BỘ Y TẾ
BÁO CÁO KẾT QUẢ NGHIÊN CÚU ĐỀ TÀI CẤP BỘ
Ten dé tai: -
PHAT HIEN KHUYET BOAN GEN
Ủ HHỮNG BỆNH NHÂN LAN DUONG CO DUCHENNE BẰNG PHƯƠNG PHAP MULTIPLEX PCR
Chủ nhiệm đẻ tài : TS.BS Nguyễn Thị Trang
Cơ quan chủ trì đề tài : Trường Đại học y Hà nội
Trang 2BOYTE
BAO CÁO KẾT QUÁ NGHIÊN CỨU ĐỀ TÀI CẤP BỘ
Tên đề tài:
PHÁT HIỆN KHUYẾT ĐOẠN GEN
6 NHUNG BỆNH NHÂN LOẠN DƯỠNG CO DUCHENNE
BẰNG PHƯƠNG PHÁP MULTIPLEX PCR
Chủ nhiệm để tải: TS.BS Nguyễn Thị Trang : Trường Đại học y Hà nội
Cơ quan chủ trì đề t
Cấp quản lý để tài: Bộ y tế
Thời gian thực biện: từ tháng 112004 đến tháng 1212006 Tổng kinh phí thực hiện để tài: 200 triệu đồng
Trang 3
L.Tén dé ti
“Phát hiện khuyết đoạn gen ở những bệnh nhân loạn đưỡn g cơ Duchenne bing phương pháp Multiplex PCR”
2.Chủ nhiệm đề tài: TS.BS Nguyễn Thị Trang
3 Cơ quan chữ trì đề t Trường Đai học y Hà nội 4.Cơ quan quần lý để tài: Bộ y tế
5 Thư ký đề tài: Thạc sĩ Bác sĩ Lương Thi Lan Anh 6 Những người thực hiện chính:
‘TS.BS Nguyễn Thị Trang Bộ mơn Y sinh học-Di truyền ĐHY Hà nội "Thạc si BS Va Chi Dũng Khoa Nội tiết-Chuyển hố-Di truyền BV Nhi TW
Cử nhân Nguyễn Thị Phương Mai La bơ Di truyền BV Nhi TW ‘TS.BS Hồng Hạnh Phúc Khoa Sinh hố Bệnh viện Nhỉ trung ương "Thạc sĩ B8 Lương 'Thị Lan Anh Bộ mơn Y sinh học - Di truyền ĐHY Hà nội PGS TS Le Van Phủng La bỏ Trung tâm Y sinh họcÐH Y Hà nội
Trang 4ARN BMD bp cK Cartier CMC DMD DGGE FISH FIGE HDA NST KN-KT kb DANH MỤC CHU VIET TAT Acid deoxyribonucleic Acid ribonucleic
Becker muscular dystrophy (loan duBiag cd Becker) Base pair (cặp base trong phân từ ADN kép)
Creatine kinase
Người lành mang gen bệnh
Chemical mismatch cleavage (Phương pháp cắt liên kết khơng
tương xứng hĩa học)
Duchenne muscular dysttophy (Bệnh loạn dưỡng cơ Duchenne)
Denaturing gradient gel electrophoresis (Điện di gel dựa trên
gradient)
Fluorescent in situ hybridisation (Lai tại chố phát hiện bằng chat mau huỳnh quang)
Field inversion gel electrophoresis (Điện đi đảo ngược) Teteroduplex analysis (Phân tích dị hợp từ kép )
Nhiễm sắc thể
Kháng nguyên- Kháng thể
kilo base
Trang 5RFLP
RT-PCR SSCP
TSDT
Protein truncation test (Xét nghiệm kiểm tra Protein bi cat)
Restriction fragment leagth polymorphism (Phuvag phip
phân đoạn giới hạn đa độ dài)
Reverse transcriptioa PCR (Phương pháp phiên mã ngược)
Single strand conformation polymorphism (Phương pháp cấu
trúc đa hình sợi đơn)
Trang 6MUCLUC
DAT VAN DE
Chuong 1 : TONG QUAN
1.1 Đặc điểm di truyền của bệnh DMD
1.2 Tân số của bệnh loạn dưỡng cơ Duchenne 1.3 Cơ sở di truyền phân từ của bệnh DMD
1.3.1 Vị trí, cấu trúc và chức năng của gen DMD 1.3.2 Cấu trúc và chức năng của Dysttophy
1.4 Cơ chế bệnh sinh của DMD
1.5 Cơ chế dĩ truyền của bệnh DMD
