BỘ Y TẾ VIÊN VỆ SINH DỊCH TẾ HỌC CHƯƠNG TRÌNH NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CẤP NHÀ NƯỚC 64B ĐỀ TÀI 64B-0403
“NGHIÊN CỨU ỨNG DỰNG ĐỀ SAN XUAT THU CAC CHE PHAM
SINH VAT VÀ VACXIN DUNG CHO VIEC CHAN DOAN CHINH XÁC BỆNH SỐT XUẤT HUYẾT DENGUE (SXHD) , VIEMNAO
NHAT BAN (VNNB) VA TRONG DU PHONG BENH VNNB, *
GOONS THING NOME
Trang 2CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI:
GS.TS HOANG THUY NGUYEN
NHUNG NGUOITHUC HIEN:
'PTS Huỳnh Phương Liên BS Nguyễn Mạnh Khương |
KS Đồn Thị Thủy ¡ ÐS Nguyễn Thị Hịa |
BS Nguyén Thi Hong Hanh
BS Phan Thi Nga PTS Truong Uyén Ninh
'ẤS Nguyễn Kim Việt BS Lê Văn Điệt
BS Nguyễn Anh Tuấn K§ Hồng Minh Tuyết
KTV Lê Kim Phượng KTV Nguyén Thị Thành
CO QUAN THUC HIEN:
Trang 31, SẢN XUẤT THỬ NGHIỆM VĂC-XIN VIÊM NAO NHAT BAN TINH KHIET VA BAT HOAT A DAT VAN DE
1, DAC DIEM VIRUT HOC VA LICH SU CUA BENE:
Bệnh viêm não Nhật Bản (VNNB) là bệnh cĩ hội chứng não cấp, gay ra bồi vizut VNNB, 1
thành viên của nhĩm B các Arbovirul, thuộc gia đình Togaviriđae, giịng Flavivirut Quan sát dưới
kinh hiển vì điện tử cho thấy hạt vicut tỉnh khiết cĩ hình quả cầu, đường kính trung bình 40-50nm Cấu
trúc của virut cĩ 3 thành phần: lơi nucleocapsid, vỏ glycoprotein và bề mật của hạt viru Bề mặt của
hạt virut mang kháng nguyên ngưng kết hồng cầu và hoại (inh trung hịa Vật liệu di truyền là ARN Bệnh VNNB lần đầu tiên được biết năm 1871 tại Nhật Bản Một vài vụ dịch xảy ra ư Nhật năm 124 và virnt đã được phân lập bằng cách tiem truyền vào não thỏ Năm 1934, Hayashi tiêm truyền vào não khi; đến năm 1935, Kasahara phan lập dược virut từ não 1 tử thi ð Tokyo Ching Nakayama da dude Xác định là Prơtơtfp củagirut VNNB Ngay từ năm 1930, người ta đã nghỉ ngd vécts (ruyền bệnh là muồi Năm 1938, Mianaura và CTV thơng báo đã phân lập dude virut VNNB tir mudi Culex trilaeniorhynehus
Những nghiên cứu của Scherer và CTV ị Nhật Bản đã xác định rằng lon va chim là ố chứa virut, Culex tritaeniothynchus 18 véeto truyền virit từ ổ chứa sang cho người
Virgt VNNB 06 ai tính với tế bào thần kinh, viral nhan lên rất tốt trên tế bảo não, đặc biệt là não chuột ổ Virot cịn nhân ư tế bào tiên phát như tế bào thân chuột đất vàng, thận lọn, thận khi, tế bào phơi ga Virut cố thể nhân lên ư các đồng tế bào thường trực như các dịng tế bảo cĩ nguồn sốc từ muối, tế bào Vero, LLC-MK2, BHK21, Những dịng tế bào này dược sử dung trong kỹ thuật tạo đầm hoại tử Virut nhân lên ư tế bào não trong giai doạn cấp gây ra hiện tượng phù nề ị não, xung, huyết và xuất huyết vì thể làm hủy hoại tế bào thần kinh Những thay đổi này xây ra chủ yếu Ư chất xám, Thần kinh trung ưởng bị tổirthương gây ra rối loạn chức năng hơ hấp, tuần hồn, thận,
lách Nhiễm viru quá đường rau thai cũng đã được chúng mình 2 BỆNH CẢNH LÂM SÀNG:
“Tỉnh nghiêm trọng của bệnh biểu hiện ư bệnh cảnh lâm sảng Thời kỳ ú bệnh Lử 6-16 ngày, sau đồ khơi bệnh ồ ạt bằng các triệu chứng sốt cao, đau dầu, buồn nơn, chĩng mặt, hoa mắt và lỉ bi O trẻ nhỏ thường cơ đâu bụng và la chảy Tiếp theo lã các triện chứng thần kinh: cũng gầy, số ánh sáng, rối loạn tỉnh thần và trạng thái bị kích thích, nặng hĩn là liệt nửa ngưũi trên boặc liệt tồn thân Trẻ em
thường lên cịn cĩ giật; ð người lĩn tý lệ này đưới 10% Từ vong xăy ra vào ngày thứ 5 - thứ 9 Giai đoạn cấp cĩ thể qua đi hoặc bệnh nhân khối, hoặc kéo đài với các biển chứng thân kinh, tim, phối
IgM xuất hiện trong mầu và Irong nước não tủy của bệnh nhân Ư máu ngoại vi, bạch cầu khơng tăng, tế bàơ limphơ 'T giảm Viêm đường tiết niệu võ (rùng, tìm thấy hồng cầu và alhumin trong nước tiểu áp lực nước não tủy tăng, xét nghiệm cĩ bạch cầu, Prơtein tăng nhẹ (50-100mg5) Điện não đồ khơng bình thưởng Ư 706 sổ sống sĩt cĩ rối loạn tâm thần hoặc liệt vàn động, đặc biệt là ð trẻ em
Trang 4
3 CHẨN ĐỐN PHỊNG THÍ NGHIỆM: 3,1, Não tử thì:
- Cổ thể tìm kháng nguyên virut VNNB bằng kỹ thuật miễn địch huỳnh quang,
~ Phân lập virut bằng cách tiêm truyền vào não chuột hoặc trên nuơi tế bào muỗi đồng C6/36
3.2, Máu và nước não tủy:
~ Phân lập virút từ máu và nước não tủy rất khĩ cĩ kết quả vì virut tập trung ị hệ thần kinh, - Xét nghiệm huyết thanh kép de tim đọng lực kháng thể (máu 2 cao hĩn máu l ít nhất là 4 lần) bằng kỹ thuật ức chế ngưng kết hồng cầu và kết hợp bổ thể Sử dụng kỹ thuật miễn dich men ELISA đế phát hiện kháng thể IgM hoặc lgG
4 DỊCH TẾ HOC VNNB:
Bệnh viêm não Nhật Bản được phan b6 d chau A bao gồm Nhật Bán, Trung Quốc, Dai Loan,
“Triều Tiên, Philippin, hầu hết các nước Đơng Nam A va An Do Hàng nấm ð Nhàt cĩ khống 20,
trường hợp, Ị Trung Quốc trên 10000 trường hợp Gần dây tỷ lệ này cĩ giảm di, nhưng ư Ấn Độ, Nepal và phía Bác Đơng Nam Á thì lại tăng lên vào những năm 197 Dịch bùng nố ð Ấn Dộ năm 1973 và năm 1983 cĩ (ren KLGQO trường hợp (Bernard N.Fields -David M.Knipe), Thái Lăn cĩ 3,3 trường họp/100.000 dân (Somsacl)
Ơ Việt Nam bệnh xây ra ư hầu hết các tình phía Bắc và địch bệnh nghiêm trọng vào những, tháng hè, cao độ là tháng 5 - tháng 7 Nhìn vào bản đồ địch tế học ta thấy: 18 tỉnh phia Bắc, tren địa bàn của 107 Quận, Huyện, thị cĩ lưu hành VNNB trên tổng số 262 Quận, Huyện, thị (40,896), Trong,
khi dồ ư miền Trung và miền Nam chỉ cổ 5 trên tổng số 148 Quận, Huyện, thị cĩ lưu hành dịch
Theo thơng báo dịch tế học (số 69/9/1989) từ năm 1976-1988 số mắc hội chứng não cấp thấp nhất là năm 1981 với số mắc 1095 trường hợp và chết 298 trường họp (27,29) cao nhất là năm 1985
với số mắc 3381 và chết là 669 trưởng họp (19,8%) Tỷ lệ mắc/100.000 dân là 2,84-5,18 và tý lệ chết 0,5-1,3 Trong hội chứng não cấp cĩ 75% la viêm não Nhật Bản, Nhĩm tuổi cảm nhiễm nhất là 1- LŨ tuổi đặc biệt là trẻ <5 tuổi, Ơ miền Bắc nuốc ta bệnh lưu hành quanh năm Yếu tổ ảnh hưởng đến tỷ lệ mắc là chỉ số mật độ vécto, sau đĩ, là ổ chứa và sau cùng là tuổi cảm nhiễm Muỗi Culex
trilaeniorhynchus là vécto chỉnh truyền bệnh - Muối đẻ trứng và phát triển trong các ao hồ, đâm lầy
