Nghiên ứu đánh giá sự hiện diện và tính ổn định ủa gen huyển trong á dòng ngô huyển gen kháng sâu tạo ra thông qua vi khuẩn agrobaterium

ứTôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới TS.. Tôi xin bày t lòng biỏết ơn chân thành đối với những giúp đỡ quý báu đó.

Nghiên cứu đánh giá diện tính ổn định gen chuyển dịng ngơ chuyển gen kháng sâu tạo thông qua vi khuẩn Agrobacterium  Để hồn thành luận văn này, tơi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Phạm Thị Lý Thu tận tình hướng dẫn tạo điều kiện giúp đỡ tơi q trình học tập nghiên cứu Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn chân thành tới TS Lê Quang Hòa thầy giáo phịng Sau Đại học, thầy giáo Viện CN Sinh học & CN Thực phẩm – Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội giúp đỡ nhiệt tình tạo điều kiện thuận lợi thời gian học tập hồn thành khóa luận tốt nghiệp Tôi xin gửi lời cảm ơn tới tập thể cán Phịng thí nghiệm Trọng điểm Cơng nghệ tế bào Thực vật - Viện Di truyền Nông nghiệp giúp đỡ nhiệt tình suốt thời gian tơi thực khóa luận Cuối tơi xin gửi tới bố mẹ, anh chị bạn bè, người quan tâm, ủng hộ chỗ dựa cho tơi suốt thời gian tơi làm khóa luận này, sống Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành giúp đỡ quý báu Hà Nội, ngày 26 tháng năm 2013 Học viên Nguyễn Thị Hòa Nguyễn Thị Hòa -i- 1708094068796a62fe4dc-63cf-4c78-89b3-555c0da8b374 1708094068795c965bf77-1aff-41dd-9d09-d5d0d3d1b13f 1708094068795e5ed1e79-e3b2-4c9b-bdb4-473a2a9a4084 Hà Nội, 09/2013 Nghiên cứu đánh giá diện tính ổn định gen chuyển dịng ngơ chuyển gen kháng sâu tạo thông qua vi khuẩn Agrobacterium  ADN : Deoxirionucleic Acid Bt : Bacillus thuringensis CCC : Chiu cao : Chip Cry : Crystal CS : Cng s CTAB : Cetyltrimethylammonium Bromide  : i chng FAO : Food and Agriculture Organization GMC : Genetically Modified Corn GMO : Genetically Modified Organism OD : Optical Density PCR : Polymerase Chain Reaction T-DNA : Transfer-DNA TGST : Thng Ti-plasmid : Tumor-Including Plasmid Vir : virulence Nguyễn Thị Hòa - ii - Hà Nội, 09/2013 Nghiên cứu đánh giá diện tính ổn định gen chuyển dịng ngô chuyển gen kháng sâu tạo thông qua vi khuẩn Agrobacterium  Hình 1.1 B Ti- plasmid dng octopin Hình 2.2 Quá trình chuyn T-ADN vào t bào thc vt 12  cu trúc vector liên hp 16  cu trúc vector pADT2 35 Hình 3.1 Kt qu n di kim tra mu ADN tng s gel agarose 0,8 % 46 Hình 3.2 Kt qu phân tích PCR gen Cry1A(c)  T2 ca dòng VN106 48 Hình 3.3 Kt qu phân tích PCR gen Cry1A(c)  T2 ca dịng CH9 48 Hình 3.4 Kt qu  hin din protein Cry1A(c) dịng ngơ mang gen kháng sâu th h T2 50 Hình 3.5       ca dịng ngơ CH9.13.159.1 chuyn gen b sâu in vitro 53 Hình 3.6 So sánh mt s ch tiêu nông sinh hc ca dịng ngơ chuyn gen kháng sâu Cry1A(c) th h T2 vi chnn gen) 55 Hình 3.7 Các dịng ngơ mang gen kháng sâu Cry1A(c) th h T2 trng nhà i cách ly côn trùng 55 Hìc tri cách ly 56 Hình 3.9 Kt qu phân tích PCR gen Cry1A(c)  T3 ca dịng VN106 58 Hình 3.10 Kt qu phân tích PCR gen Cry1A(c)  T3 ca dịng CH9 58 Hình 3.11 Kt qu lai Southern blot dịng ngơ CH9 chuyn gen Cry1A(c) th h T3 59 Hình 3.12 Kt qu  hin din protein Cry1A(c) dịng ngơ CH9 chuyn gen kháng sâu th h T3 .61 Hình 3.13  c thân thân ca dòng mang gen kháng sâu th h T3 63 Hình 3.14 So sánh mt s ch tiêu nơng sinh hc