Nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành phần hóa học và một số tác dụng sinh học của cây Giảo cổ lam quả dẹt (Gynostemma compressum X.X. Chen D.R. Liang).Nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành phần hóa học và một số tác dụng sinh học của cây Giảo cổ lam quả dẹt (Gynostemma compressum X.X. Chen D.R. Liang).Nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành phần hóa học và một số tác dụng sinh học của cây Giảo cổ lam quả dẹt (Gynostemma compressum X.X. Chen D.R. Liang).Nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành phần hóa học và một số tác dụng sinh học của cây Giảo cổ lam quả dẹt (Gynostemma compressum X.X. Chen D.R. Liang).Nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành phần hóa học và một số tác dụng sinh học của cây Giảo cổ lam quả dẹt (Gynostemma compressum X.X. Chen D.R. Liang).Nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành phần hóa học và một số tác dụng sinh học của cây Giảo cổ lam quả dẹt (Gynostemma compressum X.X. Chen D.R. Liang).Nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành phần hóa học và một số tác dụng sinh học của cây Giảo cổ lam quả dẹt (Gynostemma compressum X.X. Chen D.R. Liang).Nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành phần hóa học và một số tác dụng sinh học của cây Giảo cổ lam quả dẹt (Gynostemma compressum X.X. Chen D.R. Liang).Nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành phần hóa học và một số tác dụng sinh học của cây Giảo cổ lam quả dẹt (Gynostemma compressum X.X. Chen D.R. Liang).Nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành phần hóa học và một số tác dụng sinh học của cây Giảo cổ lam quả dẹt (Gynostemma compressum X.X. Chen D.R. Liang).Nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành phần hóa học và một số tác dụng sinh học của cây Giảo cổ lam quả dẹt (Gynostemma compressum X.X. Chen D.R. Liang).Nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành phần hóa học và một số tác dụng sinh học của cây Giảo cổ lam quả dẹt (Gynostemma compressum X.X. Chen D.R. Liang).Nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành phần hóa học và một số tác dụng sinh học của cây Giảo cổ lam quả dẹt (Gynostemma compressum X.X. Chen D.R. Liang).Nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành phần hóa học và một số tác dụng sinh học của cây Giảo cổ lam quả dẹt (Gynostemma compressum X.X. Chen D.R. Liang).Nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành phần hóa học và một số tác dụng sinh học của cây Giảo cổ lam quả dẹt (Gynostemma compressum X.X. Chen D.R. Liang).Nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành phần hóa học và một số tác dụng sinh học của cây Giảo cổ lam quả dẹt (Gynostemma compressum X.X. Chen D.R. Liang).Nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành phần hóa học và một số tác dụng sinh học của cây Giảo cổ lam quả dẹt (Gynostemma compressum X.X. Chen D.R. Liang).Nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành phần hóa học và một số tác dụng sinh học của cây Giảo cổ lam quả dẹt (Gynostemma compressum X.X. Chen D.R. Liang).Nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành phần hóa học và một số tác dụng sinh học của cây Giảo cổ lam quả dẹt (Gynostemma compressum X.X. Chen D.R. Liang).Nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành phần hóa học và một số tác dụng sinh học của cây Giảo cổ lam quả dẹt (Gynostemma compressum X.X. Chen D.R. Liang).Nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành phần hóa học và một số tác dụng sinh học của cây Giảo cổ lam quả dẹt (Gynostemma compressum X.X. Chen D.R. Liang).Nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành phần hóa học và một số tác dụng sinh học của cây Giảo cổ lam quả dẹt (Gynostemma compressum X.X. Chen D.R. Liang).Nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành phần hóa học và một số tác dụng sinh học của cây Giảo cổ lam quả dẹt (Gynostemma compressum X.X. Chen D.R. Liang).Nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành phần hóa học và một số tác dụng sinh học của cây Giảo cổ lam quả dẹt (Gynostemma compressum X.X. Chen D.R. Liang).Nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành phần hóa học và một số tác dụng sinh học của cây Giảo cổ lam quả dẹt (Gynostemma compressum X.X. Chen D.R. Liang).Nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành phần hóa học và một số tác dụng sinh học của cây Giảo cổ lam quả dẹt (Gynostemma compressum X.X. Chen D.R. Liang).Nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành phần hóa học và một số tác dụng sinh học của cây Giảo cổ lam quả dẹt (Gynostemma compressum X.X. Chen D.R. Liang).Nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành phần hóa học và một số tác dụng sinh học của cây Giảo cổ lam quả dẹt (Gynostemma compressum X.X. Chen D.R. Liang).Nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành phần hóa học và một số tác dụng sinh học của cây Giảo cổ lam quả dẹt (Gynostemma compressum X.X. Chen D.R. Liang).Nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành phần hóa học và một số tác dụng sinh học của cây Giảo cổ lam quả dẹt (Gynostemma compressum X.X. Chen D.R. Liang).Nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành phần hóa học và một số tác dụng sinh học của cây Giảo cổ lam quả dẹt (Gynostemma compressum X.X. Chen D.R. Liang).Nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành phần hóa học và một số tác dụng sinh học của cây Giảo cổ lam quả dẹt (Gynostemma compressum X.X. Chen D.R. Liang).Nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành phần hóa học và một số tác dụng sinh học của cây Giảo cổ lam quả dẹt (Gynostemma compressum X.X. Chen D.R. Liang).Nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành phần hóa học và một số tác dụng sinh học của cây Giảo cổ lam quả dẹt (Gynostemma compressum X.X. Chen D.R. Liang).Nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành phần hóa học và một số tác dụng sinh học của cây Giảo cổ lam quả dẹt (Gynostemma compressum X.X. Chen D.R. Liang).
TỔNG QUAN
TỔNG QUAN VỀ CHI GYNOSTEMMA BLUME
1.1.1 Vị trí phân loại, đặc điểm thực vật và phân bố của chi Gynostemma Blume
1.1.1.1 Vị trí phân loại của chi Gynostemma Blume
Chi Gynostemma do nhà thực vật học Hà Lan gốc Đức Carl Ludwig Blume (1796 - 1862) (viết tắt là Blume) xác lập năm 1825, trên cơ sở của mẫu typ của loài Gynostemma simplicifolium Blume (mang số hiệu C L Blume 1493 (L.), thu thập ở Java, Indonesia) được công bố trong "Bijdr Flora Ned-Indonesia" No 23, 1825 Nhà thực vật này công bố 2 loài nhưng chỉ được coi là đồng danh (synonyms) của Gynostemma Blume.
Người Việt Nam đầu tiên đề cập đến các loài thuộc chi Gynostemma Blume (họ Bí - Cucurbitaceae) là Phạm Hoàng Hộ Trong bộ "Cây cỏ Việt Nam" Q.I xuất bản năm 1999, ông cũng chỉ nêu ra được 2 loài thuộc chi Gynostemma Blume (Gynostemma laxum (Wall.) Cogn và
Gynostemma pentaphyllum (Thunb.) Makino) [7] Đến năm 2003, trong "Danh lục các loài thực vật Việt Nam", khi biên soạn họ Cucurbitaceae, Nguyễn Hữu Hiến cũng chỉ nhắc lại 2 loài thuộc chi Gynostemma Blume [8] đã được các tác giả tiền bối công bố ở nước ta [7], [9], [10].
Theo hệ thống phân loại thực vật của Takhtajan 2009 [11], có thể phân loại chi
Ngành Ngọc lan (Magnoliophyta) Lớp
Phân lớp Sổ (Dilleniidae) Liên bộ Hoa tím (Violanae)
Họ Bí (Cucurbitaceae)Phân họ Nhandiroboideae Tông Zanonieae
Một số nhà thực vật Việt Nam như Phạm Hoàng Hộ [7], Võ Văn Chi [12] cũng xếp chi
Gynostemma Blume thuộc họ Bí (Cucurbitaceae) tương đồng với hệ thống phân loại của
Chi Gynostemma Blume được chia thành hai phân chi (Subgenus), bao gồm:
(i) Subgenus Trirostellum với dạng quả nang, tự mở bằng 3 van và được chia thành
(ii) Subgenus Gynostemma với dạng quả mọng, không tự mở.
1.1.1.2 Đặc điểm thực vật của chi Gynostemma Blume
Theo một số tài liệu về phân loại thực vật, đặc điểm chung của các loài thuộc chi
Gynostemma Blume là cây thảo nhiều năm, có dạng dây leo nhẵn hoặc có lông Các loài thường mọc lan ở dưới tán; rễ có củ hoặc không; cành mảnh, có lông thưa hoặc lông mịn Lá so le, kép chân vịt, 3 – 9 lá chét, hiếm khi đơn; phiến lá chét hình trứng – mác Tua cuốn chẻ đôi, ít khi đơn. Cây đơn tính khác gốc Hoa đơn tính, cụm hoa chùm hoặc chùy, nách lá hoặc đầu cành; cuống của hoa có khớp; lá bắc con ở gốc Hoa đực: Ống đài ngắn, 5 thùy; các mảnh hình mác hẹp; tràng màu xanh hoặc trắng, hình bánh xe (rotate), 5 thùy xẻ sâu; các thùy hình mác hoặc trứng – mác, mép cuộn vào trong khi là nụ; nhị 5, đính vào gốc của ống bao hoa; chỉ nhị ngắn, hàn liền; bao phấn đứng, hình trứng, 2 ô, nứt dọc, trung đới hẹp, nhưng không kéo dài; hạt phấn hình cầu hoặc elip, có sọc hoặc vạch theo chiều dọc hoặc nhẵn hoặc trơn, tự mở bằng lỗ; nhụy hoa tiêu giảm không có (tiêu giảm hoàn toàn) Hoa cái: Đài và tràng giống hoa đực; nhị lép tồn tại; bầu hình cầu, 2 – 5 ô; vòi nhụy 3, hiếm khi 2, 4 hoặc 5, rời nhau; núm nhụy 2 hoặc 1, hình lưỡi liềm hoặc xẻ răng cưa không đều; noãn 2, treo hoặc rủ trong mỗi ô Quả mọng hình cầu, hình dáng và kích thước giống đậu Hà Lan (pea), hoặc quả nang, có 3 thùy từ đỉnh, đỉnh có u hoặc 3 vòi nhụy dài tồn tại Hạt 2 hoặc 3, hình trứng rộng, dẹp, có nhú hoặc gai nhú [13].
