Tóm tắt luận án phân lập và sàng lọc niêm khuẩn sinh chất có hoạt tính sinh học tại việt namn

Tóm tắt luận án phân lập và sàng lọc niêm khuẩn sinh chất có hoạt tính sinh học tại việt namn Tóm tắt luận án phân lập và sàng lọc niêm khuẩn sinh chất có hoạt tính sinh học tại việt namn Tóm tắt luận án phân lập và sàng lọc niêm khuẩn sinh chất có hoạt tính sinh học tại việt namn Tóm tắt luận án phân lập và sàng lọc niêm khuẩn sinh chất có hoạt tính sinh học tại việt namn Tóm tắt luận án phân lập và sàng lọc niêm khuẩn sinh chất có hoạt tính sinh học tại việt namn

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO - PHÂN LẬP VÀ SÀNG LỌC NIÊM KHUẨN SINH CHẤT CĨ HOẠT TÍNH SINH HỌC TẠI VIỆT NAM Ngành: Công nghệ dược phẩm bào chế thuốc Mã số: 9720202 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC Năm 2023 Cơng trình hồn thành tại: Đại học Y Dược Tp.HCM Phản biện 1: …………………………………………… Phản biện …………………………………………… Phản biện 3: …………………………………………… Luận án bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án cấp trường họp vào hồi ngày tháng năm Có thể tìm hiểu Luận án thư viện: - Thư viện Quốc gia Việt Nam - Thư viện Khoa học Tổng hợp - Thư viện Đại học GIỚI THIỆU LUẬN ÁN a Lý tính cần thiết nghiên cứu Thực tiễn nay, đề kháng kháng sinh nhu cầu hóa trị liệu ung thư đặt yêu cầu cấp thiết tiến hành nghiên cứu khám phá nguồn tài nguyên thiên nhiên, hướng tới tìm xác định hợp chất sinh học Nhiều chất chuyển hóa thứ cấp nguồn gốc từ niêm khuẩn thể hoạt tính kháng oxy hóa, kháng vi sinh vật độc tế bào cao sử dụng ngành y dược crocapeptin, crocagin, crocadepsin, eremophilen, cittilin, myxoprincomid, homospermidin… Theo báo cáo tổng hợp nghiên cứu tính đa dạng phân bố niêm khuẩn toàn giới Jingjing Wang cộng (2021) cho thấy đồ nghiên cứu niêm khuẩn trải rộng khắp châu lục vùng biển Tuy nhiên, Việt Nam chưa định vị đồ nghiên cứu phân bố Sở hữu khu vực địa lý đa dạng vùng khí hậu nhiệt đới đặc trưng, nước ta có hệ vi sinh vật tự nhiên phong phú, kể niêm khuẩn Từ đó, chúng tơi tin khai thác nguồn niêm khuẩn môi trường đất mở tiền đề cho cấu trúc chất chuyển hóa tiềm định hướng sản xuất thuốc hóa trị liệu hợp chất tự nhiên b Mục tiêu nghiên cứu Phân lập định danh chủng niêm khuẩn từ đất số tỉnh, thành phố Việt Nam Sàng lọc hoạt tính kháng oxy hóa, kháng vi sinh vật, kháng ung thư từ dịch chiết chủng niêm khuẩn Phân lập xác định cấu trúc hợp chất thứ cấp từ dịch chiết mơi trường lên men chủng có hoạt tính sinh học cao Tối ưu hóa thành phần mơi trường ni cấy chủng có hoạt tính sinh học nhằm tăng hàm lượng hoạt chất c Đối tượng phương pháp nghiên cứu Đối tượng: Niêm khuẩn phân lập từ mẫu đất thu thập số tỉnh/ thành phố Việt Nam Phương pháp nghiên cứu: Phương pháp phân lập làm niêm khuẩn, phương pháp sàng lọc hoạt tính kháng oxy hóa, kháng vi sinh vật kháng ung thư, phương pháp dự đoán hợp chất sắc ký lỏng kết hợp khối phổ, phương pháp sắc ký chiết xuất hợp chất tối ưu hóa mơ trường lên men dựa mơ hình tốn học d Những đóng góp nghiên cứu mặt lý luận thực tiễn Xây dựng sưu tập gồm 43 chủng niêm khuẩn thuộc chi bao gồm Angiococcus, Archangium, Chondromyces, Corallococcus, Cystobacter, Melittangium Myxococcus thuộc phụ Cystobacterineae Sorangiineae, Myxococcales thơng qua đặc điểm hình thái, liệu sinh hóa trình tự gen 16S rDNA Đây sưu tập chủng niêm