Nghiên cứu xạ khuẩn nội sinh trên cây cam hàm yên tuyên quang và tiềm năng sinh tổng hợp chất kháng nấm của chúng

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT  ĐÀO ÁNH VÂN NGHIÊN CỨU XẠ KHUẨN NỘI SINH TRÊN CÂY CAM HÀM YÊN - TUYÊN QUANG VÀ TIỀM NĂNG SINH TỔNG HỢP CHẤT KHÁNG NẤM CỦA CHÚNG LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC Chuyên ngành : Vi sinh vật học Mã ngành :60 42 01 03 Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: TS PHAN THỊ HỒNG THẢO Hà Nội - 2015 Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.ltc.tnu.edu.vn Tai ngay!!! Ban co the xoa dong chu nay!!! LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan là công trình nghiên cứu của riêng Các số liệu, kế t nêu Luận văn là trung thực và chưa từng công bố bất kỳ công trình nào khác Tôi xin cam đoan rằ ng mo ̣i sự giúp đỡ cho việc thực Luận văn này đã đươ ̣c cảm ơn và các thông tin trić h dẫn Luận văn đã đươ ̣c chỉ rõ nguồ n gố c Hà Nội, Ngày 25 tháng 11 năm 2015 Học viên Đào Ánh Vân Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.ltc.tnu.edu.vn LỜI CẢM ƠN Trước hết, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc tới TS Phan Thị Hồng Thảo – Trưởng phòng Vi sinh vật Đất, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam người truyền thụ cho kiến thức chuyên ngành, hướng dẫn, định hướng nghiên cứu và tận tình giúp đỡ tơitrong śt quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn Xin chân thành cảm ơn các thầy, cô thuộc Viện Công nghệ Sinh học – Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật giúp đỡ và bảo tơi quá trình học tập Xin chân thành cảm ơn các cán Phòng Vi sinh vật Đất, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam động viên, giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi cho śt quá trình thực đề tài này Tơi xin cám ơn sự hỗ trợ kính phí thực từ đề tài “Nghiên cứu sự đa dạng xạ khuẩn nội sinh có múi đặc sản miền Bắc Việt Nam và tiềm sinh tổng hợp các chất kháng khuẩn và kích thích tăng trưởng thực vật chúng” Mã số đề tài: VAST.ĐLT.12/15-16 thuộc cấp quản lý Viện Hàn lâm KHCNVN vàPhịng Thí nghiệm trọng điểm Công nghệ Gen, Viện Công nghệ sinh học tạo điều kiện và cung cấp các thiết bị để tơi tham gia thực đề tài Ći cùng, tơi xin tỏ lịng biết ơn tới gia đình và bạn bè, người quan tâm giúp đỡ và động viên tơi để có thành ngày hôm Hà Nội, Ngày 25 tháng 11 năm 2015 Học viên Đào Ánh Vân Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.ltc.tnu.edu.vn DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT STT Tên viết tắt Tên đủ CFU Đơn vị hình thành khuẩn lạc DNA Deoxyribosenucleoic Acid EDTA Ethylene diamine tetra-acetic acid HTKS Hoạt tính kháng sinh ISP Internationl Streptomyces Project KTCC Khuẩn ty chất KTKK Khuẩn ty khí sinh PCR Polymerase Chain Reaction: Phản ứng khuếch đại gen rDNA Ribosomal Deoxyribosenucleoic Acid 10 RNA Ribonucleic acid 11 rRNA Ribosomal Ribonucleic acid 12 SDS Sodium dodecyl sulfate 13 TAE Tris-acetat EDTA 14 VSV Vi sinh vật Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.ltc.tnu.edu.vn DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 3.1 3.2 3.3 3.4 3.5 3.6 3.7 Tên bảng Tổng hợp số nghiên cứu giới các loài xạ khuẩn nội cộng sinh thực vật Kết phân lập xạ khuẩn nội sinh từ mẫu rễ Cam Hàm Yên Tuyên Quang số môi trường khác Tỷ lệ các xạ khuẩn phân lập chia theo đa dạng nhóm màu Khả kháng vi sinh vật kiểm định các chủng xạ khuẩn Số lượng các chủng xạ khuẩn nội sinh phân lập có khả đới kháng với các chủng nấm và vi khuẩn kiểm tra Kết kiểm tra hoạt tính kháng sinh chủng xạ khuẩn lựa chọn nuôi cấy môi trường dịch thể ISP2 sau ngày Đặc điểm nuôi cấy xạ khuẩn nội sinh C12 và R12-4 các môi trường ISP Khả đồng hóa nguồn cacbon chủng xạ khuẩn tuyển chọn sau 14 Trang 13 27 30 30 31 32 33 36 ngày nuôi cấy nhiệt độ 30C Ảnh hưởng nồng độ NaCl môi trường ban đầu đến khả sinh trưởng và phát triển chủng xạ khuẩn tuyển chọn Ảnh hưởng pH môi trường ban đầu đến khả sinh trưởng chủng xạ khuẩn tuyển chọn 37 3.10 Ảnh hưởng nhiệt độ ban đầu đến khả sinh trưởng chủng xạ khuẩn tuyển chọn 3.11 khả sinh tổng hợp enzyme ngoại bào các chủng xạ khuẩn 3.12 So sánh trình tự gen mã hóa 16S rRNA chủng R12-4 với gen tương ứng các chủng xạ khuẩn đăng ký GenBank 3.13 Môi trường thích hợp cho sinh tổng hợp hoạt chất kháng nấm hai chủng xạ khuẩn C12 và R12-4 3.14 Ảnh hưởng pH môi trường nuôi đến sinh tổng hợp hoạt chất kháng nấm 3.15 Nhiệt độ thích hợp cho sinh tổng hợp hoạt chất kháng nấm hai chủng xạ khuẩn lựa chọn 37 3.16 Lựa chọn dung môi để chiết hoạt chất kháng nấm từ dịch lên men và sinh khối 3.17 Ảnh hưởng các pH chiết khác đến khả chiết chất kháng nấm 3.18 Xác định độ bền nhiệt đến hoạt tính kháng nấm chủng R12-4 42 3.8 3.9 DANH MỤC CÁC HÌNH Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.ltc.tnu.edu.vn 37 38 39 40 41 41 43 44 Hình 3.1 3.2 3.3 3.4 Tên hình Hình ảnh minh họa kết phân lập các chủng xạ khuẩn nội sinh số môi trường sau tuần nuôi cấy Tỷ lệ xạ khuẩn nội sinh phân lập theo phận Cam Hàm