Các nghiên cứu về nhiễm sắc thể cho thấy, số nhiễm sắc cơ bản của các loài trong chi
Gynostemma Blume là 2n = 22; có thể xuất hiện dạng đa bội, thường là 2n = 22, 44, 66 hoặc 88.
Hiện tượng đa bội nhiễm sắc thể xuất hiện thường xuyên ở một số loài như G. longipes (2n = 22, 44), G cardiospermum (2n = 22, 66), G yixingerse (2n = 22, 88) và G. pentaphyllum (2n = 22, 44, 66, 88) [14].
1.1.1.3 Phân bố của các loài thuộc chi Gynostemma Blume
Theo công bố mới nhất tham khảo trên trang web http://www.theplantlist.org (15/4/2020) [15], trên thế giới chi Gynostemma Blume có 19 loài đã được chấp nhận (Bảng 1.1) Các loài thuộc chi Gynostemma phân bố chủ yếu ở vùng nhiệt đới châu Á đến Đông Á, từ dãy Hymalaya tới Nhật Bản, Malaysia và New Guinea Trung Quốc là quốc gia có các loài thuộc chi Gynostemma nhiều nhất, gồm 14 loài (Bảng 1.2) trong đó có 9 loài đặc hữu phân bố ở miền tây nam Trung Quốc (phía nam tỉnh Thiểm Tây và khu nam lưu vực sông Trường Giang) Loài G. pentaphyllum (Thunb.) Makino phổ biến nhất và mọc rải rác cả ở Trung Quốc, Bangladesh, Bu Tan, Ấn Độ,
Indonesia, phía nam Nhật Bản, phía nam Hàn Quốc, Lào, Maylasia, Myanmar, Nepal, New Guinea, Srilanca, Thái Lan và Việt Nam [13].
Bảng 1.1: Danh sách các loài thuộc chi Gynostemma Blume [15]
STT Tên loài Ghi chú
1 G aggregatum C Y Wu & S K Chen Đã được chấp nhận
2 G burmanicum King ex Chakrav Đã được chấp nhận
3 G cardiospermum Cogn ex Oliv Đã được chấp nhận
4 G caulopterum S Z He Đã được chấp nhận
G cissoides (Wall.) Benth & Hook f ex Franch & Sav.
5 G compressum X X Chen & D R Liang Đã được chấp nhận
6 G guangxiense X X Chen & D H Qin Đã được chấp nhận
7 G intermedium W.J.de Wilde & Duyfjes Đã được chấp nhận
8 G laxiflorum C Y Wu & S K Chen Đã được chấp nhận
9 G laxum (Wall.) Cogn Đã được chấp nhận
STT Tên loài Ghi chú
10 G longipes C Y Wu Đã được chấp nhận
11 G microspermum C Y Wu & S K Chen Đã được chấp nhận
12 G pallidinerve Z Zhang Đã được chấp nhận
13 G papuanum W.J.de Wilde & Duyfjes Đã được chấp nhận
14 G pentagynum Z P Wang Đã được chấp nhận
15 G pentaphyllum (Thunb.) Makino Đã được chấp nhận
G pentaphyllum f dasycarpum (C Y Wu) W.J.de Wilde &
G pentaphyllum f fasciculare W.J.de Wilde & Duyfjes
G pentaphyllum f grandiflorum W.J.de Wilde & Duyfjes
G pentaphyllum f knemandrum W.J.de Wilde & Duyfjes
G pentaphyllum f pubescens (Gagnep.) W.J.de Wilde &
G pentaphyllum f simplicifolium (Blume) W.J.de Wilde &
16 G pubescens (Gagnep.) C Y Wu Đã được chấp nhận
17 G simplicifolium Blume Đã được chấp nhận
G wightianum (Arn.) Benth & Hook.f ex B D Jacks.
18 G yixingense (Z P Wang & Q Z Xie) C Y Wu & S K Chen Đã được chấp nhận
19 G zhejiangense X J Xue Đã được chấp nhận
Bảng 1.2: Danh sách các loài Gynostemma ở Trung Quốc [16]
STT Tên loài STT Tên loài
1 G pentagynum Z P Wang 9a G burmanicum var burmanicum
3 G cardiospermum Cogn ex Oliv 10 G pentaphyllum (Thunb.) Makino
STT Tên loài STT Tên loài
6 G laxiflorum C Y Wu & S K Chen 11 G guangxiense X X Chen & D H Qin
8 G laxum (Wall.) Cogn 13 G longipes C Y Wu
9 G burmanicum King ex Chakrav 14 G caulopterum S Z He
Bảng 1.3: Danh sách các loài Gynostemma ở Thái Lan và Malaysia [14]
STT Tên loài STT Tên loài
2 G papuanum W.J.de Wilde & Duyfjes 4.d G pentaphyllum forma knemandrum
4 G pentaphyllum (Thunb.) Makino 4.f G pentaphyllum forma pubescens
(Gagnep.) W.J de Wilde & Duyfjes 4.a G pentaphyllum forma dasycarpum
Tại Việt Nam, theo các tác giả Phạm Hoàng Hộ [7] và Võ Văn Chi [12], chi
+ G pentaphyllum (Thunb.) Makino (cổ yếm, thư tràng 5 lá) phân bố nhiều ở các vùng rừng núi, lùm bụi có độ cao 1.000 - 2.000 m tại nhiều tỉnh Bắc, Trung và Nam [7].
+ G laxum (Wall.) Cogn (thư tràng, cổ yếm lá bóng) thường xuất hiện ở các rừng thưa tại Lào Cai, Hòa Bình, Ninh Bình, Quảng Trị [7], [12].
+ G pedatum Blume phân bố ở Ba Vì, Lạng Sơn, Sapa, Ninh Bình, Hòa Bình [12].
Nhóm nghiên cứu của Trường Đại học Dược Hà Nội đã bổ sung thêm 4 loài là G longipes C Y Wu, G. burmanicum King ex Chakrav., G compresum X X Chen & D R Liang [3] và G guangxiense X X Chen & D.
Bảng 1.4: Danh sách các loài Gynostemma ở Việt Nam [6]
STT Tên loài STT Tên loài
1 G pentaphyllum (Thunb.) Makino 3 G longipes C Y Wu
1a G pentaphyllum var pentaphyllum 4 G burmanicum King ex Chakrav.
2 G laxum (Wall.) Cogn 6 G guangxiense X X Chen & D H Qin
Ngoài ra, loài G pubescens mới được tìm thấy tại Lào Cai, Việt Nam năm 2019 bởi Suleman bid và cộng sự [164].
Về việc phân loại các loài trong chi này có sự khác nhau giữa các quan điểm Trong khi Chen Shu-kun & Charles Jeffrey (Bảng 1.2) [18] thường có xu hướng tách ra các loài riêng biệt, thì W J J O de Wilde & B E E. Duyfijes (Bảng 1.3) [19] lại có xu hướng sát nhập một số loài vào với nhau thành các dạng (forma) của cùng một loài.
Theo Chen Shu-kun & Charles Jeffrey (Bảng 1.2) [18], hai loài G pallidinerve Z Zhang và G. zhejiangense X J Xue được nhập thành tên đồng nghĩa của thứ G pentaphyllum var pentaphyllum Theo W J J.
O de Wilde & B E E Duyfjes tại khu vực Thái Lan và Malaysia có 4 loài thuộc chi Gynostemma Blume, nhưng do đặc thù sinh thái đã chia loài G pentaphyllum (Thunb.) Makino thành 7 dạng (forma) khác nhau, gồm
G pentaphyllum forma dasycarpum (C.Y Wu in C.Y Wu & S.K Chen) W.J de Wilde & Duyfjes, G. pentaphyllum forma fasciculare W.J de Wilde & Duyfjes,
G pentaphyllum forma grandiflorum W.J de Wilde & Duyfjes, G pentaphyllum forma knemandrum W.J de Wilde & Duyfjes, G pentaphyllum forma pentaphyllum,
G pentaphyllum forma pubescens (Gagnep.) W.J de Wilde & Duyfjes và
G pentaphyllum forma simplicifolium (Blume) W.J de Wilde & Duyfjes [14].
Các quan điểm đều thống nhất là loài G pentaphyllum (Thunb.) Makino phổ biến nhất và mọc rải rác ở Ấn Độ, Nepal, Bangladesh, Srilanca, Lào, Việt Nam, Myanmar, Hàn Quốc và Nhật Bản.
1.1.2 Thành phần hóa học của chi Gynostemma Blume
Thành phần hóa học của các loài thuộc chi Gynostemma đã được nghiên cứu nhiều trên thế giới, đa số các báo cáo về loài G pentaphyllum với thành phần chính là saponin; ngoài ra còn một số nhóm chất khác như flavonoid, polysaccharid, chlorophyll và chất béo.
