ứTôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới TS.. Tôi xin bày t lòng biỏết ơn chân thành đối với những giúp đỡ quý báu đó.
Trang 1Nguy n Th Hòa ễ ị - - i Hà N i, 09/2013 ộ
Để hoàn thành b n lu ả ận văn này, tôi xin bày tỏ lòng bi ết ơn sâu sắ ớ c t i TS Phạ m Th ị Lý Thu đã tận tình hướ ng d n và t o m ẫ ạ ọi điề u ki ện giúp đỡ tôi trong quá trình học tậ p và nghiên c u ứ
Tôi cũng xin bày tỏ lòng bi ết ơn chân thành tớ i TS Lê Quang Hòa cùng các thầy cô giáo phòng Sau Đạ ọ i h c, th y cô giáo Vi n CN Sinh h c & CN Th c ph ầ ệ ọ ự ẩm – Trư ờng Đạ i h c Bách Khoa Hà N ọ ội đã giúp đỡ nhi t tình và t o m ệ ạ ọi điề u ki n ệ thu ậ ợ n l i trong th i gian h c tập cũng như khi hoàn thành khóa luậ ố ờ ọ n t t nghi ệ p
Tôi xin g i l i c ử ờ ảm ơn tớ ậ i t p th cán b Phòng thí nghi m Tr ể ộ ệ ọng điể m Công ngh t bào Th c v - ệ ế ự ậ t Việ n Di truy n Nông nghi p v s ề ệ ề ự giúp đỡ nhi t tình trong ệ suốt thờ i gian tôi th c hi n khóa lu n ự ệ ậ
Cuố i cùng tôi xin g i t i b m , anh ch cùng b n bè, nh ử ớ ố ẹ ị ạ ững người đ ã luôn quan tâm, ng h và là ch d a cho tôi trong su t th i gian tôi làm khóa lu n này, ủ ộ ỗ ự ố ờ ậ cũng như trong cuộ c sống
Tôi xin bày t lòng bi ỏ ết ơn chân thành đố i vớ i nh ững giúp đỡ quý báu đó.
Hà Nội, ngày 26 tháng 9 năm 2013
Trang 2FAO Food and Agriculture Organization :
GMC : Genetically Modified Corn
GMO : Genetically Modified Organism
OD : Optical Density
PCR : Polymerase Chain Reaction
T-DNA : Transfer DNA
-TGST : Thng
Ti-plasmid : Tumor-Including Plasmid
Vir : virulence
Trang 3Nguy n Th Hòa ễ ị - - iii Hà N i, 09/2013 ộ
Hình 1.1 B - plasmid dTi ng octopin 9
Hình 2.2 Quá trình chuyn T-ADN vào t bào th c vt 12
c u trúc vector liên h p 16
c u trúc vector pADT2 35
Hình 3.1 Kt qu n di ki m tra m u ADN t ng s trên gel agarose 0,8 % 46
Hình 3.2 Kt qu phân tích PCR gen Cry1A(c) các cây T2 c a dòng VN106 48
Hình 3.3 Kt qu phân tích PCR gen Cry1A(c) các cây T2 c a dòng CH9 48
Hình 3.4 K t qu hi n di n protein Cry1A(c) trong các dòng ngô mang gen kháng sâu th h 50 T2 Hình 3.5 c a dòng ngô CH9.13.159.1 chuy n gen bsâu in vitro 53
Hình 3.6 So sánh m t s tiêu nông sinh h c chính c a các dòng ngô chuy n gen ch kháng sâu Cry1A(c) th h T2 vi ch n n gen) 55
Hình 3.7 Các dòng ngô mang gen kháng sâu Cry1A(c) th h T2 tr ng trong nhà i cách ly côn trùng 55
Hìc tri cách ly 56
Hình 3.9 Kt qu phân tích PCR gen Cry1A(c) các cây T3 c a dòng VN106 58
Hình 3.10 Kt qu phân tích PCR gen Cry1A(c) các cây T3 c a dòng CH9 58
Hình 3.11 K t qu lai Southern blot các dòng ngô CH9 chuy n gen Cry1A(c) th h T3 59
Hình 3.12 K t qu hi n di n protein Cry1A(c) trong các dòng ngô CH9 chuy n gen kháng sâu th h 61 T3 Hình 3.13 c thân trên lá và thân c a các dòng mang gen kháng sâu th h 63 T3 Hình 3.14 So sánh m t s tiêu nông sinh h c chính c a các dòng ngô CH9 ch chuy n gen kháng sâu Cry1A(c) th h T3 v i dòng ng i ch n gen) 64
Hình 3.15 Các dòng ngô CH9 mang gen kháng sâu Cry1A(c) th h T3 tr ng trong i cách ly côn trùng 65
Trang 4Nguy n Th Hòa ễ ị - - iv Hà N i, 09/2013 ộ
DANH M C B NG
B ng 1.1 Các ch th ch n l c dùng cho bi n n p gen 17
B ng 1.2 Các gen ch th sinh hóa 18
B ng 2.1 Danh sách các dòng ngô mang gen kháng sâu Cry1A(c) th h T1 s d ng làm v t li u nghiên c u 34
B ng 2.2 Trình t n mi s d ng trong nghiên c u 38
B ng 3.1 K t qu PCR phân tích các dòng ngô chuy n gen T2 47
B ng 3.2 K t qu hi n di n c a protein Cry1A(c) trong các dòng ngô mang gen kháng sâu th h 49 T2
B c ca các dòng ngô mang gen 51
B ng3.4 t s c tính nông sinh h c chính c a các dòng ngô mang gen kháng sâu Cry1A(c) th h T2 53
B ng 3.5 Các dòng ngô mang gen kháng sâu Cry1A(c) th h T2 s d ng làm v t liu nghiên c u 56
B ng 3.6 K t qu PCR phân tích các dòng ngô chuy n gen T3 57
B ng 3.8 K t qu hi n di n c a protein Cry1A(c) trong các dòng ngô mang gen kháng sâu th h 60 T3
B c thân c a các dòng ngô mang gen kháng
sâu Cry1A(c) hth T3 62
B ng3.9 c tính nông sinh h c chính c a các dòng ngô mang gen kháng
sâu Cry1A(c) h T3 63th
Trang 5Nguy n Th Hòa ễ ị - - v Hà N i, 09/2013 ộ
M C L C Ụ Ụ
LI C i
KÝ HIU VIT TT ii
DANH M C HÌNH V iii
M U 1
NG QUAN TÀI LI U 4
1.1 Ngu n g c, vai trò và v trí ca cây ngô trong h ng cây tr ng 4th 1.1.1 Ngu n g c và phân lo i 4
1.1.2 Vai trò c a cây ngô trong n n kinh t 4
1.1.3 Tình hình s n xu t ngô trên th i và Vi gi t Nam 5
1.1.4 Khái quát tình hình sâu h i ngô Vit Nam 6
1.2 Vi khu chuy n gen vào th c vt 8
1.2.1 Gii thiu chung v Agrobacterium tumefaciens 8
1.2.2 C u trúc và ch a Ti-plasmid 8
1.2.3 C u trúc và ch n T-ADN 9
phân t c a vi c chuy n gen thông qua A grobacterium tumefaciens 10
a T-ADN và genome t bào th c v t 12
1.3 H ng vector bi n n p gen thông qua vi khu n th Agrobacterium tumefaciens vào t bào th c vt 13
1.3.1 H vector hai ngu n 14
1.3.2 H vector liên h p 15
1.3.3 Các gen ch th ch n l c và các gen thông báo trong h ng vector bi n th n p 16
1.4 Nh ng nghiên c u v Bacillus thuringiensis và Cry 19
1.4.1 Nh ng nghiên c u chung v Bacillus thuringiensis 19
1.4.2 Nh ng nghiên c u v gen Cry 19
1.4.3 C u trúc và ch a protein tinh th c 20
Trang 6Nguy n Th Hòa ễ ị - - vi Hà N i, 09/2013 ộ
1.4.4 M t s nghiên c u v gen Cry1A(c) 22
1.5 Th c tr ng nghiên c u và ng d ng Công ngh Sinh h c trong ch n t o gi ng ngô 23
1.5.1 H ng tái sinh cây ngô 23th 1.5.2 H ng chuy n gen ngô 26th 1.5.3 M t s c ci thi n cây ngô bt di truy n 30
T LI U 34
2.1 Vt liu 34
2.1.1 Vt liu thc vt 34
2.1.2 Vt liu di truyn 34
m 35
ng ru ng 35
n gen 37
T QU VÀ TH O LU N 45
3.1 K t qu tách chi t ADN t ng s t lá c a các dòng ngô mang gen kháng sâu Cry1A(c) h 45th T2 3.2 K t qu phân tích PCR s có m t c a gen Cry1A(c) trong các dòng ngô chuyn gen th h 46 T2 hi n di n c a protein Cry1A(c) trong các dòng ngô mang gen kháng sâu Cry1A(c) th T2 h 48
3.4 c a các dòng ngô mang gen kháng sâu Cry1A(c) th h bT2 sâu in vitro 50