~ chim và lọn là ổ chứa trong thiên nhiên Vùng khí hãu nĩng virul xuất hiện ư muỗi vào tháng 7, sau 1-3 tuần thì lộn và chim nhiễm viruL Vài tuần tiếp theo virul được muỗi truyền cho người Vấn đề phịng bệnh bằng điệt vécid thực hiện rất khĩ khan Muỗi Culex trítaeniarhynchus sống trong các tuộng lưa, đầm lầy, ao bồ trên J điện rộng khĩ diệt, tiêm phịng vacxin cho lợn cũng rất khĩ khăn vì sau 4 tháng tuổi, lọn mồi hết miễn địch me truyền và 6-7 tháng luổi đã giết thị, do đĩ khoảng cách cịn lại để tiêm vácsin rất ngắn Vậy vácxin phịng bệnh cho người là cần thiết và là biện pháp tích cực nhất
5 VĂCXIN PHỊNG BỆNH VNNB:
Mitamura va CTV (1936), Takenouchi và CTV (1938) đã nghiên cũu sản xuất (hữ vàcxin 'VNNB từ não chuột được tiêm truyền virut VNNB và bất hoạt bằng formalia Sau đĩ, Takagy và Takenouchi thủ cơng hiểu của vàcxin này bằng cách gây miễn dịch trên chuột rồi thử thách bằng chủng
Trang 5virut độc lực, Kết quả này được khẳng định bằng cách phát hiện kháng thể trưng hịa ơ khi sau khi tiem väccin Milamura cho thử trên thực địa và nhận xét cĩ đáp ứng miễn dịch ư vùng cĩ lưu hành dịch và đáp ứng kém hon ư vùng khong cĩ lưu hành địch
Nam 1944, Kii thong bdo v8 vacxin bất hoạt thử trên ngựa cĩ cơng hiệu tốt
Năm 1946-1949, Mỹ và Nhật đã hợp tác nghiên cứu về cơng hiệu của văcxin VNNB đo Nhật sản xuất Đã chọn vùng cĩ lưu hành dịch ở Nhật là Okayama Kết quả thống kê cho thấy tý lệ mắc giầm 1/3-1/4 Đến thơi gian này, vãodin sản xuất đĩn giản là hỗn dịch não chuột ahiểm virut VNNH được xit ly bang Formalin,
Năm 1954, trong việc sản xuất vacxia VNNB ư Nhật đà cĩ yêu cầu kiểm dịnh chất lượng về ham hiong Protein, Tu đĩ Bộ y tế Khát thiết lặp hệ thống sàn xuất và kiếm dink vacxin VậcxÍn được thữ trên thực địa ư 4 vùng cĩ lưu hành dich: Tokyo, Toyama, Shiga v8 Osaka va 2 vùng khơng cĩ dịch là Sapporo và Kitami để đánh giá cơng hiệu và quan sat các phần ứng phụ
Năm 1957, việc sẵn xuất đi vào kế hoạch va chat hong dude nang cao: hàm lướng Prơtêin (rong vexin là ,2mgjml
Năm 1962, 2 nhĩm nghiên cửu vicxin VNNB [a "Biken" 6 Osaka va "Nisseiken"ð Tokyo nghiên cứu tình chế vaexin bang siêu ly lâm hạ thép bam Itong Protein trong vacxin xuống 0,02mg/ml
Năm 1965, Nhậnsản xuất vagxin VNNB (it nd chuột được xử lý bằng Prơtamin sulfal, bất hoạt bang formalin va sau cing tỉnh chế bằng sieu ly tâm Từ đĩ chất lượng vàcxin VNNB sẵn xuất ngày cảng cĩ chất lượng,
"Từ năm 1959 đến 1981, Trung Quốc nghiên cứu sản xuất vàcxin sống giảm độc lực bằng chúng virut VNN độc lực, truyền 110 lần trên tế bào phơi gà, sâu đĩ cấy truyền trên tế bào thân chuột đất 109 lần vẫn cịn thấy cĩ yếu tổ gây độc thân kinh (Li và CTV, 1966) Chũng virur này tiếp tục được lựa chọn bằng phương pháp tạo đám hại tử (chủng 12-1-7),
Nam 1973, Yuva CTV sử dụng chúng 3-8, cũng bất nguồn tứ chúng 12-1-? và giảm độc lực của virut bằng tia cục tím,
Năm 174, Chen và Wang chạn lọc virut thuần khiết về di truyền bằng kỹ thuật tạo dám hoại tử để sản xuất vacain, Tht nghiém vacxin này trên 8000 trẻ em ư vùng khơng tư hành địch, kết quả 50⁄8 cơ đáp ứng kháng thể,
Năm 1981, Yu và CTV lại truyền chủng này Š lần bằng đường tiêm dưới da cho chuột số sinh, đạt được một giống giảm độc bực cao (chủng 14-2), tiếp tục la chọn và cuối cùng «6 được 1 giống nhan lên mạnh hĩn, tính miễn dịch khá hon so với chúng ban đầu
Tứ nam 1968, vaoxin được tỉnh chế ở trình độ cao hon bằng siều ly tăm Thử nghiệm thực dị trên người đã được tiến hành rộng rãi ư Thái Lan và đạt cơng hiệu 91% Vãctin này đã được tổ chúc tiêm phịng trong quần thể dân ex đơng ư Nhật Bản, Đài Loan và Trung Quốc Gay miễn địch 2 lần, cách nhau 7-14 ngày (mmÌ=I liều); liều nhắc lại tiêm sau 3-4 nam Quan sắt dịch tế học trên quần thể dân cử này cho thấy khơng cĩ phân ứng phụ và khơng cĩ trường hợp biến chững viêm não sau khi iếm vaexia,
Nam 1971, Fukai yêu cầu độ tỉnh khiết của viexin VNNB phải cao: hàm lượng TCA-Prưtein khơng quá 001mg/mlL
Trang 6cửu để thử nghiệm i 6 GIỐNG VIRUT VNNB DE SAN XUAT VACXIN:
‘Ching Nakayama được chọn để san xudi vicxin ding cho ngưi và dong vật, nhưng cĩ một số
chying virut VNNE phân lập được cĩ tính kháng nguyên khdc vai virut Nakayama, cho nên một số tác, giả đã nghiên cứu vấn đề này Đây là một cơng việc hết súc phức tạp, rất khĩ phân biệt nếu đùng các phướng pháp huyết thanh học đĩn giản như các phản ứng UCNKHC, KHBT và trung hịa
Nam 1962, Okuno và CTV sử dụng kỹ thuật hếp phụ kháng thể c chế ngưng kết hồng cầu và đã (hành cơng trong việc xếp loại 22 chủng phân lập được hầu hết ư Nhật Bản tữ 1935 đến nay thành 3 tập miễn dich;
~ 1-58 và Nakayama - NIH: týp đại diện là "1-58", + 17 chủng khác đại diện là "JaGAr-01";
- Chũng Nakayama-REVLL cĩ tính chất giữa hai chủng trên xếp loại là "tớp trưng gian”; - Những chũng cịn lại khơng xép loại
Aizawa và CTV, Han và CTV đã chứng minh được một số tính kháng nguyên khác nhau giữa
chủng Nakayama-NIH và nhiều chủng kháe bằng kỹ thuật trung hịa giảm dám hoại lữ
Năm 1968, Katsurađa đùng chủng JaG Ar-01 và Nakayama-NIH sản xuất văcxin và so sánh kết quả đáp ứng kháng thể trên ngưỡi ư Hokkaido là vùng Khơng cĩ lưu hành VNNE Kết quả cho thấy
hiệu giá khẩng thể trung hịa cao ư virut cùng loại và thấp hon Ư virut khác loại
Ngày nay, văcxin bất hoạt và tỉnh chế đã được sản xuất từ 5 chủng Nakayama-NIH, Nakzyama- yakken, JaGAr-01, Yokoshiba (YS) và TS 2 ching Nakayama-MIH va Nakayama-yaltken c6 nguồn
gốc mbit nhau (phan lập nam 1935 từ não người), Nhật Bán sử dụng chúng Nakayama-NIH để sân
xuất vãcxin ding cho người và chúng Nakaya ma- Yakken để sản xuất văxÍn đùng cho động vật
7 TIÊU CHUẨN CHỌN GIỐNG VIRUT SAN XUAT VACXIN:
Từ năm 1935 đến 1945, luại văcxin làm từ não chuột và bất hoạt bằng Formalin được sản xuất ư Nhật Bản và chủng sản xuất là Kalinina dược phân lập năm 1935 tì não tử thi Chủng này cĩ tính kháng nguyên khơng thay đổi (Mitamura),
Sau chiến tranh thể giỏi lần thứ 2, chủng Naksyama-NIH được sử dụng rộng rãi để sẵn xuất vacxin viem não cho người và cả cho động vật Chúng Naksyama-NIH cĩ những tiêu chuẩn sau:
1- Chủng dùng sản xuất phải cĩ khả năng sinh kháng (hể dịch thể và kháng thể trung gian tế bào để cĩ (hề kháng lại các chũng virut VNNB hoang dại,