Yên – Tuyên Quang Khả đối kháng số chủng xạ khuẩn phân lập với nấm Xạ khuẩn C12 và R12-4 đối kháng với nấm 3.9 Khuẩn lạc xạ khuẩn C12 các môi trường ISP Khuẩn lạc xạ khuẩn R12-4 các môi trường ISP Cuống sinh bào tử, chuỗi bào tử và hình da ̣ng bào tử xạ khuẩn nội sinh C12 Cuống sinh bào tử, chuỗi bào tử và hình da ̣ng bào tử xạ khuẩn nội sinh R12-4 Khả đồng hóa nguồn cacbon chủng xạ khuẩn R12-4 và C12 3.10 sau 14 ngày nuôi cấy nhiệt độ 28C Điện di đồ DNA tổng số hai chủng xạ khuẩn C12 và R12-4 gel 3.5 3.6 3.7 3.8 3.11 3.12 agarose 1,0 % Điện di đồ sản phẩm PCR chủng xạ khuẩn C12 và R12-4 với cặp mồi sử dụng 27F và 1492R gel agarose 1,0% Mức độ tương đồng di truyền chủng Streptomyces angustmyceticus C12 với các loài xạ khuẩn có họ hàng gần dựa vào 16S rRNA Trang 29 29 31 32 34 34 35 35 36 38 38 39 3.13 3.14 3.15 3.16 3.17 Độ bền chất kháng nấm với nhiệt Độ bền chất kháng nấm với pH Khả bền với pH chất kháng nấm Hoạt chất kháng nấm kháng sinh tinh Hình ảnh quang phổ hấp thu điện tử UV VIS kháng sinh tinh 44 45 45 46 46 3.18 Hình ảnh phổ hồng ngoại kháng sinh tinh 47 Số hóa Trung tâm Học liệu – ĐHTN http://www.ltc.tnu.edu.vn MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH MỞ ĐẦU PHẦN I TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Xạ khuẩn nội sinh thực vật 1.1.1 Giới thiệu chung xạ khuẩn 1.1.2 Xạ khuẩn nội sinh thực vật 1.1.3 Mối quan hệ thực vật xạ khuẩn nội sinh 1.1.4 Con đường xâm nhập vi sinh vật vào chủ 1.1.5 Các phương pháp phân lập xạ khuẩn nội sinh 1.1.6 Phân loại xạ khuẩn nội sinh 10 1.2 Tình hình nghiên cứu xạ khuẩn nội sinh tiềm ứng dụng xạ khuẩn nội sinh 12 1.2.1 Tình hình nghiên cứu xạ khuẩn nội sinh 12 1.2.2 Tiềm ứng dụng xạ khuẩn nội sinh 15 1.3 Cây có múi khả thu nhận thể nội sinh 17 PHẦN II: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 20 2.1 Vật liệu 20 2.1.1 Mẫu 20 2.1.2 Vi sinh vật kiểm định: 20 2.1.3 Hóa chất thiết bị 20 2.1.4 Môi trường nghiên cứu 21 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 22 2.2.1 Phân lập chủng xạ khuẩn nội sinh từ mô sống mẫu thực vật 22 2.2.2 Đánh giá khả đối kháng xạ khuẩn 22 2.2.3 Nghiên cứu đặc điểm sinh học xạ khuẩn 23 2.2.4 Phân tích trình tự gen mã hóa 16S rRNA 24 2.2.5.Phương pháp tách chiết tinh kháng sinh 24 2.2.6 Phương pháp xác định số tính chất chất kháng nấm kháng khuẩn 26 Phần III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 27 3.1 Phân lập sàng lọc chủng xạ khuẩn nội sinh có khả sinh tổng hợp hoạt chất kháng nấm Cam Hàm Yên – Tuyên Quang 27 3.1.1 Kết phân lập chủng xạ khuẩn nội sinh cam Hàm Yên – Tuyên Quang 27 3.1.2 Tuyển chọn chủng xạ khuẩn nội sinh có khả sinh chất kháng nấm, kháng khuẩn 30 3.2 Nghiên cứu đặc điểm sinh học hai chủng xạ khuẩn nội sinh lựa chọn 32 3.2.1 Nghiên cứu đặc điểm sinh lý đặc điểm nuôi cấy chủng xạ khuẩn lựa chọn 32 3.2.2 Đặc điểm sinh học hai chủng xạ khuẩn lựa chọn 35 3.3 Nghiên cứu môi trƣờng điều kiện sinh tổng hợp chất kháng nấm hai chủng xạ khuẩn nội sinh lựa chọn 40 3.3.1 Lựa chọn mơi trường ni cấy thích hợp cho sinh tổng hợp hoạt chất kháng nấm 40 3.4 Nghiên cứu số tính chất hố lý hoạt chất kháng nấm thu nhận từ chủng R12-4 42 3.4.1 Tách chiết chất kháng nấm 42 3.4.2 Khả bền nhiệt chất kháng sinh 43 3.4.3 Khả bền với pH chất kháng nấm 45 3.4.4 Tinh thu nhận chất kháng sinh 46 PHẦN IV KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 48 KẾT LUẬN 48 KIẾN NGHỊ 48 TÀI LIỆU THAM KHẢO 49 PHỤ LỤC 53 Luận văn tốt nghiệp Đào Ánh Vân MỞ ĐẦU Cây có múi là tên gọi chung nhóm cam, chanh, quýt, bưởi họ Rutaceae Cây ăn trái có múi trồng 100 q́c gia Đây là loại có tầm quan trọng hàng đầu giới, với sản lượng năm 2009 đạt 120 triệu tấn, cam chiếm 54% [15, 42, 46], bao gồm Việt Nam, vùng cam tiếng Hàm Yên - Tuyên Quang hiệu kinh tế thu khá cao Tuy nhiên, việc trồng có múi phải đối mặt với số vấn đề là tăng trưởng chậm, côn trùng, sâu bệnh [41].Bên cạnh đó, sự phát triển nhanh chóng các vùng trồng và sử dụng lượng hóa chất nơng nghiệp thiếu kiểm soát nước dẫn đến tác động tiêu cực sản xuất, môi trường, chất lượng đất, sức khỏe người, vật nuôi và ngày càng nhiều vi sinh vật gây bệnh có khả kháng các loại th́c bảo vệ thực vật thơng dụng Vì vậy, việc tìm kiếm và ứng dụng các vi sinh vật để kiểm soát sinh học, kích thích tăng trưởng thực vật là phương pháp thay để giảm sử dụng hoá chất nông nghiệp Trong số các loài vi sinh vật, xạ khuẩn có vị trí quan trọng sự đa dạng cao, khả sinh tổng hợp nhiều chất có hoạt tính sinh học enzym, chất kích thích sinh trưởng thực vật, thuốc kháng sinh dùng nông nghiệp và y học Đặc biệt là các loài xạ khuẩn nội sinh mô thực vật sống (lá, cành, rễ) Các loài xạ khuẩn sống nội sinh thực vật có khả tích hợp với chủ và sinh tổng hợp sớ chất chuyển hóa thứ cấp có lợi cho chủ Đó là hệ sinh thái đặc biệt và khó tiếp cận, nơi mà xạ khuẩn nội sinh có vai trị quan trọng sự phát triển chủ, chúng ảnh hưởng đến sinh trưởng đường đồng hóa các chất dinh dưỡng, kích hoạt hệ thớng miễn dịch và sản xuất các chất chuyển hóa thứ cấp, giúp chủ hạn chế bệnh và kích thích sinh trưởng cho cây[22, 23] Trong mới quan hệ tương hỗ với chủ, vi sinh vật nội sinh nhận từ chủ các chất dinh dưỡng để sinh trưởng Đến nay, có nhiều nghiên cứu công bố khả sản sinh các chất thứ cấp tiêu diệt nhiều loài nấm bệnh và sinh tổng hợp các kháng sinh munumbicin, kakadumycin và coronamycin các loài xạ khuẩn nội sinh Như vậy, xạ khuẩn nội sinh thực sự là ứng cử viên tiềm kiểm soát sinh học cho tương lai Tuy nhiên, số lượng các nghiên cứu xạ khuẩn nội sinh cam và có múi nói chung Việt Nam hạn chế Xuất phát từ lí trên, chúng tơi thực nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu xạ khuẩn nội sinh Cam Hàm Yên- Tuyên Quang tiềm sinh tổng hợp chất kháng nấm chúng” Mục tiêu đề tài: Viện Sinh thái Tài nguyên sinh vật Luận văn tốt nghiệp Đào Ánh Vân Phân lập và tuyển chọn các chủng xạ khuẩn nội sinh Cam Hàm Yên Tuyên Quang có tiềm sinh tổng hợp chất kháng nấm cao Nội dung nghiên cứu đề tài: Phân lậpcác chủng xạ khuẩn nội sinh rễ và cành các mẫu rễ và cành cam Hàm Yên- Tuyên Quang Tuyển chọn các chủng xạ khuẩn nội sinh cam Hàm Yên –Tuyên Quang có khả sinh tổng hợp chất kháng khuẩn và kháng nấm cao Nghiên cứu đặc điểm sinh học và phân loại các chủng xạ khuẩn nội sinh lựa chọn Nghiên cứu môi trường và điều kiện sinh tổng hợp hoạt chất kháng nấm các chủng xạ khuẩn nội sinh lựa chọn Nghiên cứu sớ tính chất hoá lý hoạt chất kháng nấm thu nhận từ xạ khuẩn R12-4 Đề tài thực phòng Vi sinh vật đất, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm khoa học và công nghệ Việt Nam Viện Sinh thái Tài nguyên sinh vật Luận văn tốt nghiệp Đào Ánh Vân 6,5 16 16 15 13 21 11 19 13 17 7,5 19 10 18 11 10 15 15 10 Khảo sát pH môi trường nuôi cấy cho thấy, xạ khuẩn C12 và 10 12 11 R12-4 sinh 11 18 13 10 tổng hợp hoạt chất kháng nấm thích hợp pH 7,0 xác định 04 chủng nấm kiểm định, pH môi trường thấp cao làm ảnh hưởng đến khả sinh tổng hợp hoạt chất kháng nấm hai chủng xạ khuẩn nghiên cứu - Khảo sát nhiệt độ ni cấy Nhiệt độ ni cấy có tác động lớn đến hoạt tính kháng nấm hai chủng xạ khuẩn nghiên cứu Với số liệu khảo sát khoảng nhiết độ nuôi cấy cho thấy các chủng xạ khuẩn nghiên cứu là các chủng ưa ấm Nên chọn khoảng nhiệt độ khảo sát cho sinh trưởng và sinh tổng hợp hoạt chất kháng nấm 27, 30 và 37 oC Bảng 3.15 Nhiệt độ thích hợp cho sinh tổng hợp hoạt chất kháng nấm hai chủng xạ khuẩn lựa chọn Nhiệt độ 27 30 37 G candidum C12 R12-4 19 21 22 25 15 15 Vòng kháng nấm ( D-d, mm ) F oxysporum F udum C12 R12-4 C12 R12-4 21 14 21 10 23 20 23 24 14 13 14 10 C trumcatum C12 R12-4 16 18 20 24 15 19 Số liệu bảng 3.15 cho thấy chủng xạ khuẩn C12 và Chủng R12-4 sinh tổng hợp hoạt chất kháng nấm thích hợp nhiệt độ 30oC, vịng kháng nấm dao động khoảng 20 ÷ 23 mm đới với củng C12 và 20 ÷ 25 với chủng R12-4 Nâng nhiệt độ ni cấy lên 37oC, hoạt tính kháng nấm giảm khoảng 40% so với nhiệt độ thích hợp Nhiệt độ 30oC lựa chọn các nghiên cứu tiếp sau Tuy nhiên thời gian nghiên cứu hạn chế, chủng R12-4 sinh tổng hợp hoạt tính kháng nấm ổn định Nên lựa chọn chủng R12-4 để tiến hành nghiên cứu thu nhận hoạt tính kháng nấm và nghiên cứu sơ hoạt chất kháng nấm 3.4 Nghiên cứu số tính chất hố lý hoạt chất kháng nấm thu nhận từ chủng R12-4 3.4.1 Tách chiết chất kháng nấm Khả hoà tan chất kháng nấm các dung môi khác là yếu tố cầ n đư ̣c chú ý để thu nhận chất kháng nấm Tuy nhiên , độ hoà tan của chấ t kháng sinh rấ t khác các loại dung môi Để xác đinh ̣ đư ̣c dung môi thích hơ ̣p cho việc tách chiế t chấ t kháng sinh của xa ̣ khuẩ n , xạ khuẩn nuôi các môi trường lên men AH Viện Sinh thái Tài nguyên sinh vật 42 Luận văn tốt nghiệp Đào Ánh Vân nhiệt độ 30oC và pH 7,0 Dịch kháng nấm thô chiết loại dung môi khác (Bảng 3.16) Dịch kháng nấm sau chiết rút tẩm vào khoanh giấy lọc , cho bay hơivà xác đinh ̣ hoạt tính kháng nấm (VSV kiểm định là F oxysporum FO5) Kế t quả đư ̣c thể hiện trên bảng 3.16 Bảng 3.16 Lựa chọn dung môi để chiết hoạt chất kháng nấm từ dịch lên men và sinh khối STT Dung môi hữu Etyl axetate n-butanol Methanol Iso propanol Ethanol Aceton Iso amyl alcohol Hoạt tính kháng nấm chủng R12-4 ( D-d,mm) Sinh khối Dịch ngoại bào 13 10 16,5 11,5 10 10 12,5 11 5,5 Kế t quả cho thấ y , chất kháng nấm của chủngR 12-4 nằ m cả sinh khố i và dich ̣ ngoại bào Cả bảy loại dung mô i trên đề u có thể sử du ̣ng để tách chiế t chất kháng nấm Trong bảy loa ̣i dung môi sử du ̣ng , để chiếtchất kháng nấm từ sinh khối , methanol là dung môi cho hiệu quả cao nhấ t , dịch chiết dung mơi này có vịng kháng là tách kháng sinh từ dich ̣ ngoa ̣i bào thì etyl acetate la ̣i cho hiệu quả cao hơn 16,5 mm Để Theo kế t quả nhiều nghiên trước cơng bớ , có nhiều loại dung môi sử dụng để tách chiết CKS từ xa ̣ khuẩ n Tuy nhiên , việc sử du ̣ng loa ̣i dung môi nào là thić h hơ ̣p la ̣i tuỳ thuộc vào chất hoá học từng loại CKS [1, 12] Khả hoà tan chất kháng nấm dung mơi cịn phụ thuộc vào pH Để xác đinh ̣ pH cho hiệu quả tách chiế t chất kháng nấm cao nhấ t , tiến hành tách chiết CKS từ dich ̣ ngoa ̣i bào loại dung môi các pH 3, pH vàpH10 Kết thể bảng sau: Bảng 3.17 Ảnh hưởng các pH chiết khác đến khả chiết chất kháng nấm STT Dung môi pH pH 7 Etyl Acetate n-butanol Methanol Iso propanol Ethanol Aceton Iso amyl ancohol 10 11,5 10 12 Viện Sinh thái Tài nguyên sinh vật 13 10 Hoạt tính kháng nấm ( D-d, mm) pH 10 K.chỉnh pH ĐC (-) 11 6 11 43 13 10 11 0 0 0 ĐC (+) 16,5 Luận văn tốt nghiệp Đào Ánh Vân Kế t thể bảng 3.17.cho thấ y, chủng R12-4 pH 7, hầu hết dich ̣ chiế t đề u có hoạt lực cao so với dịch chiết các dung mơi có pH và pH 10 Điề u này đã chứng tỏ khả năng hoà tan dung môi của các chất kháng nấm tố t nhấ t môi trường có pH trung tính (pH 7) Với dịch lọc pH3, aceton có hiệu tách chiết kháng sinh cao nhất.Ethyl acetate là dung môi tốt chiết kháng sinh từ dịch lọc pH7 và pH 10 Khi đưa 4°C, dịch chiết với methanol và ethyl acetate tạo kết tủa (kháng sinh thô) dịch chiết aceton khơng Do lựa chọn methanol làm dung môi để chiết kháng sinh từ sinh khối và ethyl acetate làm dung môi chiết kháng sinh từ dịch nuôi cấy xạ khuẩn nội sinh R12-4 Một điể m cầ n lư u ý là pH của môi trư ờng cũng có ảnh hư ởng đế n việc chiết kháng sinh ngoài môi trư ờng nhiề u hay tích tu ̣ sinh khố i nhiề u [4].Vì vậy, để tách chiết chất kháng nấm từ chủng R 12-4 có hiệu quả, nên tách chiết mơi trường trung tính Kiểm tra hoạt tính kháng nấm phần dịch chiết với dung môi trước và sau cho bay hơi, phần kháng sinh thô thu và dịch dung môi sau tách kháng sinh thô Khi tách chiết từ sinh khối dung môi methanol và tách chiết từ dịch lọc dung mơi ethyl acetate, hoạt tính kháng nấm sau bay (trước tạo kết tủa) cao so với trước bay dung môi Đưa các mẫu sau bay dung môi 4°C để tạo tủa (kháng sinh thô).Ly tâm lạnh tách kháng sinh thô và phần dung môi sau ly tâm Dung môi sau ly tâm khơng cịn hoạt tính kháng nấm, chứng tỏ hoạt chất kháng nấm kết tinh hoàn toàn 3.4.2 Khả bền nhiệt chất kháng nấm Để xác đinh ̣ khả năng bề n nhiệt của chất khá ng nấm , tiế n hành nuôi xa ̣ khuẩ n trên mơi trường lên men thích hợp Thu dịch kháng sinh thô để xử lý với nhiệt độ 40, 70, 80 và 100°Ctrong các khoảng thời gian 30, 60, 90 và 120 phút.Xác định hoạt tính dịch kháng nấm phương pháp đục lỗ.Kết thể bảng 3.18 Chất kháng nấm thu nhận từ chủng R12-4 là tương đối bền với nhiệt Hoạt chất kháng nấm không thay đổi theo thời gian xử lý Khi tăng nhiệt độ xử lý từ 80 ÷ 100 °C, hoạt tính có giảm dần mức độ giảm không nhiều.Đặc biệt 100 °C với thời gian xử lý 120 phút, hoạt chất kháng sinh dịch chiết khoảng 70 % so với ban đầu Bảng 3.18 Xác định độ bền nhiệt đến hoạt tính kháng nấm chủng R12-4 Thời gian (phút) Hoạt tính kháng sinh (D-d, mm) các nhiệt độ ( °C ) 28 40 70 80 100 2 2 30 22 21 21 20 21 20 21 19 20 19 60 23 20 20 20 20 19 20 19 18 17 90 21 20 19 19 20 21 17 16 16 16 120 22 21 20 20 21 20 16 15 14 13 Ghi chú: (1) F oxysporum; (2) G candidum Viện Sinh thái Tài nguyên sinh vật 44 Luận văn tốt nghiệp Đào Ánh Vân b a d c Hình 3.13 Độ bền chất kháng nấm với nhiệt (a) 30 phút, (b) 60 phút, (c) 90 phút và (d) 120 phút Theo kết công bố số nghiên cứu trước khả bền nhiệt chất kháng sinh thu nhận từ xạ khuẩn, có nhiều chất kháng sinh có khả bền với nhiệt độ, 70°C thời gian 60 phút, hoạt chất kháng sinh khơng thay đổi, chí, 100°C và kéo dài đến 60 phút, hoạt chất kháng sinh khoảng 50% giảm đôi chút[1, 3] Tuy nhiên bên cạnh đó, sớ chất kháng sinh khơng bền nhiệt, hoạt tính kháng sinh bị giảm hoàn toàn 50°C[12].Như so sánh với các kết nghiên cứu trước, chất kháng sinh chủng R12-4 thuộc loại bền nhiệt.Đây là tính chất thuận lợi cho việc tách chiết, tinh chế và bảo quản chất kháng nấm 3.4.3 Khảnăng bền với pH chất kháng nấm Khả bền vững chất kháng nấm với pH là đặc điểm đáng ý điều này khơng có ý nghĩa cơng nghệ tách chiết mà cịn có ý nghĩa t Để xác đinh ̣ khả năng bề n với pH của chất kháng nấm rong ứng du ̣ng , dịch kháng nấm thơ điều chỉnh các pH ÷ và giữ nhiệt độ phòng 60 phút, sau đó điề u chỉnh về pH Hoạt chất kháng nấm của dich ̣ chiế t đư ̣c x ác định phương pháp đục lỗ Kế t quả đư ̣c thể hiện trên hình 3.14 và hình 3.15 Viện Sinh thái Tài nguyên sinh vật 45 Luận văn tốt nghiệp Đào Ánh Vân F oxysporm Geotrichum candidum 25 20 Hoạt tính 15 kháng nấm (D, mm) 10 5 7,3 (ĐC) pH thử nghiệm Hình 3.14 Độ bền chất kháng nấm với b pH a c d Hình 3.15 Khả bền với pH chất kháng nấm Ghi chú: (a,b) F oxysporum; (c,d) G Candidum Kế t quả Hình 3.14 và hình 3.15 cho thấ y, dịch kháng nấm chủng R 12-4 vẫn giữ hoa ̣t tính ở dải pH ÷ thời gian 60 phút chứng tỏ : các chất kháng nấm này đề u có khả bề n với pH Dịch chiết kháng nấm có hoa ̣t lực ma ̣nh nhấ t pH7, giảm dầ n các môi trường axit và kiề m Tuy nhiên , mức độ giảm không nhiề u Như vậy, từ kết cho thấy, chất kháng nấm từ chủng R12-4 thuộc loại bền với pH Đây là đặc điểm lợi công nghiệp thu hồi, tinh chế chất kháng sinh, đồng thời mở rộng khả ứng dụng chất kháng sinh này 3.4.4 Tinh thu nhận chất kháng nấm Viện Sinh thái Tài nguyên sinh vật 46 Luận văn tốt nghiệp Đào Ánh Vân Chất kháng nấm