved in T- DNA transfer and intergration”, Rev Plant Physiol Biology (51), pp 223-256 48 Grebenok R J., G M Lambert, and D W Galbraith (1997), “Characterization of the targeted nuclear accumulation of GFP within the cells of transgenic plants” The Plant Journal 12: 685 – 696 49 Gustavo A., Cabrera J., (1998), “The Agrobacterium tumefaciens: a natural tool for plant transformation”, Plant Cell Report (26), pp 1-11 50 Hadi, M.Z., McMullen, M.D., and Finer, J.J (1996), “Transformation of 12 diffirent plasmids into soybean via particle bombardment” Plant Cell Rep 15: 500-505 51 Hai-Kun Liu, Chao Yang, Zhi-Ming Wei (2004), “Efficient Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation of soybeans using an embryonic tip regeneration system”, Planta, 219: 1042–1049 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 73 52 Hansen, G., Das, A., and Chilton, M.D (1994), “Constitutive expression of the virulence genes improves the efficiency of plant transformation by Agrobacterium” Proc Natl Acad Sci USA 91: 7603-7607 53 Haseloff J and K R Siemering (1998), “The uses of green fluorescent protein in plants In Green Fluorescent Protein: Properties, Application, and Protocols, M Chalfie, and S Kain, eds (Wiley-Liss, Inc.), pp 191 - 219 54 Haseloff J., K R Siemering, D C Prasher, and S Hodge (1997), “Removal of a cryptic intron and subcellular localization of green fluorescent protein are required to mark transgenic Arabidopsis plants brightly” Proc Natl Acad Sci 94: 2122 -2127 55 Heim R., D C Prasher, and R Y Tsien (1994), “Wavelength mutations and posttranslational autoxidation of green fluorescent protein” Proceedings of the National Academy of Sciences 91: 12501 - 12504 56 Herrera-Estrella L., G Van Den Broeck, R Maenhaut, M Van Montagu, J Schell, M Timko, and A Cashmore (1984), “Light inducible and chloroplast associated expression of a chimeric gene introduced into Nicotiana-tabacum using a Ti plasmid vector” Nature 310: 115-120 57 Hille J., Wullems G., Schiperoort R.A., (1983), “Non-oncogenic T- Region mutants of Agrobacterium tumefaciens transfer T-DNA into plant cells”, Plant Molecular Biology (2), pp 155-163 58 Hinchee, M.A.W., D.V.Connor-Ward, C.A.Newell, R.E.McDonnell, S.J.Sato, C.S.Gasser, D.A.Fischhoff, D.B.Re, R.T.Fraley, and R.B.Horsch (1988), “Production of transgenic soybean plants using Agrobacterium-mediated gene transfer”, Bio/Technol 6:915-922 59 Hookaas P.J.J., and Beijersbergen, A.G.M (1994), “The virulence system of Agrobacterium tumefaciens” Ann.Rev Phytopathol 32: 157-179 60 Hooykass P.J.J., Schilperoort, R.A (1992), “Agrobacterium and plant genetic engineering”, Plant Molecular Biology (35), pp 205-218 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 74 61 Hu CY and Wang LZ (1999), “In planta soybean transformation technologies developed in China: Procedure, confirmation and field performance” In Vitro Cell Dev Biol Plant 35: 417-420 62 Huixia Shou, Reid G Palmer and Kan Wang (2002), “Irreproducibility of the Soybean Pollen-Tube Pathway Transformation Procedure”, Plant Molecular Biology Reporter 20: 325–334 63 Hymowitz T and Newell C.A (1981), “Taxonomy of the genus Glycine domestication and uses of soybeans”, Economic Botany, 35, pp.272-288 64 Jefferson, R.A., T.A Kavanagh and M.V Bevan (1987), “GUS fusions: βglucuronidase as a sensitive and versatile gene fusion marker in higher plants”, The EMBO Journal vol.6 no 13 pp.3901 -3907 65 Joerbo M., Donaldson I., Kreiberg J., Peterson S.G., Brunstedt J.and Okkels F.T (1998), “Analysis of mannose selection used for transformation of suger beet”, Molecular