1.1.2.1 Các hợp chất thuộc nhóm saponin
Các saponin trong G pentaphyllum (Phụ lục III) có khung dammaran Dammaran là nhóm saponin triterpenoid có cấu trúc 4 vòng (triterpenoid tetracyclic) chủ yếu xuất hiện ở các loài thuộc chi Panax L., họ Nhân sâm raliaceae Khoảng 200 saponin trong Giảo cổ lam (gypenosid) đã được phát hiện và tất cả đều thuộc khung dammaran (Hình 1.1) Phần đường của saponin trong G pentaphyllum thường là loại có 1 mạch đường hoặc 2 mạch đường rất hiếm khi 3 mạch đường Mỗi mạch đường thường có 1,2 hoặc 3 đường đơn, có thể gắn tại C-3(β), C-12(β), C-20(β) và C-21 của phần genin Có 4 loại đường chính trong các saponin của Giảo cổ lam đều thuộc dạng pyranose là β-ᴅ- glucopyranose, β-ᴅ-xylopyranose, α-ʟ-rhamnopyranose và α-ʟ-arabinopyranose.
Hình 1.1: Khung cấu trúc dammaran thuộc nhóm saponin triterpen tetracyclic
Saponin khung 3β,20β-dihydroxydammar-24-endihydroxydammar-dihydroxydammar-24-en24-dihydroxydammar-24-enen
Phần genin của các gypenosid thuộc nhóm này có thể bắt đầu từ khung dammarenediol-II có hai nhóm OH vị trí beta ở C-3 và C-20, nhóm CH3 ở vị trí 19 có thể bị oxy hóa thành CH2OH hoặc CHO, tạo thành các nhóm cấu trúc như sau:
Cấu trúc 3 β ,19 β ,20 β -trihydroxydammar-24-en: Các saponin nhóm này có khối lượng và kích thước phân tử tương tự như các protopanaxadiol (chuyển OH từ vị trí 12β sang 19) (Hình 1.2) [20], [21], [22], [23], [24],[25]:
Hình 1.2: Các saponin cấu trúc 3 β ,19 β ,20 β -trihydroxydammar-24-en
Cấu trúc 3 β ,20 β -dihydroxydammar-24-en-19-al: Nhóm OH ở C-19 có thể bị oxy hóa chuyển thành aldehyd (Hình 1.3) [20], [22], [24], [26].
Hình 1.3: Các saponin cấu trúc 3 β ,20 β -dihydroxydammar-24-en-19-al
Cấu trúc 2 α ,3 β ,20 β -trihydroxydammar-24-en: Ba saponin được phân lập từ loài
G pentaphyllum và 1 hợp chất được phân lập từ G yixingense (Hình 1.4) [20], [27], [28], [29].
Hình 1.4: Các saponin cấu trúc 2 α ,3 β ,20 β -trihydroxydammar-24-en
Saponin khung 3β,12β,20β-dihydroxydammar-24-entrihydroxydammar-dihydroxydammar-24-en24-dihydroxydammar-24-enen
Các saponin nhóm này có thêm nhóm OH ở C-12 trên khung cấu trúc dammarenediol-II và đặc trưng cho các saponin phân lập từ chi Panax L (protopanaxadiol) Một số saponin thuộc nhóm này cũng có các nhóm thế ở vị trí C-
Các saponin nhóm protopanaxadiol: Các saponin có cấu trúc protopanaxadiol (Hình 1.5) là các saponin đặc trưng của chi Panax L., phổ biến trong các loài sâm Triều Tiên (P ginseng C Mey.), sâm Mỹ (P. quinquefolius L.), sâm Nhật Bản (P japonica (T Nees) C Mey.) và sâm Việt Nam (P vietnamensis Ha &
Grushv.) Có nhiều saponin cấu trúc protopanaxadiol được phát hiện từ loài G pentaphyllum trong đó có 6 saponin cũng có mặt trong thành phần hóa học của sâm Triều Tiên là ginsenosid Rb1, Rb1-6″-malonyl, Rb3, Rd, Rd-6″- malonyl và F2 [20], [25], [27], [30], [31], [32], [33],
Hình 1.5: Các saponin cấu trúc protopanaxadiol
Các saponin nhóm 3 β ,12 β ,19 β ,20 β -tetrahydroxydammar-24-en: Phần genin của nhóm này có thể coi là dẫn chất của protopanaxadiol khi có thêm một nhóm OH tại vị trí C-19, vị trí C-20 có thể xuất hiện đồng phân 20R Các saponin có 1 hoặc 2 mạch đường (Hình 1.6) [21], [22], [25], [27].
Hình 1.6: Các saponin cấu trúc 3 β ,12 β ,19 β ,20 β -tetrahydroxydammar-24-en
TỔNG QUAN VỀ LOÀI GIẢO CỔ LAM QUẢ DẸT
Loài Gynostemma compressum X.X.Chen & D.R.Liang do Chen Xin Xiang (X.X.Chen) và Liang Ding Ren (D.R.Liang) xác định là loài mới, công bố trên tạp chí Guihaia Yanshan, Guilin, 11(1):13, năm 1991 Loài này được phát hiện ở vùng Long Châu tỉnh Quảng Tây Cây mọc ven ở vùng ẩm núi đá vôi, ở độ cao dưới 400 m G. compressum X.X.Chen et D.R.Liang cũng được người dân ở tỉnh Quảng Tây dùng làm thuốc với tên gọi là "Bian guo jiao gu lan" (Giảo cổ lam quả dẹt) [16].
Trong các tài liệu về thực vật học và cây thuốc Việt Nam trước năm 2004 [9], [10], [7], [8] chưa đề cập loài
G compressum X.X.Chen & D.R.Liang Mãi cho đến năm 2015, trong quá trình điều tra, thu thập các loài có tên chung là Giảo cổ lam (thuộc chi Gynostemma Blume, họ Cucurbitaceae), các tác giả thuộc Trường Đại học Dược Hà Nội mới phát hiện và bổ sung cho hệ thực vật Việt Nam loài G compressum X.X Chen et D.R.Liang Do đặc điểm hình thái quả của loài này dạng tam giác 3 ô, hơi dẹt theo chiều từ trên xuống nên đã gọi tên theo tiếng Việt là "Giảo cổ lam quả dẹt" [122].
1.2.1 Đặc điểm thực vật của Giảo cổ lam quả dẹt
Theo tài liệu [122] mô tả: Thân mảnh, có rãnh, nhẵn Tua cuốn dạng chỉ, đỉnh thường chẻ 2 Lá kép lông chim, 7 lá chét; cuống lá 5 - 12 cm, nhẵn; mặt dưới lá chét màu xanh lục xám, mặt trên lá chét màu xanh lục, hình elip hoặc elip - trứng, gốc hình nêm, mép khía tai bèo nhỏ, đỉnh có mũi nhọn hoặc nhọn, mặt dưới rải rác lông dọc theo gân chính và gân bên, mặt trên rải rác lông cứng, lá chét giữa 3,6 - 6,5 x 2 - 2,25 cm, lá chét bên nhỏ hơn, phía ngoài không đối xứng; cuống lá chét 3 - 5 mm Cây đơn tính khác gốc Hoa đực trong cụm hoa dạng chuỳ, mọc ở nách lá, 2 - 5 cm; cuống cụm hoa dạng chỉ, 8 - 16 mm, nhẵn; lá bắc hình giùi, ca 1,5 mm; cuống hoa 2 - 5 mm; hoa màu xanh lục nhạt, đường kính ca 1,5mm; thuỳ đài hình tam giác, ca 0,8 x 0,5 mm; chỉ nhị rất ngắn, hợp sinh; bao phấn hình trứng Hoa cái đơn độc hoặc từng đôi, ở nách lá, cuống cụm hoa dạng chỉ, 5 - 9 mm, nhẵn; cuống hoa 5 - 10 mm; thuỳ đài ca 1,3 x 0,4 mm; thuỳ tràng hình tuyến - mác 2 - 3 x ca 0,4 mm, đỉnh có đuôi - mũi nhọn; bầu 2 ô, mỗi ô 1 noãn; vòi nhuỵ 2, rời; núm nhuỵ chẻ 2 Quả dẹt, hình tam giác ngược, 5 - 8 x 5 - 7 mm, nhẵn, đỉnh có bao hoa và vòi nhuỵ tồn tại; cuống quả dạng chỉ, 1,3 - 2,5 cm Hạt nâu nhạt, hình tam giác ngược, ca 3 mm, đường kính đỉnh ca 3,5 mm, cả hai mặt đều có nốt, mép khía tai bèo hoặc rãnh Hoa tháng 3 - 4, quả tháng 3 - 5 Có khi gặp đến tháng 9 - 10.
1.2.2 Sinh thái và phân bố của Giảo cổ lam quả dẹt
Nơi sống và sinh thái: Rừng, chân núi đá vôi ẩm; 350 – 1000 m [122].
Phân bố: Cao Bằng (Trà Lĩnh, Thông Nông, Bảo Lạc, Bảo Lâm) Có thể mở rộng vùng tìm kiếm loài này sang khu vực tỉnh Hà Giang, Lạng Sơn [122].