thô tách chiết từ sinh khối dịch nuôi cấy tiến hành tinh theo quy trình mục 2.2.5, phần vật liệu và phương pháp, thu kháng nấm tinh Kiểm tra hoạt tính kháng nấm kháng sinh tinh thu cho thấy kháng sinh giữ nguyên khả kháng vi sinh vật kiểm định ban đầu a b Ghi chú: (a,b) F oxysporum; (c) G candidum c Hình 16 Hoạt chất kháng nấm kháng sinh tinh Hình 17 Hình ảnh quang phổ hấp thu điện tử UV VIS kháng sinh tinh Trên phổ UV đo dung môi methanol xuất đỉnh cực đại hấp thụ bước sóng 322; 338 và 357nm, phổ khá gọn và sắc nét chứng tỏ mẫu kháng sinh đem phân tích là tinh Viện Sinh thái Tài nguyên sinh vật 47 Luận văn tốt nghiệp Đào Ánh Vân Hình 3.18 Hình ảnh phổ hồng ngoại kháng sinh tinh Trên phổ IR xuất các dao động đặc trưng các liên kết (cm-1): Trên Phổ IR xuất dao động dặc trưng các liên kết (cm-1): 3313(-OH); 2943; 2831(CH bão hòa); 1448; 1413 (biến dạng CH); 1020(C-O) Qua phổ IR dự đoán chất kháng nấm củ chúng tơi có chứa nhiều nhóm OH liên kết với C Viện Sinh thái Tài nguyên sinh vật 48 Luận văn tốt nghiệp Đào Ánh Vân PHẦN IV KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN Từ 20 mẫu rễ, cành cam thu thập Hàm Yên – Tuyên Quang, phân lập 40 chủng xạ khuẩn Số lượng xạ khuẩn thu mẫu rễ chiếm tỷ lệ cao nhiều so với mẫu cành (rễ 62,5%, cành 37,5%) Trên môi trường phân lập xạ khuẩn nội sinh khá đa dạng với màu tương ứng đó, nhóm trắng chiếm tỷ lệ cao (81,44%), nhóm vàng cam chiếm 11,91%, nhóm xám 2,59% nhóm xanh rêu 0,65 và nhóm nâu 1,57, vàng 1,39 và đen 0,46% Trong sớ 40 chủng phân lập có: 30% xạ khuẩn kháng vi khuẩn Staphylococcus aureus, 12,5% kháng P.aeruginosa, 2,5% kháng B.subtilis Đối với các chủng nấm kiểm định, có 30% xạ khuẩn nội sinh phân lập đối kháng với G.candidumvà Colletotrichum,12,5% kháng F udum, F oxysporum Đã lựa chọn chủng R12-4 và C12 có hoạt tính kháng nấm cao để nghiên cứu đặc điểm sinh học và phân loại cho kết chủng thuộc chi Streptomyces Dựa phân tích đặc điểm sinh học và trình tự gen 16S rRNA chủng C12thuộc loàiS angustmyceticus, định danh làS angustmyceticus C12 và chủng R12-4 thuộc loàiStreptomycesprasinopilosus, định danh làS prasinopilosus R12-4 Đã nghiên cứu môi trường và điều kiện sinh tổng hợp hoạt chất kháng nấm hai chủng xạ khuẩn nội sinh R12-4 và C12: hoạt chất kháng nấm sinh tổng hợp tốt môi trường AH4, 28 ÷ 30°C, pH 7,0 Đã nghiên cứu tách chiết sơ hoạt chất kháng nấm từ chủng R12-4: chiết chất kháng nấm từ sinh khối chủng R12-4 dung môi methanol pH 7,0 Tách chiết từ dịch lên men dung môi ethyl acetate pH 7,0 Đã kiểm tra tính chất hóa lý chất kháng nấm từ chủng R12-4: chất kháng nấm bền nhiệt độ 80°C và khoảng pH ÷ Đã thu sản phẩm có hoạt tính kháng nấm tinh Chất kháng nấm phân tích phổ UV VIS và phổ hồng ngoại KIẾN NGHỊ Tiếp tục nghiên cứu đặc tính và xác định cấu trúc hoá học chất kháng nấm thu nhận từ chủng xạ khuẩn S angustmyceticus C12và S prasinopilosus R12-4 Viện Sinh thái Tài nguyên sinh vật 49 Luận văn tốt nghiệp Đào Ánh Vân TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Bùi Thị Việt Hà (2006), Nghiên cứu xạ khuẩn sinh chất kháng sinh ch ống nấm gây bệnh thực vật Việt Nam, Luận án Tiế n si ̃ Sinh ho ̣c , 2006, Cao Ngọc Điệp, Phan Thị Nhã (2011), Phân lập và xác định đặc tính vi khuẩn nội sinh Khóm (Ananas comosus [L.]) trồng đất phèn thị xã vị thanh, tỉnh Hậu Giang, Tạp chí Cơng nghệ Sinh học 9(2): 243-250 Lê Gia Hy (1994), Nghiên cứu xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces sinh chất kháng sinh chống nấm gây bệnh đạo ôn thối cổ rễ phân lập Việt Nam, Luận án Phó tiến sĩ khoa học Sinh học, Hà Nội Lê Gia Hy, Khuất Hữu Thanh, (2010), Cơ sở công nghệ vi sinh vật ứng dụng, Nhà xuất Giáo dục, Việt Nam Lê Mai Hương, Lê Minh Hà, Trần Thị Như Hằng, Trần Thị Hồng Hà, Mai Ngọc Toàn (2005), Chất có hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm từ chủng nấm Aspergillus awamori Nakazawa kí sinh sảng Sterculia lanceolata Car họ Sterculiaceae, Tạp chí Khoa học Cơng nghệ, tập 43 (6A): 132-136 Lê Thị Xuân, Lê Mai Hương (1997), Phân lập nghiên cứu các chất chiết từ nấm nội kí sinh Taxus chinensis, Kỷ yếu-Annual report, Viện Hóa Học Lương Thị Hồng Hiệp, Cao Ngọc Điệp (2011), Phân lập và nhận diện vi khuẩn nội sinh cúc xuyên chi (Twedelia trilobata (L.) hitche.) kỹ thuật PCR, Tạp chí Khoa học, 18a: 168-176 Ngơ Đình Quang Bính (2005), Vi sinh vật học công nghiệp, NXB Trung tâm Khoa học tự nhiên và Công nghệ quốc gia, Hà Nội, Tr 53 – 71 Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm văn Ty (2007) vi sinh vật học, NXB Giáo dục, Hà Nội 10 Nguyễn Sỹ Giao (1971), Nghiên cứu định hướng ứng dụng số chủng nấm cộng sinh môi trường non phục vụ nghề trồng rừng, Tập san lâm nghiệp (4): 23-28 11 Nguyễn Thành Đạt (2007), Cơ sở sinh học vi sinh vật, NXB Đại học sư Phạm Hà Nội 12 Nguyễn Thi ̣Thu Thuỷ , Hoàng Thị Kim Hồng (2009): Nghiên c ứu xạ khuẩn sinh kháng sinh phân lập từ đất trồng hoa màu Thừa Thiên Huế Hội nghi ̣CNSH toàn quố c 2009 13 Nguyễn Văn Cách (2004), Công nghệ lên men chất kháng sinh, NXB Khoa