khuẩn công bố Việt Nam Từ chủng Myxococcus stipitatus GL41, hợp chất phân lập, xác định cấu trúc hoạt tính sinh học althiomycin, 4-quinolylaldoxim indol-3-aldehyd Sự diện hợp chất lần báo cáo từ loài Myxococcus stipitatus, indol-3-aldehyd lần báo cáo từ niêm khuẩn Tối ưu hóa mơi trường ni cấy chủng Myxococcus stipitatus GL41 sản xuất althiomycin cực đại, đạt 3,3 mg/L, gấp 4,7 lần so với hàm lượng althiomycin nuôi cấy môi trường P ban đầu (0,7 mg/L) Mơi trường sau tối ưu hóa bao gồm 6,09 g/L tinh bột tan, g/L glucose, chiết xuất nấm men, 4,05 g/L men bánh mì, 1,5 g/L casiton, 0,75 g/L CaCl2.2H2O, 1,5 g/L MgSO4.7H2O, 20,65 g/L đệm Hepes, 0,5 mg/L vitamin B12, mL dung dịch muối khoáng 1,5% nhựa Amberlite XAD16N Điều kiện ni cấy: lắc 160 vịng/phút 28-30 °C ngày, nhựa Amberlite XAD-16N tiệt trùng bổ sung vào môi trường nuôi cấy vào ngày thứ tiếp tục lên men đến ngày thứ 10 e Bố cục luận án Luận án gồm 142 trang: Đặt vấn đề trang, tổng quan tài liệu 33 trang, đối tượng phương pháp nghiên cứu 29 trang, kết nghiên cứu 49 trang, bàn luận 27 trang, kết luận kiến nghị trang Luận án có 35 bảng, 41 hình, 194 tài liệu tham khảo tiếng Anh, 20 phụ lục thể kết thực nghiệm TỔNG QUAN TÀI LIỆU Niêm khuẩn thuộc ngành Myxococcota, Myxococcales, thuộc Deltaproteobacteria, vi khuẩn gram âm, di chuyển cách trượt Niêm khuẩn có đặc tính quan trọng hình thành thể chứa bào tử điều kiện môi trường khan chất dinh dưỡng ly giải tế bào vi sinh vật khác phân giải đại phân tử sinh học Niêm khuẩn phân bố đất, thực vật phân hủy, vỏ sống mục nát, mơi trường biển, phân nhiều lồi động vật ăn cỏ Niêm khuẩn chứng minh nguồn đầy triển vọng tổng hợp phân tử sinh học với phổ hoạt tính rộng kháng sinh, kháng sốt rét, kháng virus, ức chế miễn dịch, kháng ung thư, diệt côn trùng Đến 2011, khoảng 100 cấu trúc gốc 600 cấu trúc biến thể tìm từ niêm khuẩn Trong đó, hoạt tính kháng khuẩn kháng nấm chiếm 54% 29% tổng số chất phân lập được, khoảng 10% hợp chất thể hoạt tính ức chế tế bào ung thư Hiện nay, nghiên cứu Việt Nam niêm khuẩn hạn chế, tiền đề cho việc xác lập thực đề tài ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Đối tượng nghiên cứu Niêm khuẩn phân lập từ mẫu đất thu thập 20 tỉnh/ thành phố Việt Nam: Quảng Trị, Thanh Hóa, Ninh Bình, Bình Định, Bình Thuận, Gia Lai, Phú Yên, An Giang, Bình Dương, Bình Phước, Bà Rịa - Vũng Tàu, Cần Thơ, Đồng Nai, Hậu Giang, Hồ Chí Minh, Long An, Sóc Trăng, Tiền Giang, Trà Vinh Vĩnh Long 3.2 Phương pháp nghiên cứu 3.2.1 Phân lập niêm khuẩn Thu thập mẫu đất: Mẫu đất thu thập từ khu vực chịu tác động người, vị trí cạnh gốc to có bóng râm, có vỏ thân mục nát, gần rơm rạ, cách bề mặt khoảng 10 cm Sau lấy, đất làm khô sớm tốt Phương pháp phân lập: Phương pháp dùng mồi E coli thạch WCX, phương pháp dùng giấy lọc dùng phân thỏ Làm thuần: Cấy chuyển thể mép lan khuẩn lạc nhiều lần môi trường VY/2 kim vô trùng; kỹ thuật dùng mồi lần hai Kiểm tra độ tinh khiết môi trường CEH 3.2.2 Định danh niêm khuẩn  Đặc điểm hình thái  Thử nghiệm đặc trưng niêm khuẩn (Chuyển động trượt khả ly giải vi sinh vật sống) thử nghiệm sinh hóa (Kit API Zym phản ứng sinh hóa khác)  Phân tích trình tự 16S rDNA (Chiết tách DNA gen khuếch đại với cặp mồi 27F 1492R)  Phân tích phát sinh lồi: phần mềm MEGA phiên 11, chương trình Muscle, phương pháp Maximum likelihood