ng, phát tric tính nông h c quan tr ng ca các dòng ngô mang gen kháng sâu Cry1A(c) th T2 h 53
3.6 K t qu phân tích PCR s có m t c a gen Cry1A(c) trong các dòng ngô chuyn gen th h 56 T3 3.7 Phân tích Southern blot gen Cry1A(c) trong các dòng ngô chuy n gen th h T3 58
Trang 7Nguy n Th Hòa ễ ị - - vii Hà N i, 09/2013 ộ
hi n di n c a protein Cry1A(c) trong các dòng ngô mang gen
kháng sâu Cry1A(c) th T3 h 59
c thân c a các dòng ngô chuy n gen th h T3 u ki n th sâu nhân t i cách ly 61
ng, phát tric tính nông h c quan tr ng ca các dòng ngô mang gen kháng sâu Cry1A(c) th T3 h 63
K T LU NGH 66
4.1 Kt lun 66
ngh 66
TÀI LI U THAM KH O 67
Trang 8Nguy n Th Hòa ễ ị - - 1 Hà N i, 09/2013 ộ
gi i So v i lúa mì và lúa g ng th ba v di n tích, th hai v t
nh t v s ng V i giá tr kinh t cao và kh thích ng r ng,
c tr ng h u h n tích tr ng ngô trên th gi t 174,64 tri u ha v i t ng s t 838 tri u t
M c có di n tích l n nh v i 35,5 tri u ha, s t t 274 tri n u t(James, 2012) Nhu c u ngô c a th gi c d báo s i 852 triu
t t qua c g o và lúa mì (Pingali & Padney, 2010)
T i Vi c quan tr ng th ng ch l c trong công cu c bi t các t
2012, di n tích gieo tr ng ngô c a c t g n 1,2 tri u ha v i s ng 4,6 tri u t t 40,09 t /ha (T ng c c th
c ta v n ph i nh p kh u ngô v ng khá l n, 1,614 tri u t i tr
u USD (B Theo chi c c a B Nông nghi ng ngô c a Vi t Nam c t 8 9 tri u
t m b o cung c nhu c u trong n c và t c tham gia xut
kh u Tuy nhiên s n xu i m t v i tình hình sâu b nh d ch h i
n nay, r t nhi u lo i thu c tr sâu hóa h c s d ng
phòng tr sâu b nh v i chi phí t n kém, gây ô nhi ng c h i cho s c kh i, v c i thi n tình hình này, nh ng k thut tiên tin trong b o v cây tr ng nh m xây d ng m t n n nông nghi p s ch, b n v ng
và c nghiên c u
c t o ra các gi ng cây tr ng bi gen tically Modified Crops,
GMCs) có kh nh và côn trùng nh k thut chuy n gen th c v t
c quan tâm nghiên c u và ng d ng vào th c ti n nh sut cây tri l i ích t n nông nghi p
Trang 9Nguy n Th Hòa ễ ị - - 2 Hà N i, 09/2013 ộ
Cây ngô chuy n
2012 di n tích tr ng ngô bi i gen t 55,1 tri u ha chim 31,6% t ng di n tích trng ngô trên toàn th gii Trong s n gen kháng sâu bi u hi n protein Cry có ngu n g c t vi khu n Bacillus thuringensis Bt ( ) chi m kho ng 7,5 triu ha (4%) (James, 2012) T i Vi t Nam, các nghiên c u chuy i
Trang 10Nguy n Th Hòa ễ ị - - 3 Hà N i, 09/2013 ộ
trong các dòng ngô mang gen th h T2, T3
- hi n di n c a protein Cry1A(c) trong các dòng ngô mang gen kháng sâu Cry1A(c) th T2, T3. h
- c thân c a các dòng ngô mang gen kháng sâu Cry1A(c) th h T2, T3 bsâu invitro
- c thân c a các dòng ngô mang gen kháng
sâu Cry1A(c) th h T2, T3 u ki n lây nhi m nhân t i cách
ly côn trùng
- ánh giá kh ng, phát tri n, cá c tính nông h c quan
trng c a các dòng ngô mang gen kháng sâu Cry1A(c) th h T2, T3
Trang 11Nguy n Th Hòa ễ ị - - 4 Hà N i, 09/2013 ộ
1.1
1.1.1 Nguồn gốc và phân loại
Cây ngô có tên khoa h c là Zea mays L, thuc chi Maydeae , h Hòa th o
Gramineae, có b nhi m s c th 2n = 20 K t qu nghiên c ng minh r ng cây ngô có ngu n g c Trung M , trung tâm phát sinh là Mehico ( Galinat, 1995) Tri qua hàng tring c a ch n l c t nhiên và nhân t o
, phân b i, nhii th p, nhi t
i cao và c n nhi i
Cây ngô quang h quang h p cao g p 3 l n cây quang h p theo chu trình C3, có kh p cao n oxy th p Các y u t này có ti ng khác , 1997)
1.1.2 Vai trò của cây ngô trong nền kinh tế
Cây ngô c s quan tâm c a các nhà khoa h c vì có nhi c tính quý ng và phát trit cao và kh ng
r ng S n ph m t n nuôi s ng 1/3 dân s gi i Toàn th th
gi d ng 21% sc bi t là nhi c Châu Phi, Châu M , v.v ng c chính (kho ng 85% s ng ngô) Ht ngô chng tinh b t trung bình kho ng 69,2%
ng tinh b t trong g o 62,4%; lúa mì 63,8%); protein 10,6%; lipit 4,3%; chu lo i vitamin quan tr ng cho s s ng Chính vì thành
ph c dùng r t nhi u trong thành ph n th sung, giúp tái tng (Ngô H u Tình
và CS., 1997)
Cùng v i nh ng tác d n 70% c s d bi n thch c
u quan tr ng trong công nghi p ch bi n th c ph m
Trang 12Nguy n Th Hòa ễ ị - - 5 Hà N i, 09/2013 ộ
u ng gi i khát); s n xu c; công ngh c,
s n xu tinh ch vitamin v.v
1.1.3 Tình hình sản xuất ngô trên thế giới và ở Việt Nam
c tr ng c gia trên th gi i t p trung c M
Trung Quc, Braxin, Mehicô, Pháp và , chúng chi m 75% (FAO, 2008) Trên th gi i, so v i lúa m và lúa g ng th ba v di n tích, th hai v nh t v s ng Vào nhi th k 20, ngh trc phát tri n k di u nh có nh ng ng d ng r ng rãi công ngh gi ng ngô lai và nh ng thành t u khoa h c khác v di truy n t o ch n
gi ng và k thut nông h ng ngô trên th gi i Trung Qu c d u v i 197,5 tri u t n trên di n tích tr ng tr t là 34,95 tri u ha
Tc có di n tích tr ng ngô l n nh t là Indonesia (41%), Philippins (29%), Thái Lan (13%) và Vit Nam (12%)
Tuy nhiên, ngành s n xu c ta th c s có nh c ti n nh y v t
là t u nh n nay, g n li n v i vi c không ng ng m r ng gi ng ngô lai ra s n xu ng th i c i thi n các bi n pháp k thui
ca ging m i
Trang 13Nguy n Th Hòa ễ ị - - 6 Hà N i, 09/2013 ộ
n tích tr ng gi trng l m kho ng 95% trong s u hecta
c v i t gi i trong suc ta ch b ng 34% so v i trung bình th gi i (11/32 t b ng 42% (15,5/37 t
b ng 60% (25/42 t ng 73% (36/49 t t 81,0% (39,6/49 tng ngô Ving 1 tri u t n,
t 2 tri u t n n tích tr ng ngô trong n t g n 1,2 trit kho ng 40,09 t / ha và sng là 4,6 tri u t n
trung bình th gi i (80%) và r t th p so v t thí nghi m, (2) có s chênh
l ch l n gi a các vùng và mùa v , giá thành s n xu t còn cao, (3) s
ng nhu ct nhanh, nhi nh p 1,5 tri u t n ngô h n ph m t u, (5) công ngh sau thu hoc
u v t ra cho ngành s n xu t ngô trên th gi i nói chung và
c ta nói riêng: (1) khí h u toàn c n bi n r t ph c t c bi t là h n
t và nhi u lo i sâu b nh h i m i xu t hi n, (2) giá nhân công ngày càng cao, c nh tranh gay g t gi a ngô và các cây tr ng khác, (3) t ng ngô thc
s u h ch u ki n b t l t x u, chua phèn, th i gian sinh
ng ngng tht cao i s n xu t v nhi u.