3- Chúng virut nhân lên tối trên vật chủ hoặc trên tế bão nuơi để cĩ thể sẵn xuất vácxin đại trà;
3- Tĩnh bên vũng về nhiệt của chũng tốt, đăm bảo väcxín dạng dung dịch cố hiệu lực ít nhất 1 năm và lâu hĩn nếu được đơng khơ và bảo quản ư 4°C;
4- Chúng sản xuất vãcxin dâm bảo an tồn, khơng sinh ra các phân ứng phụ: phản ứng lại chỗ,
phản ứng tồn (han sau khi tiêm vãoxin
“Trong tiêu chuẩn chọn giống theo Medhat A.Darwish và William Mcd, Hammon thì virut cần đội 4 tiêu chuẩn:
1- Chúng phải (huần khiết về mặt di truyền;
2- Chùng phải thuần dịng: sẽ luơn luơn cổ định đường chuẩn bất hoại,
3- Chủng khơng gây độc thần kỉnh để đẳm bảo an tồn;
Trang 7Nhiều tác giả chứng minh chủng Nakayama-NIH đạt tất cả các tiêu chuẩn trên và nĩ vẫn là chủng hiện nay, Viện Biken, Nhật Bản dang ding để sản xuất vàcin VNNB
3, TIẾP NHẬN CHUYỂN NHƯỢNG KỸ THUẬT SẢN XUẤT VĂCXIN VNNR: Để gĩp phần giảm tý lệ mắc, tỷ lệ chết và đi chứng thần kinh đo virut VINNB gây ra và nhằm đáp ứng nhụ cầu ngày càng cấp bách về việc phịng bệnh VNNB mội cách đặc hiệu, Khoa virut (Viện 'VSDTH Hà Nội) đã nghiên cứu sản xuất thử nghiệm vãcxin VNNB bất hoạt và tỉnh khiết, thơng qua việc tiếp nhận chuyển nhượng kỹ thuật sản xuất và kiếm định väcxin này từ Viện Biken (Trường ĐH "Tổng họp Osaka, Nhật Bản) Đây là một qui trình sẵn xuất rất phức tạp, địi hỏi ứng dụng các kỹ thuật
Trang 8B VAT LIEU VA PHUGNG PHAP
L THIET BI, SUC VAT THI NGHIEM, SINA PHAM VA HOA CHAT: 1,1, Sinh phim co ban:
~ Chũng virut viêm não Nhật Bán Nakayema (NIH, Nhật Bán), ~ Vác-xin viêm não Biken Nhật Bản,
~ Vãcdn VNNB chuẩn Biken, Nhật Bản 1,2, Sức vật thí nghiệm:
Chuột Selss 3 -# tuần tuổi, - Chuột ổ 1 - 2 ngày tuổi, ~ Chuột lang 250 - 300 g, - Thỏ 2 - 3,5 kg, - Trững gà cĩ trống, Ngồng 1o: 3 4 kp, %
1.3 Phịng nuơi chuật dã gây nhiễm với virút Nakayama (diện tích 3m`) Phúng thỉ nghiệm để sản xuất vơi các thiết bị:
- Bường vơ trùng,
- Máy siêu ly tám 65.0M) vịng/phút "SORVAL" - Thiết bị siêu lọc Amicon, ~ Máy ly tâm lạnh ‡ ŠC 10.000 vịng/phút, - Tủ ẩm CO2, - Ta dm 37°C, - May chan khong, - Máy húL ẩm, + May diều hịa nhiệt độ, “ ~ Tủ lạnh -80 `C, ~ Tủ lạnh 4C, ~
- Bình nÍ-4o lơng git ging virat, = May đồng khơ sinh phẩm và vắc-in,
Trang 9
- Lị sấy tt,
- Máy giật (để rung khơ chuột sau khi rữa) 1.4 Dụng cụ thủy tĩnh ngoại trung tính:
~ Chai to loại 1000 m], 2000m], 5000 m], 10/000 mì, ~ Chai bé ioai 100 ml, 200 ml 500 ml,
~ Chai hình nĩn loại 100 m], 20 mì, 500 ml, 1000 mi,
~ Cốc thủy tĩnh loại 50 ml, 100 ml, 200 mi, $00 ml, 1000 ml, ~_Ống đong 5U mì, 100 ml, 200 ml, 500 ral, 1000 ml, 2000 ml, ~ Chai Roux audi té bao loai 1000 ml,
~ Chai vuơng nuơi tế bào loại 250 ml,
- Hộp lồng đường kinh 10 em,
- Pipét Pasteur,
= Pipét chia độ: | mi, 2 ma, S ma, 10 ov, 20 ml, 30 ml, = Phéu lọc loại đường kính 5 em, 10 cm, 15 cm, - Bình edu Joai 250 mi, 500 mi,
~ Bình cầu khía để tách tế bào loại 250 mI, $00 ml, ~ Châu loại 1000 ml, 2000 ml, ~_ Ống ly tâm loại 50 mI, 200ml, ~ Lộ 5 mũ để đựng vàcxắn (cĩ cả nút cao su và nút nhƯm) 1,5 Mơi trương, hĩa chất, sinh phẩm thiết yếu nhập ngoại
~ Mơi trường M199 khơng cĩ dõ trung tink (dang bội được đồng gối 11) DIFCO
+ Moi tnéag MEM (dang bot dong goi 1) s ~ Lãctalbumin - hydzolysat m ~Trypsin - " ~ Yeast extract & ~ Gielain - ~ Thimerosal ELANCO ~ Formalin (37%) WAKO - Tween 80 DIFCO
~ Prơtamin sulfat WAKO
- Aménium sulfat WAKO
- Albumin bo (BA) ~ Huyết thanh bê (CS)
- Huyết thanh bê bào thai (FCS)
Trang 10-Glu0z — - Na - GiulamaL - EDTA -2Na ~EDTA -3 Na -EDTA-4Na - Agat Noble - Đồ phenol - NIOH -HCL = NagHPO4.12H20 - NaH:PO¿2H2O acl -KCI - KH;PO - CClz2H2O - MgSOa.TH:O = NaHCO3 - Erythromycin - Kanamycin - Vieeilin - Fungizone waco
- Kháng viêm aio Nakayama IgG Vien Biken, Nhật Bản
- Khang viem no Nakayama IgG gắn Peroxydava Viện Biken, Nhật Bản - Té bo BHK21 -Màng lục millipore: — AP25 (75 xm) HA (045 jem) PH (0,30 xm) ~ G6 (020m) Daron mesh, 1,6 Dụng cụ piastic dùng 1 Tần; ~ Bơm tiêm 1 nl, 2 ml, Š mf, 10 ml, = Pipét 1 ml, 2 ml, $ ml, 10 mh, ~ Hop long ding kinh Sem, - Tam lam ELISA,
= Chai audi té bao $0 ml, 100 ml - $00 ml, - :Ống ly tâm loại 34 ml, 100 ml
Trang 11~ Pipetman Logi 100 1, 200 1, 1000 4, ~ Kim gặt não đường kính 2 mm, - Lo khơng khí, - Nat cao su các loại cho chai thủy tỉnh, + Giấy Parafin, - Kèm Kocher, - Kèm cĩ mẩu, - Kềm khơng cĩ mấu, ~ Kéo tọ phẫu thuật,
+ Kéo nhỏ loại phẫu thugt mắt, - Bom tiém ty dong Cornwall, - Quần áo vơ trùn/ - Mũ và khẩu trang, - Vải gác, - Bơng thắm nước, - Bơng mã, - Gáng cao su,
= Một số đồ dùng cho phịng thí nghiệm: khay men, chậu nhơm rửa chuột và rửa đụng cụ, bếp điện, soong luộc đụng cụ
2 SẲN XUẤT VÀ BẢO QUẦN GIỐNG VIRÚT VIÊM NAO (NAKAYAMA)
DB SAN XUAT VACXI
2-1 Não chuột (80g) từ 225 nào chuột được gây nhiễm và liệt + 0,81 M/75 PBS, pH 8,0, da duoc
lâm lạnh ð 5°C rồi cho vào chai 1 lít
Nghiên đồng nhất 10.000 vịng/phút trong 2) phút để cĩ dược hốn dịch nào 10% (Trong quá
trình nghiền giữ õ nhiệt độ 4*C bằng cách đặt chai não vào chậu đựng đá)
2.2, Ding phéu cĩ đường kính 1Ũ cm đặt vào chai 2 1 và phếu đã chuẩn bị cĩ phủ 1 lốp gạc 1.3 Hỗn dịch virút đã nghiên đồng nhất 10% dược lọc qua gạc
2.4 Lự tâm hỗn địch trên ư tốc độ 5000 vong/phiit, $0 phuit, 4°C Nước nổi (740 ml) được rĩt vào chải 1 L
2.8 Chai hỗn địch virut được đạt vào chậu dá Cho vào từ tử 74 ml Protamin sulfat 19% (06 khuấy từ trong 30 phat)
3,6 Lự tâm 5000 vịng/phút trong SŨ phút, 4°C, Nước nồi cho vào chai 1
2.7 Dùng phốu cĩ đường kính 10 cm, đưộc phủ với màng lọc nylon
Trang 128, Lọc vơ trăng; qua các màng lọc 293 mm đường kính: 0,45 em, Dacron, 0,8 4m, AP25; làng lọc được xử lý với PBS, pHi 7,4 cĩ 0,05%: gielatin;
~ Sau đĩ, lọc 800 m hỗn dich ching virut
3.8 Đĩng hỗn dich vir6t vào ống theo nhủ cầu: 2 mÍ, 5 mi ~ Ống đà chuẩn bị đặt lên chậu đá; ~ Mỗ lớp giấy bạc; ~ Dũng bom tiêm tự động cho nhợ nhàng hỗn dịch virút vào từng ống tránh đính lên miệng dng 2.19 Hàa kín ống 3,11, Bão quản (rong ni-to long 2.12 Thữ vơ trùng
2-13 Chuẩn độ hiệu giá: thường hiện giá là (1,2 x 1U? PEU/ml hoặc 10”° LD 50/0/03 ml 3.14, Khi dùng, lấy ống hỗn địch virát giống ra, cho tan chảy dưới vời nước,