với mơ hình Jukes-Cantor bootstrap 1.000 lần 3.2.3 Lên men thu cao chiết chủng niêm khuẩn Lên men 400 mL môi trường P, lắc 160 vòng/phút nhiệt độ phòng 10 ngày, bổ sung 1,5% nhựa Amberlite XAD-16N vào ngày thứ Kết thúc lên men thu hồi nhựa, giải hấp hỗn hợp aceton methanol Bay dung môi áp suất giảm, thu cao chiết lỏng 3.2.4 Đánh giá hoạt tính kháng oxy hóa Sử dụng phương pháp DPPH ABTS với acid ascorbic Trolox dược sử dụng làm chứng dương Xác định giá trị IC50 tỉ lệ IC50 (thử)/ IC50 (chứng) Mối tương quan thử nghiệm đánh giá hệ số tương quan R (correlation coefficient) 3.2.5 Đánh giá hoạt tính kháng vi sinh vật Sử dụng phương pháp vi pha loãng xác định MIC 3.2.6 Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào ung thư Sử dụng phương pháp MTT dòng tế bào MDA-MB-231, HepG2, MCF7 tế bào không ung thư Hek293 3T3 Xác định giá trị IC50 Doxorubicin sử dụng làm chứng dương 3.2.7 Lên men thu cao toàn phần chủng tiềm Tương tự mục 3.2.3 3.2.8 Phân tích hợp chất thứ cấp sắc ký lỏng kết hợp khối phổ Phân bố lỏng – lỏng cao toàn phần thành phân đoạn Xác định phân đoạn tiềm dựa hoạt tính gây độc dịng tế bào MDA-MB-231 phương pháp MTT) Phân đoạn có hoạt tính cao phân tích hệ thống LC-ESI-QTOF-MS Số khối mảnh ion tựa phân tử [M+H]+ tải lên chemcalc.org để tạo công thức phân tử Giá trị m/z cho ion [M+H]+ (dự đoán) ion ghi nhận từ sắc ký đồ so sánh với sai số ± ppm ± mDa 3.2.9 Phân lập hợp chất tinh khiết Phân lập hợp chất phương pháp sắc ký cột nhanh, sắc ký cột bán điều chế Kiểm tra độ tinh khiết HPLC 3.2.10 Xác định cấu trúc hợp chất Phương pháp phổ UV-Vis, phổ FT-IR, phổ MS, phổ NMR 3.2.11 Tối ưu hóa mơi trường lên men sản xuất althiomycin từ chủng tiềm Thiết kế Plackett-Burman sử dụng để sàng lọc yếu tố ảnh hưởng có ý nghĩa đến hàm lượng althiomycin Phương pháp đáp ứng bề mặt (RSM), mơ hình Box-Behnken sử dụng để xác định giá trị tối ưu yếu tố Cuối cùng, tiến hành đánh giá lại mơ hình tối ưu thực nghiệm Althiomycin định lượng phương pháp HPLC KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 4.1 Phân lập niêm khuẩn Từ 138 chủng niêm khuẩn phân lập, thu 43 chủng niêm khuẩn chủng khác nhau, đó, có 15 chủng (34,9%) phân lập phương pháp dùng mồi E coli, 16 chủng (37,2%) phân lập phân thỏ 12 chủng (27,9%) phân lập giấy lọc 4.2 Định danh niêm khuẩn Dựa kiện hình thái có, 10 chủng niêm khuẩn phân loại đến họ, 22 chủng phân loại đến chi, chủ yếu thuộc chi Myxococcus Corallococcus có 11 chủng phân loại đến loài Thử nghiệm đặc trưng phản ứng sinh hóa: Các chủng thể chuyển động trượt khả ly giải tế bào E coli Thử nghiệm API Zym cho thấy tất chủng dương tính với phosphatase kiềm, phosphatase acid catalase Kết khảo sát sinh hóa cho thấy phù hợp kết định danh sơ hình thái với liệu sinh hóa Trình tự 16S rDNA: 43 chủng phân loại vào chi, đó, 24 chủng định danh đến mức độ lồi, 19 chủng cịn lại định danh mức độ chi (Bảng 4.1) Bảng 4.1 Định danh 43 chủng niêm khuẩn Chi (số loài phân lập) Angiococcus (1) Archangium (3) Chondromyces (2) Corallococcus (15) Cystobacter (1) Melittangium (1) Myxococcus (20) Phương Số Tương pháp Loài Ký hiệu chủng chủng đồng (%) phân lập 1W A disciformis 99,86 DN11 1R, 1W, 1F 1W, 1F 5R, 8W, 2F 1R 1F 9R, 4W, 7F A gephyra A disciforme C apiculatus C pediculatus C coralloides Corallococcus sp 1 99,93100,0 100,00 100,00 100,00 