1.1.4 Khái quát tình hình sâu hại ngô ở Việt Nam
u tra thành ph n sâu h i ngô c ti
1967-1968 min Bn côn trùng, B Nông nghi p t chc
-1978 mi n Nam do Vi n B o v th c v ng d n li u quan tr ng v thành ph n, phân b và m tác h i c a các loài côn trùng gây h i trên cây ngô
Trang 14- Nhóm III : G m nh ng sâu h i có th p và th
gây ra tác h M t s ba ba (Cassida circumdata
Hebst), b nh y, b hung có s ng, b xít nh
V tính chuyên th c thì h u h t các loài sâu h n c u
là nhng, ch m t s ít loài có th coi là nh p chuyên phá h i trên các cây hoà th o
c tính phá h i c a các loài sâu h i ngô r t khác nhau Có loài phá h i trên
nhi u b ph n c c thân ngô có th phá h i
c phá bt, sâu c n nõn có th c, h t non, râu ngô Có loài chuyên phá h i trên các b ph n sinh s n c
c, râu ngô và h t ngô M t s loài khác ch i trên các b phân c a cây
t thóc ch phá h i trên h t ngô
c tính phá h i khác nhau nên có nh ng loài ch y xu t hi n vào nh ng
ng nhnh c th y trong th i
k cây non, m t thóc ch thy th i k s p thu ho c l i, có loài có th phá
h i g n su t c i k th ng cc thân ngô phá h i t khi ngô 7-8 lá cho t i lúc thu ho ch, sâu c n nõn phá h i t i k th cây con cho t i khi cây chín sáp Rp ngô phá h i t cây con cho t i khi g n thu ho ch
Trang 15Nguy n Th Hòa ễ ị - - 8 Hà N i, 09/2013 ộ
1.2 Agrobacterium tumefaciens 1.2.1 Giới thiệu chung về Agrobacterium tumefaciens
Agrobacterium tumefaciens là vi khu n gây b nh cây s t, có kh
m nhi m th c v t, kích thích t o kh i u ngay t i các v a cây ch Trong t nhiên, Agrobacterium tumefaciens ch y u t n công cây hai lá mc
bi t là nhóm th c v t có hoa Hoàn toàn khác v i mô và t bào th c v t bình
ng, kh i u do Agrobacterium tumefaciens sinh ra phát tri n r t m nh ngay trong
u ki n thi Agrobacterium tumefaciens n mn T-ADN (Transfer ADN) sang t bào th c v t và T-u khi n quá trình sinh t ng h p các các ch i u
ng h p các opin là các axit amin (amino acid- c bi t là các d n
xu t c ng D c t ng h p có th là nopalin, octopin, agrocinopin, mannozapin và agropin ph thuc vào t ng ch ng Agrobacterium tumefaciens.
ng opin ph bi c vi khu n s
d ng thay cho ngu hong c a gen chuy n hóa opin trên plasmid gây kh i u th c v t (Tumor inducing plasmid - -plasmid) (Brock, 1991; TiHooykass phân t c a s hình thành kh c quan tâm nghiên c u nh m tìm ra m c phòng b nh cho cây Khi phát hi n ra Ti- plasmid và kh chuy n T-ADN vào genom th c v c bit chú ý và khai thác kh g s d chuy n các gen quan tâm vào th c v t nh m t o cây tr ng mang nh ng tính tr ng mong mu n (Võ Th , 2007)
1.2.2 Cấu trúc và chức năng của Ti -plasmid
Ti- c phát hi n t t c các ch ng Agrobacterium tumefaciens
gây nhi m và t n t i b n v ng nhi i 300 t phân t ADN
d ng m ch vòng, s i kép và t n t i trong t c l p, có
c kho ng 200 kb Phân tích di truy n cho th y, Ti-plasmid d ng octopin và
d ng nopalin là hai d ng ph bi n nh
Trang 16-Nguy n Th Hòa ễ ị - - 9 Hà N i, 09/2013 ộ
c (VIRulence Region-vùng VIR), liên quan tr c ti p t i s hình thành kh i u thc v c có ch a các gen mã hóa các protein/enzyme VIR Có 9 i protein VIR là A, B, C, G, B1-11, D1-2, E1-2, F, H, loJ/AcvB (Genlvin, 2000) Các protein VIR này có vai trò quan tr ng trong vi c chuy n T-ADN sang t bào th c v t Hai vùng còn l i ch a gen mã hóa cho vi c sao chép plasmid và chuy n n p
Trên Ti-plasmid, ch có vùng T- c chuy n t vi khu n sang genom
c a các cây b b nh và t n t i b n v ng i không
mã hóa nh ng s n ph m trung gian cho quá trình chuy n T- ADN mà c n có s tr
c bi t c a các gen gây kh i u n m trên vùng VIR và trên nhi m s c th vi khu n (chv genes) Vùng VIR dài kho m nhim ch m Ti-plasmid d ng octopin, vùng VIR ch a t c S n ph m protein do
tách bi t T-ADN, bao b c che ch và giúp chúng ti p c n v i genom cây ch (Hooykass, 1992)
Hình 1.1 B ản đồ - plasmid d ng octopin Ti ạ
1.2.3 Cấu trúc và chức năng của các đoạn T - ADN
K t qu phân tích trình t gen trên T- ADN các Ti-plasmid khác nhau cho thy, T- c gi i h n b i m n trình t l p l i g kho ng 25 bp và g n biên Chúng là d u hi u nh n bi t cho quá trình chuy n T-ADN và xâm nh c a T-ADN vào t bào th c vp t n biên bên ph i (Right
Trang 17n quá trình sinh t ng h p auxin và cytokinin (Hooykass, 1992 ).