1.2.3 Thành phần hóa học của Giảo cổ lam quả dẹt
Năm 1993, Ding S L và Zhu Z Y đã phân lập được 4 saponin mới đặt tên là gycomosid I-IV từ phần trên mặt đất của G compressum X.X Chen et D.R Liang Cấu trúc của các chất được xác định là 1β,3β,12β,20(S),26- pentahydroxydammar-24(25)-en- 20(S)-O-β-ᴅ-glucopyranosyl-(1→6)-β-ᴅ-glucopyranosid (gycomosid I); 1β,3β,12β,20(S)- tetrahydroxydammar-24(25)-en-3-O-β-ᴅ-glucopyranosyl-20(S)-O-β-ᴅ-glucopyranosyl- (1→6)-β-ᴅ-glucopyranosid (gycomosid II); 1β,3β,12β,20(S),26-pentahydroxydammar- 24(25)-en-20(S)-O-β-ᴅ- glucopyranosid (gycomosid III) và 1β,3β,12β,20(S),26- pentahydroxydammar-24(25)-en-3-O-β-ᴅ-glucopyranosyl-20(S)-O-β-ᴅ-glucopyranosyl- (1→6)-β-ᴅ- glucopyranosid (gycomosid IV) [123].
Hình 1.27: Các gypenosid phân lập từ loài G compressum
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU
Mẫu nghiên cứu là phần trên mặt đất của cây Giảo cổ lam quả dẹt, các cao chiết và các hợp chất tinh khiết phân lập từ dược liệu này Phần trên mặt đất của cây Giảo cổ lam quả dẹt được thu hái tại Bắc Sơn, Lạng Sơn vào tháng 3, 4 năm 2018 và tháng 9, 10 năm 2019 Mẫu lưu tại Khoa Hóa Thực vật – Viện Dược liệu, mã số tiêu bản: NIMM0019225 và Phòng Tiêu bản cây thuốc – Trường Đại học Dược Hà Nội, mã số tiêu bản: HNIP/18590/19 và HNIP/18591/19 Mẫu nghiên cứu được chuẩn bị phù hợp với từng nội dung nghiên cứu như sau:
Mẫu nghiên cứu thực vật: mẫu tươi, mang hoa và quả.
Mẫu nghiên cứu thành phần hóa học: Phần trên mặt đất của cây Giảo cổ lam quả dẹt sau khi thu hái được cắt thành đoạn ngắn, phơi trong râm và sấy ở 50 o C tới khô, bảo quản trong túi PE và bao bì kín.
Mẫu nghiên cứu tác dụng sinh học: Cao chiết ethanol, nước, các cao chiết phân đoạn và một số hợp chất phân lập từ Giảo cổ lam quả dẹt.
Chuột nhắt trắng chủng Swiss albino, cả 2 giống, khỏe mạnh, trọng lượng 22,0 ± 3,0 g đạt tiêu chuẩn thí nghiệm do Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương cung cấp Chuột được cho ăn thức ăn tiêu chuẩn của Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương Chuột được nuôi trong phòng chăn nuôi trong điều kiện nhiệt độ duy trì 25 ± 1 o C, độ ẩm, không khí và ánh sáng thích hợp Chuột được uống nước tự do theo nhu cầu và được nuôi trong điều kiện phòng 7 ngày trước khi tiến hành nghiên cứu.
2.1.3 Thuốc thử, hóa chất, dung môi và tế bào
Hóa chất dùng trong tẩy nhuộm vi phẫu :
Javen (Công ty Cổ phần Bột giặt & Hóa chất Đức Giang, Hà Nội, Việt Nam Sản xuất theo tiểu chuẩn TCCS 96: 2009/HCĐG).
Acid acetic (Công ty Xilong Scientific, Guangdong, Trung Quốc Sản xuất theo tiêu chuẩn ISO 9001 – ISO
Xanh methylen (Công ty Shanghai Zhanyun Chemical, Shanghai, Trung Quốc Sản xuất theo tiểu chuẩn ISO 9001 – 2000).
Đỏ son phèn (Công ty Shanghai Zhanyun Chemical, Shanghai, Trung Quốc Sản xuất theo tiểu chuẩn ISO
Hóa chất, dung môi và thuốc thử dùng trong nghiên cứu hóa học
Định tính: Ethanol (EtOH), nước cất, chì acetat 30%, chì acetat 10%, thuốc thử Ninhydrin 3%, thuốc thử
Fehling và Fehling B, thuốc thử Lugol, thuốc thử natri nitroprussinat 0,5%, Na2CO3 khan, tinh thể Na2CO3, bột magie, anhydrid acetic, dung dịch gelatin 1%, chloroform, HCl đặc, amoniac đặc, dung dịch FeCl3 5%, dung dịch NaOH 5% (Trung Quốc) đạt tiêu chuẩn Dược điển Việt Nam V.
Chiết xuất và phân lập: Các dung môi công nghiệp được cất lại trước khi dùng như: EtOH, n-hexan, ethyl acetat (EtOAc), methanol (MeOH), dichloromethan (DCM), aceton và n-butanol (BuOH) Dung dịch
Dung môi đo phổ: CD3OD.
Đường chuẩn: ᴅ-glucose, ᴅ-xylose và L-rhamnose được cung cấp bởi công ty Sigma-Aldrich, St Louis,
Thuốc thử, hóa chất và tế bào dùng trong nghiên cứu tác dụng sinh học
Đánh giá tác dụng ức chế sự tích tụ lipid gây ra bởi acid oleic trên tế bào HepG2
Môi trường RPMI 1640, huyết thanh bào thai bò (FBS, S0115, Biochrom, Đức), penicillin/streptomycin, trypsin (Invitrogen, Mỹ), SRB (Sigma, Mỹ), TCA, fenofibrat, acid oleic, BSA (bovine serum albumin), Oil Red O, paraformaldehyd 4%, isopropanol (Sigma, Mỹ).
Tế bào: Dòng tế bào gây ung thư gan HepG2. Đánh giá tác dụng hoạt hóa AMPK, ACC, ức chế FAS và SREBP–1c trên tế bào 3T3-dihydroxydammar-24-en L1
Môi trường DMEM, trypsin (Gibco BRL, Grand Island, NY, Mỹ), RPMI (1640, Invitrogen, Mỹ).
Huyết thanh bào thai bò (FBS, S0115, Biochrom, Đức).
Kháng thể p-AMPK, p-ACC, ACC, AMPK kháng thể thứ cấp chuột, kháng thể thứ cấp thỏ và β-actin (Cell Signaling Technology, Beverly, MA, Mỹ).
Chất đối chứng dương IC R (Cayman Chemical, Ann Arbor, MI, Mỹ).
Isopropanol, fenofibrat, acid oleic, BSA (Bovine Serum Albumin), paraformaldehyd (Sigma, Mỹ).
Tế bào mô mỡ 3T3-L1 được đặt mua từ trung tâm lưu trữ tế bào ở Mỹ (ATCC, Rockville, MD, Mỹ).
Các nguyên vật liệu và hoá chất khác được cung cấp bởi công ty Sigma (Mỹ).
Đánh giá tác dụng hạ glucose máu trên mô hình đái tháo đường typ 2 thực nghiệm
Streptozocin (STZ) lọ 1 g (Sigma-Aldrich, Singapore).
Diamicron (gliclazid) viên 30 mg (Servier, Pháp).
Các hoá chất xét nghiệm và làm tiêu bản mô bệnh học.
2.1.4 Máy móc, thiết bị và dụng cụ nghiên cứu
Dùng trong nghiên cứu thực vật
Bộ rây, tủ sấy, kính hiển vi, kính lúp soi nổi, máy ảnh kỹ thuật số.
Dùng trong nghiên cứu hóa học
Máy đo góc quay cực [α]D: JASCO P-2000 Polarimeter, cuvet có bề dày 1 cm và thể tích 1 ml (Tokyo, Nhật Bản).
Máy đo phổ khối lượng: Q Exactive Orbitrap Mass Spectrometers (Thermo Fisher Scientific, Waltham,
MA, Mỹ) và hệ thống sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép nối 2 lần khối phổ-LC/MS/MS và detector D D (Shimadzu, Nhật Bản).
Máy đo phổ cộng hưởng hạt nhân (NMR): Bruker M500 FT-NMR Spectrometer (Billerica, Massachusetts, Hoa Kỳ).
Máy siêu âm Power sonic 405 (Powersonic, Hàn Quốc).
Tủ sấy UFB 500 (Memmert, Đức), FD115 (Binder, Đức).
Máy cất quay Rotavapor R-220, Rotavapor R-200 (Buchi, Swichzerland, Thụy Sỹ).
Cân kĩ thuật Precisa BJ 610C, cân phân tích Precisa 262SM -FR (Precisa, Thụy Sỹ).
Đèn tử ngoại hai bước sóng 254 nm và 366 nm (Camag, Thụy Sỹ).
Silica gel pha thường (0,040 - 0,063 mm, Merck, Đức) và pha đảo RP-18 (30 - 50 μM) thấp hơn 10 lần so với chứng dương silymarin (ICm, FuJisilisa Chemical Ltd).
Bản mỏng tráng sẵn DC-Alufolien 60G F254 (silica gel, 0,25 mm, Merck, Đức) và bản mỏng pha đảo RP-18
Các dụng cụ thủy tinh dùng trong phòng thí nghiệm như: Cột sắc ký, bình gạn, bình nón, phễu lọc, cốc có mỏ, ống nghiệm, ống đong, pipet, kim tiêm…
Dùng trong nghiên cứu độc tính và thử tác dụng sinh học
Cân phân tích Precisa 125 SCS (d = 0,1 mg, Thụy Sĩ) dùng để cân mẫu.
Cân động vật Sartorius dùng để cân chuột.
Chuồng nhốt chuột, bình uống nước, kim đầu tù, bơm tiêm, pank, kéo và các thiết bị cần thiết khác.
Tủ nuôi cấy tế bào Shellab (Mỹ).
Box thao tác sinh học Bio-II (Tesla, Mỹ).