BP181, QT15 99,78100,00 99,86100,00 TV11 HCM21 BRVT1 Cystobacter sp M boletus 99,71 AG11, LA43, LA44, TV51 BDi23, BT92, BT101, DN23, GL43, PY1, QT72, ST11, TH41, TV22, VL32 LA41 100,00 BDi22 Myxococcus sp 99,65100,00 M fulvus 99,93100,00 M stipitatus 99,86100,00 99,93 BP182, CT21, HG225, NB83, TG23, TH48, TH52 BP161, BP213, DN21, NB71, NB81, TG131, VL25 BD2, BT43, GL41, HG223, VL21 HCM81 11 M virescens Tổng 43 Ghi chú: F: phương pháp giấy lọc; R: phương pháp dùng phân thỏ; W: phương pháp dùng mồi E coli thạch WCX Kết định danh dựa vào trình tự 16S rDNA cho kết tương đồng với đặc điểm hình thái phản ứng sinh hóa 4.4.3 Phân tích hợp chất thứ cấp cao ethyl acetat sắc ký lỏng kết hợp khối phổ Dựa giá trị m/z ion [M+H]+, đề xuất chất tương tự cấu trúc biết gồm myxalamid C, myxochelin A, althiomycin, myxothiazol DKxanthen-518 chất chưa xác định với số khối ion [M+H]+ dao động từ 332,1930 đến 815,5858 m/z 4.4.4 Phân lập tinh khiết hợp chất 4.4.4.1 Hợp chất C3 Hợp chất C3 chất bột vơ định hình màu trắng; Phổ UV: đỉnh cực đại 222, 242 285 nm methanol Phổ HR-ESI-MS: 422,0563; 440,0672 462,0483 m/z Phổ NMR:  Phổ 1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6) δH: 3,39 (1H, m); 3,59 (1H, m); 3,81 (2H, m); 3,88 (3H, s); 4,33 (2H, m); 4,88 (1H, m); 5,07 (1H, m); 5,43 (1H, d, J = 2,5 Hz); 6,16 (1H, dq, J = 8,5; 1,0 Hz); 8,35 (1H, s); 8,38 (1H, s); 8,42 (1H, dd, J = 18,0, 9,0 Hz); 12,23 (1H, s)  Phổ C-NMR (125 MHz, DMSO-d6) δC: 34,6 (C-9); 13 48,0 (C-15); 53,9 (C-6); 59,2 (C-16); 62,2 (C-7); 78,0 (C-10); 94,4 (C-13); 125,3 (C-3); 143,2 (C-1); 149,7 (C4); 159,8 (C-5); 162,6 (C-2); 168,3 (C-11); 169,6 (C-12); 173,3 (C-8); 177,2 (C-14) 12 Hình 4.2 Cấu trúc hóa học tương tác HMBC, COSY hợp chất C3 Từ liệu phổ đề nghị kết luận hợp chất C3 althiomycin, (C16H17N5O6S2), kháng sinh thuộc dẫn chất thiazol (Hình 4.2) 4.4.4.2 Hợp chất C7 Hợp chất C7 chất bột vơ định hình màu trắng Phổ UV: đỉnh cực đại bước sóng 238, 312 nm acetonitril-nước (1:1, tt/tt) Phổ HR-ESI-MS: 173,0710 m/z Phổ NMR:  Phổ 1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6) δH: 7,67 (1H, dt, J = 7,5; 1,0 Hz); 7,74 (1H, d, J = 4,5 Hz); 7,81 (1H, dt, J = 7,0; 1,5 Hz); 8,07 (1H, d, J = 8,5 Hz); 8,30 (1H, d, J = 8,5 Hz); 8,84 (1H, s); 8,93 (1H, d, 4,5 Hz)  Phổ 13C-NMR (125 MHz, DMSO-d6) δC: 119,4 (C-3); 124,6 (C-4a); 124,8 (C-5); 127,2 (C-6); 129,5 (C-7); 129,6 (C-8); 136,6 (C-4); 146,3 (-CH=N-OH); 148,3 (C8a); 150,3 (C-2) Từ liệu phổ đề nghị kết luận hợp chất C7 4quinolylaldoxim, với công thức phân tử C10H8N2O (Hình 4.3) 13 (a) (b) Hình 4.3 Cấu trúc hóa học tương tác HMBC, COSY hợp chất C7 (a) C8 (b) 4.4.4.3 Hợp chất C8 Hợp chất C8 tinh thể hình kim không màu (hơi ngả vàng) Phổ UV: đỉnh cực đại bước sóng 244, 260 298 nm acetonitril-nước (1:1, tt/tt) Phổ HR-ESI-MS: 146,0599 m/z Phổ NMR:  Phổ 1H-NMR (500 MHz, DMSO-d6) δH: 7,21 (1H, dt, J = 7,5; 1,0 Hz); 7,26 (1H, d, J = 7,5; 1,5 Hz); 7,51 (1H, d, J = 8,0 Hz); 8,09 (1H, d, J = 7,5 Hz); 8,28 (1H, s); 9,94 (1H, s); 12,12 (1H, s)  Phổ 13C-NMR (125 MHz, DMSO-d6) δC: 112,4 (C-7); 118,2 (C-3); 120,8 (C-4); 122,1 (C-5); 123,4 (C-6); 124,1 (C-3a); 137,0 (C-7a); 138,4 (C-2); 184,9 (C-8) Từ liệu phổ đề nghị kết luận hợp chất C8 indol-3aldehyd, với cơng thức phân tử C9H7NO (Hình 4.3) 4.4.5 Đánh giá hoạt tính sinh học hợp chất phân lập Giá