1.2.4 Cơ chế phân tử của việc chuyển gen thông qua Agrobacterium tumefaciens
Các t bào cây b t t ra các h p ch t hóa h c d n d vi khuti n
- i tác d ng c a các h p ch t này,
Agrobacterium tumefaciens nh n bi t r i bám vào thành t bào ch và chuy n T- ADN vào t bào th c v c s tr c bi t c a các gen R VI
và RB, LB (Võ Th p ch t này, v i vai trò
cm ng, giúp cho các gen vùng VIR hong bi u hi n
ng c a các gen sinh ra s -ADN làm xu t hi n b n copy
s i c a T-ADN Ch n s a hai trình t biên (LB và RB)
c a T-ADN m c chuy n vào t bào th c v c g n vào genome c a t
u t hong cis c a h th ng v n chuy n T-ADN Protein VIRD1,
c này, chúng nh n ra trình t biên T-ADN và
c t s i t i mm cu và k t thúc c a s i tái sinh Sau
VIRD2 v n còn g n k t v u cua s i T-ADN và t bào th c
v t N t bi n hay lo i b an RB thì h t hoàn toàn kh chuy n T-ADN, còn n t bi n LB s làm gi m hi u qu chuy n T-ADN (Hille, 1983) ng t t ng h p s i T-ADN là t c bu t
n RB và k t thúc LB
Trang 18gic c a ph c xu ng x p x 2nm, t u ki n thu n l i cho quá trình
di chuy n qua các kênh d n truy n trên màng t bào (Gustavo, 1998) Protein VIRE2 ch ng hai tín hi nh v trong nhân t bào th c v t và m t protein VIRD2 (Bravo Angel, 1998) Th c t cho th y hai protein này có vai trò quan tr ng trong vi c dàn x p s h p th ph c vào trong nhân t bào th c v t ( Rossi, 1996; Zupan, 1996) N u lo i b tín hi nh v trong nhân thì m t trong các protein này
b gi c ch hoàn toàn quá trình chuy n T- a T-ADN v i gennom t bào th c v t, ch ng t có m t thành viên khác có th m
nh n m t ph n t i thi u vai trò c a protein b thiu (Gustavo, 1998) Protein VIRE
c n thi i v i quá trình bài xu t protein VIRE2 sang t bào th Binns, c v t (1995)
Protein VIR t bu i v i s v n chuy n ph c ss-T- ADN Cha protein VIRD4 là liên kt v c l p v i ph c protein c n thi t v i quá trình di truy n T-ADN (Firth và CS., 1996)
Các nghiên c u công b ã miêu t vai trò c a operon VIR c 9,5kb trong quá trình s n sinh c u trúc b m t c a t i v i s v n chuy n
phc t vi khu n sang t bào th c vt (Fernandez, 1996; Finberg, 1995)
Protein VIRB là protein có tính k protein k t h p trên màng khác (Shirasu, 1990) Ph n l n protein VIR c phát hi n gi protein xuyên màng (Stephens, 1995; Ward, 1998) vài protein VIRc phân ph i l i trong quá trình phát sinh sinh v t và th c
hi n cha kênh k t h p qua t bào v n chuy protein VIRB2, VIRB11 là thành phn c a b máy v n chuy n T-ADN t t bào vi khu n sang t bào th c v t (Berger, 1994) Sau khi T-ADN qua màng t bào
Trang 19Nguy n Th Hòa ễ ị - - 12 Hà N i, 09/2013 ộ
ng vào nhân và k t h p v i h gen th c v t, b u hong và s n sinh ra auxin, cytokinin và opin gây nên s phát tri n thái quá c a hàng lo t t bào lân cn dn s hình thành kh i u
Hình 2.1 Quá trình chuy n T-ADN vào t bào th c v t ể ế ự ậ
1.2.5 Tương tác giữa T ADN và genome tế bào thực vật
-Trong t bào th c v t, ph c ss-T-
c này là VIRD2 và VIRE2 Tín hi u
nh v trong nhân c a VIRD2 và VIR trò ch y u Protein VIRD2 có ch nh v trí cho T-ADN trong nhân Ph c ss-T- ADN là ph c
n 20Kb ch a m n v i protein VIR c
c bao b c b i s ng l n phân t VIRE2 (xp x 600/20kb T-ADN) và m i
ph c này có hai tín hi nh v trong nhân Hai tín hi u này c VIR a trò quan tr i v i vi c nh n liên t c ph c T-ADN c a nhân, có kh thích m l màng nhân Kh n ph c c u khi n b i protein
k t h p tín hi nh v c tìm th y trong t bào cht c a t bào thc vt (Gustavo, 1998)
c cu i cùng trong quá trình v n chuy n T-ADN là s
genom t bào th c v t Các ph n ng trong s - i n
Trang 20u tiên gi a s i T- ADN và ADN thc v t là t o l h ng s - a ADN
thc v c v c c t v a l h ng b i endonuclease và nucleotit c t c p v i VirD2 b i m t nucleotid c u
s c th c v t th Gii phóng protein VIRD2 có th cung c ng chng trong các liên ki nucleotid u tiên c a s i T-ADN,
a s i T-ADN không còn ( Tinland, 1995) Ngoài ra quá trình chuy n T-ADN còn có s i các protein do gen trên nhi m s c th c a
Agrobacterium tumefaciens quy nh và protein trong t bào th c vt
Trang 211.3.1 Hệ vector hai nguồn
Nghiên c u c c chuy n gen vào phôi non dòng ngô lai HiII và các dòng ngô khác s d ng h ng vector m th i: vector hai ngu n Quy trình chuy n gen này có th áp d chuy n gen vào các dòng ngô khác nhau, th m chí các dòng ngô ch n l c
phát hi n hai vùng VIR không c n n m trên cùng m t plasmid
v i vùng T-ADN mà v u khic s chuy n và xâm nh p c a T-ADN vào
h gen th c v u và hoàn ch nh h ng vector hai ngu th n
-ADN và vùng VIR ncùng m t ch ng Agrobacterium tumefaciens
Có hai lo c s d ng trong h ng vth ector hai ngun:
(a) Vector chuy n gen là Ti-plasmid nh có kh sao chép và có ph
v t ch r ng v n T-c c t b h t các gen không c n thi t gi a hai trình t biên trái và biên ph i, g n thêm m t s thành ph n t o ra c u trúc m i: i) cá ADN plasmid có th v a t nhân trong c E.coli và
Agrobacterium; ii) các gen ch n l c, gen ch ; iii) vùng có ch a nhi th m ct
c a các enzyme gi i h n (vùng t m gi a hai trình t biên trái
và biên ph chèn gen mong mu n).