Kính hiển vi soi ngược (Carl zeiss, Đức).
Máy ly tâm ngang (Bekman Counter, Mỹ).
Đĩa nuụi cấy tế bào 100 mm, đĩa 96 giếng, 24 giếng, falcon 15 ml và 50 ml, màng lọc 0,2 àm, ống 1,5 ml và đầu typ các cỡ.
Buồng đếm số lượng tế bào Thoma (Đức).
Pipet và đầu côn các kích cỡ.
Máy đọc ELISA (BioTek, Đức).
Máy đo quang microplate reader (Varioskan, Thermo Electron Co., Mỹ).
Máy chụp Western blot (LAS 4000, Nhật Bản).
Máy thử glucose máu On Call EZII (ACON Biotech, Mỹ).
Kit định lượng glucose On Call Plus (ACON Biotech, Mỹ).
Bộ kit đo triglycerid, HDL-C, cholesterol huyết thanh (Erba, Đức)
Máy sinh hóa bán tự động (Erba, Đức).
ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU
2.2.1 Địa điểm nghiên cứu thực vật
Phòng Tiêu bản, Bộ môn Thực vật - Trường Đại học Dược Hà Nội.
Trung tâm Tài nguyên dược liệu - Viện Dược liệu.
2.2.2 Địa điểm nghiên cứu thành phần hóa học
Khoa Hóa Thực vật - Viện Dược liệu.
Trung tâm Phổ, Viện Hóa học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
2.2.3 Địa điểm nghiên cứu độc tính và tác dụng sinh học
Khoa Dược lý Sinh hóa - Viện Dược liệu.
Bộ môn Dược lý - Đại học Y Hà Nội.
Trung tâm Nghiên cứu và phát hiện sớm ung thư.
Khoa: Khoa học Y khoa Thực nghiệm, Khoa Y, Đại học Lund, Thụy Điển.
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3.1 Phương pháp nghiên cứu thực vật
Phương pháp nghiên cứu đặc điểm hình thái : Quan sát và mô tả đặc điểm hình thái thực vật tại thực địa và chụp ảnh theo phương pháp mô tả hình thái thực vật [124].
Phương pháp giám định tên khoa học các mẫu nghiên cứu: Giám định tên khoa học mẫu nghiên cứu bằng phương pháp so sánh hình thái mẫu nghiên cứu với các mẫu tiêu bản trong các phòng tiêu bản online (Herbarium of National Taiwan University (T I); Herbier Muséum Paris – Muséum National d’Histoire Naturelle (P); Royal Botanic Gardens, Kew (K); New York Botanical Gardens (NY); Botanischer Garten und Botanisches Museum Berlin-Dahlem, Freien Universitọt Berlin (B); Royal Botanic Garden Edinburgh Herbarium (RBGE) và một số tài liệu chuyên khảo [13], [125].
Phương pháp nghiên cứu đặc điểm vi học : Làm vi phẫu các bộ phận của cây theo phương pháp cắt ngang, nhuộm kép Soi bột dược liệu, quan sát và chụp ảnh dưới kính hiển vi [124].
2.3.2 Phương pháp nghiên cứu thành phần hóa học
2.3.2.1 Phương pháp định tính các nhóm chất hữu cơ Định tính các nhóm chất hóa học chính trong các mẫu nghiên cứu bằng phản ứng hóa học theo phương pháp ghi trong tài liệu [126].
2.3.2.2 Phương pháp chiết xuất, phân lập và xác định cấu trúc
Phương pháp chiết xuất: Dược liệu được chiết nóng bằng EtOH 80% ở 70°C với tỉ lệ dược liệu/dung môi
1/10 (kg/l) Cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm được cao tổng (GCT) Chiết phân đoạn bằng các dung môi có độ phân cực tăng dần: Phân tán cao tổng trong nước nóng và chiết lỏng - lỏng lần lượt với các dung môi có độ phân cực tăng dần (n-dihydroxydammar-24-enhexan, EtO c và BuOH) với tỷ lệ 1:1 Cất thu hồi dung môi của mỗi phân đoạn chiết dưới áp suất giảm thu được các cao tương ứng với từng phân đoạn chiết (n-hexan: GCH, EtOAc: GCE, BuOH: GCB và cắn nước:
Phương pháp phân lập các hợp chất: Phân lập các hợp chất bằng sắc ký cột với chất hấp phụ là silica gel pha thường và pha đảo Theo dõi các phân đoạn bằng sắc ký lớp mỏng pha thường và pha đảo Phát hiện chất bằng đèn tử ngoại hoặc dùng thuốc thử (dung dịch H2SO4 10% / EtOH) , sấy khô rồi hơ nóng đến khi hiện màu.
Phương pháp xác định cấu trúc các hợp chất: Xác định cấu trúc của các hợp chất phân lập được dựa trên các tính chất lý hóa và các dữ liệu phổ cộng hưởng từ hạt nhân, phổ khối và kết hợp so sánh với tài liệu tham khảo.
Phương pháp thủy phân và xác định cấu hình tuyệt đối của đường: Các hợp chất saponin mới được thủy phân cắt đường, sau đó xác định sự có mặt của các đường trong các sản phẩm thủy phân bằng TLC và góc quay cực, kết hợp so sánh với các đường chuẩn.
Cách tiến hành: Các hợp chất saponin mới (4,0 - 6,0 mg) được hòa tan trong 1 ml dung dịch HCl 1.0 N (H2O/dioxan, 1:1, v/v) sau đó đun nóng ở 80°C trong 8 h Hỗn hợp phản ứng được làm nguội ở nhiệt độ phòng, loại bỏ dung môi bằng N2 và chiết lỏng - lỏng với CH2Cl2 và H2O (tỉ lệ 1:1, 3 lần) Gộp các dịch chiết nước và cất loại bớt dung môi dưới áp suất giảm thu được (các) monosaccharid Monosaccharid trong sản phẩm thủy phân trước tiên được xác định bằng phân tích TLC cùng với các đường chuẩn (hệ dung môi CH2Cl2-MeOH-H2O, 3/2/0,3, v/v/v).Tiếp theo, phân tách các monosaccharid bằng TLC với hệ dung môi triển khai sắc ký là CH2Cl2-MeOH-H2O(3/2/0,3, v/v/v), một phần bản mỏng được tách rời, phun dung dịch thuốc thử H2SO4 10% trong 95% EtOH và hơ bản mỏng ở 100°C trong 2 phút để phát hiện các vết đường Cạo riêng từng vết đường trên bản mỏng, lọc và rửa sản phẩm thu được bằng hỗn hợp dung môi MeOH - H2O (1:1, v/v) Sau khi cất quay thu hồi dung môi, hòa tan sản phẩm trong nước và đo góc quay cực, so sánh giá trị và chiều hướng của góc quay cực nhận được với mẫu đường chuẩn tương ứng được đo trong cùng điều kiện.
Góc quay cực riêng α 20 được tính theo công thức:
α 20 = a/(l x c) x 1000 Trong đó: a là góc quay cực đo được. l là chiều dài ống đo của phân cực kế (tính bằng dm). c là nồng độ của chất thử trong dung dịch (tính bằng g/l).
2.3.3 Phương pháp nghiên cứu độc tính cấp
Chuẩn bị mẫu nghiên cứu độc tính cấp
Mẫu nghiên cứu sử dụng trong nghiên cứu độc tính cấp là cao chiết nước và cao chiết cồn của phần trên mặt đất Giảo cổ lam quả dẹt được điều chế theo phương pháp sau:
Cao nước: Dược liệu khô (250 g) được sắc với nước 3 lần rồi đem cô thành dạng cao đặc (tỷ lệ dược liệu/ nước 5:1) (50 g cao, hiệu suất 20%).
Cao chiết ethanol (GCT1): Phần trên mặt đất Giảo cổ lam quả dẹt (700 g, độ ẩm 10,15%) được chiết nóng với EtOH 80% 3 lần x 3 h ở 70°C với tỉ lệ dược liệu/dung môi là 1:6 kg/l Lọc loại bã dược liệu và gộp các dịch chiết, sau đó cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm thu được 184,49 g cao EtOH 80% (độ ẩm 11%, hiệu suất 28,56%).
Phương pháp nghiên cứu độc tính cấp
Nghiên cứu độc tính cấp của các cao chiết từ cây Giảo cổ lam quả dẹt theo hướng dẫn trong tài liệu "Phương pháp xác định độc tính của thuốc" [127] LD50 được tính theo phương pháp Behrens-Karber Nguyên tắc tiến hành như sau:
- Chuột mua về được nuôi 3 ngày trước khi thí nghiệm để chuột thích nghi điều kiện thí nghiệm, cho ăn uống thoải mái Trước khi thí nghiệm, cho chuột nhịn đói qua đêm, nước uống theo nhu cầu của chuột, Chuột được chia thành các lô thí nghiệm (mỗi lô 10 chuột), mỗi lô chuột được uống các mức liều khác nhau của mẫu thử.
- Đường dùng thuốc: đường uống, cho chuột uống bằng cách dùng kim tiêm có kim đầu tù để đưa mẫu thử một cách nhẹ nhàng vào dạ dày chuột.
- Chuẩn bị mẫu thử: mẫu được cân một lượng chính xác rồi nghiền mịn, thêm một lượng chính xác nước cất để đạt được nồng độ thích hợp cho chuột uống.