trị MIC althiomycin chủng vi khuẩn thử nghiệm MRSA, MSSA, S faecalis, E coli P aeruginosae lần 14 lượt 4, 4, 16, 32 512 µg/mL Khả ức chế vi khuẩn gram dương (MIC từ 4-16 µg/mL) tốt so với vi khuẩn gram âm (MIC từ 32 512 µg/mL) Hợp chất hiệu kháng nấm C albicans nấm mốc khoảng nồng độ khảo sát Giá trị IC50 althiomycin dòng tế bào lớn 100 µM 4-quinolylaldoxim chế 10 chủng vi sinh vật thử nghiệm nồng độ khảo sát < 512 µg/mL Trong đó, hoạt tính kháng khuẩn tốt kháng nấm men nấm sợi Cụ thể, khả ức chế MRSA, MSSA E coli tốt so với cao toàn phần với giá trị 0,5, µg/mL, hoạt tính kháng S faecalis tương đương chứng dương amikacin có giá trị IC50 với althiomycin chủng P aeruginosa 4-quinolylaldoxim có hoạt tính ức chế HepG2 MDA-MB-231 yếu (lần lượt 83,05 ± 18,43 93,38 ± 14,18 µM) Indol-3-aldehyd có hoạt tính kháng nấm sợi yếu đến trung bình với MIC ≥ 64 µg/mL, hoạt tính kháng khuẩn nấm men C albicans trung bình (MIC từ 32-64 µg/mL) trừ kháng P aeruginosa yếu (MIC = 128 µg/mL), giá trị MIC thấp MRSA, MSSA C albicans với MIC = 32 µg/mL Indol-3aldehyd có hoạt tính kháng ung thư trung bình, với IC50 dịng tế bào MDA-MB-231 3T3 42,89 ± 6,23 51,39 ± 5,90 µM, khơng có hoạt tính tế bào HepG2, MCF7 Hek293 15 4.4.6 Tối ưu hóa môi trường lên men chủng GL41 sản xuất althiomycin Do hoạt tính kháng dịng tế bào ung thư thử nghiệm đạt mức trung bình kém, nhiên hoạt tính kháng khuẩn chất phân lập lại có tiềm Vì vậy, chúng tơi tối ưu hóa thành phần mơi trường lên men chủng M stipitatus GL41 nhằm cải thiện suất thu nhận althiomycin - chất có hoạt tính kháng khuẩn cao tốt có lượng đủ nhiều để làm chất đối chiếu định lượng althiomycin dịch nuôi cấy Sàng lọc yếu tố ảnh hưởng: Thí nghiệm thiết kế với 11 yếu tố 12 thí nghiệm Chuẩn bị mơi trường với thành phần theo ma trận đề xuất, lên men thu dịch chiết sử dụng để định lượng althiomycin, thu giá trị thực nghiệm Phân tích thống kê kết định lượng althiomycin cho thấy yếu tố gồm tinh bột tan (X1), men bánh mì (X2) đệm hepes (X8) có giá trị ảnh hưởng dương đáng kể đến diện tích pic althiomycin sắc ký đồ (APA, mAU.s) độ tin cậy 95% Do đó, yếu tố chọn để tối ưu hóa thiết kế thí nghiệm RSM Tối ưu hóa cơng thức mơi trường lên men: Chuẩn bị mơi trường 15 thí nghiệm ni cấy M stipitatus GL41 mơ hình Box - Behnken Phân tích phương sai (ANOVA) ghi nhận giá trị p = 0,0001, f = 88,96, R2 = 0,9889, cho thấy mơ hình hồi quy có ý nghĩa thống kê Các biến số A, B, C, AB, A2, B2 C2 tương ứng với tinh bột tan (A), men bánh mì (B) hepes (C) có giá trị "Prob > f" < 0,05, cho thấy tinh bột tan, men bánh mì hepes tương tác tinh bột tan men bánh mì 16 đáng kể (Hình 4.2) Phần mềm Design Expert® 11.0.0 phân tích liệu diện tích pic tín hiệu althiomycin phù hợp với mơ hình bậc 2: APA (mAU.s) = -1769,68 + 370,80A + 189,63B + 154,27C +12,04AB  33,60A2  36,92B2  3,71C2 Với APA diện tích pic althiomycin (mAU.s), A, B C nồng độ tinh bột tan, men bánh mì hepes (g/L) B: Men bánh mì A: Tinh bột tan B: Men bánh mì A: Tinh bột tan (a) (b) Hình 4.