(b) Vector b tr n m trong : Agrobacterium tumefaciens , v i toàn b vùng
c gi l i b hoàn toàn vùng T-ADN và RB, LB Plasmid này
c c i ti n lo i b gen kích thích t bào th c v t phát tri n thành kh
v n duy trì kh p vào t bào th c vt
Trang 22Nguy n Th Hòa ễ ị - - 15 Hà N i, 09/2013 ộ
Hai cAgrobacterium tumefaciens, khi các gen trên vector b hotr ng thì các s n ph m c a nó s ng tn T-ADN trên vector chuy n gen d n s chuy n T-ADN sang t bào th c v t Quá trình bi n n p n di c nhân lên
trong E.colic chuy n tr c ti p ho c qua quá trình ti p h p vào t bào
Agrobacterium tumefaciens chuy n T-ADN vào genom th c v t; (iii) ch n l c t bào thc vt trong nhu ki n thích h p (Armstrong, 1991)
Th c t cho th y, plasmid v sao chép có th không b n v ng
trong E coli khi c hai vùng này cùng ho ng Tuy nhiên, vector hai ngu n có
m t s y ra quá trình tái t h p gi a các plasmid; (ii)
c c a vector khá nh Nh v y, hi u qu quá trình chuy n gen t E.coli
sang Agrobacterium tumefaciens
1.3.2 Hệ vector liên hợp
Vector liên hc xây d s tái t h p gi ng
n m trên plasmid vi khu a E.coli ) v i vùng T-ADN trên Ti-plasmid
ca Agrobacterium tumefaciensi ta gi l i vùng VIR, lo i b vùng
mã hóa ch i u và thay th b ng nh n ADN m i trong Ti-plasmid (hình 1.3)
Trang 23Nguy n Th Hòa ễ ị - - 16 Hà N i, 09/2013 ộ
Hình 1.3 Sơ đồ ấ c u trúc vector liên h p ợ
i vector tham gia vào h ng vector liên h p:
(a) Ti-plasmid: các gen gây kh thay b i gen kháng kanamycin c a vi khu n (H ng vector SEV) ho c m th n trình t c a vector pBR322 (H thng vector pGV)
(b) Vector trung gian: có ngu n g c t pBR322 v c nh c
b tr ch t c a Ti-c nhân lên trong E.coli
và chuy n sang Agrobacterium tumefaciens nh quá trình ti p h p Do không th sao chép trong Agrobacterium tumefaciens nên chúng mang nh
ng v i T- ADN
(c) Vector tr giúp : t n t i trong E c nh , ch a các gen di
ng (mob) và gen chuy n (tra) giúp cho quá trình ti p h p và chuy n vào
Agrobacterium tumefaciens (Walkerpeach , 1994)
1.3.3 Các gen chỉ thị chọn lọc và các gen thông báo trong hệ thống vector biến nạp
Vic xem xét tính h u hi u c a vector chuy n n p c n vi c ch n gen ch phù h p cho ch n l c các s n ph m chuy n gen và có tác d ng trong s th
Trang 24Nguy n Th Hòa ễ ị - - 17 Hà N i, 09/2013 ộ
ph i h p v i các quy trình nuôi c y mô và t bào Có hai lo i ch th ch n l
ch th ch n l c di truy n và chi th ch n l c sinh hóa
1.3.3.1 Các gen ch ỉ thị chọ ọ n l c di truy n ề
B ng 1.1 là danh m c các ch th ch n l c di truy c s d ng
ph bi n hi n nay trong quá trình bi n n p gen Vi c ch n các gen ch di truy th n
c n chú ý m t s yêu c u: Th nh t là ch t ch n l c c ch ng các t bào
c bi n n p; th hai là s th hi n c a gen ch n l c không ng t i
i ch t c a các t bào chuy n n p; th ba là s th hi n c a gen ch n l c b o
v t bào kh i tác d ng c a ch t ch n l c và cho th y rõ ràng s khác nhau v sinh
ng gi a t c chuy n n p và t c chuy n n p, th không ng tng c a cây hoàn ch nh t c t cây chuy n gen
hyg hygromycin Waldron và CS.,1985
gent Gentamycin Hayford và CS., 1988
bleo Bleomycin Hille và CS.,1986
aat Stretomycin, spectinomycin
Trang 25(Joerbo, 1998) thu c h ng bi th ng T bào th c v c chuy n gen
pmi có kh ng mannose 6-phosphate thành fructose 6-phosphate,
dc h p th b i t bào th c v t H ng ch n l c b th
c s d ng thành công trong chuy n gen cho lúa (Hille, 1983), lúa mì và ngô (Wright, 2001)
1.3.3.2 Các gen ch ỉ thị
phân bi t th chuy n gen, các nhà nghiên c ch th
u khi n b i chu i kh c thù c a th c v t và s n ph m c a các gen này có th phân tích b ng sinh hóa M t gen ch th thc vng cn
có m t s n ph m c c nh i v i t bào th c v t ch ; các enzym ch th ph i có kh ch mã nh cao; có các
n ph m c a gen thu n ti n r ti n, nh c thù, có kh
t h p v i các polypeptide bên ngoài mà v n gi c ho t tính c a enzym
B ng 1.2 Các gen ch sinh hóa ỉ thị
Gen ch th S n phm gen Tác gi
Sinh hóa
gus Ecoli uidA ( ) - glucuronidase Jefferson và CS.,1987
gus ci tin - glucuronidase Vancanneyt và CS.,1990
gfp Green fluorecent protein
lac ( Ecoli lacZ) -glucuronidase Helmer và CS.,1984
nptII neomycin Redke và CS.,1988
Trang 26Nguy n Th Hòa ễ ị - - 19 Hà N i, 09/2013 ộ
blas Blastidin S deaminese Kumakura và CS.,1990
lux Luciferase (P.pyralis) Ow và CS.,1986
Luciferase (vibrio spp.) Boylan và CS.,
1.4 Bacillus thuringiensis và Cry
1.4.1 Những nghiên cứu chung về Bacillus thuringiensis
Vi khu n Bacillus thuringiensis có th tìm th y nhi t r ng, bi
c bi n, xác ch t côn trùng ( Martin, 1989) Bacillus thuringiensis
là vi khu n hi o t trong
u king b t l i và s n sinh protein tinh th c d ng ngo i bào (a, b,
exotoxin) và n i bào ( - - endotoxin là m t h protein tinh th c chính Mc coi là thu c tr sâu vi sinh hi u qu , m t s h n ch
nhnh v n sinh hi gian ng ng n, không ti p xúc
c v i côn trùng n nào gi m m s d ng ch ph m
Bt (Koziel, 1993) Nhm b t l i này hoàn toàn b i tr khi chuy n và bi lo u
hi n gen vào cây tr ng (Roush, 1994) cry
Trong chuy n gen, nh c có kh t sâu ca Bacillus
thuringiensis c s d t o nên các s n ph m kháng côn trù
c bi t c ng protein tinh th c hình thành trong quá trình hình thành bào t Nhng phân t
c bi i v i các u trùng và nh ng d ng côn trùng gây h cánh c ng, b hai cánh, b cánh v y, b cánh màng, b côn trùng cánh gi ng) v i hi u l c t c cc hi u r t
Trang 27Nguy n Th Hòa ễ ị - - 20 Hà N i, 09/2013 ộ
(a) Các gen mã hóa ti c t 130-140 kDa gây h i sâu Cánh ph c xp vào nhóm (class) cryI - c phân lo cryIA cryIG a n Dtrên s ng v trình t acid amin ( > 80%), gen cryIA có th c phân loi
a thành IA(a), IA(b), IA(c).
(b) Gen cryII t o ti c t 66 kDa gây h i sâu Cánh ph n ( cryIIB) ho c gây
hi c sâu Cánh ph n và sâu Hai cánh ( cryIIA).