Breed (4), pp 111-117 66 John J Finer Akitsu Nagasawa (1988), “Development of an embryogenic suspension culture of soybean (Glycine max Merrill.)”, Plant Cell, Tissue and Organ Culture 15:125-136 67 Jorgensen, R.A., Cluster, P.D., English, J., Que, Q., and Napoli, C.A (1996), “Chalcone synthase cosuppression phenotype in petunia flowers: comparison of sense vs antisense constructs and single-copy vs complex T-DNA sequences” Plant Mol.Biol 31: 957-973 68 Komari T, Hiei Y, Saito Y,Murai N and Kumashiro T (1996), “Vectors carrying two separate T-DNAs for co-transformation of higher plants mediated by Agrobacterium tumefaciens and segrega-tion of transformants free from selection markers” Plant J 10: 165–174 69 Lakshmi P Manavalan & Satish K Guttikonda & Vinh T Nguyen & J Grover Shannon & Henry T Nguyen (2009), “Evaluation of diverse soybean germplasm for root growth and architecture”, Plant Soil Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 75 70 Larson G P., K Itakura, H Ito, and J J Rossi (1983), “Saccharomyces cerevisiae actin-Escherichia coli lacZ gene fusions: synthetic-oligonucleotide-mediated deletion of the 309 base pair intervening sequence in the actin gene” Gene 22: 31-39 71 Lazzeri, P.A., Hildebrand, D.F., Collins, G.B (1985), “A procedure for regeneration from immature cotyledon tissue of soybean” Plant Mol.Biol.Rep.3: 160-167 72 Lee M.K., Walter F.S., Hart H., Palekar N., Chen J.S (2003) “The mode of action of the Bacillus thuringiensis protein Vip3A differs from that of Cry1Ab delta-endotoxin” Appl & Envir Micro 69:4648-4657 73 Lei BJ, Li XC, Lu CH, Qian H, Zhou SJ, Xie WW, and Wang B (1994), “Introduction of wild soybean DNA into cultivar soybean and molecular RAPD confirmation” Sci China (Ser B) 24: 596-601 74 Lei BJ, Lu CH, Qian H, Li XC, Lu YB, Zhao K, Liu GY, and Yang XY (1995), “New soybean strains of high protein and double high content obtained from introduction of exogenous total DNA” Soybean Sci 14: 203-208 75 Lewin B (1997), Genes VI New York, USA, Oxford University Press, Inc p 1260 76 Li Haiyan, Liu Mio, Song xiaohui, Han Yingpeng, Wu Xiaoxia, Zang Dayong and Li Wenbin (2010), “Effect of 6-BA and 2,4-D on soybean transformation”, Journal of Northeast Agricultural University 77 Lippmann, B., Lippmann G (1984), “Indution of somatic embryos in cotyledonary tissue of soybean (Glycine max (L.) Merr.)”, Plant cell Rep 3; 215-218 78 Liu DP, Liao L, Yuan Y, and Liu YZ (1997), “Gaining of soybean lines resistant to SMV by introducing exogenous DNA” Soybean Sci 16: 277-281 79 Liu DP, Yuan Y, and Sun H (1992), “A study of exogenous DNA introduction into cultivated soybean In: Zhou GY, Chen SB, and Hu JQ (eds), Advances in Molecular Breeding Research of Agriculture”, China Agri Sci Tech Press, pp 134-140, 80 Liu S.J., Wei Z.M., Huang J.Q (2008), “The effect of co-cultivation and selection parameters on Agrobacterium-mediated transformation of Chinese soybean varieties”, Plant Cell Rep, 28, pp 489-498 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 76 81 Liu WN, Torisky RS, McAllister KP, Avdiushko S, Hildebrand D, Collins GB and Liu WN (1996), “Somatic embryo cycling: evaluation of a novel transformation and assay system for seed-specific gene expression in soybean” Plant Cell Tissue and Org.Cult 47: 33-42 82 Luo ZX and Wu R (1989), “A simple method for the transformation of rice via the pollen- tube pathway” Plant Mol Biol Rep 7: 69-77 83 M A Schmidt, P R LaFayette, B A Artelt and W A Parrott (2007), “A comparison of strategies for transformation with multiple genes via microprojectile-mediated