ca dịng ngơ CH9 chuyn gen kháng sâu Cry1A(c) th h T3 vi dòng ngi ch n gen) 64 Hình 3.15 Các dịng ngơ CH9 mang gen kháng sâu Cry1A(c) th h T3 trng i cách ly côn trùng 65 Nguyễn Thị Hòa - iii - Hà Nội, 09/2013 Nghiên cứu đánh giá diện tính ổn định gen chuyển dịng ngơ chuyển gen kháng sâu tạo thông qua vi khuẩn Agrobacterium DANH MC BNG Bng 1.1 Các ch th chn lc dùng cho bin np gen 17 Bng 1.2 Các gen ch th sinh hóa .18 Bng 2.1 Danh sách dịng ngơ mang gen kháng sâu Cry1A(c) th h T1 s dng làm vt liu nghiên cu .34 Bng 2.2 Trình t n mi s dng nghiên cu 38 Bng 3.1 Kt qu PCR phân tích dịng ngơ chuyn gen T2 .47 Bng 3.2 Kt qu  hin din ca protein Cry1A(c) dịng ngơ mang gen kháng sâu th h T2 49 B c ca dịng ngơ mang gen 51 Bng3.4 t s c tính nơng sinh hc ca dịng ngơ mang gen kháng sâu Cry1A(c) th h T2 53 Bng 3.5 Các dịng ngơ mang gen kháng sâu Cry1A(c) th h T2 s dng làm vt liu nghiên cu 56 Bng 3.6 Kt qu PCR phân tích dịng ngơ chuyn gen T3 .57 Bng 3.8 Kt qu  hin din ca protein Cry1A(c) dịng ngơ mang gen kháng sâu th h T3 60 B c thân ca dòng ngô mang gen kháng sâu Cry1A(c) th h T3 62 Bng3.9 c tính nơng sinh hc ca dịng ngơ mang gen kháng sâu Cry1A(c) th h T3 .63 Nguyễn Thị Hòa - iv - Hà Nội, 09/2013 Nghiên cứu đánh giá diện tính ổn định gen chuyển dịng ngơ chuyển gen kháng sâu tạo thông qua vi khuẩn Agrobacterium MỤC LỤC LI C i KÝ HIU VIT TT ii DANH MC HÌNH V iii M U NG QUAN TÀI LIU 1.1 Ngun gc, vai trị v trí ca ngô h thng trng .4 1.1.1 Ngun gc phân loi 1.1.2 Vai trò ca ngô nn kinh t 1.1.3 Tình hình sn xut ngô th gii  Vit Nam 1.1.4 Khái quát tình hình sâu hi ngô  Vit Nam 1.2 Vi khu chuyn gen vào thc vt 1.2.1 Gii thiu chung v Agrobacterium tumefaciens 1.2.2 Cu trúc cha Ti-plasmid .8 1.2.3 Cu trúc chn T-ADN .9  phân t ca vic chuyn gen thông qua Agrobacterium tumefaciens .10 a T-ADN genome t bào thc vt 12 1.3 H thng vector bin np gen thông qua vi khun Agrobacterium tumefaciens vào t bào thc vt 13 1.3.1 H vector hai ngun 14 1.3.2 H vector liên hp .15 1.3.3 Các gen ch th chn lc gen thông báo h thng vector bin np 16 1.4 Nhng nghiên cu v Bacillus thuringiensis Cry 19 1.4.1 Nhng nghiên cu chung v Bacillus thuringiensis 19 1.4.2 Nhng nghiên cu v gen Cry 19 1.4.3 Cu trúc cha protein tinh th c 20 Nguyễn Thị Hòa -v- Hà Nội, 09/2013 Nghiên cứu đánh giá diện tính ổn định gen chuyển dịng ngơ chuyển gen kháng sâu tạo thông qua vi khuẩn Agrobacterium 1.4.4 Mt s nghiên cu v gen Cry1A(c) 22 1.5 Thc trng nghiên cu ng dng Công ngh Sinh hc chn to ging ngô .23 1.5.1 H thng tái sinh  ngô .23 1.5.2 H thng chuyn gen  ngô 26 1.5.3 Mt s c ci thin  ngô bt di truyn 30 T LIU 34 2.1 Vt liu 34 2.1.1 Vt liu thc vt 34 2.1.2 Vt liu di truyn 34 m .35 ng rung 35 n gen .37 T QU VÀ THO LUN 45 3.1 Kt qu tách chit ADN tng s t ca dịng ngơ mang gen kháng sâu Cry1A(c) th h T2 45 3.2 Kt qu phân tích PCR s có mt ca gen Cry1A(c) dịng ngơ chuyn gen th h T2 .46     hin din ca protein Cry1A(c) dịng ngơ mang gen kháng sâu Cry1A(c) th h T2 48 3.4  ca dịng ngơ mang gen kháng sâu Cry1A(c) th h T2 b sâu in vitro 50  ng, phát tric tính nơng hc quan trng ca dịng ngơ mang gen kháng sâu Cry1A(c) th h T2 .53 3.6 Kt qu phân tích PCR s có mt ca gen Cry1A(c) dịng ngơ chuyn gen th h T3 .56 3.7 Phân tích Southern blot gen Cry1A(c) dịng ngơ chuyn gen th h T3 58 