(c) Gen cryIII t o protein 73 kDa gây h i sâu Cánh c ng
(d) Gen cryIV-phân l p t chng Bt (israelensis) t o protein các lo i 135, 128,
74, và 72 kDa có tác d ng gây h i sâu Hai cánh
(e) Gen cryV t o protein 80 kDa có tác d ng gây h i sâu Cánh ph n và sâu cánh cng
(f) Gen cryVI có hot tính gây h i tuy n trùng
1.4.3 Cấu trúc và chức năng của protein tinh thể độc
c t Cry c phân l p và ki m
c trên nhi u lo sách nh ng gen hay protein m i liên t c kéo dài, nh ng danh pháp m ng
ng m i geon/protein có tên dài g m 4 ch cái, d a vào trình t nh (Crickmore và CS., 1998) Protein tinh th c
có c c thù Các nghiên c u v c u trúc c ng b u b ng
nh ng nghiên c u v cha nh ng vùng c n hình trong c u trúc c a protein tinh th c là có các vùng b o th n m xen k nh ng vùng bi n i Các vùng b o th ng v m t c u trúc và
ch-endotoxins cc nghiên c u m phân t có th
hi u rõ m i quan h gi a cu trúc và ch ng cc t
1.4.3.1 C u trúc c a Bt d- ấ ủ endotoxin s
Bt d-endotoxins là phân t protein hình c i d ng ti c t trong sun cu i c a s hình thành bào t Ti c t
Trang 28Nguy n Th Hòa ễ ị - - 21 Hà N i, 09/2013 ộ
vào ru t gi c phân tách thành phu C ch a phân
t kho ng 66kDa và ph u N ch a phân t c t c ho t hóa Phân t tin
c t c (protoxin) bao g m nh ng ph n b o th ch a phân t cysteine (kho ng 16 phân t trong Cry1A(c u n i trong vi c giúp phân t protoxin liên
k t v i c u n i disulphide và t o thành c u trúc tinh th (Saraswathy (2004) Hin nay, c u trúc th nguyên c a phân t protein t c t nh Gia chúng có d ng tinh th Cry hoc d-endotoxins viz Cry1Aa c hi u v i b cánh v y, Grochulski và CS., 1995) và Cry3A c hi u v i b cánh c ng; Li và CS., 1991) Nh ng phân t amino acid t o nên k t c u trong c u trúc cu i cùng c a phân t protein, có m i quan h g i nh ng protein, Cry 1Aa và Cry 3A, có kho ng 36% trình t nh là r t gi ng v c u trúc và th hi n cùng mc ho protein Cry2A, v20% trình t amino acid gi ng, t o thành m t domain v i ch n (Schnepf và CS., 1998 C u trúc th 3 c d-) a c bao gi m 3 domain
c liên k t v i nhau b i m t trình t ng n b o th M i domain c a d-
c l i t bào bi u mô ru t c a u trùng (Knowles, 1994) Phân tích phát sinh loài trên domain c d-endotoxins ch ra ra ng domain I có tính b o th cao nh i nhi u nh t gi a các d ng khác nhau c d-endotoxins (Bravo, 1997 a )
1.4.3.2 Cơ chế và ho ạt độ ng c a protein tinh th c t ủ ể độ ố
u tiên tinh th xâm nh côn trùng theo th ng ming c pH > 10 ru t gi a c a sâu cùng v i s ho ng c a proteaza ru trypsin, các ti c t c
ho t hóa Ti c t CryI và CryIV v c 130-c hot
c t c 65- 75 kDa có ho t tính b n v ng Trong khi ti c t CryII và III (70-75 kDa) sau quá trình bi c t kích
c 60- c ho t hóa, protein tinh th t ái l c
m nh v i các ch t nh n glycoprotein t i nh ng v c hi u n m trên các vi nhung
Trang 29mt s v trí khác có th liên k t vi hai hay nhi u lo i y, m c t c thù
có th liên k t v i nhi u v trí nh n trong ru t côn trùng Sau khi g n k t, protein tinh th c t m t t bào bi u mô ru t gia, gây ty
t bào, tiêu di t côn trùng m n c m (Knowles, 1992) c t Bt g n vào glycoprotein niêm m c ru c bin gi a ru t làm cho ru t b ng, rò r th
d ng d n máu gây nên hi ng b loãng d ch tiêu hóa và nhi m trùng máu (Hofte , 1989)
1.4.4 Một số nghiên cứu về gen Cry1A(c)
Trong s các nghiên c u v c t Cry, Cry1A(c) là m t trong nh ng protein Cry c nghiên c i b t v c tính kháng sâu m nh, ch ng l i côn trùng
b cánh vc bic s d ng trong vi c b o v nông nghi p
Tuy nhiên m i quan h gi c u trúc và ch a protein Cry1A(c) vn
c hi u rõ và c n nh ng nghiên c u v tinh th bào t bao g m m nh ADN d h p 20kb liên k t v i ti c t , nó có th chìa khóa trong vim b o c u trúc nh c a nh ng h t tinh th
ho t hóa tinh th c t trong ru t gi a c nhiên c a ti c t Bt v i ADN, trình t và ngu n g c c a ADN 20kb còn l i
c nghiên cc thuy t hi i nghiên c u c u tr c không gian 3 chi u c a
Cry1A(c) c d u c u trúc c ng c a nó là
Cry1A(a), và s khác bi t v c u trúc gi a Cry1A(a) Cry2A(a) Cry3A(a), , và
Cry4A(a) C u trúc c a nó g m 3 domain chính Domain 1 bao g m 7 chu i xo n
i th c bao quanh b i các chu i khác, t o nên m t bó
xo n Domain 2 bao g m 3 t m b t o nên c u trúc hình h c x p trong 1
c t o ra b i 2 t m b không song song thành d ng bánh
Trang 30Nguy n Th Hòa ễ ị - - 23 Hà N i, 09/2013 ộ
b-sandwich trong m t c u trúc hình trn gen Cry1A(c) c phân lp
và tách ra t chng Bt 4.0718, và qua plasmid bi u hi c cài gen
Cry1A(c)5 nh vector con thoi pHT315
Tinh th c t c chuy n cùng v c bi u hi n thành
d ng ti c t Cry1A(c)5 130kDa, trong nh ng nghiên c phát hin
ra 20kb-ADN và Cry1A(c) c tinh s ch, và m c phân tích b ng cách s d ng phép th hu nh quang Nh ng vùng liên k u n m trong
3 phn th y so v i c u tr ng, ADN 20kb có liên k t r t ch t ch Bên c nh có c u trúc chung gi ng v i t t c các phân
t c t có th là do các trình t c hi u t o nên th hi n trong nhin c a phân t ADN 20kb Phân t c mô ph ng s d ng Cry1A(c)5 và
mn c a 20-bp ADN ch m t vài v trí liên k t v i 3 domain c a Cry1A(c)5
V trí liên k t Ser283- Ala284-Gln285, Ser440-Ser441-Ser442 ADN Leu556- c t o nên nh liên k
Ser555-gi a phân t phosp n ADN v i 3 phân t amino acid (Arg209, Asn212 ADN Gly339) ca Cry1A(c)5 Ph n thêm c a phân t 20kb - ADN ho t hóa
Cry1A(c) u ki c tính c u ki n có trypsin và tia c ra r ng s t n t i c a 20kb - ADN trong nh ng phân t
c t o v c
1.5.1 Hệ thống tái sinh ở cây ngô
M t h ng chuy n gen th c v t hoàn thi n bao g th chuy n ADN mong mu n vào t bào th c v t và kh nh ca
t bào chuy nuôi cng thông qua các b ph n
c a cây (ch i và r ) ho c t các phôi soma (phôi non ca ngô)
1.5.1.1 S phát sinh phôi ự soma củ a ngô
Trang 31Nguy n Th Hòa ễ ị - - 24 Hà N i, 09/2013 ộ
u tiên v tình hình tái sinh cây t nuôi c y mô cây ngô b u t
nhng thành c a dòng lai A188 (Green, 1975) S tái sinh
th c vc bin là nh ng d ng mô s o c ng, mà gi i chúng là callus d ng I, m t s phát tri n d nhn th y t d ng phát sinh phôi K t
qu nghiên c u s tái sinh t ng thành có ngu n g c t nuôi c c miêu t rõ ràng r ng s tái sinh cây t nhng t bào v y thông qua s phát sinh phôi soma (Green, 1982; Lu, 1982) Nh ng nghiên c s tái
c t o thành t m t kh i mô r n ch c, gi o d
c m t d ng
mô so d n v v v i hình d ng và màu s c khác v i d ng mô s o c c mô t