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VỀ THỰC VẬT
3.1.1 Đặc điểm hình thái thực vật loài Giảo cổ lam quả dẹt ( Gynostemma compressum X.X.Chen & D R. Liang)
Dây leo Tua cuốn mọc ở nách lá, hình chỉ mảnh, dài khoảng 3 - 5 cm, thường chia 2 nhánh ở đầu, mỗi nhánh dài khoảng 5 - 7 mm, có trường hợp không chia hoặc chia ba nhánh Thân nhẵn, trừ có lông thưa ở mỗi đốt, mảnh, có rãnh, 5 cạnh, mọc bò lan trên mặt đất, rễ thường mọc từ đốt ra Lá mọc so le, mỏng, thường 7 (đôi khi có 5) lá chét; cuống lá dài khoảng 5 cm, nhẵn, có rãnh ở mặt trên; phiến lá chét hình thoi hoặc trứng ngược, mép khía tai bèo, đỉnh có mũi nhọn ngắn, mặt dưới có lông ở gân, mặt trên lông rải rác ở phiến lá; gân bên 5 - 6 đôi, nổi rõ ở mặt dưới, lõm ở mặt trên; lá chét giữa kích thước 3 - 4,7 cm x 1,3 - 2,2 cm, gốc lá nhọn, các lá chét bên nhỏ hơn lá chét giữa, gốc lệch; cuống lá chét dài khoảng 5 mm (Hình 3.1) (bổ sung hình ảnh lá bắc)
Hình 3.1: Đặc điểm cơ quan sinh dưỡng loài Giảo cổ lam quả dẹt a Cây trong tự nhiên; b Tua cuốn; c Lá; d Mặt dưới lá; e Mặt trên lá; f Mép lá
Cây đơn tính Hoa đực mọc thành chùm kép ở nách lá; trục cụm hoa nhẵn, có sọc, dài khoảng 2 - 5 cm, chia khoảng 3 - 6 nhánh; hoa màu trắng hơi xanh, mẫu 5, đôi khi mẫu 6, có đường kính khoảng 4,5 - 5 mm; lá bắc hình dải, dài khoảng 1,5 mm; cuống hoa dạng sợi, dài khoảng 5 mm; đài thuôn, đỉnh nhọn, khoảng 0,6 x 0,5 mm; tràng hình tam giác hẹp, có mũi nhọn dài, khoảng 2 x 0,8 mm, mép xẻ răng cưa nhỏ; chỉ nhị rất ngắn, hàn liền, cao khoảng 0,3 mm; bao phấn 5, hình trứng (Hình 3.2) (Bổ sung thêm ảnh bao phấn)
Hình 3.2: Đặc điểm cơ quan sinh sản đực của loài Giảo cổ lam quả dẹt a Cây đực; b Thân mang cụm hoa; c Cụm hoa đực; d Hoa đực (nhìn mặt sau); e Hoa đực (nhìn mặt trước); f Hoa đực (cắt dọc).
Hoa cái mọc thành cụm từ 1 - 6 hoa ở nách lá, thường mẫu 5, đôi khi mẫu 4 hoặc 6; trục cụm hoa nhẵn, từ rất ngắn đến 2,5 cm; lá bắc hình dải, dài khoảng 1,2 – 1,5 mm; đài hình thuôn, đỉnh nhọn, khoảng 0,7 x 0,6 mm; tràng hình tam giác hẹp, có mũi nhọn dài, khoảng 2 x 0,6 – 0,7 mm, mép xẻ răng cưa nhỏ; bầu thường 2 ô, ít khi 3 ô, đường kính khoảng 1,2 – 1,4 mm, mỗi ô chứa một noãn; số vòi nhụy bằng số ô (thường 2, ít khi 3), có rãnh ở mặt trong, dài khoảng 0,6 mm; núm nhụy xẻ 3 ở đỉnh, dài khoảng 0,4 mm Quả màu xanh, dẹt, hình tam giác ngược, kích thước khoảng 5 x 7 mm, vỏ mỏng, dày khoảng 0,25 – 0,35 mm, khi chín tự vỡ để giải phóng hạt ra ngoài; đỉnh mang bao hoa và núm nhụy tồn tại; cuống quả dạng sợi, dài 0,8 – 1,8 cm Hạt 2, hình tam giác ngược, kích thước khoảng 3 x 4 mm, dày khoảng 2 mm, bề mặt có nốt sần (Hình 3.3) Hoa tháng 3-4, quả tháng 4-5 Có khi gặp đến tháng 9-10.
Hình 3.3: Đặc điểm cơ quan sinh sản cái của loài Giảo cổ lam quả dẹt a Cây cái; b Thân mang cụm hoa (đơn độc); c Cụm hoa cái; d Hoa cái; e Hoa cái (nhìn mặt trước); f Hoa cái (nhìn mặt sau); g Cụm quả; h Quả; i Quả cắt ngang (trên) và dọc
3.1.2 Kết quả giám định tên khoa học của mẫu nghiên cứu
Mẫu nghiên cứu được giám định tên khoa học là Gynostemma compressum X X Chen & D R Liang, họ Bí (Cucurbitaceae) Tên thường gọi là Giảo cổ lam quả dẹt Tiêu bản thực vật khô Giảo cổ lam quả dẹt được lưu tạiPhòng Tiêu bản – Khoa Tài nguyên dược liệu – Viện Dược liệu với mã số tiêu bản NIMM0019225 và Phòng Tiêu bản cây thuốc – Trường Đại học Dược Hà Nội với mã số tiêu bản HNIP/18590/19 và HNIP/18591/19.
3.1.3 Kết quả nghiên cứu đặc điểm vi học của mẫu nghiên cứu
3.1.3.1 Đặc điểm bột dược liệu
Bột lá và thân Giảo cổ lam quả dẹt có màu xanh thẫm (bột lá), có thể ngả sang vàng nâu (bột thân), mùi thơm đặc trưng, vị hơi ngọt Soi dưới kính hiển vi quan sát thấy các đặc điểm: tế bào cứng (1, 2) riêng lẻ hoặc tập trung thành mảng, kớch thước khoảng 20 x 30 àm; lụng che chở đa bào (3, 4); cỏc hạt tinh bột kớch thước hỡnh hơi trũn hoặc hỡnh trứng, đường kớnh khoảng 15 - 25 àm, được chứa trong cỏc tế bào mụ mềm (5) hoặc đứng riờng lẻ (6, 7), mảnh mang màu (8), mảnh mạch xoắn (9), mạch điểm (10) và đôi khi quan sát thấy sợi (12) rải rác trong tiêu bản bột dược liệu Có thể (hiếm) quan sát được mảnh biểu bì mang lỗ khí kiểu hỗn bào (11) (Hình 3.4).
Hình 3.4: Đặc điểm bột dược liệu
1, 2 Tế bào cứng; 3, 4 Lông che chở đa bào; 5 Mảng mô mềm chứa tinh bột; 6, 7 Hạt tinh bột; 8 Mảnh mang màu; 9 Mảnh mạch xoắn; 10 Mạnh điểm; 11 Biểu bì mang lỗ khí; 12 Sợi.
3.1.3.2 Đặc điểm vi phẫu Đặc điểm vi phẫu cuống lá
Cuống lá có thiết diện hình 6 cạnh, đối xứng hai bên, hơi lõm ở mặt trên, từ dưới lên trên gồm các phần sau: biểu bì dưới (1) là một hàng tế bào hình chữ nhật, phía ngoài phủ cutin màu xanh; mô dày dưới (2) gồm 2 - 3 hàng tế bào hình trứng, kích thước không đều nhau, thành dày lên ở góc, bắt màu đỏ; mô mềm (3) gồm những tế bào hình đa giác, thành mỏng, kích thước không đều nhau, bắt màu đỏ; rải rác trong lớp mô mềm là 5 bó libe – gỗ kích thước không đều nhau xếp thành vòng cung; phần libe (4) tạo thành vòng không liên tục bao quanh gỗ (tập trung 2 phía đầu gỗ); phần gỗ (5) gồm các mạch gỗ tròn nối tiếp nhau thành từng dãy, mỗi dãy cách nhau bởi 1 – 2 hàng tế bào mô mềm gỗ; mô dày trên (6) gồm 7 – 8 hàng tế bào giống mô dày dưới; biểu bì trên (7) giống biểu bì dưới (Hình 3.5).
Hình 3.5: Vi phẫu cuống lá mẫu nghiên cứu
1 Biểu bì dưới; 2 Mô dày dưới; 3 Mô mềm; 4 Libe; 5 Gỗ; 6 Mô dày trên; 7 Biểu bì trên Đặc điểm vi phẫu lá
Phần gân lá : tiết diện bất đối xứng, phần gân trên nhú cao, nhọn, bề ngang khoảng 1/4 bề ngang của gân dưới Cấu tạo vi phẫu gân lá từ dưới lên trên gồm những phần sau: biểu bì dưới (5) gồm một hàng tế bào xếp sít nhau, bên ngoài phủ một lớp cutin mỏng, có thể quan sát được lông che chở đa bào (rất ít, thường quan sát rải rác ở bột lá) và lỗ khí; mô dày dưới (1) gồm 2 – 3 hàng tế bào hình trứng, kích thước không đều nhau, thành dày lên ở góc, bắt màu đỏ; mô mềm (2) là những tế bào hình tròn hoặc đa giác, thành mỏng, kích thước không đều nhau, bắt màu đỏ; trong mô mềm, bó (hoặc các bó) libe – gỗ tập trung giữa gân; phần libe (3) gồm nhiều tế bảo nhỏ, bắt màu đỏ đậm, tạo thành vòng không liên tục bao quanh gỗ; phần gỗ (4) gồm các mạch gỗ tròn nối tiếp nhau thành từng dãy, mỗi dãy cách nhau bởi 1 – 2 hàng tế bào mô mềm gỗ; mô dày trên (8) gồm 5 – 6 hàng tế bào giống mô dày dưới; biểu bì trên (9) là một hàng tế bào tương tự biểu bì dưới nhưng không mang lỗ khí (Hình 3.6).