“Chế ý: đeo găng và kính để đăm báo an tồn
Pha theo hiệu giá đã định: 1 - 4x 10” PFU/ml, tiem cho chuột để sản xuất văcxin
%
3 CHUAN BỊ CHỦNG VIRÚT ĐỂ SAN XUẤT VÄCXIN:
10
1 L4y ống chủng virit bio quân trong nỉ-tở lỏng Cho tan chảy đưi vịi nước
2 Pha hỗn dịch vì rút ð nơng độ I - 4x 10” PEU/mi trong mơi trường M199 cĩ 0226 giêlatin Khối lượng pha bao nhiêu (heo yêu cầu săn xuất, nh theo cơng thức:
Số chuột tiem x 0,05 ml trong châu đá (42C),
3, Dùng bơm tiêm loại 1 mi và kim tiêm não Tiêm vào vùng não giữa tai và mãi vơi khối lướng 0,03 ml/con
4, Chuột tiêm xong được cho vào lồng đã chuẩn bị, Theo rơi, nhật bỏ những chuội chết
do tiêm sau 24 gid, ã
Trang 13
4 SỐ ĐỒ TIÊM VÀO NÁO CHUỘT, GẶT VÀ XỦ LÝ BẰNG PRƠTAMIN
SULFAT:
“Chuẩn bị hỗn địch giống virat “Tiêm vào nào chuột
Chọn L nhật chuột liệt sau 72 gid GAL nao và bảo quản nào đã gat
Chuẩi bị nghiên đồng nhất não trong M/7S PBS, pH§ (2096)(1H) Jy tm 5000 vony/phal trong 50 phút ð 42C Nude in (IN) ¿ Xi lý với Prơtamin Sulfat Nghiên lại tong PBS, pHa (2H) (1,5 mg/ml ư nồng dộ I
cuối cùng) Nước nổi (2N)
Xitly Protamin Sulfat (0.9 mg/ml)
Trang 14
5, THEO DOI GAT NAO CHUỘT LIỆT:
5.1 72 gid sau khi tiêm chủng virut (Nakayama 1-4 x 10" /ml, tiêm 0,03 mÍ vào não) chuột cố
các triệu chứng sau:
~ 1 chân sau liệt và chội ra;
~ Tĩm vào thất lưng xách lên thì chân đuổi ra;
- Thả chuột xuống, tự nĩ khơng đứng dậy được §.2 Lưới rửa chuột đặt rong chậu nước đấy
5.3 Dùng béo cất vào nách chuột cho chảy hết máu Cho chuột vào lưới đã chuẩn bị ở trên, Lúc ơy mơ vơi nước chây ïLmuội sào bể rữa chuột Khoảng 300 con chuột rũa vào 1 lưới, L châu
5:4, Nhấc lối rửa chuột sang 1 châu rửa khác cũng bằng nước vời; chuột đưộc rữa 4 lần với nước vời như vậy
3,5 Sau đĩ rửa 1 lần với dung địch 0,002% Hibiten $6, Rửa 4 lần bằng nước cất
5/7 Thả lưới rửa chuột vào máy quay làm khơ; quay trong 1 phút cho ráo nước 58, Chuột đã khơ chuyển qua phịng gắt
§.9 Xếp chuột vào khay, 50 chuột cho mỗi khay 3.10, Mơ bộc lộ não chuột trắng buồng võ trùng,
ELLE, Hat nao bằng kim nối liền với hệ thống bom hút chân khơng 5412, GặL 200 não chuột vào 1 chai Day bằng nút cao su
3.13 Bảo quản ngay vào ti lạnh - 8ŨĐC, càng nhanh càng tốt
‘ ¢ ở
6 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN ĐỒNG NHẤT VÀ XỦ LÝ HON DICH VIRUT BANG PROTAMIN SULFAT:
6.1, Lựợ dựng não chuột lấy từ -B0°C ra, để ð nhiệt độ phịng trong vài phái, đùng thìa thép Khơng rỉ xến ra thành mảnh nhỏ, tồi cho vào bình thép khơng vĩ để nghiền đồng nhất Irong M/75 PBS,
HBO dé cĩ ndng do 20%, te d6 10,000 vong (phút trong l5 phút 6.2, Phéu loc dvge dal 4 Lop ga
6.3 Hỗn dịch não 20%: được lọc qua 4 lớp pac 6.4 Hồn dịch này gọi là "1 H"
6:5 Ly tam 5000 vịng/phút trong 50 phút Lấy nước nổi gọi là "1 NỈ
6:6, Cho vào từ từ Prơtamin sulfat 1% để đạt nồng độ cuối càng là 1 #g/1 ml %7, Khuấy từ từ trong 30 phit 84°C
6.8 Ly tâm 5000 vịng/phút trong 50 phat 6 4°C Lay nước néi loc qua miang nylon: đồ là "2N", 6.9 Cho thêm Eormalin đế cĩ nồng độ cuối cũng 0,06% và 0,005M EDTA - 3Na
Trang 157 TƠM TẮT SĨ ĐỒ TINH CHẾ:
Tiến địch virúL bắt hoạt 700 m1
Loc qua mang Nylon - Thêm vào 1/100 thể ch của EDTA - 4Na 1%,
Ly tam 5000 vongiphat, 5U phút, 49 Cơ đặc băng siêu lọc để cĩ được 35ml
'Tửa Arhơnium sulfat bão hịa 1/3 thé tích (10,2 ml) phút, 4°\ Ly tam 5000 vịng'phút, § | Nước nổi loại bỏ cận | `
Lấy 16, mi nước nổi cho vào ống ly lâm
‘Thém vido 16,5 ml Sucroza 409 cầm cho thẳng xuống đầy Siêu ly lâm 26.000 vongphot trong 26 gid (May Sorval)
Lấy cặn”+ 5 ml hén dich virút ð đấy (Tráng ống bằng M/75 PBS, pH1,4 cĩ 0,125
và 0,01% EDTA - 4Na) giclatin
Tiộn cáê hỗn dịch virút thu được lại, “Thẩm tích trong M/75 PBS;pH 7.1 cĩ 005% Formalin "Thêm M199 cho đổ 35 mí (1/20 khối lượng bạn đần) 2% Thimerusal nồng độ cuối cùng (009%, t 10% Tween 80, nồng độ cuối cùng 0/0542 i
Loe vơ trùng: - Xử lý măng lọc với 209 ml M199,
Trang 168 TINH CHẾ VĂCXIN VNNB TÙ HỒN DỊCH VIRÚT BAT HOẠT:
$1 Hin dich vicút đã bất hoạt bằng formalìn để ð 4°C sau 6Ú ngày, được lấy ra từ phịng lạnh
Kiểm tra tủa đẹp: nước nồi trong hay bị nhiễm khuẩn
8.2 Lau miệng chai sạch bằng khăn tấm cồn MƠ bỏ nút cao su, miệng chai phủ bằng giấy tầm cồn 83 Lọc loại bổ tủa qua nylon mesh (2 - 3 lớp mesh dùng lọc cho 20 lít hồn địch)
8.4, Hồn dịch vaodn thơ đã lọc được ly sâm 5000 vịng/phút trong 50 phút ð 4°C, lấy nước nổi Lấy mẫu để định lượng khẩng nguyên (ELISA) và TCA - protein
8.5 Co đặc vàccin bằng thiết bị siêu lọc Amicon, để ð nhiệt độ đ°C, Chú ý theo dõi lọc thưởng, xuyên và cho thêm vãcxin từ từ Nước loại sau sieu lọc phải gi lại vào { lợ vơ trùng Lượng văcxia cơ
đặc hàng 1/20 khối lượng ban đầu Nếu cơ đặc 500 mI vácxin thì cịn lại 25 rnl - sau đĩ tráng loc bang M15, PBS, pH 7,4 co 0,01% EDTA - 4Na, gielatin 0,12%, để thụ lại được 100 ml vãcxin
8.6 Lấy mẫu thử: - Kháng nguyên (ELISA) 3 ml,
- TCA - Prơtẹn 2 mí 8.7 Tia Amonium sulfat bao hda: 1/3 thé tích
Vacuin sau khi ch dac bang siêu lọc để ư 4C (chậu đá) Nhỏ amơnium sulfat bào hịa từ từ,
Vita nhỏ giọt vừa lắc nhẹ chai vãcxin, sau đĩ cho khuấy từ 30 phút 6 4°C DEO 4°C qua dém cho ta các protein của chất nào cộn lại
8.8 Ly tâm 5000 vịng/phút trong 30 phút ư 4°C, để loại bỏ tủa
8.9 Lấy nước nổi để siêu ly tâm bằng máy siêu ly âm Hitacbi 35p, rotor rp-2), 10 ống (94mlống) Ly tâm 19.000 vịng/phúi trong 13 giị Trước khi ly (âm nhỏ kiểm tra máy, làm vệ sinh và lau đầu rotor, Sau khi ly âm xong cùng nhỏ làm vệ sinh máy và kiểm tra máy,
"Trong nghiên cứu sản xuất thực nghiệm chúng tơi sử dụng máy siêu ly tâm Sorval (Mỹ) loại lý tâm 8 ống, rotov nhỏ, 34 ml/ểng, Siêu ly tâm với suerơza 40% Trước hết dùng pipét cho 16 ml sucrơ⁄a 40% vào ống, sau đĩ nhọ nhàng cho 16 mi hỗn địch virút cơ đặc lên trên:
- Can bằng từng cặp ống (cần thật chính xác),
- Nhẹ nhàng đặt vào ro¡or từng cặp ống da can bang,
~ Đặt rotor vào máy ly tám, kiểm tra lại nắp đậy, theo thứ tự, tốc độ, thời gian, nhiệt độ, chân khơng, - Khởi hành máy vận động và tự đơng báo hiệu thời gian, tốc độ, chân khơng, Bao giỏ đủ tốc độ thì tính thơi gian từ đĩ Với máy siễu ly tâm Sorsal th tốc độ là 26.000 vịng/phút trong 26 gid
