A BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ VIỆN DƯỢC LIỆU PHÙNG THANH LONG NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT, THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ TÁC DỤNG CHỐNG VIÊM CỦA CÂY NHO RỪNG (Vitis heyneana Roem & Schult ), HỌ NHO (VITAC[.]
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ VIỆN DƯỢC LIỆU PHÙNG THANH LONG NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM THỰC VẬT, THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ TÁC DỤNG CHỐNG VIÊM CỦA CÂY NHO RỪNG (Vitis heyneana Roem & Schult.), HỌ NHO (VITACEAE) Chuyên ngành: Dược liệu - Dược học cổ truyền Mã số: 972.02.06 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC Hà Nội, năm 2023 Hà Nội, năm 2022 Cơng trình được hồn thành tại: - Viện Dược liệu - Viện Hóa học Viện Sinh thái Tài nguyên sinh vật - Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam - Đại học Lund, Thụy Điển - Trường Đại học Dược Hà Nội Người hướng dẫn khoa học: PGS TS Đỗ Thị Hà TS Hà Vân Oanh Phản biện 1: Phản biện 2: Phản biện 3: Luận án bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án cấp Viện tổ chức Viện Dược liệu Vào hồi giờ phút, ngày tháng năm Có thể tìm đọc Luận án tại: - Thư viện Quốc gia Hà Nội - Thư viện Viện Dược liệu A GIỚI THIỆU LUẬN ÁN Tính cấp thiết luận án Ở tỉnh phía Bắc Việt Nam, lồi Nho rừng hay cịn gọi Nho lơng hay Nho năm góc, có tên khoa học Vitis heyneana Roem & Schult từ lâu người dân sử dụng một vị thuốc cổ truyền Toàn sử dụng để chữa phong thấp, an thai, giải nhiệt Mặc dù sử dụng từ lâu y học dân gian, nước ta chưa có nghiên cứu loài Trên giới, có nghiên cứu lồi Vitis heyneana Từ thực tế trên, đề tài “Nghiên cứu đặc điểm thực vật, thành phần hóa học tác dụng chống viêm Nho rừng (Vitis heyneana Roem & Schult.), họ Nho (Vitaceae)” thực để tạo sở khoa học cho việc sử dụng góp phần phát triển sản phẩm chăm sóc sức khỏe từ loài Mục tiêu nội dung Luận án 2.1 Mục tiêu Luận án - Mục tiêu Mô tả đặc điểm thực vật Nho rừng - Mục tiêu Nghiên cứu thành phần hóa học Nho rừng - Mục tiêu Đánh giá tác dụng chống viêm cao chiết hợp chất stilbenoid oligostilbenoid phân lập từ Nho rừng 2.2 Nội dung Luận án ➢ Về thực vật: - Mơ tả đặc điểm hình thái khẳng định tên khoa học mẫu nghiên cứu - Xác định đặc điểm giải phẫu đặc điểm vi học thân Nho rừng ➢ Về hóa học: - Định tính mợt số nhóm chất Nho rừng - Chiết xuất, phân lập xác định cấu trúc hóa học hợp chất phân lập từ Nho rừng ➢ Về tác dụng sinh học: - Đánh giá tác dụng chống viêm in vitro cao chiết cồn, cao phân đoạn một số hợp chất stilbenoid oligostilbenoid phân lập từ Nho rừng - Đánh giá tác dụng chống viêm giảm đau in vivo phân đoạn tiềm sau sàng lọc Những đóng góp Luận án 3.1 Về thực vật học Luận án tài liệu mô tả đặc điểm giải phẫu thân, xác định đặc điểm bột dược liệu thân, Nho rừng (Vitis heyneana Roem & Schult.), họ Nho (Vitaceae) 3.2 Về hóa học Luận án tài liệu công bố thành phần phần hóa học nho rừng V heyneana Việt Nam Luận án phân lập xác định cấu trúc 16 hợp chất tinh khiết, đó: - 09 hợp chất, gồm 2-r-viniferin, betulifol A, vitisinol C, αviniferin, amurensin B, vitisinol B, cis-vitisin B, acid protocatechuic, daucosterol, lần phân lập từ loài Nho rừng - 02 hợp chất shoreaketon dehydrocostus lacton lần phân lập từ chi Nho Vitis L 3.3 Về tác dụng sinh học Luận án công bố tác dụng chống viêm giảm đau loài