Phần phiến lá : phiến lá nằm ngang, hơi hướng lên trên, bề dày phiến lá chỉ khoảng 1/3 bề dày của gân dưới.
Cấu tạo phiến lá từ dưới lên trên gồm những phần sau: biểu bì dưới gồm một hàng tế bào xếp sít nhau, phía ngoài phủ cutin tương tự gân lá, mang lỗ khí (10); mô mềm (hay mô khuyết) (6) là những tế bào hình tròn hoặc đa giác, thành mỏng, kích thước không đều nhau, bắt màu đỏ; mô giậu (7) gồm một hàng tế bào hình chữ nhật (hoặc vuông), xếp sít nhau và vuông góc với bề mặt lá, bắt màu đỏ; biểu bì trên giống biểu bì tương tự gân lá (Hình 3.6).
Hình 3.6: Vi phẫu lá mẫu nghiên cứu
1 Mô dày dưới; 2 Mô mềm; 3 Libe; 4 Gỗ; 5 Biểu bì dưới; 6 Mô khuyết; 7 Mô giậu; 8 Mô dày trên; 9 Biểu bì trên;
10 Lỗ khí Đặc điểm vi phẫu thân
Mặt cắt ngang thân cây có 5 cạnh, lồi lên ở các góc, một cạnh (trên cùng) hơi lõm Từ ngoài vào trong gồm các phần sau: ngoài cùng là một hàng tế bào biểu bì (1), phía ngoài phủ cutin; ngay sát lớp biểu bì ở 5 góc thân là lớp mô dày (10) gồm 3 – 4 hàng tế bào hình trứng, kích thước không đều nhau, thành dày lên ở góc, bắt màu đỏ; bên trong là lớp mô mềm vỏ (2) gồm 2 – 3 hàng tế bào (nằm ngay sát biểu bì) hoặc 1 – 2 hàng tế bào (nằm trong mô dày), hình đa giác, thành mỏng, sắp xếp lộn xộn, bắt màu đỏ; tiếp theo là cung mô cứng (3) gồm 2 – 5 hàng tế bào, hình đa giác, kích thước không đều nhau, thành dày hóa gỗ, bao quanh bó libe-gỗ bên trong; trong cung mô cứng có đám mô mềm
(7) gồm 1 – 2 hàng tế bào, thành mỏng, bắt màu đỏ; kế tiếp là các bó libe – gỗ kích thước không đều nhau, gồm: libe cấp 1 (4) bên ngoài bị ép dẹp thành 1 dải mỏng, bắt màu đỏ đậm (không rõ hình dạng tế bào); libe cấp 2 (5) là các tế bào thành mỏng, kích thước nhỏ, hình đa giác, xếp thành hàng từ 6-10 tế bào một hàng, bắt màu đỏ; gỗ cấp 2 (6) ở trong bắt màu xanh, có sợi là các tế bào màu xanh bao quanh (6), có mô mềm gỗ màu hồng bên trong Xen kẽ giữa các bó libe – gỗ là những đoạn tia ruột (8) Trong cùng là tế bào mô mềm ruột (9) thành mỏng, hình đa giác, bắt màu đỏ, kích thước lớn hơn so với mô mềm vỏ và đám mô mềm trong cung mô cứng (Hình 3.7).
Hình 3.7: Vi phẫu thân lá mẫu nghiên cứu
1 Biểu bì; 2 Mô mềm vỏ; 3 Mô cứng; 4 Libe cấp 1; 5 Libe cấp 2; 6 Gỗ cấp 2; 7 Đám mô mềm trong vòng mô cứng; 8 Tia ruột; 9 Mô mềm ruột; 10 Mô dày góc
3.2 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VỀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC
3.2.1 Kết quả định tính các nhóm chất hữu cơ
Kết quả định tính các nhóm chất hữu cơ trong Giảo cổ lam quả dẹt được trình bày tóm tắt ở Bảng 3.1:
Bảng 3.1: Kết quả định tính các nhóm chất hữu cơ trong dược liệu
STT Nhóm chất Phản ứng Kết quả Nhận xét
Phản ứng với hơi NH3 +
Phản ứng tạo bọt phân biệt 2 loại saponin +++
Phản ứng với thuốc thử Mayer -
Phản ứng với thuốc thử Dragendorff - Phản ứng với thuốc thử Bouchardat -
Phản ứng mở đóng vòng lacton -
Phản ứng với chì acetat 10% ++
7 Anthranoid Phản ứng Borntraeger - Không có
8 Chất béo Vết mờ trên giấy lọc - Không có
STT Nhóm chất Phản ứng Kết quả Nhận xét
9 Carotenoid Phản ứng với H2SO4 đậm đặc +++ Có
10 Sterol Phản ứng Liebermann-Burchard ++ Có
11 Đường khử Phản ứng với thuốc thử Fehling +++ Có
12 Acid hữu cơ Phản ứng với tinh thể Na2CO3 - Không có
13 Acid amin Phản ứng với thuốc thử Ninhydrin +++ Có
14 Polysaccharid Phản ứng với thuốc thử Lugol ++ Có
Ghi chú: (-): âm tính, (+): dương tính, (++): dương tính rõ, (+++): dương tính rất rõ
Kết quả định tính bằng phản ứng hóa học cho thấy, trong mẫu Giảo cổ lam quả dẹt có chứa các nhóm chất flavonoid, saponin, caroten, sterol, đường khử, acid amin và polysaccharid.
Kết quả định tính saponin và flavonoid trong các cao chiết
Các cao chiết phân đoạn (n-hexan, EtO c, BuOH và H2O) của cao tổng EtOH 80% của Giảo cổ lam quả dẹt được định tính saponin và flavonoid Kết quả chỉ ra ở Bảng 3.2:
Bảng 3.2: Kết quả định tính saponin và flavonoid trong các cao chiết từ GCL quả dẹt
Saponin Phản ứng tạo bọt - + +++ +
Ghi chú: (-): âm tính; (+): dương tính; (++): dương tính rõ, (+++): dương tính rất rõ
Chen & D R Liang)
4.2 Về thành phần hóa học
4.2.1 Về kết quả định tính các nhóm chất hữu cơ
Bằng các phản ứng hóa học đặc trưng đã xác định trong dịch chiết phần trên mặt đất Giảo cổ lam quả dẹt có 7 nhóm chất: saponin, flavonoid, caroten, sterol, đường khử, acid amin và polysaccharid.
Kết quả định tính này cũng tương đồng với kết quả định tính các nhóm chất trong loài G pentaphyllum [4],
G guangxiense và G burmanicum [5] Bên cạnh đó, kết quả định tính cũng cho thấy rõ saponin là thành phần chính của Giảo cổ lam quả dẹt và tập trung chủ yếu trong cao BuOH Điều đó cho thấy sự phù hợp về thành phần chính của loài này so với các loài cùng chi Gynostemma.
Các kết quả định tính dịch chiết dược liệu và định tính các cao chiết phân đoạn trong Giảo cổ lam quả dẹt đã giúp định hướng cho việc phân lập saponin trong cao chiết butanol cũng như nghiên cứu tác dụng sinh học của cao chiết ethanol.
4.2.2 Về kết quả phân lập các hợp chất
Nghiên cứu thành phần hóa học của loài Giảo cổ lam quả dẹt được thực hiện dựa trên kết quả tổng quan về thành phần hoá học của chi Gynostemma Blume đã chỉ ra saponin là thành phần chính và kết quả định tính các chất hữu cơ trong Giảo cổ lam quả dẹt, ngoài ra kết quả đánh giá tác dụng ức chế sự tích tụ lipid gây ra bởi acid oleic của cao chiết các phân đoạn đã góp phần định hướng phân lập các hợp chất trong Giảo cổ lam quả dẹt với mục tiêu tìm kiếm hợp chất có hoạt tính sinh học từ phân đoạn tiềm năng được lựa chọn.
Theo kết quả định tính cao chiết các phân đoạn cho thấy, saponin tập trung chủ yếu trong cao BuOH (Bảng
3.2) Bên cạnh đó, các kết quả sàng lọc cũng cho thấy, cao chiết BuOH (GCB, 20 μM) thấp hơn 10 lần so với chứng dương silymarin (ICg/ml) tăng hoạt hóa p- CC và p-
AMPK mạnh nhất so với các mẫu thử khác và gần tương đương so với chứng dương IC R (2 mM) trên biểu hiện p-AMPK (Hỡnh 3.32) Ngoài ra, cao BuOH ở nồng độ 100 àg/ml cũng thể hiện tỏc dụng ức chế sự tớch tụ lipid trờn tế bào HepG2 với tỷ lệ ức chế đạt 19,73 ± 3,71% (Bảng 3.21) Như vậy, thông qua hai tham chiếu này đề tài đã lựa chọn được cao phân đoạn BuOH để tiến hành phân lập các hợp chất nhằm tìm kiếm các hợp chất mới và các chất có tác dụng sinh học.
Bằng phương pháp dùng sắc ký cột pha thường và pha đảo RP-C18 với các dung môi rửa giải khác nhau đã phân lập được 17 hợp chất Sử dụng các phổ: phổ khối (ESI- MS, HR-ESI-MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1 chiều và 2 chiều ( 1 H-NMR, 13 C-NMR, DEP, HMBC, HSQC, COSY, NOESY) đã xác định cấu trúc hoá học của 17 hợp chất đã phân lập được từ cao chiết BuOH của Giảo cổ lam quả dẹt (Hình 4.1).