bombardment”, The Society for In Vitro Biology 84 Marco T Buenrostro-Nava, B.S., M.S (2002), Characterization of gfp gene expression using an automated image collection system and image analysis, Dissertation, The Ohio State University 85 Margine M.Paz, Juan Carlos Martinez, Andrea B.Kalvig, Tina M.Fonger, Kan Wang (2006), “Improved cotyledonary node method using an alternative explant derived from mature seed for efficient Agrobacterium-mediated soybean transformation”, Plant Cell Rep, 206-213 86 Mauro A.O., Pfeiffer, T.W., and Collins, G.B (1995), “Inheritance of soybean susceptibility to Agrobacterium tumefaciens and its relationship to transformation” Crop Sci 35: 1152-1156 87 McCabe, D.E., Swain, W.F., Martinell, B.J., and Christou, P (1988), “Stable transformation of soybean (Glycine max Merrill) by particle acceleration” Bio/Technol 6: 923-926 88 McKenzie, M.A., and Cress, W.A (1992), “The evaluation of South African cultivars of soybean for their susceptibility to Agrobacterium tumefaciens and the production of transgenic soybean” S.A.J.Sci.88: 193-196 89 Miller M, Tagliani L, Wang N, Berka B, Bidney D and Zhao ZY (2002), “High efficiency transgene segregation in co-transformed maize plants using an Agrobacterium tumefaciens 2T-DNA binary system” Transgenic Res 11: 381–396 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 77 90 Ni WC, Zhang ZL, and Guo SD (1998), “Development of transgenic insect-resistant cotton plants” Sci Agric Sin 31: 8-13 91 Olhoft, P.M., L.E Flagel, C.M Donovan, and D.A Somers (2003), “Efficient soybean transformation using hygromycin B selection in the cotyledonary-node method”, Planta 216:723-735 92 Owens, L.D., and Cress, D.E (1985), “Genotypic variability of soybean response to Agrobacterium strain Ti or Ri plasmids” Plant Physiol 77:87-94 93 Ren-Gao Xue, Hong-Feng Xie and Biao Zhang (2006), “A multi-needle-assisted transformation of soybean cotyledonary node cells”, Biotechnol Lett , 28:1551–1557 94 P.M Olhoft, K Lin ,J Galbraith, N.C Nielsen and D.A Somers (2001), “The role of thiol compounds in increasing Agrobacterium-mediated transformation of soybean cotyledonary-node cells”, Plant Cell Rep 20:731–737 95 P.M.Olhoft.D.A.Somers (2001), “L-Cysteine increases Agrobacterium-mediated TDNA delivery into soybean cotyledonary-node cells”, Plant Cell Rep 20:706–711 96 Parrott, W.A., Dryden, G., Vogt, S., Hildebrand, D.F., Collins G.B., Williams, E.G (1988), “Optimization of somatic embryogenesis and embryo germination in soybean” Invitro Cell Dev.Biol 24: 817-820 97 Parrott, W.A., Hoffman, L.M., Hildebrand, D.F., Williams and Collin G.B (1989), “Recovery of primary transformation of soybean” Plant Cell 2: 201-204 98 Paul Christou, Jean E Murphy and Williams F Swain (1987), “Stable transformation of soybean by electroporation and root formation from transformed callus”, Proc Natl Acad Sci USA,Vol 84, pp 3962-3966 99 Paula P Chee, Krystal A Fober, and Jerry L Slightom (1989), “Transformation of Soybean (Glycine max) by Infecting Germinating Seeds with Agrobacterium tumefaciens”, Plant Physiol: 91, p.1212-1218 100 Paulo Celso de Mello-Farias; Ana Luscia Soares Chaves (2008), “Advances in Agrobacterium – mediated plant transformation with Enphasys on soybean”, Sci Agric (Piracicaba, Braz.), v.65 (1) p.95-106 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 78 101 Paz M.M., Huixia S., Zibiao G., Zhanyuan Z., Anjan K B & Wang K (2004), “Assessment of conditions affecting Agrobacterium-mediated soybean transformation using the cotyledonary node explant”, Euphytica, 136, pp 167-169 102 Paz