ng mô s o này phát tri n r t nhau, d dàng b t ch i và có th phát tri n thành r t nhi u phôi soma khác nhau M c dù có t l tái sinh cao, nh ng mô s o d
v c n này l i không d dàng duy trì tr n nhân nhanh Kh
b gi c chuyng nuôi c y liên t c V h n ch này c a mô s o d v c Armstrong và Green (1985) c i ti n khi ti n hành nuôi c y phôi non c ng N6 có b sung 6nM proline
i d ng mô s o là này d so sánh v i mô s o d ng I Trong
th ng phát sinh mô s o v n d a vào nh ng nghiên c u tiên này, và vc la ch n trong nuôi c y mô, tái sinh và chuy n gen cây ngô
trên, s phát sinh phôi soma cây ngô ph thu c r t nhi u vào
ki u gen c a cây ngô H u h t các nghiên c u tiên c a s phát sinh phôi này
u dùng dòng ngô A188 ho c con lai c a chúng v i m m quan tr ng trong chuy n gen ngô là s phát tri n c a Hi-II, m t d ng phôi hóa II, có
kh t li u cho chuy n gen, chúng có ngu n g c t dòng lai gi a A188
và B73 (Armstrong và CS., 1991) Armstrong và c ng s a ch n t nh ng
m m t qu nh n ra các dòng lai khi nuôi c y có mô s o d ng II chi m t l cao Mô s o d c s d ng
ph c v trong c các phòng thí nghi m công nghi p và chuy n gen Do mô nuôi
c y có kh p nh n gen ngo i lai cao, Hi- t thí
Trang 32Nguy n Th Hòa ễ ị - - 25 Hà N i, 09/2013 ộ
nghim chuy n gen cây ngô Tuy nhiên, Hi-II l i không th thc hi n phép lai cùng dòng, do v y nó không ph i là s s a ch ng khi ti n hành chuy n gen cho các cây s d ng vào m i Dù v y, Hi-II v n
t vai trò quan tr ng trong l ch s c a chuy n gen cây ngô
1.5.1.2 S ự phát sinh cơ quan ở ngô
S phát sinh phôi soma là m t v l n trong h ng tái sinh c a cây su th t
2 th p k c, Tuy nhiên, tái sinh cây thông qua s phát sinh
c th c hi n u nh ng nghiên trên h th u so
vi nhng nghiên c u v phát sinh phôi v n là quá ít
M t h thng trong vi c chuy n gen thành công ngô S tái sinh c a cây ngô thành nh ng ch i
nh t phôi non l c miêu t b i Jones và Reiter (1992) Trong giai
ng nuôi c c nuôi c ng có b sung 2,4D (1,0mg/l) và BAP n p (0.05 0.10mg/l) T h p c a auxin và cytokinin th
y s phát tri n c ng nuôi cy s phát tri n c a các chnh, kích thích s t o ch i m ng th i kích thích t o r trong
ng n u b sung m t lo i auxin khác là NAA
K t qu là có nhi u h tho ra cùng lúc nhi u
mô phân sinh, và k t qu là t o ra th c v t có ngu n g c t nhi u t bào N u chúng
s d ng cho chuy n gen có th t o nên các th kh m, t c là th g m nh ng t bào
c chuy n gen và c nh ng t c chuy n gen cùng t n t i Trong h thc miêu t b i Lowe và c ng s ng cá th chuy u
c t o ra tr c ti p t n nuôi c y phôi non có xu
ng t o nên th kh m và hi m khi t o nên các dòng thu n
Nhân ch i t c miêu t l u
b i Zhong và c ng s (1992) Ông nuôi cy mô phân sinh trong t i su t 7 ngày,
ng có b sung 0.5mg/l 2,4- c nhân lên sau 7 ngày s c chuy n qua nuôi c y ngoài sáng và t o nên các kh i r n
Trang 33Nguy n Th Hòa ễ ị - - 26 Hà N i, 09/2013 ộ
chy ch i s d ng không có 2,4-theo nhóm nghiên c u, ch nh hai tháng tung chuyng khi s d ng súng b c hi n thí nghith ng yêu c u m
n th p (75µg/l ng kính h t vàng ho Sairam và c ng s miêu t nh phân sinh c a ngô thông qua T-ADN có ngu n g c t A.tumefaciens và cho k t qu a, h thng nhân nhanh ch i còn có kh i ch i phát tri n thành m t ch i cây m i,
t o thêm r và phát tri n thành cây hoàn ch nh
1.5.2 Hệ thống chuyển gen ở ngô
Vic chuy n gen vào th c v t hai lá m m thông qua vi khu n A.tumefaciens
c bi n vào th c v t v i hi u qu cao Tuy nhiên, h u h t các cây m t lá m u không ph i là v t ch c a
A.tumefaciens, do v y nh ng nghiên c u chuy c xây
d ng và phát tri n h ng tái sinh t vi c chuy n gen vào các t th c bit
1.5.2.1 Chuy n gen b ng dung h p t bào tr n ể ằ ợ ế ầ
Vào cu i nh c b nhi u th i gian và công s c vào vi c phát tri n h ng tái sinh t t bào tr n c a ngô (Rhodes, 1982; Shillito, th 1989) Tái sinh thông qua nuôi c y t bào tr n k t h p v i chuy n ADN ngo i lai qua màng t p c n h p lý Trên th c t , hi u su t ADN
bào tr n c a ngô khá cao, và chuy n gen vào t bào tr n c s
d ng trong h u h t các thí nghi m chuy n gen th tái sinh cây t
nh ng t bào tr n l i g p r t nhi n gen vào
t bào tr n l i không th sinh s n (Rhodes, 1982) M c dù v y, cu c th c v t chuy n gen thông qua t bào tr n (Golovkin, 1993), m i xu t hi n
u thú v khi ti n hành chuy n gen vào t bào tr n
là phân t A t cách nguyên ven qua thành t bào nh s n (D'Halluin và CS., 1992)
Trang 34Nguy n Th Hòa ễ ị - - 27 Hà N i, 09/2013 ộ
1.5.2.2 S d ng súng b n gen ử ụ ắ
S phát tri n c t b chuyn ADN vào t bào tr n th c v t
c miêu t b i Klein và cs, 1988 Cùng v i kh t qua thành t bào m t cách nguy n v n, kh bào tr n tr thành m t v và thay th cho h th ng tái sinh cây có th c s d n gen
b n v ng B n gen tr thành chìa khóa phát tri n h ng chuy n gen cây ngô th Trong cùng m n hai báo cáo v vi c chuy n gen vào t bào tr n s
d ng h ng b n gen vào mô s o phát sinh t phôi và nuôi c y huy n phù t bào, th
n th h ti p theo
B c áp d ng nhi u phòng thí nghi m và trên nhi u d ng mô tái sinh khác nhau c a ngô, bao g m c phôi non, callus d nh ch i mô phân sinh Có r t nhi u k t qu qu l c
c thông báo, chuy n gen c nhi u thành công nh pháp này Su t nh u 1990, b ng trong vic chuy n gen i v i c công nghi p và kinh t , và l u tiên s n ph m chuy n gen n ph c t o nên t
c t c APHIS ch p nh n t o ra
b ng b d u tiên s d ng A.tumefaciens
làm công c chuy c ch p nh n t 2007)
L i th c n gen là s d n và hi u qu khi chuy n
ng th i các gen mong mu n cùng v i gen ch th ch n l c Quá trình chuy n gen ch di n ra v i m c, nh n ADN mong muc tr n l n vào nhau
mn rc bao quanh h bào th c v t (Wu và CS.,
n thi t k vector r t ph c t p và ph i tr i qua giai
n A.tumefaciensn quá thì không d dàng chuy n vào và duy trì chúng trong A.tumefaciens Vi c s d ng
c c a b n gen g c gi
Trang 351.5.2.3 Chuy n gen thông qua vi khu n A.tumefaciens ể ẩ
- cây m t lá m m chuy c thu
nh n nh lây nhi m phôi non v i A.tumefaciens (Chan và CS., 1993) Tingô chuy c t o ra b t trong nh ng nguyên nhân dn s chm tr trong các nghiên c u bi n n
c c thông qua A.tumefaciens là do thi u ph n ng gây t c ph n ng gây t mô t bào c c Phn ng này là m t trong nh ng
y u t c n thi i v i s lây nhi m thành công A.tumefaciens vào t bào th c v t (Repellin và CS., 2001)
S d ng ch ng A.tumefaciens LBA4404 và h ng siêu vecto hai nguth
tt phá trong chuy n gen thông qua A.tumefaciens ngô (Ishia và CS., 1996) v i t n s chuy t 5 - 30%