8.10, Tắt máy, bao gid may dimg băn, mơi mồ náp, [ay rotor ra nhẹ nhàng đạt vào buồng vơ, trùng Lần uot dat các Ong vào giá để ống (trong chậu đá 4°C)
Ding pipét Paslcui bái từng lốp của 3 lớp (tiền hành từng ống một): - lốp trên (màu đỏ) - lốp giữa (sucrơza) - lớp đầy (sucrơza cặn virút), chộn đều, lấy mấu để thủ hàm lượng kháng nguyên và TCA - prư lên,
ˆ Hơn phần đầy xong, tráng ống bàng PBS pH 7,4 cĩ 0/01% EDTA - 4Na 8.11 Thẩm tích vẽcxin đặc, loại bd sucroza:
- Dũng M15 PBS pH 72 cĩ 0,005% formalin - Ngâm đồi thẩm lích trong PBS pH 7.2
Trang 17~ Buộc thất lại L đầu,
- Dũng pÍpét cho tử từ vãcxin đặc vào ruột dồi (chú ý nên để cho dồi lịng, khơng nên thất chật sẽ võ đồi)
- Thả đồi vào chai dung dịch thẩm tich cĩ khuấy từ Để 4°C, 8 gid thay Jung địch tấm tích 1 ân trong 3 ngày, cho đến khi do suorơza (rong dung dịch thẩm tích khơng cịn nữa
Nhấc dồi ra, thấm nhọ cho khơ nước Dặt dồi vào cốc (để trong đá), nhẹ nhàng cất miệng đồi và từ lữ hút ván đặc đã thẩm tích vào 1 chai vơ trùng hoặc đong ngay vào ống dong, dé sau đĩ tính chất bảo quản cần phải cho them:
- 1# thimerosal (xơng độ cuối cùng 0,009%) - 19 tween 80- (nồng độ cuối cùng 0,0007%) 8.12, Lọc võ trùng:
- Tráng loc bing M/75, PBS pI] 7,4 06 0,05% gietatin, ~ Lọc vaexin ac qua mang loc: AP25, HA, Dacron va PH
~ Sau cling cho M119 đặc 1 lần qua màng lọc để cuối cùng cĩ 11 ml vâcxin, - Lấy mẫu để thử hàm lượng kháng nguyen (ELISA) va TCA - prưtơin 8.13 Vicxin bán thinh phdm (Batch Solution):
Trang 18+ Lo thiy tinh 5 mh, - Nút cáo su,
- Nút nhơm
9.2, Phương pháp:
"Trước khi pha phi thử hiệu giá kháng nguyên của vácxin bằng kỹ thuật ELISA Pha vácxin sao cho cĩ hiệu giá ELLISA bằng 1,5 lần hiệu giá của vấcxin chuẩn loạt 181
Thi du: Hiệu giá ELISA của vácxin chuẩn bằng 100
Hiệu gia ELISA cia vacxin sẽ pha bằng 100x1,5 = 150
Trang 19C KIỂM TRA CHẤT LƯỢNG VẮC-XIN VIÊM NAO NHẬT BẢN
SN XUẤT TẠI KHOA VIRÚT, VIỆN VSDTH, HA NỘI
Khoa Virát (Viên về sinh dịch tế học, Hà Nội) đã sản xuất thừ nghiệm 5 loại vắc-xÍn viêm não Nhật Bản Vắc-xin dược bất hoại, tinh chế bằng siêu ly tâm và kiểm tra chất lượng theo qui trình của Viện Biken, Trường Đại bọc Osaka, Nhật Bản
1.ĐO pH CỦA VẮC-XIN:
Sit dung may đo pH MICRO PH 2000, CRISON với các dung dich chuẩn pH4 và pH 7,02 "Tiến hành đo như phương pháp đo pH vơi tất cả các dung dịch
pH ofa vac-xin phai 6 trong khoảng 6,8 đến 7,4,
2 DINH LUQNG PROTEIN TRONG VAC-XI
2.1 Nguyên lý:
Prơtcin trong vác-sin được tũa bằng axit ieloraxetic (TCA) rồi định lượng theo phương pháp Lowry Cac dang địch protein chuẩn là abumin bờ cĩ nồng độ 50, 100, 150 gra,
2.2 Hĩa chất; *
~ Albumin bù SIGMA
- Natri hydtoxyt CHEMAPOL
- Natri caebonat MERCK
- Đồng sunfat PROLABO
- Nai wactrat MERCK
- Anit trieloraxetie LABOSI
- Folin
2,3 Dung cy, may moc:
~ Máy quang phổ Shimadzu
- Cơng thủy tỉnh dai Lom - Lự tâm ~ Ống thủy lính ~ Piped thấy tỉnh = Pipet wy dong P-1000, P-200 2.4 Chuẩn bị dung địch:
- Dung dịch A: (pha ngay trước khi dùng)
Hoa tan 0,8 g Natri hydroxyt trong nước cất, rồi thêm 4 g Nai cacbonat, lắc cho tan đều Thêm nước cất vừa đủ 100ml
= Dung dich B: (pha ngay trước khi dùng)
"Trồn đều 1 ml dang dịch đồng sun[aL 28% vối 1 m] Natri tacteal 4%,
Trang 20- Dụng dich C: (Them 1 mal dung địch B vào $0 ml dung địch A ~ Dụng địch axit wrieloraxetic 10%: Can 100 g anit tricloraxetic, 1] them nude eft vita di 1000 mal 2.5 Tiến hãnh:
~ Nhỏ lần lướt nước cất (làm đối chúng), các dung dich protein chudin và các mẫu vắc xin vào các ống (mỗi mẫu 3 ống, mỗi ống Lanl)
- Thêm vào mỗi ống Linl dung dich TCA 10% ~ Đun cách thủy 100 ĐC, L5 phút
- Để nguội ư nhiệt độ phịng,
- Ly tâm 3400 - 3508 vịng/phu, 2 phút, Ư nhiệt độ phịng - Ruta tha bing 2 ml dung dich TCA 5%
- Ly tâm 3400-3500 vịng/pnau, 20 phút, 8 nhigt độ phịng Loại nước nổi ~ Thếm vào mỗi ống 2,5 mỹ đụng dich , lắc đều, để 30 phút ư nhiệt độ phịng - Thêm 2,5 mÌ nước cất,
= Them 0.5 mi dung dich Folin, để 30 phút ð 37 °C, ~ Để nguội rồi đo độ hấp phy ð bước sĩng 750 nm
- Dựng đường chuẩn nơng do protein, tồi đựa theo đường chuẩn tính nồng độ protein trong ve xin
3, ĐỊNH LUONG THIMEROSAL:
3.1 Nguyên lý:
Dựa trên cĩ số thimcrosal phần ứng với đhizon tạo thành hợp chất cĩ độ hấp phụ cực dai 3 bude sĩng 480 nm Dinh jvang thimerosal bing cách đo độ hấp phụ của hợp chất tạo thành ồ bước song nay (CSc dung dịch thimerosal chuẩn cĩ tồng độ 50, 100, 150 g/m 3,2 Hĩa chất: ps - Thimerosal ELANCO - Dithizon 7 WAKO + Cachou tetraclorit WAKO - Nước amoaia WAKO + Natsi sunfis, khan waKO 3.3 Dung cy, may moc:
Trang 21~ Dung dịch địIhiron (002/6:
Can 2:mg dithizon, them cachon tetracloriL đến 109 ml - Nưộc amonia 60% (ON):
Dong 60 ml nước amonia, thêm nước cất đến 100 ml
3.5 Tiển hành:
- Nhỏ lần lướt nước cất (làm đối chứng), các dung dich thimerosal chadn và mẫu vắc xin vào các ống (mỗi mẩu 2 ống, mỗi ag 0.5 mb)
“Thêm nước cất cho vừa đủ 5 ml
- Thêm 10 mÏ dithion, lắc mạnh trong 5 phút
- Để cho tách riêng lắp nước và CCH Hút hộ hết lốp nước ð trên
~ Thêm 1Ơ ml nước cát, lắc mạnh Hút bỏ hết lớp nước,
- Thêm nước amonia, lắc, rồi lại hút bị lớp trên (3 lần)
- Rửa làn nữa bằng 10 mì nước cất
~ Thêm 1 thìa Natri sulfet khan để dừng phản ứng,
~ Do độ hấp phụ ị bước sĩng 480 nm, trên máy quang phố
- Dựng đường chuẩn nồng độ thimerosal, rồi đựa theo đĩ tính nồng độ thimerosal trong vắc-xin
4 ĐỊNH LƯỢNG FOCMALDEHYT: 4.1 Nguyên
Định lượng Foenaldchyt bằng cách do cường dộ màu của 3Š - diaxetyL, 4 - dihydrolthidin ð bước sơng 415 nm Phiic hop này dyoc tạo thành do phân ứng của Eocmaldehyt chữa trờng vậc xin vơi axetylaxeton va amonia trag mơi trường øxit nhe
“Các dụng địch Focmaldchyl chuẩn cĩ nồag 49 2, 4, 6 agin 4.2 Hĩa chất: - Hoxamethylentetramin WAKO - Axetylaxeton WAKO = Amoni axctat ˆˆ MERCK `
4.3 May mée, dung cys
- May quang phổ Shimadzu - Cơng thạch anh dai Tem ~ Pipet thủy tỉnh
- Ống thủy tính
4.4 Chuẩn bị dụng địch:
= Dung dịch Focnaldchyl chuẩn:
Can 388,8 mg hexamethylcmtctranim thêm nước cất vữa đủ 500 rml, Nơng độ Focmaldehy!