M.M (2005), “Agrobacterium-mediated transformation of soybean and recovery of transgenic soybean plants”, Plant cell reports 103 Pederson, H.C., Christiansen, J., and Wyndaele, R (1983), “Induction and invitro culture of soybean crown gall tumors” Plant cell rep 2:201-204 104 Perl A, Lotan O, Abu-Abied M, Holland D (1996), “Establishment of an Agrobacterium-mediated transformation system for grape (Vitis vinifera L.): the role of antioxidants during grape- Agrobacterium interactions” Nat Biotechnol 14:624–628 105 Ponnappa T., A E Brzozowski, and J J Finer (1999), “Transient expression and stable transformation of soybean using the jellyfish green fluorescent protein” Plant Cell Reports 19: - 12 106 Prasher D C., V K Eckenrode, W W Ward, F G Prendergast, and M J Cormier (1992), “Primary structure of the Aequorea victoria green-fluorescent protein” Gene 111: 229 - 233 107 Santarem, E.A., Pelissier, B., Fimer, J.J “In press Effect of explant, pH, solidifying agent and wouding on initiation of soybean somatic embryos” Invitro Cell Dev.Biol-Plant 108 Shaw W V., L C Packman, B D Burleigh, A Dell, H R Morris, and B S Hartsley (1980), “Primary structure of a chloramphenicol acetyl transferase EC-2.3.1.28 specified by R plasmids” Nature 282: 870-872 109 Shu KM and Yeh MS (1988), “The differentiation abilities of callus induced from different explants of soybean varieties” J Agric For 37 : 67-69 110 Stachel, S.E., Messsens, E., Van Montagu, M., and Zambryski, P (1985), “Identification of the signal molecules produced by wounded plant cells which active the T-DNA transfer process in Agrobacterium tumefaciens” Nature 318: 624-629 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 79 111 T.A Pham, C.B Hill, M.R Miles, B.T Nguyen, T.T Vu, T.D Vuong, T.T Van Toai, H.T Nguyen, G.L Hartman (2010), “Evaluation of soybean for resistance to soybean rust in Vietnam”, Field Crops Research 117: 131–138 112 Teeri T H., H Lehvaslaiho, M Franck, J Uotila, P Heino, E T Palva, M.-v Montagu, and L Herrera-Estrella (1989), Regulated expression of lacZ gene fusions in tobacco In Primary and Secondary Metabolism of Plant Cell Cultures II, W G.W Kurz, ed (New York, Springer-Verlag), pp 274-280 113 Tetsuji Oya, Alexandre Lima Nepomuceno, Norman Neumaier, Jose Renato Boucas Rarias, Satoshi Tobita Osamu Ito (2004), “Drought tolerance characteristics of Brazilian soybean cultivars evaluation and characterization of drought tolerance of various Brazilian soybean cultivars in field”, Plant Prod.Sci (2): 129-137 114 Thomas E Clemente, Bradley J LaVallee, Arlene R Howe, Dannette Conner-Ward, Renee J Rozman, Priscilla E Hunter, Debra L Broyles, Daniel S Kasten, and Maud A Hinchee (2000), “Progeny Analysis of Glyphosate Selected Transgenic Soybeans Derived from Agrobacterium-Mediated Transformation”, Crop science, Vol 40: 797 – 803 115 Tinland, B., and Hohn, B (1995), “Recombination between prokaryotic and eukaryotic DNA: Intergation of Agrobacterium tumefaciens T-DNA into the plant genome” In: Genetic Engineering, Vol 17, J.K Setlow, ed Plenum Press, New York, pp 209-229 116 Townsend, J.A., and Thomas, L.A (1993), An improved method of Agrobacterium – mediated transformation of culture soybean cells Patent No WO94/02620 117 Tran Thi Cuc Hoa (2007), “Assessment of the inhibition ability of mannose on soybean seed germination, shoot elongation and rooting for the establishment of a mannose selection system in soybean transformation”, Omonrice 15: 21-28 118 Tran Thi Cuc Hoa, Tran Vu Hai, La Cao Thang (2008), “Transformation efficienciens of the soybean variety PC19 (Glycine max (L.) Merrill) using Agrobacterium tumefaciens and the cotyledonary node method”, Omonrice 16: – Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 80 119 Trick, H.N., Finer, J.J (1997), "SAAT: sonication-assisted Agrobacterium - mediates transformation", Transgenic Res.6, pp 329-337 120 Wright M., Dawson J., Dunder E., Suttie J., Reed J., Kramer R., Chang Y.F., Novitzky R Wang H and Artim-Moor L., (2001), “Efficient biolistic transformation of maize (Zea mays L.) and wheat (Triticum aestivum L.) using the phosphomannose isomerase gene, pmi, as the seletable marker”, Plant Cell Report (20), pp 429-436 121 Xinping YI and Deyue YU (2006), “Transformation of multiple soybean cultivars by infecting cotyledonary-node with Agrobacterium tumefaciens”, African Journal of Biotechnology Vol (20), pp 1989-1993 122 Young Jin Kim, Tae ll Park, Hyun Soon Kim, Ho Ki Park, Sang Uk Chon, Song Joong Yun (2004), “Factors affecting Organogenesis from Mature cotyledon Explants and Regeneration in soybean” J Plant Biotechnology Vol 6(1).pp.39-43 123 Yu HX, Liu JJ, Feng ZL, and Dong JD (1999), “Study on introduction of verminresistance gene (CpTI) into wheat through pollen-tube pathway method” J ShanDong Agric Sci 99: 5-8 124 Yu C.G., Mullins M.A., Warren G.W., Koziel M.G., Estruch J.J (1997), “The Bacillus thuringiensis vegetative insecticidal protein Vip3A lyses midgut Epithelium cells of susceptible insects” Appl & Envir Mcro 63 125 Zambryski, P (1998), “Basic processes underlying Agrobacterium –media DNA transfer to plant cells” Ann.Rev.Genet 22: 1-30 126 Zeng (2004), “An improved Agrobacterium-mediated soybean transformation procedure”, Plant Cell Reports 22:478-482 127 Zeng P., Vadnais D.A., Zhang Z., Polacco J.C (2004), “Refined glufosinate selection in Agrobacterium-mediated transformation of soybean (Glycine max (L.) Merrill)”, Plant Cell Rep, 22, pp 478-482 128 Zenglu Li, Randall L Nelson, Jack M Widholm, and Andrew Bent (2001), “Soybean Transformation via the Pollen Tube Pathway”, Plant Mol.Biol 129 Zhao LM, Liu DP, Sun H, Yun Y, and Huang M (1995), “A sterile material of soybean gained by introducing exogenous DNA” Soybean Sci 14: 83-87 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 81 130 Zhen JZ, Wu YX, Wang DJ, Zhang J, Ma ZR, and Zhou ZY (1998), “The exploration of the mechanism and genetic performance of the progenies gained from pollen-tube path-way transformation” Sci Bull (China) 43: 561-566 131 Zhou GY, Weng J, Zhen YS, Huang JG, Qian SY, and Liu GL (1983), Introduction of ex-ogenous DNA into cotton embryos In: Wu R, Grossman L and Molddave K (eds), Methods in enzymology, Vol 101, Recombination DNA, Part C, pp 433-481 Academic Press, New York 132 Zupan J., Muth T.R., Draper O., and Zambryski P.(2000), “The transfer of DNA from A.tumefaciens into plants: a feast of fundamental insights”, Plant J 23:11-28 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 82 ... gen vào đậu tương (Glycine max (L. ) Merrill) thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens? ?? Mục tiêu nghiên cứu Nghiên cứu biến nạp gen vào số giống đậu tương Vi? ??t Nam Yêu cầu nghiên cứu - L? ??a chọn... thực nghiệm Mã số : 60.42.30 Tên đề tài: “NGHIÊN CỨU BIẾN NẠP GEN VÀO ĐẬU TƯƠNG (Glycine max (L. ) Merrill) THÔNG QUA VI KHUẨN Agrobacterium tumefaciens? ?? LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Người hướng dẫn... đậu tương  Chuẩn bị vi khuẩn biến nạp Chủng vi khuẩn AGL-1 biến nạp plasmid vector pX2-H mang gen chọn l? ??c hpt gen thị gfp Trước biến nạp, chủng vi khuẩn A tumefaciens l? ??y từ đĩa môi trường LB