Vitis heyneana Roem & Schult Luận án công bố : - Tác dụng ức chế biểu COX-2 gây LPS đại thực bào RAW264.7 cao ethyl acetat phần mặt đất Nho rừng (VHE) hợp chất (-)-trans-ε-viniferin (VH6) - Tác dụng ức chế mức độ biểu COX-2, iNOS, mức độ biểu COX-2 mRNA, sản sinh PGE2, NO làm giảm hoạt tính NF-kB hợp chất VH6 - Tác dụng chống viêm cấp mơ hình gây phù chân cḥt tác dụng giảm đau mơ hình gây đau quặn acid acetic cao VHE Ý nghĩa luận án Đây lần loài nho rừng mọc tự nhiên Việt Nam nghiên cứu đầy đủ thực vật, thành phần hóa học tác dụng sinh học - Tên khoa học mẫu nghiên cứu xác định giúp cho kết nghiên cứu hóa học tác dụng sinh học khẳng định rõ nguồn gốc - Đặc điểm vi học góp phần nhận biết tiêu chuẩn hóa dược liệu - Kết nghiên cứu thành phần hóa học: phân lập xác định cấu trúc 16 hợp chất tinh khiết, đó có 09 hợp chất, lần phân lập từ loài nho rừng 02 hợp chất shoreaketon dehydrocostus lacton lần phân lập từ chi Nho Vitis L Kết nghiên cứu thành phần hóa học giúp bổ sung tư liệu cho hóa học chi Vitis L loài V heyneana - Kết nghiên cứu tác dụng sinh học cho thấy cao chiết ethyl acetat phần mặt đất hợp chất VH6 có tác dụng chống viêm giảm đau mơ hình in vitro in vivo Kết góp phần tạo sở cho việc sử dụng Nho rừng dân gian để trị đòn ngã tổn thương, gân cốt tê đau Từ đó gợi ý loài Nho rừng ứng viên tiềm việc phát triển sản phẩm điều trị bệnh lý liên quan đến viêm đau xương khớp tương lai Bố cục luận án Luận án có 118 trang, gồm chương, 31 bảng, 39 hình, 282 tài liệu tham khảo 18 phụ lục Các phần luận án: Đặt vấn đề (2 trang), Tổng quan (41 trang), Nguyên vật liệu phương pháp nghiên cứu (12 trang), Kết nghiên cứu (44 trang), Bàn luận (18 trang), Kết luận kiến nghị (1 trang) B NỘI DUNG CỦA LUẬN ÁN CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN Đã tổng hợp trình bày mợt cách hệ thống kết nghiên cứu từ trước đến thực vật, thành phần hóa học tác dụng sinh học chi Vitis L loài nho rừng V heyneana giới Việt Nam CHƯƠNG 2: NGUYÊN VẬT LIỆU, ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu Phần mặt đất loài Nho rừng mọc tự nhiên xã Bản Mế, huyện Si Ma Cai, tỉnh Lào Cai, thu hái vào tháng 9/2016 2.2 Phương pháp nghiên cứu - Thực vât: Xác định tên khoa học loài nghiên cứu sở phân tích đặc điểm hình thái thực vật, so sánh với tài liệu công bố lồi khóa phân loại thực vật; Xác định đặc điểm vi phẫu phần mặt đất đặc điểm bột dược liệu phương pháp hiển vi - Hóa học: Xác định cấu trúc hợp chất phân lập dựa thông số vật lý liệu phổ bao gồm: Điểm chảy, góc quay cực riêng, phổ hồng ngoại (IR), phổ tử ngoại (UV), phổ khối lượng, phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều hai chiều, đồng thời so sánh với liệu phổ hợp chất biết - Tác dụng sinh học: Đánh giá khả ức chế mức độ biểu COX-2 mRNA kỹ thuật RT – PCR; Đánh giá khả ức chế mức độ biểu COX-2 iNOS phân tích Western blot; Đánh giá khả ức chế sản sinh PGE2 phương pháp miễn dịch gắn kết enzym liên kết (ELISA); Đánh giá khả ức chế hoạt tính phiên mã NF-kB thí nghiệm phân tích hoạt đợng luciferase; Đánh giá khả ức chế sản sinh NO phương pháp đo quang; Đánh giá tác dụng chống viêm cấp mô hình gây viêm cấp carrageenin; Đánh giá tác dụng chống viêm mạn mơ hình gây u hạt chuột cống trắng; Đánh giá tác dụng giảm đau theo mơ hình gây đau quặn acid acetic CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1 Kết nghiên cứu đặc điểm