trong dung dich này bằng 1000 zgimlL, Từ dụng dịch này pha cá dung dich Focmaldehyt chuẩn
Trang 22
2,4, 6ugiml
- Dung dich axctylaxeton:
Hịa tun 150 g amoni axetat trong một lượng nutdc thich hop, thém 3 ml awit axetic va 2 ml axctylaxeton, rbi thêm nước cất vừa đủ 1000 nal
4.5 Tiên hành:
- Nhỗ lần lượt nước eft (Lam đối chứng), các dung dich Focmaldehyt chudn và mẫu vắc xin vào các ống (mỗi mẫu 2 dng, mỗi ống 2 ml)
- Thêm vào mỗi ống 2 ml axetylaxeton (axetylaxetom đã được pha vơi amoni uxetal và axit axetic)
- Đun cách thủy 100°C, 15 phi, ri tam ngudi bang nước vịi - Đo độ hip phy 0.415 nm trém may quang phổ
~ Dựng đường chuẩn nồng độ Focmaldchyt, rồi dựa theo đơ tinh ndag độ Focmaldehyt (rong vắc-xia 5 THỦ AN TỒN (trên chuột Jang): 8.1 Mục dich; "Tim những chất đột trong vác-sin làm ảnh hưởng đến sức khỏe và trọng lượng cĩ thể, 5.2 Tiến hành:
- Chọn chuội lang cân nặng 330 - 350 sr Theo đối trong 5 ngày trước khi tiệm, chuột phải khỏe trạnh và tang cân bình thưởng,
~ Tiểm phúc mạc cho 2 chuột, mỗi con 5 mi vắc sia 2 chuột đối chứng được tiêm mơi com 5 mÌ nước muối sinh lý
- Cân và (heo dõi chuột trong 7 ngày sau khi tiêm vác-xin đước coi là an tồn nếu 7 ngày sau khi tiêm chuột vẫn khốc mạnh và tăng cân từ 106 trồ lên
6 THỦ CHÍ NHIỆT TỐ (trên thỏ):
6.1 Mục đích:
“Tìm những yếu tố gây sốt oÏg vắo-xin bằng cách tiêm tĩnh mạch cho thổ, rồi đo thân nhiệt san khi tiêm
~ Chọn thỏ nặng 1,5 ke trở lên và cĩ thân nhiệt duơi 39,3 °C
- Cho nhịn an trước khí tiêm 1 ngay ~ Đo thân nhiệt trước khi tiêm
~ Tiêm tình mạch tai cho 3 thé (1 ml vac-xin/1kg)
- Đo thân nhiệt thỏ trong 3 - 5 giờ sau khi tiêm (30 phút 1 lân)
Vic-sin dược coi là đạt tiêu chuẩn (chí nhiệt tổ âm tính) nếu trong thời gian này (hân nhiệt
Trang 237 THỦ VƠ TRÙNG:
Dùng mơi tevdng Thioglycoltat (Eiken) để thữ vị khuẩn và nấm 7.1 Chuẩn bị mơi trường:
~ Pha 29,3g mơi trường trong 1000ml nước cất, đun nĩng cho tan = Rot vao céc ống khuẩn tà, mỗi Sng 40m\ mơi trường
~ Đây nút bơng rồi xấy khử trùng 6 121 %C trong 20 phút
- Lâm lạnh ngay bằng nước vơi dé loai Oz 7.2 Tiến hàn - Vắc xin bán thành phẩm: Nhỏ vác-xin vào các ống mơi trường với số lượng như sau: Thữ nghiệm Lượng sắc-xin | Lượng mơi tường | ống mơi trường | '— Thữvikhuẩn | 12ml | 16ống 1ml x8 ống À Ị 0,5m x8 ống | “Thử nấm amt 1 Sống —~ ¬ Imax#ống | J Để 14 ngày ư 311°C (thd vi khuẩn) và 4 20 - 25 °C (thử nấm) - Vác xin thành phẩm:
Số lọ vão-xin trong mỗi loại được lấy để thử võ trùng như sau:
T si, trong một loạt Số lọ để thử | Số lọ trong một loạt Số lọ để thit | [ <10 ~ 1 |[_— Mã — 6 ợ 11-50 ? 251-300 : 7 51-100 3 ~ 301-350 § 8 | “wrist | 351-400 | ~~ 9 151-20 5 >400 10 |
Lấy vắc-xin từ mỗi lọ và cho vào 2 ống mơi trường, một để (hữ ví khuẩn, mới để thử nấm Quan sất mơi trưởng vào ngày (hit 3, 7 v4 14 sau khi cho vắc-sín
`Väe-sin dược cĩi là vơ trùng nếu sau 14 ngày khơng thấy vi khuẩn hoặc nầm phát triển 8, THU BAT HOAT:
Mục đích: để khẳng định sự bất hoạt hồn tồn của virút viêm não Nhật Bản bằng cách cấy vắc-xin trên tế bào nuơi và tiêm não chuột
'Vắc-xin bán thành phẩm được thứ trên tế bào BHK2I và chuột Hồn dịch virúL bất hoạt và vắc-xin thành phẩm được thử trên chuột
8.1 Thử trên tế bào BHK21 theo số đồ sau:
Trang 24la bán thành phẩm (25 liều trở lên) Thẩm tích với M/75 PBS, pH74 Lọc vơ trùng, “Cây trên tế bào BHK2L, 20 ml vắc-xin/1 chai tế bào (LraU/3cmˆ x 5 chai Đề hấp phu 35-41 °C trong 90 phút
“Thêm mơi trường duy trì (100m1 chai tế bào)
“Thay mơi trường (3 ngày sau}
Để Š 35+ 12C và quan sắt trong 2 tuần
“Ghi kết quả như sau: 4
- Tế bào khơng thối hĩa - Nghỉ ngồ tế bào (hối hĩa
[_ + TẾ bào thối hĩa rõ rệt,
Sau 14 ngày lấy tự mỗi chai 5 ml dịch tế bào (chỉ lấy ị các mẫu vắc-xin chơ tất cả các chai tế bào (-) hoặc (+)), trộn đều để thừ trên chuột
8.2 Thử trên chuột:
Xi iy hn địch virút bất hoạt như sau: Smt hon địch được ly tâm 2500 vịng/phút trong 30 phút Lấy nước nổi, rồi thêm 0,3 ml dung dich 0,1M CaClo
Hơn dich virét bất hoại đã xử lý, địch tế bào cấy vắc-xin bán thành phẩm và vae-xin thành phẩm: được tiêm não chuột, mỗi chuột 0,03 mÌ với số lưộng như sau:
Tỗn địch virút bất hoạt 30 chuột |
Tịch tế bio edy vie-xin ban thank phdm | 10 chuột
'Vắc-xin thành phẩm „— 10chuột
by — ee
“Theo dõi chuột trong 14 ngày sau khi tiêm, Vắc-xin được coi là bất hoạt hồn tồn nếu tế bào khơng bị thối hĩa và tất cả chuột sống bình thường
9 THỦ CƠNG HIỆU CỦA VẮC-XIN (bằng ký thuật trung hùa giảm đám hoại tử)
Mục đích: (im cong hiệu của vác-xin vim não Nhật Băn dựa trên hiệu giá kháng thể trung hịa
trên chuột,
Trang 259.1, Vật liệu: - Các dụng địch: + MI75 PBS, pH 7,4 + MI7S PBS, pH7,4 06 0.02% giclatin + Dung dich Harle’s, + GiucbzA 49, + Dung dich LE + Bicacbonat 7%, + Đỏ nhenol 0.5% + Dich chiét men bia 10% + Da trung tinh 0,25% + Albumin ba 10%, + Dung dich LE 06 0,2% albumin bo, + Trứng gà cĩ phơi 9 ngày + Kanamycin + Erythromycin + Fungizon + Viecillin - Virgt thử thách, ~ Huyết thanh đương,