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến APA Đường biểu diễn 2D (a) bề mặt đáp ứng 3D (b) thể tương tác tinh bột tan (A) men bánh mì (B) APA Với hàm mục tiêu APA đạt cực đại, phần mềm Design Experts dự đốn thơng số tối ưu: nồng độ tinh bột tan 6,09 g/L, nồng độ men bánh mì 4,05 g/L nồng độ đệm hepes 20,65 g/L Đánh giá lại mô hình tối ưu thực nghiệm cho thấy độ tương thích mơ hình tính tốn thực nghiệm 96,4%, chứng tỏ mơ hình tương thích tốt với thực nghiệm Đường chuẩn ước tính nồng độ althiomycin (µg/mL) y = 7,669x  1,215 Trong đó, y APA (mAU.s) x nồng độ althiomycin (µg/mL) Theo đó, tính tốn nồng độ althiomycin dịch chiết 3,3 mg/L, cao gấp 4,7 lần so với 17 môi trường P ban đầu (0,7 mg/L) BÀN LUẬN 5.1 Phân lập niêm khuẩn Ba phương pháp phân lập có đặc điểm chung sử dụng chất tối thiểu nhằm hạn chế phát triển vi sinh vật khác không mong muốn, đồng thời cung cấp nguồn hữu đặc trưng, chọn lọc cho niêm khuẩn, từ kích thích bào tử nảy mầm, phát triển khóm lan rộng mơi trường sau tạo thành thể Phương pháp dùng phân thỏ có số khó khăn (1) thời gian ủ dài, (2) lượng đất nhiều tỉ lệ với mật độ vi sinh vật ngoại nhiễm cao, (3) nguồn phân thỏ tự nhiên khơng sẵn có Kết hợp tiền xử lý đất nhiệt dùng hỗn hợp kháng nấm, phát triển nấm mốc kiểm soát, tạo điều kiện chủng niêm khuẩn hình thành thể tách Nhờ vậy, hiệu suất phân lập phương pháp khác biệt rõ rệt so với nghiên cứu trước Phương pháp giấy lọc đòi hỏi thời gian ủ dài (2-4 tuần) làm mẫu bị ngoại nhiễm nên số chủng phân lập từ phương pháp chiếm tỉ lệ thấp (27,9%) Từ kết đề tài so sánh liệu công bố, đề xuất áp dụng phương pháp để tối đa hóa đa dạng hóa số chủng niêm khuẩn phân lập Tỉ lệ phân lập trung bình cao (2,2) cho thấy phong phú hệ niêm khuẩn đất nước ta Tỉ lệ làm thấp (0,3) (i) chủng niêm khuẩn giống mẫu đất; (ii) trình phân lập - chủng bị gián đoạn dịch Covid19 (iii) tương đồng hình thái vi khuẩn khác với niêm 18 khuẩn Khơng có khác biệt đáng kể mẫu đất phân lập từ miền loại đất Đồng thời, khơng có tương quan rõ ràng loại đất phương pháp phân lập với chi niêm khuẩn phân lập 5.2 Định danh niêm khuẩn Hiện nay, đặc điểm hình thái học dùng để phân loại phụ gần khơng thay đổi Ở cấp độ chi lồi, sắc tố, hình dạng thể quả, hình dạng kích thước túi bào tử xem thông số định để phân loại Tuy nhiên, thể bị thay đổi hình dạng cấu trúc, thối hóa q trình ni cấy Phân loại dựa đặc tính sinh lý, sinh hóa khó khăn lớn sở liệu đặc điểm sinh lý sinh hóa chưa đáp ứng yêu cầu Định danh kỹ thuật sinh học phân tử công cụ hữu hiệu để xây dựng phát sinh loài Tuy nhiên, số trường hợp, trình tự 16S rDNA khơng thể định danh niêm khuẩn đến mức độ lồi Vì hầu hết chi, khác biệt trình tự gen 16S rDNA lồi nhỏ Chúng tơi đề xuất dựa vào hình thái trình tự gen đáp ứng tiêu chí phân loại định danh niêm khuẩn Kết định danh cho thấy 43 chủng phân lập thuộc 10 loài, nằm 30 loài niêm khuẩn phân lập từ mẫu đất giới Nghiên cứu không phân lập chi Polyangium, Sorangium Nannocystis thể chi thường chìm giấy lọc phân hủy, khó làm Tuy nhiên, nghiên cứu phân lập lồi gặp Chondromyces 19 apiculatus; lồi Chondromyces pediculatus Melittangium boletus Như vậy, việc phân lập loài thuộc phổ loài phổ biến tự nhiên cho thấy điều kiện lấy mẫu, phân lập làm nghiên cứu phù hợp đáp ứng yêu cầu đề tài, đồng thời việc phân lập loài thể đa dạng phân bố niêm khuẩn môi trường đất nước ta, hứa hẹn phổ loài đa dạng mở rộng vùng lấy mẫu khu vực địa lý khác 5.3 Hoạt tính sinh học niêm khuẩn Các chủng niêm khuẩn thể hoạt tính kháng oxy hóa, kháng vi sinh vật kháng ung thư mức độ khác tùy thuộc vào nồng độ Niêm khuẩn có khả tổng hợp hợp chất có hoạt