thực vật 3.1.1 Đặc điểm hình thái giám định tên khoa học Dây leo, thân nhánh non có lông tơ tơ nhện màu vàng trắng, sau đó nhẵn; cuống, mặt cụm có lông tơ màu nâu vàng; tua đối diện với lá, xẻ đôi đỉnh, phủ lông tơ dày đặc lúc non, sau nhẵn Lá đơn, mọc so le; kèm rụng sớm, có vết kèm gốc cuống lá; cuống phủ lông tơ dày đặc; phiến hình bầu dục hình trứng, nguyên có thùy nơng; gốc hình tim cụt, mép có cưa nhọn, đỉnh nhọn có mũi nhọn; gân hình chân vịt, gân từ gốc 5, gân có 5-7 cặp, gân cấp song song; mặt phủ lông tơ màu nâu xám, mặt có lông tơ dạng mạng nhện lúc non, sau nhẵn Cụm hoa dạng chùy, đối diện với lá; nụ hoa hình trứng ngược, đỉnh trịn, khơng có lơng Hoa mẫu 5-6 7; đài hình chén, khơng chia thùy thùy ngắn; cánh hoa hình trứng ngược giáo, nhẵn, màu xanh, dính đỉnh thành mũ, rụng hoa nở; số nhị số cánh hoa, mọc đối diện với cánh hoa, nhị mảnh, nhẵn, bao phấn hai ơ, đính gốc, màu vàng nhạt; bầu hình trứng, màu xanh, nhẵn, vịi nhụy ngắn, núm nhụy màu trắng, trịn chia thùy nơng, mép tua Cụm chùm kép, đối diện lá, cuống cụm chia nhiều nhánh, nhánh phía dài nhánh phía Quả mọng hình cầu, kích thước khơng mợt cụm, chín màu tím đen, nhẵn, vị chua Hạt 3-4 một quả, hình trứng ngược, đỉnh trịn, gốc thn nhọn, xẻ 2; vỏ hạt nhẵn, mặt lưng có một đốm màu nâu với đường sọc màu vàng nâu kéo dài qua đỉnh sang hết mặt bụng đến gốc hạt, mặt bụng có hai rãnh dọc xuất phát từ đỉnh hạt đến gần đỉnh, khía sâu vào hạt Đối chiếu với tài liệu phân loại thực vật, loài Nho rừng sơ bộ xác định thuộc chi Vitis L., họ Nho (Vitaceae) TS Nguyễn Thế Cường – Viện Sinh thái Tài nguyên sinh vật Viện khoa học Công nghệ Việt Nam giám định tên khoa học Vitis heyneana Roem & Schult., họ Nho (Vitaceae) 3.1.2 Đặc điểm vi phẫu - Đặc điểm vi phẫu thân: Vi phẫu có thiết diện trịn Từ ngồi vào gồm: Biểu bì, mơ dày góc, mơ mềm vỏ, sợi, mô dẫn gồm libe gỗ tạo nên bó chồng, bó mô dẫn tia ruột, mô mềm ruột - Đặc điểm vi phẫu lá: Gân lá: Mặt lõm, mặt lồi Từ lên gồm: Biểu bì có lơng che chở đơn bào Mô dày Mô mềm Mô dẫn tạo thành bó, gồm libe trên, gỗ Mô cứng Mơ dày Biểu bì Phiến lá: Cấu tạo biểu bì biểu bì Mơ giậu Mô khuyết, rải rác có tinh thể calci oxalat hình cầu gai 3.1.3 Đặc điểm bột dược liệu - Đặc điểm bột thân: Bột màu xám, không mùi, không vị Các đặc điểm: Tinh thể calci oxalat hình kim, hình cầu gai hình khối Hạt tinh bợt hình chuông Sợi Mảnh mạch xoắn mảnh mạch điểm Mảnh mô mềm Lông che chở đơn bào - Đặc điểm bột lá: Bột màu xám, không mùi, không vị Các đặc điểm sau: Tinh thể calci oxalat hinh kim hình cầu gai Mảnh mạch xoắn mạch điểm Hạt tinh bợt đơn, hình trịn Lơng che chở đơn bào 3.2 Kết nghiên cứu hóa học 3.2.1 Kết định tính Kết có nhóm chất: flavonoid, tanin, acid amin, đường khử, polysaccharid, chất béo sterol 3.2.2 Kết chiết xuất, phân lập xác định cấu trúc hợp chất Phần mặt đất lồi Nho rừng phơi khơ, cắt nhỏ (1,5 kg) chiết hồi lưu với ethanol 96% (3 h × lần × 36l) Lọc, gợp dịch chiết cất thu hồi dung môi thu cắn ethanol (VH, 68,11 g) Phân tán cắn nước nóng (tỉ lệ 1:1), chiết lỏng-lỏng với dung môi n-hexan ethyl acetat Các phân lớp cất thu hồi dung môi thu cắn tương ứng n-hexan (VHH, 7,83 g), ethyl acetat (VHE, 39,16 g) cắn nước (13,43 g) Cắn VHE (34,0 g) tiến hành phân lập sắc kí cợt pha thường, rửa giải với hệ dung môi DCM-MeOH (100:1-1:100, v/v), thu phân đoạn (VHE1-VHE7) Phân đoạn VHE4 (1,5 g) phân