- Vée-xin viêm não Nhật Bán chuẩn (chủng Naleyama loại 181) ~ Chuột nhất cải 4 tuần tuổi 9.2 Dụng eu mây mĩc: ~ Ống thủy tinh ~ Bĩm tiêm tự động Š ml, 1 ml ~ Bĩm tiêm 2 ml, 1 mi re ~ Pipct thúy linh - Pipet ty dng P-200, P-50 ~ Ly tâm lạnh - Tủ ấm CO; ~ Nồi cách thủy, ~ Hộp đèn #.3 Tiến hành:
- Sản xuất huyết thanh miễn dịch trên chuột nhất:
ha vắc-xin: vắc-sin chuẩn loạt I8I và mẫu vắc-xin được pha lỗng 1/16, 1/32, 1/64 (x 16, x 32, x64) với M/75 PBS, pH7,4 06 0,02% gielatin
Trang 26Mỗi độ pha lỗng được tiêm phúc mạc cho 10 chuột, mỗi chuột 2 liều 0,5m! cách nhau 7 ngày: "Máu chuột dược lấy 7 ngày sau khi tiêm mũi thứ 2 Dể riêng niáu mỗi chuột vào Ï ống, để 4°C, qua dem, Chai, gop chung huyết thanh của các chuột được tiêm vắc xin cũng dộ pha lỗng mỗi chuột ấy 0,1m), Ly tâm 3000 vịng/phủt, 30 phút Lấy nước nổi (huyết thanh), rồi pha huyél thank 1/10 trong dụng địch L.E cĩ 0,2% BA, Bất hoạt huyết thanh 1/108 56°C trong 30 phút rồi giữ ị -20°C
- Chuẩn bị tế bào phơi gà:
“Tế bào phơi gà được lách bằng trypsin 0,2% và được pha trong mơi (rường nuội cấy là LẺ cổ
5%: huyết thanh bê đến nồng độ 250 x 10” tế bào/m, Sau đĩ tế bào được nhớ vào các địa Pclri đường
kinh 5cm (Smml/1 đĩa), rồi để tủ ấm CO2, 37°C qua dem,
- Pha huyết thanh:
Huyết thanh được pha lỗng bằng dụng dich LE cĩ 0,2% BA như sau: Mẫu huyết thành Độ phá lỗng, ] [err x16 = xI280 2580! 2) Loat 181 2 , — XĩỦ x1280 3) Loat 181 x6 x160 x320 x640 | 4)Mauvéedin xl6 | x640 x1280 2560 | 5)Mãuvácxn — x32 x320 x640) x1280 6)Mauvécxin x64 x160 x320 x640 | | 'T) Huyết thanh dương chuẩn | x80 x60 x30
~ Chuẩn bị dung địch virũt thủ thách:
Dung địch virút thờ thách được pha dến 200 PEV/0,4ml bằng LE cĩ 02%BA - Chuẩn bị lốp thạch thứ nhất:
+ Dịng dịch A: Thêm 500ml nước cfit vao 8g Noble Agar, xy 121 C/40 phút
+ Dung dịch B: Thêm 250 mì nước cất vào 5g, Lactalbumin hydralysat, xy 1 152C/40) phút Đổ dụng dich B vào A, rồi thêm 100 mì glue0za 46, 100ml dung dich Barle's 10x, Sn dịch
chiết men bia Để nguội đến 50°C, rồïïêm 32m1 bicacbonat 7%, Imi Erythromycin, Ll Kanamycin,
1ml Eungiron và 0,5 ml Viecillin - Chuẩn bị lớp thạch thứ hai:
+ Thêm 850ml nước cất vào 8g Noble Agar, xấy 121°C/40 phút
Trang 27"That nghiệm trung hịa được tiền hành như sau:
1m† huyết thanh mối độ pha lộng + 1ml virút thử thách Để tủ ấm CO¿, 37°C, 90 phú | Nhỏ hỗn dịch huyết thanh + virút vào tế bào phơi gà (02m1 hồn dich dia, mdi độ pha lỗng 3 đĩa) láng đều | Để tủ ấm CO2, 372C, 90 phái (15 phút lắc 1 lần) | Phe lap lạnh thứ nhất (5ml/Lđia) Ị Để ð tủ ấm CƠ¿, 37"C, 3 ngày | Phủ lốp lạnh thứ bat (3.Šm/1 đĩa) | x BE ti CO2, 37°C, 3 pid | Đểm các đấm hoại tứ Hiểu giá kháng thể truns hịa được tính theo cơng thie sau: y-sit + logios 41,1622, là hiệu giá kháng thể làm giảm 50%, dám hoại tử, y; Tỷ l€ giảm đám hoại từ (4) x: DO pha lỗng của huyết than
š: Số đâm hoại từ cơa mơi độ huyết thanh nha lỗng +; 8ố đánn hoại Lữ của virút thử thách Vidụ:y¬ T346 x = 640 13/9 - 50 x + logy 640 = 04 + 28 = 32 411632 tà tơ
"hoa của vắc-xin phải cao hĩn của vắc-xio chuẩn
Khi đồ hiệu giá kháng thể rung hi
Trang 28D KẾT QUẢ
Năm loạt vác-xin đã được sản xuất và kiểm tra chất lượng tại khoa virơ1 (Viện vệ sinh địch tế
học Hà Nội) đạt kết quả tốt Hai toạt 4 và 5 đã được Viện Biken (Trudng Dat hoc Osaka, Nhật Bàn)
+iểm định về chãt lượng và so sánh với vắc-xin chuẩn của Nhật Bản:
Bang 1: Két quả kiểm tra chất lượng loạt 4
- Bảng 2: Kết quả kiếm tra chất lượng boat 5 Báng3: Kết quả kiểm tra chất lượng lost 1 - Bằng 4p Két qué kiểm tra chất lượng lo§t 2 - Bảng SỈ Kết quả kiểm tra chất lượng loật 3-
~ Hình 1: Hình ảnh hạt virút trong vắc-sin dưới kính hiển vi điện từ ư độ phơng đại 60,000 [ăn
và 120.000 lần, Kết quả kiểm tra cho thấy vắc-xin NNB do Khoa Virot (Viện vệ sinh dịch tế học Hà
Trang 35Nl SAN XUAT BO SINH PHAM DUNG CHO CHAN DOAN VIEM NAO NHAT BAN
Mục địch đề tài
Hội chúng não cấp cán nguyên do virul viêm não Nhật Bản (VẶNB) cĩ tỉ lệ tử vong và đi chững cao, để gây thành dịch lớn Do vậy cơng (ác chẩn đốn phát hiện bệnh sớm rất quan Irọng để phịng
chống địch kịp thơi
Dé co thé chẩn đốn bệnh sốm ngay tại các tuyến địa phương, việc cung cấp sinh phẩm chẩn cđốn là rất căn thiết Đặc biệt là sinh phẩm ð dưới dạng những bộ sinh phẩm rất phù họp wrong diều
kiện hiện nay của các tuyến địa phương, đáp ứng cơng tác chấn đốn bệnh sắm agay tại cĩ sở
Nội dung thực hiện:
1, Sản xuất kháng nguyên Nakayama , Sản xuất kháng huyết thanh Nakayama 3, 80 đồ sit dung bộ sinh phẩm chẩn đốn
4, Kérqua
5,
1 SAN XUAT KHANG NGUYEN NAKAYAMA THEO PHUONG PHAP XU LY BANG PROTAMIN SULFAT:
1.1 Vặt liệu
~ Não chuột Swiss đã nhiễm virut; - Cối hoạc máy nghiÈn não;
- Dụng địch Protamin sulfat pha trong nước muối 0.855%;
Trang 36
1.2 Phương phảp tiến hành,
1.3.1 Nhân giống chủng Nekayema làm giống gốc:
- Chủng viruL mẫu Nakayama được tạo thành hỗn địch 19” wong PBS;
- Tiêm 0,03m hỗn dịch trên vào não chuột 11-138 (vị trí tiêm ị giữa điểm nối mắt - tai); ~ Bái chuột ốm liệt sau khí tiêm tử ngày thứ 3 trỏ đi - Mổ lấy não võ trùng; ~ Nghiền não chuột, tạo thành hỗn dịch 1096 trong dung địch Borat pH.9 cĩ 0,4% Albumin b6 (mbi lọ 0,5ml-lmml); - Hn dich tren được kiểm tra vơ trùng trước và sau khi đơng khĩ, bảo quan 3 - 70°C ầm giống gốc