học và Kĩ thuật Hà Nội 14 Nguyễn Văn Minh, Mai Hữu Phúc, Võ Ngọc Yến Nhi, Dương Nhật Linh, Nguyễn Anh Nghĩa (2014), Sàng lọc vi sinh vật nội sinh cao su có khả kiểm soát sinh học vi nấm Corynespora cassiicola, Tạp chí Sinh học, 36(1se): 173-179 Tiếng Anh 15 Alipour H., Hosein B A., Jahed M., Rahnama H., Sharifnia M., (2013) A Review on Citrus Production and Export Marketing Strategies in Mazandaran Province Iran, Middle-East Journal of Scientific Research, 14 (10): 1375-1380 Viện Sinh thái Tài nguyên sinh vật 50 Luận văn tốt nghiệp Đào Ánh Vân 16 Bacon C.W and White J.F., 2000 Microbial Endophytes Marcel Dekker, New York, pp: 341-388 17 Cao L.X., Qiu Z.Q., You J.L., Tan H.M., Zhou S (2005), Isolation and characterization of endophytic Streptomycete antagonists of Fusarium with phathogen from surface-sterilized banana roots FEMS Microbiol Lett 247: 147-152 18 Conn V.M and Franco C.M.M (2004) Analysis of the endophytic actinobacterial population in the roots of wheat (Triticum aestivum L.) by terminal restriction fragment length polymorphism and sequencing of 16S rRNA clones Appl Environ Microbiol, 70: 1787-1794 19 Conn V.M., Walker A R., Franco C.M.M (2008), Endophytic actinobacteria induce defense pathways in Arabidopsis thaliana Mol Plant Microbe Interact, 21 (2): 208-218 20 Coombs J.T and Franco C.M.M (2003) Isolation and identification of actinobacteria from surface-sterilized wheat root Appl Environ Microbiol, 69:5603-5608 21 De Aráujo J M , da Silva A C and Azevedo J L (2000) Isolation of endophytic actinomycetes from roots and leaves of maize (Zea mays L.) Brazilian Archvies of Biology and Technology 43: 447-451 22 El-Tarabily, K A & Sivasithamparam, K Non-streptomycete actinomycetes as biocontrol agents of soil-borne fungal plant pathogens and as plant growth promoters Soil Biol Biochem 38, 15 23 Gangwar M, S Dogra, N Sharma (2011), Antagonistic Bioactivity of Endophytic Actinomycetes Isolated from Medicinal Plans, J Advanced Lab Research in Biology 2(4): 154-157 24 Gangwar M., Dogra S., Gupta U P., Kharwar R N (2014) Diversity and biopotential of endophytic actinomycetes from three medicinal plants in India, African Journal of Microbiology Research, 8(2): 184-191 25 Hong Y.Z., Quan H.X., Ming T., Guang H.S (2013), Effect of actinomycetes on ginseng growth and production of ginsenosides, J Food Agr Environ 11(1): 557559 26 Igarashi Y (2004).Screening of novel bioactive compounds from plant-associated actinomycetes Actinomycetologica 18:63–66 27 Inderiati S and Muliani S (2008) Isolation and characterization of endophytic actinomycetes of tobacco plants Journal of Agrisistem 4: 82-100 28 Intra B., Mungsuntisuk I., Nihira T., Igarashi Y., Panbangred W (2011) Identification of actinomycetes from plant rhizospheric soils with inhibitory activity against Colletotrichum spp., the causative agent of anthracnose disease BMC Research Notes, 4:98 29 Kandpal K C., Jain D A., Kumar U., Tripathi R., Kumar T S (2012) Isolation and screening of endophytic actinomycetes producing antibacterial compound from Citrus aurantifolia Fruit, European Journal of Experimental Biology, (5):17331737 30 Keswani J., Whitman W B (2001) Relationship of 16S rRNA sequence similarity to DNA hybridization in prokaryotes Int J Syst Evol Microbiol., 51, 667–678 31 Lee S O., Choi G J., Jang K S., Park D-J., Kim C-J.and Kim J-C (2008) Isolation and characterization of endophytic actinomycetes from Chinese cabbage roots as antagonists to Plasmodiophora brassicae 18 1741-1746 Viện Sinh thái Tài nguyên sinh vật 51 Luận văn tốt nghiệp Đào Ánh Vân 32 Lee J.Y and Hwang, B.K (2002) Diversity of antifungal actinomycetes in various vegetative soils of Korea Canadian J Microbiol., 48:407–417 33 Malfanova N., Lugtenberg B., and Berg G (2013) Chapter 2, in “Molecular microbial ecology of the rhizosphere”, de Bruijn FJ (ed), Wiley-Blackwell 34 Mini Priya R (2012) Endophytic Actinomycetes from Indian Medicinal Plants as Antagonists to Some Phytopathogenic Fungi, Open Access Scientific Reports, 1(4):1-5 35 Nimnoi P., Pongsilp N., Lumyong S (2010), Endophytic actinomycetes isolated from Aquilaria crassna Pierre ex Lec and screening of plant growth promoters production World J Microbiol Biotechnol, 26:193–203 36 Nomomura H (1974) Key for Classification and Identification of 458 species of the Streptomyces included in ISP, J Ferment Technol., 52(2): 78-92 37 Petrini, O (1991) Fungal endophytes of tree leaves In: Microbial ecology of the leaves (eds N.J Fokkema and van den Heuvel) Cambridge University Press, Cambridge: 185- 187 38 Qin S., Zhao G.Z., Li J., Zhu W.Y., Xu L.H., Li W.J.