lập cột sắc ký pha thường, hệ dung môi rửa giải DCM-MeOH (20:1, v/v) thu hợp chất VH4 (13,0 mg) phân đoạn (VHE4.1-VHE4.4) Phân đoạn VHE4.2 (200,0 mg) rửa hệ DCM-MeOH (1:1, v/v) thu hợp chất VH1 (50,0 mg) Phân đoạn VHE4.3 (150 mg) rửa giải cột Sephadex với hệ dung môi MeOH-H2O (2:1, v/v) thu hợp chất VH5 (13,0 mg) VH6 (40,0 mg) Phân đoạn VHE5 (1,2 g) phân lập cột sắc ký pha thường, hệ dung môi rửa giải DCM-MeOH (15:1, v/v) thu 10 phân đoạn (VHE5.1VHE5.10) Phân đoạn VHE5.3 (100 mg) rửa giải cột Sephadex với hệ dung môi MeOH-H2O (5:1, v/v) thu hợp chất VH7 (25,0 mg) Phân lập phân đoạn VHE5.4 (500 mg) cột sắc ký pha đảo với hệ dung môi rửa giải MeOH-H2O (1:2, 1:1, 2:1, v/v) thu hợp chất VH8 (25,0 mg), VH10 (13,0 mg) VH9 (22,0 mg), phân đoạn (VHE5.4.1-VHE5.4.5) Phân đoạn VHE5.4.3 (120 mg) rửa giải cột MCI với hệ dung môi MeOH-H2O (3:2, v/v) thu hợp chất VH11 (14,0 mg) Phân đoạn VHE6 (300 mg) phân lập cột Sephadex với hệ dung môi MeOH-H2O (1:1, v/v) thu hợp chất VH2 (12,0 mg) VH3 (25,0 mg) Phân đoạn VHE7 (500 mg) phân lập sắc kí cợt pha đảo, rửa giải với hệ dung môi aceton-nước (8:2, v/v) thu hợp chất VH12 (15,0 mg) Phân tách VHH (6,0 g) sắc kí cợt pha thường, rửa giải với hệ dung môi DCM-MeOH (50:1-30:1, v/v), thu 12 phân đoạn (VHH1-VHH12) Phân đoạn VHH2 (135 mg) phân lập sắc kí cợt pha đảo, rửa giải với hệ dung môi aceton-nước (6:1, v/v) thu hợp chất VH13 (30,0 mg) Phân đoạn VHH3 (2,33 g) phân tách sắc kí cợt pha thường, rửa giải với hệ dung môi n-hexan-aceton (7:1, v/v) thu phân đoạn (VHH3.1-VHH3.8) Phân đoạn VHH3.3 kết tinh aceton thu hợp chất VH14 (105,0 mg) Phân đoạn VHH9, VHH10 kết tinh aceton, thu hợp chất VH15 (100 mg) VH16 (61,0 mg) Dựa vào số vật lý, phổ khối lượng (ESI-MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều, hai chiều (NMR) đối chiếu với tài liệu tham khảo, xác định cấu trúc 16 hợp chất a VH1 (Resveratrol): Bột kết tinh màu kem; tonc: 261-263ºC; ESIMS m/z: 227 [M-H]-; Phổ 1H-NMR (500 MHz, CD3OD) δH: 6,47 (2H, d, J = 2, H-2, H-6), 6,18 (1H, t, J = 2,0, H-4), 7,36 (2H, d, J = 8,5, H-2', H-6'), 6,79 (1H, d, J = 8,5, H-3'), 6,78 (1H, d, J = 8,5, H-5'), 6,83 (1H, d, J = 16,3, H-a), 6,96 (1H, d, J = 16,3, H-b); Phổ 13C-NMR (125 MHz, CD3OD) δC: 141,3 (C-1), 105,8 (C-2, C-6), 159,6 (C-3, C5), 102,7 (C-4), 130,4 (C-1'), 128,8 (C-2', C-6'), 116,5 ( C-3', C-5'), 158,3 (C-4'), 127,0 (C-a), 129,4 (C-b) b VH2 (Piceid): Tinh thể hình kim màu trắng; tonc: 223-226ºC; ESI-MS m/z: 413 [M+Na]+; Phổ 1H-NMR (500 MHz, CD3OD), δ (ppm): 7,39 (2H, d, J=8,5, H-2', 6'), 7,04 (1H, d, J = 16,5, H-b), 6,87 (1H, d, J = 16,0, H-a), 6,81 (1H, s, H-2), 6,79 (1H, d, J=8,5, H-3', 5'), 6,64 (1H, s, H-6), 6,48 (1H, t, J=2,0, H-4), 4,92 (1H, d, J= 7,5, H1''), 3,95 (1H, dd, J= 2,0, 12,0, H-6a''), 3,74 (1H, dd, J= 6,0; 12,5, H6b''), 3,52-3,39 (4H, m, H-2'', 3'',4'', 5'') Phổ 13C-NMR (125 MHz, CD3OD), δ (ppm): 160,5 (C-5), 159,6 (C-3), 158,4 (C-4'), 141,4 (C-1), 130,3 (C-1'), 130,0 (C-b), 128,9 (C-2', 6'), 126,7 (C-a), 116,5 (C-3', 5'), 108,4 (C-6), 107,1 (C-2), 104,1 (C-4), 102,4 (C-1''), 78,2 (C-5''), 78,1 (C-3''), 75,0 (C-2''), 71,5 (C-4''), 62,6 (C-6'') c VH3 (2-r-viniferin): Chất rắn màu nâu xám; tonc: 301-302ºC; [α]25D = +132,9 (MeOH); ESI-MS m/z 929,3 [M+Na] +; Phổ 1HNMR (500 MHz, Aceton-d6), δ (ppm): 7,18 (2H, d, J=8,5, H2,6), 7,14 (2H, d, J= 8,5, 2'",6'"), 7,03 (2H, d, J= 8,5, H-2",6"), 