1.2.2 Gay nhiém vi nit Nakayama cho chudt Swiss 11-13g: - Chũng virut giống được tao thành hồn địch 10 trong PBS;
- Tiêm 0,03mÌ hỗn dịch trên vào não chuột, vị trí tiêm ị giữa điểm nổi mắt tai; ~ Theo rõi chuột sau khi tiêm, bất chuột ốm liệt tử ngày thứ 3 trở đi;
~ Mồ lấy não võ trùng
1.3.3 Chế tạo kháng nguyên:
~ Nghiền não chuột tạo thành hốn dich 20% trong dung địch Borat pH.9 cĩ 0,4% Albumin bị để đ°C qua đêm;
~ Ly tâm hồn dich não này 12.000 vịng/phát trong 1 giỏ ð 42C, Lấy nước nổi;
~ Cho dung dich prơtamin sulfat SOmg/ml theo tile Iml Protamin sulfat cho 1ml hỗn dịch não 20% Lắc đều để ơ 4°C trong | gi, ly tâm 12.000 vịng/phút trong 1 gid, lấy nước nổi kiểm tra hiệu giá kháng nguyên trước khi đơng khơ; kháng nguyên sau khi đơng khơ được kiểm tra và bao quand - 20°C
TOM TAT QUI TRINH
Ding ching virut miu Nakayama cia Nhat Ban (hỗn dịch virut dùng để tiêm 102)
“Tiếm vào não chuột Ssiss (L1-13g) 0/03ml4con |
.Mổ số trùng lấy não đã nhiễm virut (chuột ồm liệL)
Nghiên não chuột đã nhiễm vĩ rút thành hỗn dich 20% dé 4°C qua đêm i
Ly 1am 12.000vip/1 gi8, lấy nước nổi
‘Cho Protamin sulfat theo tilé Img/1ml hỗn dịch não 20%: để 42C trong | gid
LÁc đều cho vào ống ly tám 12.000 v/p/1 giờ ð 4”C, lấy nước nổi kiểm tra hiệu giá
Đơng khơ kháng nguyên, kiểm tra lại hiệu giá, bảo quan d -20°C
Trang 372 KỸ THUAT TAO BANG MIEN DICH TRONG SAN XUAT
HUYET THANH KHANG VIRUT VIEM NAO NBAT BAN:
2.1 Vật liệu:
3-1-1 Đơng vật thi nghiện:
“Chuột nhất trắng cái giống Swfss trưởng thành cân nặng 15-20 3.12 Khơng ngưyên gây miễn dick
'Vizut viêm não Nhật Bán, tá được (ồn phần F(eund theo tì lệ l/L 3.1.3 Tế bào Sáccơm TƠ 180
4.3 Phương pháp tiến hành 2.3.1 Gây miễn dịch cho chuột:
~ Tiêm 5 mũi, mỗi mũi cách nhau 7 ngày;
~ Liêu gây miền dịch là 0,2ml hỗn địch virut vơi lá dược 2.3.3, Gây ung thự hạch mặc treo và phúc mặc:
- Sau khi gây miễn dich 26 ngày (trước khi tiêm mũi 5 hai ngày), liêm để bào Sáocơm TG 180 vào ổ bạng cho chuột;
- Liêu tiêm 0,2ml hỗn dịch lế bào được pha trong nước muối sinh lý (số lưởng tế bào -3-x 10 tế bào trang 0,2ml) 32.8 Hit bồng miễn địch = Sau khi tiêm tế bào Sáocơm TG 180 vào ổ bung thi 7-10 ngày sau chuột sé co bang miễn dịch;
- Ding kim va bom tiêm võ trùng hút địch báng, ly tâm loại bỏ phần cặn, kiểm tra hiệu giá dich bang thu dược trước khi dịng khơ
Trang 38
3 SƠ ĐỒ SỬ DỤNG BỘ SINH PHẨM CHAN DOAN VIEM NAO BAN
(ding phan img ngén agung kết hồng cầu)
Rủa hồng cầu ngơng 10%
(ly lãm rữa hồng cầu 3 lần bằng NMSŠL 0,85%) ma" Pha hồng cầu 10% tron, 1g g Pha hồng cầu ngỗng 0,5% trong gong, dem Borat pH9,0 đệm Phốt phát pH 6,1 (pha số lưộng theo yêu cầu ) (pha số lượng theo yêu cầu) | Xử lý huyết thanh xét nghiệm (dùng hồng cầu 1066 và kaolin25) |
“Chuẩn độ hiệu giá kháng nguyên (bằng phân ứng ngúng kết hơng cầu)
Đọc hết quả|kau 1 giờ để 372 Pha loang huyết thanh bộc 2 trong,
đệm Boral trên lầm nhựa 96 giếng, mỗi giếng đ,025mi:
Pha kháng nguyên 8 đĩn vi trong đệm Borat(số lượng, theo yêu cầu)
a
“Cho kháng nguyen 8 don ¥j vao ting giéng huyết thanh đã pha lồng, mỗi giếng 0,02m!
Đề ư nhiệt độ 372C/1 gi
Cho hồng cầu ngồng 0,5% vào tất cả các
giếng, mỗi giếng 005ml
Đề ư nhiệt độ phịng 1 giồ Đọc kết quả
Trang 394 KẾT QUÁ 4i ố lượng cấc sinh phẩm đã sản xuất
Kháng nguyện Nahayanml: l3Ưm| (1 ml khẩng nguyện dùng chủ ï bỏ sinh phẩm
Kháng huyết thanh akaysmna: 100m (0.2m! huyết thành mẫu dùng; cho L bộ sunn phẩm)
4-3 Chất lượng của bà sinh phi
Kết quả kiểm trụ bộ sinh nhám tại Viện Bik
năm I0) „Trương Đại bĩc O§AKA, Nhật Bản (hàng 12
4.2.1 Vật tiện
lên VSDSTH (Hà Nội) [Vida BIKEN (Osaka)
Kháng nguyên Nakayama | Khang nguyen! Tuyết thánh thồC) — Huyết nh chi (+) | [Bi sinh pra Khang nguyen Khang nguyen Nakayama Khang the Kaolin 255% kaolin wrong dem Boral po Hồng cầu ngỗng 10% Ệ pong, Fong cầu ngơng § iB igOmg, „ Hồng cầu ngững xử lý vơi i i
i Formabin 10%, photphai 60 | VAD 62
| Băng địa #2álbmminbỏ, "| 6% albumin ting
phá lỗng dọn Borat pH, em Borat plig ¡ Tấm nhựa Hinhihữ tl : | v tường i 42.2 Phương pháp ai LỆ huyết thanh:
- Xử lý bằng Kaolin (phường pháp Viện VSDTH, Hà Nội), - Xử lý bằng sctoo (phường pháp Vien Bikea, Osaka), +33: Kế quá “Chuẩn đồ khẳng nguyên lân ] i ˆ Sinh ghẩm HữN giá |
lẽ ý nguyên Viện Biken (Hồng cầu Biken) [mẽ |
Kháng sguyền Viện VSDTH Hà Nội (Hồng cáu Iượi} | 52
Trang 40- Chuẩn độ khang nguyên lần 2:
‘Khang nguyên NakayamA _—ˆ Viện Biken,Osala jo“ 'VSDTH, Hà Nội ~ Kết quả của thử nghiệm ngăn ngưng ket hong Cũ:
"`" '1WSY 1: | Kháng nguyên Nakayama |
Chứng đường, a0 | 640 ` | - ViênBiken Osake |
Chúng am @ © Vign Biken, Osaka
Chúng dưang 1280 1280 Viện VSDTH, Hà Nội —,
| Viện VSDTH, Hà Nội
Chứng âm oO | O
|
4.3.4 Kết luận:
+ Hai phương pháp xử lý huyết thanh bằng Axeton và Kaolin cho cùng một ket quay
+ Hiệu giá cầu chứng dương là 640 (Viện Biken, Osaka) và 1280 (Viện VSDTH, Hà Nội) 4.3 Theo đổi sự ồn định của kháng nguyên NKHC NaK đồng khĩ báo quán tại
n Vệ sinh Dịch tế học Hà nội
4.3.1 Hiệu quả kháng nguyên NKHC NaK bảo quả ở 42C