Gycomosid VN9 (GC6) Glc =O Glc(1→6)-[Rham(1→2)]Glc H
Gycomosid VN10 (GC7) Xyl =O H OH
Gycomosid VN1 (GC9) H OH Glc H
Gycomosid VN4 (GC10) H OH Glc-6ʹ-Ac H
Gycomosid VN2 (GC11) H OH Glc(1→6)Glc(1→2)Glc H
Gycomosid II (GC12) Glc OH Glc(1→6)Glc H
Gycomosid VN3 (GC13) Glc OH Glc(1→6)Glc(1→2)Glc H
Gycomol VN1 (GC14) H OH H OH
Hình 4.2 Cấu trúc của các hợp chất phân lập từ Giảo cổ lam quả dẹt
Trong số 17 chất phân lập từ phần trên mặt đất Giảo cổ lam quả dẹt (Gynostemma compressum X.X.Chen
& D.R.Liang) thu hái ở Việt Nam có 14 chất mới trong tự nhiên và 3 hợp chất đã được biết là corchionol C (GC1), hydroxymethylfurfural (GC2) và gycomosid II (GC12) Hợp chất corchionol C (GC1) đã được phân lập từ loài
Euonymus alatus năm 2013 [142] Hợp chất hydroxymethylfurfural (GC2) đã công bố phân lập từ nhiều loài như: Curculigo orchioides [143], Angelica polymorpha [144], Polygonum perfoliatum [145], trong dầu cọ thô [146], đồ uống cola [147] Hợp chất này được biết đến với tác dụng ức chế sự tạo mỡ, tăng cường sự biệt hóa của tế bào gốc trung mô của xương [148], chống oxy hóa, chống ung thư [149], làm tăng sự biểu hiện của gen BCL-2 và giảm sự biểu hiện của gen NF-κB Tất cả những phát hiện này cho thấy các con đường β [150] Hợp chất gycomosid II (GC12) đã được Ding
S L và Zhu Z Y công bố phân lập từ loài Giảo cổ lam quả dẹt vào năm 1993 [123].
Các hợp chất mới phân lập từ cao BuOH của phần trên mặt đất của Giảo cổ lam quả dẹt thuộc cấu trúc 1β,3β-dihydroxydammar-24-en Sự khác biệt lớn nhất so với các triterpenoid và saponin trong chi Gynostemma đó là vị trí C-1 bị hydroxyl hóa Các vị trí còn lại đều tương tự như các hợp chất đã được công bố từ các loài Giảo cổ lam trong chi Gynostemma Trong số 14 chất mới có 4 triterpenoid mới được đề nghị gọi tên là:
- Gycomol VN1 (GC14): 1β,3β,12β,20(S),26-Pentahydroxydammar-24E-en
- Gycomol VN2 (GC15): 1β,3β,12β,26-Tetrahydroxydammar-20E(22),24E-dien
- Gycomol VN3 (GC3): 1β,3β,20(S)-Trihydroxydammar-24-en-12-on
- Gycomol VN4 (GC8): 1β,3β,12β,20(S)-Tetrahydroxydammar-24-en và 10 saponin mới đề nghị gọi tên là:
- Gycomosid VN1 (GC9): 1β,3β,12β,20(S)-Tetrahydroxydammar-24-en-20-O-β-
- Gycomosid VN2 (GC11): 1β,3β,12β,20(S)-Tetrahydroxydammar-24-en-20-O-β-
- Gycomosid VN3 (GC13): 1β,3β,12β,20(S)-Tetrahydroxydammar-24-en-3-O-β- D-glucopyranosyl- 20-O-β-D-glucopyranosyl-(1→6)-β-D-glucopyranosyl-(1→2)-β-D- glucopyranosid
- Gycomosid VN4 (GC10): 1β,3β,12β,20(S)-Tetrahydroxydammar-24-en-20-O- (6ʹ-O-acetyl)-β-D- glucopyranosid
- Gycomosid VN5 (GC17): 1β,3β,20β-Trihydroxy-12β,23β-epoxy-dammar-24-en- 20-O-β- D - glucopyranosid
-dihydroxydammar-24-en Gycomosid VN6 (GC16): 1β,3β,12β-Trihydroxydammar-20(21),24-dien-3-O-β-dihydroxydammar-24-en
- Gycomosid VN7 (GC4): 1β,3β,20(S)-Trihydroxydammar-24-en-12-on-20-O-β-ᴅ- glucopyranosid
- Gycomosid VN8 (GC5): 1β,3β,20(S)-Trihydroxydammar-24-en-12-on-3-O-β-ᴅ- glucopyranosid
- Gycomosid VN9 (GC6): 1β,3β,20(S)-Trihydroxydammar-24-en-12-on-3-O-β-ᴅ- glucopyranosyl- 20-O-β-ᴅ-glucopyranosyl-(1→6)-[α-ʟ-rhamnopyranosyl-(1→2)]-β-ᴅ- glucopyranosid
- Gycomosid VN10 (GC7): 1β,3β,20(S),26-Tetrahydroxydammar-24-en-12-on-3-
Các saponin có từ 1 đến 2 mạch đường, mỗi mạch đường có từ 1 hoặc 3 đường đơn và có thể gắn vào các vị trí C-3(β) và C-20(β) của phần genin Chỉ có 3 loại đường chính trong các saponin phân lập từ Giảo cổ lam quả dẹt thuộc dạng pyranose là β-ᴅ- glucopyranose, β-ᴅ-xylopyranose và α-ʟ-rhamnopyranose Như vậy, dựa trên các nhóm dammaran được phân loại ở phần tổng quan có thể chia 14 hợp chất mới thuộc 2 cấu trúc chính:
- Cấu trúc không bị biến đổi ở C-17 (các triterpen và saponin có cấu trúc chung là 1β,3β-dihydroxydammar-24- en hay mạch nhánh tại C-17 không bị biến đổi):
Cấu trúc 1β,3β,20(S)-trihydroxydammar-24-en-12-on: Gycomol VN3 (GC3), gycomosid VN7 (GC4), gycomosid VN8 (GC5) và gycomosid VN9 (GC6)
Cấu trúc 1β,3β,12β,20(S)-tetrahydroxydammar-24-en: Gycomol VN4 (GC8), gycomosid VN1 (GC9), gycomosid VN4 (GC10), gycomosid VN2 (GC11) và gycomosid VN3 (GC13).
- Cấu trúc biến đổi ở C-17 (mạch nhánh tại C-17 của các hợp chất bị oxy hóa, hình thành nối đôi hay đóng vòng):
Hydroxyl hóa tại C-26: Gycomosid VN10 (GC7) và gycomol VN1 (GC14).
Hydroxyl hóa tại C-26 và dehydrat hóa tại vị trí C-20 hình thành nối đôi ở 20(22): Gycomol VN2 (GC15).
Dehydrat hóa tại vị trí C-20 hình thành nối đôi ở 20(21): Gycomosid VN6 (GC16).
Vòng kép 12,23-epoxydammaran: Gycomosid VN5 (GC17).
Như vậy có thể thấy, saponin là thành phần chính trong cao chiết phân đoạn BuOH hay của Giảo cổ lam quả dẹt Kết quả này phù hợp với phần định tính cũng như các nghiên cứu về thành phần hóa học của chi Gynostemma của nhiều tác giả Đồng thời, các saponin của loài này cũng có nhóm 1β-OH và 20S tương tự như các gycomosid I-
IV mà nhóm nghiên cứu của Ding S L và Zhu Z Y đã công bố [123] Chính sự xuất hiện của nhóm 1β-OH này đã tạo ra sự khác biệt của các aglycon và saponin trong loài Giảo cổ lam quả dẹt so với các loài khác trong chi
Gynostemma Blume Ngoài ra, cấu hình tại C- 20 của các hợp chất phân lập từ Giảo cổ lam quả dẹt như GC3 -
GC11, GC14 và GC13 chỉ xuất hiện ở dạng "S" Đây cũng là cấu hình phổ biến của các hợp chất triterpen và saponin triterpen trong chi Gynostemma Blume Một số ít hợp chất có cấu hình 20R như gypenosid LIII (59), gypenosid XXXIX (60), gypenosid XL (61) và gypenosid LI (73)
4.3 Về độc tính cấp Đánh giá độc tính cấp là thông tin đầu tiên thể hiện tính an toàn khi sử dụng cũng như xác định liều lượng trên lâm sàng của dược liệu Do các sản phẩm từ Giảo cổ lam trong thực tế thường được sử dụng dưới dạng nước sắc và trà nên việc đánh giá tác dụng độc tính cấp của cao chiết nước là phù hợp Ngoài ra, luận án cũng tiến hành đánh giá độc tính cấp của cao EtOH 80% nhằm mục đích xác định liều dùng trong các thử nghiệm về tác dụng sinh học Sở dĩ trong luận án đã tiến hành xác định độc tính cấp của dịch chiết nước và độc tính cấp của dịch chiết cồn EtOH 80% vì độc tính cấp của dịch chiết cồn để thử tác dụng sinh học và độc tính cấp của dịch chiết nước để ứng dụng phát triển sản phẩm định hướng dưới dạng trà túi lọc Theo kết quả tra cứu về loài Giảo cổ lam quả dẹt thì chưa có thông tin về độc tính của loài này Do vậy, việc đánh giá độc tính cấp của loài Giảo cổ lam quả dẹt là cần thiết và đây cũng là công bố đầu tiên về độc tính cấp của loài