Các nghiên c u chuy n gen vào t bào ngô thông qua A.tumefaciens cho thy quá trình chuyng b t c ngh n t h s k p c a T-ADN trong h gen c a th c v t (Narasimhulu và CS., 1996) S k t h p c a ADN ngo i lai trong h gen th c v t có th x y ra thông qua s tái t h p b ng (Kohli và CS., 1999) S
d ng các siêu vector hai ngu n, gen hpt/bar c chuy n vào phôi non dòng ngô
Trang 36Nguy n Th Hòa ễ ị - - 29 Hà N i, 09/2013 ộ
A188 và các dòng lai v i A188 (Ishida và CS., 1996) Quá trình chuy
c áp d ng các phòng thí nghi m v i các gen ch n l c khác, ch ng h gen pmi chuy n vào phôi ngô non c a các dòng A188, HiII (Negrotto và CS. , 2000)
Cây ngô, m t loài cây tr ng khó tính trong chuy n gen trong qua
A.tumefaciens, t n s chuy c c i thi n b ng vi c t t s y u t
u ki n nuôi c ng sinh và nuôi ph c h i, b sung các cht kìm hãm vi khuc N c a các ch t này ph thu c vào ki u gen th c v t, vi c l a ch n ki u gen có th là m t y u t quy nh trong chuyn gen vào cây ngô Shen và c ng s y dòng A188 là dòng ngô có
kh n T- c l i dòng K55 không có c hai kh
u c a mình, Frame và c ng s n hành chuy n gen vào phôi non m i tách c dòng ngô lai HiII, s d ng vector hai ngu a n
và b ng nuôi cc hi u qu chuy n
n g n 5.5% 2009, trong báo cáo c a mình, Goetz và
c ng s d ng h ng vector hai ngu n pGH218 v i gen là ch th pat th chn
l c và gen gus n hành chuy n gen thành công vào phôi non c a dòng ngô lai HiII v i t n s n 24% M c dù v y, các công trình chuy n gen thành công ngô v n b gi i h n b i vi c s d ng dòng ngô A188 ho c dòng l i
ho c m làm v t li u Vi c s d ng quy trình chuy n gen
c a Ishida và c ng s (1996) có c i ti n, m t s dòng ngô ch n l c chuyn gen hi u qu
Trong h u h t các nghiên c u bi n n p gen thành công ngô nh vi khu n
A.tumefaciens, phôi non mc xem là d ng v t li u có kh chuy n n p t t nh t Mc dù vy, m t s nghiên c u g y các d ng m u
mô khác c non, bao ph n, cây con in vitro và t bào g
có kh tái sinh và s d ng làm v t li u cho bi n n p gen (Cheng và CS.,
Trang 371.5.3 Một số đặc tính đã được cải thiện ở cây ngô bằng kĩ thuật di truyền
K thut di truyc áp d i v i m t s c quan tr ng (ngô, lúa m , lúa m c nh ng k t qu r t kh quan Nhi nh
c tính quan trm chuyc chuyc H u h t các dòng chuy c trông
kh o nghi ng ru ng, nhi u gi i hóa (Repellin và
i v i cây ngô, m t s c c i thi c
Các gi ng ngô chuy n gen kháng thu c di t c glufosinate, Roundup và
t các gi ng ngô chuy n gen kháng các lo i thu c di t c c tr ng ch y u
c nh p kh u vào c ng chung Châu Âu, m c dù v n t n t i khá nhi u tranh cãi Trong th p k qua (1995 - i v i cây chuyc tính kháng thuc
Trang 38Nguy n Th Hòa ễ ị - - 31 Hà N i, 09/2013 ộ
di t c liên t c là tính tr ng n i b t (chi m 71%), ti c tính kháng sâu
b nh (chi m 18%), và các cây mang c c tính này (chim 11%)
1.5.3.2 Đặ c tính kháng côn trùng
Côn trùng h i r ngô ( Diabrotica sp.c coi là nhóm côn trùng có h i nh t
i v i cây ngô Các lo i thu c tr sâu ch h n ch c mng nh các côn
c phân l p t vi khu n Bacillus thuringiensis (Bt) c nghiên c u chuy n vào cây tr ng Có r t nhi u lo i gen mã hóa cho các protein có
ho t tính di t côn trùng c a Bt, ch y u là các gen cry Gen cry1A( b) c
chuy n vào gi ng ngô lai gi a gi ng CML139 và CML 167 bi u hi n kh
c thân mía (Bergvinson và CS., 1997) Ting ngô lai CBH351 chuy n gen cry c t o ra và tr ng th nghi ng ru ng (William và CS., 1997) Các gi ng ngô kháng côn trùng là m t trong nh ng cây tr ng bi i
di truya và c tr ng trên di n tích 8,9 tri u ha vào
n nay, có khá nhi u nghiên c u thành công t c các gi ng ngô chuy n gen mang m t ho c hai gen (kháng sâu và kháng thu c di t c ) Dòng ngô chuy n gen MON 88017 có kh min tây (D VIRgifera) và min b c M ( D barberi) và bi u hi n kh c tr c glyphosate
Hai gen cry3Bb1 và cpepsps c chuy n vào dòng ngô LH198 b ng
n n p thông qua A.tumefaciens Dòng ngô chuyn gen
DAS-59122-7 kháng 3 lo i côn trùng cánh c ng D VIRgifera, D barberi D baberi zeae a và cMexico nh vi c chuy n 3 gen cry34Ab1, cry35Ab1 và gen pat vào ngô l i HiII thông qua A.tumefaciens Hai gen cry34Ab1, cry35Ab1 phân l p t vi khu n Bt
c chuy n vào dòng ngô lai HiII và gen pat c chuy n
ng th i vào dòng ngô này , i ta s d t công
c ch n l c các cây có mang hai gen nói trên
Trang 39Nguy n Th Hòa ễ ị - - 32 Hà N i, 09/2013 ộ
Dòng ngô BT11 v a có kh a có kh thuc di c c bit c t o ra b ng vi c chuy n tr c ti p plasmid pZ01502 có ch a m t d ng gen cry1A(b) và gen vào tpat bào trng ch n l c
M t s gen kháng côn trùng và kháng thu c di t c c chuyn vào các
gii s cho phép c a C i
u h t các gi ng ngô chuy
u mang gen cry1Ab Tuy nhiên, nghiên cu bi n n p s
d ng vector mang gen Cry1Ac t s ng cây tr ng
1.5.3.3 M ột số đặ c tính khác
c tính ch u l c c i thi n Gen beta c phân l p t
E.coli mã hóa cho enzyme choline deh c chuy n vào dòng ngô DH4866 thông qua A.tumefaciensc 4 dòng ngô chuy n gen
có kh c chuy n gen 10-150C, các dòng ngô chuy n gen này có t ng cao ng bình
ng (Quan và CS., 2004) C i thi n tính tr ng chín s m giúp ch n t o các gi ng ngô ngc tách chi t t Sinapis alba,
có tin thng c a cây tr ng Sau khi chuy n gen FPF1 vào A.thailiana thng ca Arasbidopsis Nhi u phòng thí nghiu chuyi cây tr ng khác nh m rút ng n th ng c a cây.
Chng h t là m c tính ph c t nh theo phan b a lý,
nu ci tiêu dùng (Repellin và CS., 2001) M i
v i vi c c thin di truy n h c là các thành ph n c a h t: tinh b t, protein
d d , polysaccarit, khoáng và vitamin Gen sacB bã hóa cho enzyme sinh t ng h p
c chuy n vào acsc dòng ngô A188, B73 Các cây ngô chuy n gen
nhc có kh t Dòng ngô lai HiII có kh
Trang 40c hi n và chuy n giao ng dng thành công ti Vi n Nghiên c u Ngô
S dng ch th phân t ng di truyn, tính khong cách di truyn và tìm ra s d lai sm cho ch n t o ging
c mt s tác gi nghiên c u (Ngô H u Tình, 2009)
Xây d ng h thng tái sinh và chuyn gen vào cây c bu nghiên cu mt cách bài bn Vit Nam t (Ph m Th Lý Thu và CS., 2003; 2005;
2006, 2007) Ti u n np thành công gen kháng sâu
Cry1A(c) vào các dòng ngô mô hình (HR8 và HR9) và các dòng ngô chn lc, c
c các dòng ngô có kh c thân (Nguyng
và CS., c tính kháng sâu bc tính chng chu vu kin bt li cn, lc bu
ng cây tr
ng nghiên c u r t quan tr ng, to ti cho các nghiên cu chn to các gi ng cây tr ng bii gen trong u kin Vit Nam