6,87 (1H, dd, J= 8,5, 2,0, H-6'), 6,83 (2H, d, J=8,5, H-3,5), 6,77 (2H, d, J = 8,5, 3'",5'"), 6,72 (1H, d, J = 8,5, H-5'), 6,66 (2H, d, J = 2,0, 3",5"), 6,51 (1H, brs, H-14 ʹ), 6,39 (2H, s, H-7’, 8’), 6,26 (1H, d, J = 1,5, H-14'"), 6,25 (1H, s, H-12’), 6,21 (1H, t, J = 2,0, H-12), 6,16 (2H, d, J = 2,0, H-10, H-14), 6,09 (1H, brs, H-2'), 6,08 (1H, d, J = 2,0, H-12"), 6,06 (1H, d, J = 2,5, H-14"), 5,88 7), 33,6 (C-13') f VH6 (-)-trans-ε-viniferin: Chất rắn màu nâu xám; tºnc: 150152ºC; [α]25D = - 47,0 (MeOH); ESI-MS m/z: 477 [M+Na]+; Phổ 1HNMR (500 MHz, Aceton-d6), δ (ppm): 7,20 (2H, d, J=8,5, H-2,6), 7,17 (2H, d, J=8,5, H-2',6'), 6,90 (1H, d J= 16,5, H-7'), 6,83 (2H, d, J=8,5, H-3,5), 6,73 (2H, d, J=9,0, H-3',5'), 6,72 (1H, H-14 ʹ), 6,71 (1H, d, J=16,5, H-8'), 6,33 (1H, d, J=2,0, H-12'), 6,24 (3H, s, H-10, 12, 14), 5,42 (1H, d, J=5,5, H-7), 4,47 (1H, d, J=5,5, H-8) Phổ 13C-NMR (125 MHz, Aceton-d6), δ (ppm):162,5 (C-11'), 159,9 (C-11, 13), 159,6 (C-13'), 158,2 (C-4, 4'), 147,4 (C-9), 136,4 (C-9'), 133,9 (C-1), 130,1 (C-7'), 129,9 (C-1'), 128,7 (C-2', 6'), 127,9 (C-2, 6), 123,5 (C-8'), 119,8 (C-10'), 116,3 (C-3',5'), 116,2 (C-3, 5), 107,0 (C-10, 14)), 104,2 (C14'), 102,1 (C-12), 96,8 (C-12'), 93,9 (C-7), 57,1 (C-8) g VH7 (α-viniferin) Chất rắn màu nâu; tºnc: 231-233oC; [α]25D = +50,7 (EtOH); ESI-MS m/z: 701,0 [M+Na]+; Phổ 1H-NMR (500 MHz, Aceton-d6), δ (ppm): 7,19 (d, J=7,5, H-2’,6’), 7,04 (d, J=8,5, H-2’’, 6’’), 7,01 (d, J=8,5, H-2,6), 6,78 (d, J=8,5, H-3’’, 5’’), 6,77 (d, J=8,5, H-3’,5’), 6,72 (d, J=8,5, H-3,5), 6,72 (H-14), 6,60 (d, J=2,0, H-14’), 6,25 (d, J=1,5, H-12), 6,24 (d, J=2,0, H12’), 6,22 (d, J=2,0, H-12’’), 6,06 (s, H-7), 6,00 (d, J=2,0, H14’’), 5,94 (d, J=10,0, H-7’), 4,91 (d, J=6,0, H-7’’), 4,68 (d, J=10,0, H-8’), 4,60 (d, J=6,0, H-8’’), 3,96 (s, H-8) Phổ 13CNMR (125 MHz, Aceton-d6), δ (ppm): 161,7 (C-11’), 161,4 (C11’’), 161,0 (C-13’), 160,6 (C-13’’), 159,4 (C-11), 159,4 (C-13), 158,4 (C-4’’), 158,3 (C-4’), 158,0 (C-4), 141,2 (C-9’’), 139,6 (C9), 138,6 (C-9’), 132,4 (C-1’), 132,1 (C-1’’), 131,8 (C-1), 128,5 (C-2’’, 6’’), 128,1 (C-2, 6, 2’, 6’), 120,7 (C-10), 119,5 (C-10’), 118,7 (C-10’’), 116,1 (C-3’, 5’), 116,1 (C-3’’, 5’’), 115,7 (C-3, 5), 108,5 (C-14’’), 106,2 (C-14), 105,7(C-14’), 98,0 (C-12’’), 96,9 (C-12’), 96,5 (C-12), 95,5 (C-7’’), 89,9 (C-7’), 86,3 (C-7), 55,6 (C-8’’), 52,9 (C-8’), 46,1 (C-8) h VH8 (shoreaketon): Chất rắn màu nâu; tºnc: 256-258ºC; [α]25D = -225 (MeOH); ESI-MS: m/z 929,0 [M+Na]+ Phổ 1HNMR (500 MHz, Aceton-d6), δ (ppm): A: 7,47 (2H, dd, J=8,5, 10 2,0, H-2, 6), 6,87 (2H, d, J=9,0, H-3, 5), 6,73 (1H, d, J=1,5, H14"), 6,71 (2H, s, H-2'",6'"), 6,67 (2H, d, J=9,5, H-3'",5'" ), 6,48 (1H, d, J=1,5, H-14), 6,45 (1H, d, J=2,5, H-6'), 6,21 (1H, d, J=1,5, H-12"), 6,16 (1H, d, J=2,0, H-12), 6,12 (1H, d, J=2,0, H12'), 6,05 (1H, t, J=2,3, H-12'"), 6,00 (1H, d, J=2,5, H-14'), 5,94 (2H, d, J=2,0, H-10'", 14'"), 5,85 (1H, d, J=10,5, H-7), 5,45 (1H, d, J=10,0, H-5'), 5,09 (1H, d, J=10,5, H-8), 4,96 (1H, d, J=5,0, H-7'"), 4,74 (1H, d, J=2,0, H-2'), 3,8 (1H,*,H-7'), 3,6 (1H, *, H8'), 3,6 (1H,*,H-8"), 3,33 (1H, d, J=4,5, H-8'"), 3,25 (1H, d, J=9,0, H-7"), 3,00 (1H, dd, J=17,5, 2,0, H-3'), 2,72 (1H, dd, J=17,5, 3,5, H-3') B: 7,44 (2H, d, J=8,5, H-2, 6), 7,15 (2H, dd, J=8,5, 2,0, H-2'",6'"), 6,85 (2H, dd, J=8,0, H-3, 5), 6,66 (2H, d, J=9,0, H-3'",5'" ), 6,44 (1H, t, J=2,0, H-12'"), 6,40 (1H, brs, H14), 6,39 (1H, d, J=2,5, H-14'"), 6,37 (1H, d, J=2,0, H-6'), 6,33 (1H, d, J=2,5, H-12"), 6,16 (1H, d, J=2,0, H-12'), 6,08 (1H, d, J=2,0, H-12), 5,97 (1H, d, J=2,0, H-14'), 5,94 (1H, d, J=2,0, H10'"), 5,86 (1H, d, J=10,5, H-7), 5,75 (1H, d, J=2,0, H-14"), 5,31 (1H, d, J=10,0, H-5'), 5,18 (1H, d, J=2,5, H-7'"), 5,13 (1H, d, J=10,5, H-8), 4,54 (1H, d, J=2,5, H-8'"), 3,8 (1H,*,H-2'), 3,7 (1H,*,H-7'), 3,6 (1H,*,H-8'), 3,5 (1H,*, H-8"), 3,19 (1H, d, J=11,0, H-7"), 2,40 (1H, dd, J=17,5, 3,5, H-3'), 2,28 (1H, dd, J=17,5, 2,0, H-3').(*: tín hiệu bị che lấp) Phổ 13C-NMR (125 MHz, Aceton-d6), δ (ppm): A: 196,7 (C-4'), 162,0 (C-11"), 160,1 (C11'), 159,8 (C-13"),158,9 (C-11'", 13'"), 158,5 (C-4), 157,8 (C13), 157,5 (C-4'"), 157,1 (C-13', 4"), 154,8 (C-6'), 154,7 (C-11), 146,5 (C-9'"), 143,5 (C-9), 142,1 (C-9"), 138,3 (C-9'), 132,9 (C1'"), 131,7 (C-1), 131,4 (C-1"), 129,7 (C-2, 6), 128,8 (C-5'), 128,2 (C-2'",6'"), 120,6 (C-10"), 117,6 (C-10'), 116,1 (C-3, 5), 116,0 (C-3'",5'"), 113,7 (C-10), 109,8 (C-14'), 107,2 (C-10'", 14'"), 105,8 (C-14), 105,7 (C-14"), 102,1 (C-12'"), 101,6 (C-12), 97,1 (C-12'), 96,1 (C-12"), 94,1 (C-7'"), 87,3 (C-7), 76,0 (C-2'), 63,4 (C-7"), 57,0 (C-8"), 54,9 (C-8'"), 50,7 (C-8, -7'), 49,7 (C-8'), 47,9 (C-7'), 46,3 (C-1'), 39,6 (C-3'); B: 196,8 (C-4'), 164,1 (C-11"), 160,5 (C-11'"), 159,8 (C-11'), 158,5 (C-4, 13', 13"), 157,7 (C-4'"), 11 157,2 (C-13), 156,7 (C-4"), 155,3 (C-6'), 154,7 (C-11), 148,7 (C9'"), 142,4 (C-9), 140, (C-9"), 139,2 (C-9'), 134,0 (C-1'"), 131,6 (C-1), 131,2(C-1"), 129,5 (C-2, 6), 128,6 (C-5'), 127,5 (C2'",6'"), 117,3 (C-10'), 116,4 (C-10"), 116,4 (C-3'",5'"), 116,1 (C3, 5), 113,6 (C-10), 113,4 (C-14"), 109,6 (C-14'), 107,2 (C14'")106,3 (C-10'"), 105,8 (C-14), 102,5 (C-12'"), 101,7 (C-12), 96,5 (C-12'), 96,3 (C-12"), 94,1 (C-7'"), 87,4 (C-7), 75,6 (C-2'), 62,6 (C-8"), 57,4 (C-8'"), 57,1 (C-7"), 50,6 (C-8), 48,2 (C-7'), 47,4 (C-8'), 45,8 (C-1'), 39,6 (C-3') i VH9 (amurensin B): Chất rắn màu vàng nâu; [α]25D = +164 (MeOH); ESI-MS m/z: 703,0 [M+Na]+; Phổ 1H-NMR (500 MHz, Aceton-d6), δ (ppm): 7,24 (2H, d, J=8,5, H-2'',6''), 7,05 (2H, d, J=8,5, H-2, 6), 6,97 (2H, d, J=8,5, H-2', 6'), 6,86 (2H, d, J=8,5, H-3'',5''), 6,75 (1H, d, J=16,5, H-7'), 6,64 (2H, d, J=8,5, H-3, 5), 6,63 (1H, d, J=17,0, H-8'), 6,63 (2H, d, J=8,5, H-3', 5'), 6,50 (1H, s, 12'), 6,26 (2H, d, J=2,5, H-10'',14''), 6,17 (1H, t, J=2,5, H-12''), 5,96 (1H, t, J=2,5, H-12), 5,91 (1H, d, J=7,5, H-7), 5,87 (2H, d, J=2,0, H-10, 14), 5,45 (1H, d, J=5,0, H-7''), 4,71 (1H, d, J=8,0, H-8), 4,56 (1H, d, J=5,0, H-8''), Phổ 13C-NMR (125 MHz, Aceton-d6), δ (ppm): 162,4 (C-11'), 162,1 (C-13'), 159,8 (C11'',13''), 158,8 (C-11, 13), 158,2 (C-4', 4''), 157,4 (C-4), 147,3 (C-9''), 143,0 (C-9), 133,9 (C-7'), 133,8 (C-1''), 133,2 (C-9'), 130,1 (C-1'), 129,1 (C-1), 129,0 (C-2, 6), 128,5 (C-2', 6'), 127,8 (C-2'',6''), 122,4 (C-8'), 121,9 (C-10'), 120,4 (C-14'), 116,2 (C-3, 5, 3'',5''), 115,1 (C-3', 5'), 108,7 (C-10, 14), 106,9 (C-10'',14''), 102,1 (C-12''), 101,8 (C-12), 94,0 (C-7''), 91,7 (C-12'), 90,8 (C-7), 57,9 (C-8''), 53,9 (C-8) k VH10 (vitisinol B): Chất rắn màu vàng nâu; [α]25D = +194,3 (MeOH); Phổ 1H-NMR (500 MHz, Aceton-d6), δ (ppm): 9,38 (1H, s, CHO), 7,47 (1H, dd, J=2,0, 8,5, H-4''), 7,14 (2H, d, J=8,5, H-2, 6), 7,05 (2H, d, J=8,0, H-2', 6'), 6,99 (1H, d, J=8,0, H-3''), 6,78 (2H, d, J=8,5, H-3, 5), 6,68 (2H, d, J=9,0, H-3', 5'), 6,70 (1H, brs, H-6''), 6,24 (1H, brs, H-14a), 6,13 (2H, d, J=2,0, H-12b, 14b), 6,03 (1H, d, J-2,0, H-12), 5,87 (1H, d, J=11,5, H-7), 5,56 (1H, d, J=3,5, H-8'), 5,43 (1H, 12 d, J=3,5, H-7'), 4,27 (1H, d, J=11,5, H-8); Phổ 1H-NMR (500 MHz, Aceton-d6), δ (ppm): 190,8 (CHO), 160,9 (C-2''), 160,5 (C-11'), 159,0 (C-13'), 158,6 (C-4), 157,9 (C-11), 157,2 (C-13), 156,1 (C-4'), 142,3 (C-9), 140,4 (C-9'), 135,0 (C-6''), 134,9 (C-1'), 133,6 (C-1''), 130,9 (C1), 130,1 (C-2, 6), 129,8 (C-4''), 128,8 (C-2', 6', 5''), 120,5 (C-10'), 119,7 (C-10), 116,0 (C-3, 5), 115,6 (C-3''), 115,6 (C-3', 5'), 110,0 (C14'), 105,1 (C-14), 100,8 (C-12), 96,4 (C-12'), 88,5 (C-7), 49,5 (C-8), 41,6 (C-8'), 40,6 (C-7') l VH11 (cis-vitisin B): Tinh thể hình kim màu vàng; [α]25D = -41,9 (MeOH); Phổ 1H-NMR (500 MHz, Aceton-d6), δ (ppm): 7,20 (2H, d, J=8,5, H-2''', 6'''), 7,11 (2H, d, J=8,5, H-2, 6), 7,00 (1H, dd, J=8,3, 1,7, H-6''), 6,83 (2H, d, J=8,5, H-3''', 5'''), 6,81 (2H, d, J=8,0, H-3, 5), 6,69 (1H, brs, H-2''), 6,65 (2H, d, J=8,5, H-2', 6'), 6,63 (2H, d, J=8,5, H-3', 5'), 6,60 (1H, d, J=8,0, H-5''), 6,31 (1H, d, J=2,0, H-12'), 6,29 (1H, d, J=2,0, H-12''), 6,26 (1H, d, J=2,0, H-14''), 6,23 (1H, t, J=2,2, H-12'''), 6,21 (1H, d, J=2,0, H-14'), 6,20 (1H, t, J=2,0, H-12), 6,11 (2H, d, J=2,5, H-10''', 14'''), 6,07 (1H, d, J=12,5, H-8''), 6,04 (2H, d, J=2,0, H-10, 14), 5,96 (1H, d, J=12,5, H-7''), 5,55 (1H, d, J=5,0, H7'), 5,37 (1H, d, J=5,0, H-7'''), 5,31 (1H, d, J=5,0, H-7), 4,46 (1H, d, J=4,5, H-8'''), 4,30 (1H, d, J=5,0, H-8'), 4,04 (1H, d, J=5,5, H-8); Phổ 13C-NMR (125 MHz, Aceton-d6), δ (ppm): 162,5 (C-11'), 162,3 (C-11''), 160,0 (C-11''', 13'''), 159,6 (C-11, 13), 159,2 (C-4''), 158,2 (C4, 4'''), 157,7 (C-4'), 147,3 (C-9'''), 146,9 (C-9), 142,2 (C-9'), 137,0 (C9''), 133,8 (C-1, 1'''), 132,2 (C-1'), 131,0 (C-1''), 130,9 (C-3''), 130,9 (C-7''), 129,4 (C-6''), 128,0 (C-2, 6), 127,9 (C-2''', 6'''), 127,4 (C-2', 6'), 127,2 (C-2''), 126,1 (C-8''), 120,0 (C-10''), 119,8 (C-10'), 116,2 (C-3''', 5'''), 116,1 (C-3, 5), 116,0 (C-3', 5'), 109,8 (C-5''), 108,3 (C-14''), 107,0 (C-10''', 14'''), 106,9 (C-10, 14), 106,9 (C-14'), 102,4 (C-12'''), 102,0 (C-12), 96,8 (C-12''), 96,5 (C-12'), 94,2 (C-7'''), 94,1 (C-7), 91,2 (C-7'), 57,1 (C-8), 56,9 (C-8'''), 52,4 (C-8') m VH12 (acid protocatechuic): Dạng bột màu nâu nhạt, tonc: 198203°C, ESI-MS m/z: 153,1 [M+H]-; Phổ 1H-NMR (500 MHz, CD3OD): δH 7,45 (1H, m, H-6), 7,43 (1H, d, J = 2,5 Hz, H-2), 6,81 (1H, d, J = 8,5 Hz, H-5); Phổ 13C-NMR (125 MHz, CD3OD): δC 13 115,8 (C-2), 117,8 (C-5), 123,3 (C-1), 123,9 (C-6), 146,1 (C-3), 151,5 (C-4), 170,3 (C-7) n VH13 (dehydrocostus lacton): Chất bột màu trắng; tonc: 5860°C; Phổ 1H-NMR (500 MHz, CDCl3): δH 1,42 (1H, m, H-8a), 1,87 (1H, m, H-2a), 1,95 (1H, m, H-2b), 2,16 (2H, m, H-9), 2,24 (1H, m, H-8b), 2,52 (3H, m, H-1, H-3), 2,87 (1H, m, H-5), 2,90 (2H, m, H-7), 3,96 (1H, t, J = 9,0, H-6), 4,82 (1H, s, H-15a), 4,90 (1H, s, H-15b), 5,07 (1H, br d, J = 2,0, H-14a), 5,27 (1H, br d, J = 2,0, H-14b), 5,49 (1H, d, J = 3,0, H-12a), 6,22 (1H, d, J = 3,5, H-12b); Phổ 13C-NMR (125 MHz, CDCl3): δC 30,3 (C-2), 30,9 (C-8), 32,6 (C-3), 36,2 (C-9), 45,2 (C-7), 47,7 (C-1), 52,1 (C-5), 85,2 (C-6), 109,7 (C-14), 112,7 (C15), 120,2 (C-12), 139,8 (C-11), 149,3 (C-10), 151,2 (C-4), 170,3 (C13) o VH14 (β-sitosterol): Dạng tinh thể hình kim khơng màu, tonc: 133-135°C Chấm sắc kí đối chứng có thể khẳng định VH14 stigmast-5-en-3-ol hay gọi β-sitosterol p VH15 (daucosterol): Dạng tinh thể hình kim màu trắng, tonc: 285°C; Phở 1H-NMR (500 MHz, CD3OD & CDCl3): δH 0,69 (3H, s, H-18), 0,82 (1H, d, J = 7,0 Hz, H-26), 0,84 (1H, d, J = 7,0 Hz, H-27), 0,85 (1H, t, J = 7,0 Hz, H-29), 0,93 (1H, d, J = 6,5 Hz, H-21), 1,01 (3H, s, H-19), 3,18 (1H, m, H-3), 3,25 (1H, m, H-2ʹ), 3,30 (1H, m, H5ʹ), 3,42-3,45 (2H, m, H-3ʹ, H-4ʹ), 3,76 (1H, dd, J = 12,0; 4,0 Hz, H6ʹ), 3,85 (1H, dd, J = 12,0; 3,0 Hz, H-6ʹ), 4,41 (1H, d, J = 7,5 Hz, H1ʹ), 5,37 (1H, t, J = 2,5 Hz, H-6); Phổ 13C-NMR (125 MHz, CD3OD & CDCl3): δC 11,7 (C-18), 11,8 (C-29), 18,6 (C-21), 18,9 (C-26), 19,2 (C-19), 19,6 (C-27), 21,0 (C-11), 23,0 (C-28), 24,2 (C-15), 26,0 (C23), 28,1 (C-16), 29,1 (C-25), 29,5 (C-2), 31,8 (C-7, C-8), 33,9 (C-22), 36,0 (C-20), 36,6 (C-10), 37,2 (C-1), 38,6 (C-4), 39,7 (C-12), 42,2 (C13), 45,8 (C-24), 50,1 (C-9), 56,0 (C-17), 56,7 (C-14), 61,8 (C-6ʹ), 70,1 (C-4ʹ), 73,4 (C-2ʹ), 75,6 (C-5ʹ), 76,3 (C-3ʹ), 79,1 (C-3), 101,0 (C1ʹ), 122,1 (C-6), 140,2 (C-5) q VH16 (acid betulinic): Tinh thể hình kim màu trắng; tonc: 316318°C; Phổ 1H-NMR (500 MHz, CD3OD): δH 4,74 (1H, s, H-29α), 4,61 (1H, s, H-29β), 3,18 (1H, dd, J = 11,0, 5,0 Hz, H-3), 3,00 (1H, m, 14 H-19), 1,69 (3H, s, H-30), 0,98 (3H, s, H-27), 0,97 (3H, s, H-23), 0,94 (3H, s, H-26), 0,83 (3H, s, H-25), 0,76 (3H, s, H-24); Phổ 13C-NMR (125 MHz, CD3OD): δC 14,7 (C-27), 15,4 (C-24), 16,0 (C-26), 16,1 (C-25), 18,3 (C-6), 19,4 (C-30), 20,9 (C-11), 25,5 (C-12), 27,4 (C-2), 28,0 (C-23), 29,7 (C-21), 30,6 (C-15), 32,2 (C-16), 34,4 (C-7), 37,0 (C-22), 37,2 (C-10), 38,4 (C-13), 38,7 (C-1), 38,9 (C-4), 40,7 (C-8), 42,5 (C-14), 46,9 (C-19), 49,3 (C-18), 50,6 (C-9), 55,4 (C-5), 56,3 (C17), 79,0 (C-3), 109,7 (C-29), 150,4 (C-20), 179,5 (C-28) 15 Hình 4.1 Cấu trúc hóa học hợp chất phân lập từ VH 16 3.3 Kết nghiên cứu tác dụng sinh học 3.3.1 Kết nghiên cứu tác dụng chống viêm 3.3.1.1 Kết nghiên cứu tác dụng chống viêm in vitro a Tác dụng chống viêm in vitro cao chiết phần mặt đất loài Nho rừng Tác dụng chống viêm in vitro cao chiết EtOH 96% (VH) cao phân đoạn n-hexan (VHH), ethyl acetat (VHE) phân đoạn nước (VHW) Nho rừng thể qua hình 3.22 Kết cho thấy cao chiết VHE có tác dụng mạnh Hình 3.1 Ảnh hưởng cao chiết ethanol 96% phân đoạn từ phần mặt đất Nho rừng lên mức độ biểu COX-2 mRNA ***: p < 0,001 so sánh với lô chứng DMSO, #: p < 0,05 so sánh với lô đối chứng dương LPS b Tác dụng chống viêm in vitro hợp chất tinh khiết phân lập từ Nho rừng ❖ Đánh giá ảnh hưởng hợp chất tinh khiết phân lập từ Nho rừng lên mức độ biểu gen COX-2 sản sinh PGE2 Các hợp chất tinh khiết thuộc nhóm stilben phân lập từ Nho rừng (VH2-VH11, 10 μM) đánh giá ảnh hưởng lên mức độ biểu COX-2 mRNA sản sinh PGE2 đại thực bào RAW264.7 gây kích thích viêm LPS Kết 17 hình 3.23 cho thấy, (-)-trans-ε-viniferin (VH6) có tác dụng mạnh Hình 3.2 Ảnh hưởng hợp chất tinh khiết phân lập từ Nho rừng lên mức độ biểu COX-2 sản sinh PGE2 đại thực bào RAW264.7 ***p < 0,001 mức ý nghĩa thống kê so sánh với lô chứng DMSO; # p < 0,05, ## p < 0,01, ### p < 0,001, mẫu thử so sánh với lơ dùng chất kích thích viêm LPS ❖ Nghiên cứu chế chống viêm in vitro hợp chất tiềm VH6 ((-)-trans-ε-viniferin) phân lập từ Nho rừng 18