(2009) Actinomadura flavalba sp nov., an endophytic actinomycete isolated from leaves of Maytenus austroyunnanensis int J Syst Evol Microbiol., 59(10):2453-2457 39 Qin S., Xing K., Jiang J H., Xu L H., Li W J (2011) Biodiversity, bioactive natural products and biotechnological potential of plant-associated endophytic actinobacteria Appl Microbiol Biotechnol 89 (3): 457-473 40 Sambrook J., Russell D W (2001) Molecular cloning A laboratory manual, 3rd ed Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York 41 Sardi P., Saracchi M., Quaroni S., Petrolini B., Borgonovi E and Merlit S (1992).Isolation of endophytic Streptomyces strains from surface-sterilized roots Applied and Environmental Microbiology 58: 2691-2693 42 Sarma C., Borthakur A., Singh S., Modi M K., Sen P (2011), Efficient in vitro plant regeneration from cotyledonary explants of Citrus reticulata L Blanco Annals of Biological Research, (6):341-348 43 Shimizu M (2011), Endophytic Actinomycetes: Biocontrol Agents and Growth Promoters, in Bacteria in Agrobiology: Plant Growth Responses, Chap 10, Ed Maheshwari D.K., Springer-Verlag Berlin Heidelberg 2011 44 Shirling E B., Gottlieb D (1966) Cooperative description of type culture of Streptomyces species Int J Sys Bacteriol., 19(4): 391-512 45 Shutsrirung A., Chromkaew Y., Pathom-Aree W., Choonluchanon S., Boonkerd N (2013), Diversity of endophytic actinomycetes in mandarin grown in northern Thailand, their phytohormone production potential and plant growth promoting activity Soil Science and Plant Nutrition, 59 (3):322- 330 46 Snoussi H., Duval M-F., Garcia-Lor A., Belfalah Z., Froelicher Y., Risterucci A-M., Perrier X., Jacquemoud-Collet J-P., Navarro L., Harrabi M., Ollitrault P (2012), Assessment of the genetic diversity of the Tunisian citrus rootstock germplasm, BMC Genetics, 13:16 47 Strobel G, Daisy B, Castillo U, Harper J (2004), Natural products from endophytic microgranisms, J Nat Prod 67: 257-268 48 Taechowisan T, Lu CH, Shen YM, Lumyong S (2007b) Antitumor activity of 4arylcoumarins from endophytic Streptomyces aur- eofaciens CMUAc130 J Cancer Res Trer 3:86–91 Viện Sinh thái Tài nguyên sinh vật 52 Luận văn tốt nghiệp Đào Ánh Vân 49 Taechowisan T., C Lu, Y Shen and S Lumyong (2005), Secondary metabolites from endophytic Streptomyces aureofaciens CMUAc130 and their antifungal activity Microbiology 151, 1691–1695 50 Taechowisan T., Chanaphat S., Ruensamran W., Phutdhawong W S (2014), Antibacterial activity of new flavonoids from Streptomyces sp BT01 an endophyte in Boesenbergia rotunda (L.) Mansf., Journal of Applied Pharmaceutical Science, 4(4): 8-13 51 Takahashi Y & Omura S (2003) Isolation of new actinomycete strains for the screening of new bioactive compounds Journal of General & Applied Microbiology 49: 141-154 52 Tan HM, Cao LX, He ZF, Su GJ, Lin B, Zhou SN (2006) Isolation of endophytic actinomycetes from different cultivars of tomato and their activities against Ralstonia solanacearum in vitro World J Microbiol Biotechnol 22:1275–1280 53 Tokala R K., Strap J L.,Jung C M., Crawford D L.,Salove M H., Deobald L A.,Bailey J F., Morra M J (2002) Novel plant microbe Rhizosphere interaction involving Streptomyces lydicus WYEC108 and the Pea Plant (Pisum sativum), Appl Environ Microbiol, 68 (5):2161–2171 54 Trerner H.D., Buckus E.J (1963) System of color wheels for Streptomycete taxonomy, Appl Microbiol 11: 335 – 338 55 Verma V C., Gond S K, Kumar A., Mishra A., Kharwar R N and Gange A C (2009) Endophytic actinomycetes from Azadirachta indica A Juss.: isolation, diversity, and anti-microbial activity Microbial Ecology 57: 749 56 Waksman S.A (1961) The Actinomycetes Classification, identification and descriptions of genera and species, The Williams & Wilkins Co., Baltimore, USA 57 Williams S.T., Goodfellow M., Alderson G., Wellington E.M H., Sneath P.H.A., Sackin M.J (1983) Numerical classification of Streptomyces and related genera, J Gen Microbiol., 129: 1743–1813 58 Xu Z H., Gao D M , Song X L., Xu (2012) A review of endophyte and its use and function International Conference on Environmental Engineering and Technology Advances in Biomedical Engineering, 8:124–130 59 Zhao P.J., Fan L.M., Li G.H., Zhu N., Shen Y.M (2005) Antibacterial and antitumor macrolides from Streptomyces sp Is9131 Arch Pharm Res 28:1228 – 1232 Viện Sinh thái Tài nguyên sinh vật 53 Luận văn tốt nghiệp Đào Ánh Vân PHỤ LỤC Phụ lục Streptomyces angustmyceticus strain C12 16S ribosomal RNA gene, partial sequence GenBank: KT717957.1 FASTA Graphics Go to: LOCUS KT717957 1407 bp DNA linear BCT 26-OCT-2015 DEFINITION Streptomyces angustmyceticus strain C12 16S ribosomal RNA gene, partial sequence ACCESSION KT717957 VERSION KT717957.1 GI:940414451 KEYWORDS SOURCE Streptomyces angustmyceticus ORGANISM Streptomyces angustmyceticus Bacteria; Actinobacteria; Streptomycetales; Streptomycetaceae; Streptomyces REFERENCE (bases to 1407) AUTHORS Hieu,N.V., Van,D.A., Lien,N.T.H and Thao,P.T.H TITLE Endogenous actinomycetes isolation from the king mandarin of Tuyen Quang JOURNAL Unpublished REFERENCE (bases to 1407) AUTHORS Hieu,N.V., Van,D.A., Lien,N.T.H and Thao,P.T.H TITLE Direct Submission JOURNAL Submitted (04-SEP-2015) Soil Microbiology, Institute of Biotechnology, Vietnam Academy of Science and Technology, 18 Hoang