tính kháng vi sinh vật nhằm giúp chúng cạnh tranh với hệ vi sinh vật tự nhiên 5.4 Chủng tiềm Myxococcus stipitatus GL41 Phân tích liệu số khối (m/z) ion [M+H]+, dự đốn đỉnh chất chuyển hóa thứ cấp Sự diện hợp chất đề xuất khả kháng oxy hóa, kháng vi sinh vật kháng ung thư dịch chiết chủng GL41 Ngoài ra, hợp chất chưa xác định công thức hố học thành phần đóng góp vào hoạt tính sinh học cao chiết chủng GL41 Các hợp chất tinh khiết phân lập: Hợp chất althiomycin: Althiomycin phân lập từ xạ khuẩn niêm khuẩn, nhiên, lần phân lập từ M stipitatus Hoạt tính kháng vi sinh vật thấp so với cao chiết toàn phần, hoạt tính kháng nấm kháng khuẩn 20 Althiomycin khơng thể hoạt tính ức chế dịng tế bào ung thư tế bào thường (IC50 > 100 µM) Như vậy, althiomycin tác nhân tiềm cho hoạt tính kháng vi sinh vật hoạt tính ức chế chọn lọc tế bào prokaryot không ảnh hưởng đến tế bào eukaryot nghiên cứu sâu để phát triển thành kháng sinh sử dụng lâm sàng Hợp chất 4-quinolylaldoxim: Đây nghiên cứu phân lập 4-quinolylaldoxim từ M stipitatus Bettina Böhlendorf cộng (1996) chứng minh 4-quinolylaldoxim tổng hợp q trình chuyển hóa niêm khuẩn, thành phần hữu từ môi trường ni cấy 4quinolylaldoxim thể hoạt tính kháng nấm trung bình đến yếu, hoạt tính kháng khuẩn mạnh, hoạt tính kháng ung thư trung bình tùy thuộc vào dịng tế bào cụ thể Do đó, cần nghiên cứu thêm để xác định ngưỡng hiệu liều gây độc dòng tế bào khác Hợp chất indol-3-aldehyd: Đây nghiên cứu phân lập indol-3-aldehyd từ niêm khuẩn Indol-3-aldehyd có khả kháng khuẩn (trừ P aeruginosa) C albicans trung bình hoạt tính kháng nấm sợi yếu Tuy nhiên, hoạt tính kháng ung thư cao 4-quinolylaldoxim dịng tế bào MDA-MB231 3T3, cho thấy khả gây độc tế bào tùy thuộc dòng tế bào cụ thể Theo nghiên cứu hiệu hợp chất này, thách thức lớn đặt tính an tồn, theo đó, nghiên cứu tập trung vào dạng phân phối chỗ indol-3aldehyd nhằm cải thiện tính chọn lọc hạn chế tác dụng phụ 21 Như vậy, đánh giá lại hoạt tính độc tính indol-3-aldehyd cần thiết, đồng thời cần xác định liệu indol-3-aldehyd có tiếp tục chuyển hóa thành phân tử khác vào thể hay không 5.4.1 Tối ưu hóa mơi trường lên men chủng GL41 sản xuất althiomycin Kết phân tích thống kê ANOVA thiết kế sàng lọc Plackett-Burman mơ hình tối ưu hóa Box-Behnken ghi nhận giá trị p < 0,05, f > α0,05 cho thấy mơ hình có ý nghĩa thống kê phù hợp với kết từ thực nghiệm Tinh bột nguồn carbon lượng quan trọng trình trao đổi chất vi sinh vật Sự tổng hợp chất kháng sinh thường tăng dần giai đoạn bước vào pha ổn định đường cong tăng trưởng, chất dinh dưỡng giảm tăng trưởng tế bào chậm lại, tức giai đoạn tinh bột tiêu thụ Men bánh mì bổ sung peptid acid amin cho nguồn nitơ, carbon lượng cần thiết cho phát triển hầu hết chủng niêm khuẩn Q trình chuyển hóa dẫn đến tích lũy lượng amoniac lớn kìm hãm tăng trưởng tổng hợp chất thứ cấp niêm khuẩn Do đó, ổn định pH hệ đệm hepes giúp cải thiện khả sản xuất hợp chất sinh học KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 6.1 KẾT LUẬN Phân lập 43 chủng niêm khuẩn từ mẫu đất thu thập 20 tỉnh/thành nước phương pháp Định danh niêm khuẩn dựa đặc điểm hình thái, sinh hóa trình tự 16S rDNA cho thấy 43 chủng niêm khuẩn phân loại 22 vào 10 loài thuộc chi: Angiococcus, Archangium, Chondromyces, Corallococcus, Cystobacter, Melittangium, Myxococcus thuộc