Nguyễn Thị Hòa - vi - Hà Nội, 09/2013 Nghiên cứu đánh giá diện tính ổn định gen chuyển dịng ngơ chuyển gen kháng sâu tạo thông qua vi khuẩn Agrobacterium     hin din ca protein Cry1A(c) dịng ngơ mang gen kháng sâu Cry1A(c) th h T3 59  c thân ca dịng ngơ chuyn gen th h T3 u kin th sâu nhân ti cách ly 61  ng, phát tric tính nơng hc quan trng ca dịng ngơ mang gen kháng sâu Cry1A(c) th h T3 .63 KT LU NGH 66 4.1 Kt lun .66  ngh 66 TÀI LIU THAM KHO 67 Nguyễn Thị Hòa - vii - Hà Nội, 09/2013 Nghiên cứu đánh giá diện tính ổn định gen chuyển dịng ngơ chuyển gen kháng sâu tạo thông qua vi khuẩn Agrobacterium  Ngô (Zea mays L.) m   c quan trng nht th gii So vi lúa mì lúa gng th ba v din tích, th hai v t  nht v sng Vi giá tr kinh t cao kh  thích ng rng, c trng  hu hn tích trng ngơ th git 174,64 triu vi tng st 838 triu t M  c có din tích ln nht vi 35,5 triu ha, s  t 274 triu tn (James, 2012) Nhu cu ngô ca th gic d báo s i 852 triu t t qua c go lúa mì (Pingali & Padney, 2010) Ti Vic quan trng th ng ch lc công cu    c bit  t    2012, din tích gieo trng ngơ ca c t gn 1,2 triu vi sng 4,6 triu tt 40,09 t/ha (Tng cc th c ta vn phi nhp khu ngô vng ln, 1,614 triu ti tr    u USD (B    Theo chi c ca B Nông nghi      ng ngô ca Vit Nam c t  triu t m bo cung c nhu cu nc tc tham gia xut khu Tuy nhiên sn xu    i mt vi tình hình sâu bnh dch hi n nay, rt nhiu loi thuc tr sâu hóa hc s dng  phòng tr sâu bnh vi chi phí tn kém, gây nhing c hi cho sc khi, v ci thin tình hình này, nhng k thut tiên tin bo v trng nhm xây dng mt nn nông nghip sch, bn vng  c nghiên cu Vic to ging trng bi i gen (Genetically Modified Crops, GMCs) có kh nh côn trùng nh k thut chuyn gen thc vt  c quan tâm nghiên cu ng dng vào thc tin nh   sut tri li ích tn nơng nghip Nguyễn Thị Hịa -1- Hà Nội, 09/2013 Nghiên cứu đánh giá diện tính ổn định gen chuyển dịng ngơ chuyển gen kháng sâu tạo thông qua vi khuẩn Agrobacterium Cây ngô chuyn       2012 din tích trng ngô bii gen t 55,1 triu chim 31,6% tng din tích trng ngơ tồn th gii Trong s   n gen kháng sâu biu hin protein Cry có ngun gc t vi khun Bacillus thuringensis (Bt) chim khong 7,5 triu (4%) (James, 2012) Ti Vit Nam, nghiên cu chuy   i ng ngô N  Cry1A(c)   Agrobacterium. chn                       Cry1A(c)  Xut phát t   khoa hc thc tin trên, thc hi  tài: Nghiên c hin din tính nh ca gen chuyn dịng ngơ chuyn gen kháng sâu to thơng qua vi khun Agrobacterium Mục tiêu nghiên cứu:   Cry1A(c) 2, T3 - Cry1A(c) - Cry1A(c) - Cry1A(c) -                -  Nội dung nghiên cứu: - Phân tích sinh hc phân t (PCR) gen kháng sâu Cry1A(c) dịng ngơ mang gen th h T2, T3 - Phân tích sinh hc phân t (lai Southern blot) gen kháng sâu Cry1A(c) Nguyễn Thị Hòa -2- Hà Nội, 09/2013 Nghiên cứu đánh giá diện tính ổn định gen chuyển dịng ngơ chuyển gen kháng sâu tạo thơng qua vi khuẩn Agrobacterium dịng ngơ mang gen th h T2, T3 -  hin din ca protein Cry1A(c) dịng ngơ mang gen kháng sâu Cry1A(c) th h T2, T3 -  c thân ca dòng ngô mang gen kháng sâu Cry1A(c) th h T2, T3 b sâu invitro -  c thân ca dòng ngô mang gen kháng sâu Cry1A(c) th h T2, T3 u kin lây nhim nhân ti cách ly côn trùng - ánh giá kh   ng, phát trin, cá c tính nơng hc quan trng ca dịng ngơ mang gen kháng sâu Cry1A(c) th h T2, T3 Nguyễn Thị Hòa -3- Hà Nội, 09/2013