Quoc Viet, Ha Noi, Cau Giay, Viet Nam FEATURES Location/Qualifiers source 1407 /organism="Streptomyces angustmyceticus" /mol_type="genomic DNA" /strain="C12" /db_xref="taxon:285578" /country="Viet Nam" rRNA1407 /product="16S ribosomal RNA" ORIGIN ggggggctac catgcagtcg acgatgaacc tccttcggga ggggattagt ggcgaacggg 61 tgagtaacac gtgggcaatc tgcccttcac tctgggacaa gccctggaaa cggggtctaa 121 taccggatac gacctccgac cgcatggtct ggtggtggaa agctccggcg gtgaaggatg 181 agcccgcggc ctatcagctt gttggtgggg tgatggccta ccaaggcgac gacgggtagc 241 cggcctgaga gggcgaccgg ccacactggg actgagacac ggcccagact cctacgggag 301 gcagcagtgg ggaatattgc acaatgggcg aaagcctgat gcagcgacgc cgcgtgaggg 361 atgacggcct tcgggttgta aacctctttc agcagggaag aagcgagagt gacggtacct 421 gcagaagaag cgccggctaa ctacgtgcca gcagccgcgg taatacgtag ggcgcaagcg 481 ttgtccggaa ttattgggcg taaagagctc gtaggcggct tgtcacgtcg gatgtgaaag 541 cccggggctt aaccccgggt ctgcattcga tacgggcagg ctagagttcg gtaggggaga 601 tcggaattcc tggtgtagcg gtgaaatgcg cagatatcag gaggaacacc ggtggcgaag Viện Sinh thái Tài nguyên sinh vật 54 Luận văn tốt nghiệp Đào Ánh Vân 661 gcggatctct gggccgatac tgacgctgag gagcgaaagc gtggggagcg aacaggatta 721 gataccctgg tagtccacgc cgtaaacgtt gggaactagg tgtgggcgac attccacgtc 781 gtccgtgccg cagctaacgc attaagttcc ccgcctgggg agtacggccg caaggctaaa 841 actcaaagga attgacgggg gcccgcacaa gcagcggagc atgtggctta attcgacgca 901 acgcgaagaa ccttaccaag gcttgacata caccggaaaa ccctggagac agggtccccc 961 ttgtggtcgg tgtacaggtg gtgcatggct gtcgtcagct cgtgtcgtga gatgttgggt 1021 taagtcccgc aacgagcgca acccttgttc tgtgttgcca gcatgccctt cggggtgatg 1081 gggactcaca ggagactgcc ggggtcaact cggaggaagg tggggacgac gtcaagtcat 1141 catgcccctt atgtcttggg ctgcacacgt gctacaatgg ccggtacaat gagctgcgat 1201 accgcgaggt ggagcgaatc tcaaaaagcc ggtctcagtt cggattgggg tctgcaactc 1261 gaccccatga agtcggagtt gctagtaatc gcagatcagc attgctgcgg tgaatacgtt 1321 cccgggcctt gtacacaccg cccgtcacgt cacgaaagtc ggtaacaccc gaagccggtg 1381 gcccaacccc ttgtggagga atcgtcg// Phụ lục Streptomyces prasinopilosus strain R12-4 16S ribosomal RNA gene, partial sequence GenBank: KT751524.1 FASTA Graphics Go to: LOCUS KT751524 1392 bp DNA linear BCT 26-OCT-2015 DEFINITION Streptomyces prasinopilosus strain R12-4 16S ribosomal RNA gene, partial sequence ACCESSION KT751524 VERSION KT751524.1 GI:940416041 KEYWORDS SOURCE Streptomyces prasinopilosus ORGANISM Streptomyces prasinopilosus Bacteria; Actinobacteria; Streptomycetales; Streptomycetaceae; Streptomyces REFERENCE (bases to 1392) AUTHORS Thao,P.T.H., Van,D.A., Lien,N.T.H and Hieu,N.V TITLE Endogenous actinomycetes isolation from king mandarin of Tuyen Quang JOURNAL Unpublished REFERENCE (bases to 1392) AUTHORS Thao,P.T.H., Van,D.A., Lien,N.T.H and Hieu,N.V TITLE Direct Submission JOURNAL Submitted (15-SEP-2015) Soil Microbiology, Institute of Biotechnology, Vietnam Academy of Science and Technology, 18 Hoang Quoc Viet, Cau Giay, Hanoi, Vietnam FEATURES Location/Qualifiers source 1392 /organism="Streptomyces prasinopilosus" /mol_type="genomic DNA" /strain="R12-4" /isolation_source="roots of king mandarin" Viện Sinh thái Tài nguyên sinh vật 55 Luận văn tốt nghiệp Đào Ánh Vân /db_xref="taxon:67344" /country="Viet Nam: Tuyen Quang province, Ham Yen district" /collection_date="2015" rRNA1392 /product="16S ribosomal RNA" ORIGIN gctaccatgc agtcgaacga tgaagccctt cggggtggat tagtggcgaa cgggtgagta 61 acacgtgggc aatctgccct gcactctggg acaagccctg gaaacggggt ctaataccgg 121 atatgaccat cttgggcatc cttgatggtg taaagctccg gcggtgcagg atgagcccgc 181 ggcctatcag cttgttggtg aggtaatggc tcaccaaggc gacgacgggt agccggcctg 241 agagggcgac cggccacact gggactgaga cacggcccag actcctacgg gaggcagcag 301 tggggaatat tgcacaatgg gcgaaagcct gatgcagcga cgccgcgtga gggatgacgg 361 ccttcgggtt gtaaacctct ttcagcaggg aagaagcgag agtgacggta cctgcagaag 421 aagcgccggc taactacgtg ccagcagccg cggtaatacg tagggcgcaa gcgttgtccg 481 gaattattgg gcgtaaagag ctcgtaggcg gcttgtcacg tcgattgtga aagctcgggg 541 cttaaccccg agtctgcagt cgatacgggc tagctagagt gtggtagggg agatcggaat 601 tcctggtgta gcggtgaaat gcgcagatat caggaggaac accggtggcg aaggcggatc 661 tctgggccat tactgacgct gaggagcgaa agcgtgggga gcgaacagga ttagataccc 721 tggtagtcca cgccgtaaac ggtgggaact aggtgttggc gacattccac gtcgtcggtg 781 ccgcagctaa cgcattaagt tccccgcctg gggagtacgg ccgcaaggct aaaactcaaa 841 ggaattgacg ggggcccgca caagcggcgg agcatgtggc ttaattcgac gcaacgcgaa 901 gaaccttacc aaggcttgac atacaccgga aagcattaga gatagtgccc cccttgtggt 961 cggtgtacag gtggtgcatg gctgtcgtca gctcgtgtcg tgagatgttg ggttaagtcc 1021 cgcaacgagc gcaacccttg tcccgtgttg ccagcaggcc cttgtggtgc tggggactca 1081 cgggagaccg ccggggtcaa ctcggaggaa ggtggggacg acgtcaagtc atcatgcccc 1141 ttatgtcttg ggctgcacac gtgctacaat ggccggtaca atgagctgcg ataccgtgag 1201 gtggagcgaa tctcaaaaag ccggtctcag ttcggattgg ggtctgcaac tcgaccccat 1261 gaagtcggag tcgctagtaa tcgcagatca gcattgctgc ggtgaatacg ttcccgggcc 1321 ttgtacacac cgcccgtcac gtcacgaaag tcggtaacac ccgaagccgg tggcccaacc 1381 cctgcgggag gg // Viện Sinh thái Tài nguyên sinh vật 56