phụ Cystobacterineae Sorangiineae Đánh giá hoạt tính kháng oxy hóa, kháng vi sinh vật kháng ung thư cao chiết 43 niêm khuẩn môi trường P  Dịch chiết chủng TH41 có hoạt tính kháng oxy hóa cao nhất, CT21, TG13 GL41  Về hoạt tính kháng vi sinh vật, tất chủng niêm khuẩn ức chế vi sinh vật thử nghiệm Chủng GL41 ức chế tất vi sinh vật thử nghiệm với giá trị MIC μg/mL MRSA, MSSA, S faecalis, C albicans A niger  Cao chiết GL41, CT21 BDi22 có hoạt tính kháng dịng tế bào MDA-MB-231, cao với giá trị IC50 6,25 ± 0,07, 7,91 ± 0,08 8,32 ± 0,05 µg/mL Cao chiết dịch lên men chủng M stipitatus GL41 môi trường P, phân lập hợp chất althiomycin (11,72 mg), 4quinolylaldoxim (6,53 mg) indol-3-aldehyd (4,21 mg) từ phân đoạn ethyl acetat  Althiomycin thể hoạt tính kháng khuẩn tốt kháng nấm hiệu kháng mạnh MRSA, MSSA, trung bình S faecalis E coli, hoạt tính yếu dòng tế bào ung thư tế bào thường  4-quinolylaldoxim thể hoạt tính kháng khuẩn mạnh trên, kháng nấm trung bình - yếu, kháng ung thư yếu 23 dòng tế bào MDA-MB-231 HepG2  Indol-3-aldehyd có hoạt tính kháng trung bình MRSA, MSSA, S faecalis E coli, C albicans A niger; kháng ung thư trung bình MDA-MB-231 Ba hợp chất phân lập lần từ chủng Myxococcus stipitatus, indol-3-aldehyd báo cáo lần từ niêm khuẩn Tối ưu hóa thành phần mơi trường nuôi cấy M stipitatus GL41 sản xuất althiomycin dự đốn thơng số gồm 6,09 g/L tinh bột tan, 4,05 g/L men làm bánh 20,65 g/L đệm hepes, ước tính hàm lượng althiomycin đạt 3,3 mg/L, cao 4,7 lần so với môi trường P ban đầu mơ hình tương thích tốt (96,4%) với thực nghiệm 6.2 KIẾN NGHỊ  Đánh giá bổ sung hoạt tính độc tính indol-3-aldehyd dịng tế bào ung thư tế bào thường  Lên men sản xuất althiomycin đánh giá hoạt tính sinh học hợp chất mơ hình ex vivo in vivo để xác định khả ứng dụng hoạt chất kháng khuẩn điều trị bệnh lý nhiễm khuẩn  Nghiên cứu thành phần hợp chất khác từ cao chiết chủng GL41 để làm rõ thành phần hoạt chất chịu trách nhiệm cho hoạt tính sinh học  Lên men nghiên cứu thành phần hợp chất từ dịch nuôi cấy chủng tiềm khác Myxococcus sp CT21 Melittangium boletus BDi22 24 DANH MỤC CƠNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ CỦA TÁC GIẢ LIÊN QUAN LUẬN ÁN Nguyễn Thị Ngọc Yến, Đinh Thị Lan Linh, Nguyễn Phương Châm, Nguyễn Thị Kim Hồng, Võ Thị Nhàn, Nguyễn Đinh Nga, Nguyễn Tú Anh (2022), “Đánh giá hoạt tính kháng vi sinh vật cao chiết chủng niêm khuẩn”, Tạp chí Khoa học Cơng nghệ - Đại học Nguyễn Tất Thành, 16, tr 38-44 Nguyễn Thị Ngọc Yến, Đinh Thị Lan Linh, Dương Đình Chung, Nguyễn Đinh Nga, Nguyễn Tú Anh (2023), “Khảo sát điều kiện nuôi cấy Myxococcus stipitatus GL41 định hướng hoạt tính kháng vi sinh vật”, Tạp chí Y học Việt Nam, 526 (2) Yen Thi Ngoc Nguyen, Chung Dinh Duong, Thai Minh Nguyen, Nga Dinh Nguyen, Anh Tu Nguyen (2023), “Optimization of the culture medium of althiomycinproducing Myxococcus stipitatus GL41 using PlackettBurman Design and Response Surface Methodology”, Journal of Population Therapeutics and Clinical Pharmacology, 30 (6), pg e287-e296 Yen Thi Ngoc Nguyen, Chung Dinh Duong, Hieu VuQuang, Linh Thi Lan Dinh, Thai Minh Nguyen, Nga Dinh Nguyen, Anh Tu Nguyen (2023), “LC-ESI-QTOFHRMS-based myxobacterial metabolite profiling for the potential anti-breast cancer extract”, Journal of Medicinal and Chemical Sciences, 6(11), pg 2767-2777