1.5.1 Gen đột biến cĩ sẵn trên NSTX của mẹ 1.5.2 Đột biến mới
1.3.3 Dạng khẳm Soma tại vùng gen Dystrophy
1.5.4 Dạng khẩm đồng tế bào mầm trong bệnh DMD 1.6 Các dạng đột biến cấu tric cita gea dystrophy 1.6.1 Đột biến khuyết đoạn gen dystrophy (DMD) 1.6.2 Đột biến nhân đoạn trong gen dystrophy (DMD) 1.6.3 Đột biến điểm xảy ra trong gen dystrophy (DMD) 1.6.4 Đột biến kiểu chuyển đoạn gây bệnh DMD ở trẻ gái 1.7 Các phương pháp xết nghiệm trong chẩn đốn bệnh DMD 1.7.1 Phương pháp đo hoạt độ cteatine kỉoase trong huyết thanh 1.7.2 Phương pháp thăm dị điện sinh lý cơ(ghỉ điện cơ)
1.7.3 Phương pháp sinh thiết cơ, chẩn đốn giải phẫu bệnh vi thể
trong xác định tổn thương cơ ở bệnh nhân
Trang 71.7.3 Xết nghiệm ADN
1.8 Các phương pháp phát hiện đột biến gen dystrophy
1.8.1 Phát hiện những tổn thương lớn của gen dystrophy
1.8.2 Phát hiện những tổn thương nhỏ của gen dysttophy ở những bệnh nhân
1.8.3 Phát biện những tổn thương nhỏ ở những người nữ mang gen
1.9 Phịng bệnh DMD
1.9.1 Phát hiện những trường hợp DMD
1.9.2 Phát hiện đột biến gen ở những bệnh nhân DMD/BMD
1.9.3 Phát hiện những người lành mang gen bệnh DMD (cartiers) 1.9.4 Cho lời khuyên dĩ truyền
19.5 Phương pháp chẩn đốn trước sinh và chẩn đốn ADN của phơi trước khi cấy phơi vào cơ thể
1.10 Khả năng điều trị bệnh DMD
1.11 Tình hình nghiên cứu bệnh DMD ở trong nước
Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1 Đối tượng nghiên cứu
2.1.1 Nhĩm chứng 2.1.2 Nhĩm bệnh
2.2 Nơi thực hiện
2.3 Phương pháp nghiên cứu
Trang 82.3.4 Phương pháp chiết tách ADN từ máu ngoại vi bằng phương pháp petchlorat sodium
2.3.5 Kỹ thuật chiết tách ADN từ mầu ngoại vi theo Qiagen kit
2.3.6 Phương pháp multiplex PCR
2.3.7 Xử lý số liệu theo phương pháp thống kê y sinh học Chương 3 KET QUA
3.1 Kiểm tra kết quả chiết tách ADN ở 10 người nam bình thường theo phương pháp percblorat sodium
3.1.1 Kiểm tra kết quả tỉnh khiết của ADN
3.12 Đo hầm lượng ADN 32 Nhĩm bệnh nhân DMD, 3.2.1 Giới của bệnh nhân
3.2.2 Tiên sử đi truyền trong gia đình
3.2.3 Ti lệ bệnh nhãn DMD cĩ đột biến mất đoạn 3.2.4 35 bệnh nhân được khảo sát thêm cxoa 4ố
32.3 30 bệnh nhân được khảo sát thêm cxon lố, 32, 34, 41, 42, và
vùng promotor não(Pb)
3.3 Nhĩm mẹ, và chị em gái của mẹ bệnh nhân DMD được xét
nghiệm CK cho tư vấn di truyền
3.4 Minh hoạ một số hình ảnh kết quả PCR khảo sát những exon trong vùng hay xdy ra mat doan cita gen dystrophin ở bệnh nhân
DMD
Trang 94.1 DMD là bệnh phát sinh do cơ chế di truyền và đột biến mới 4.2 So sánh các phương pháp di truyền phân tử phát hiện đột biến mất đoạn gen và tình hình phát hiện đột biến mất đoạn gen ở các nước 4.2.1 So sánh các phương pháp di truyền phân từ phát hiện đột biến mất đoạn gen 4.2.2 So sánh về nghiên cứu mất đoạn gen ở một số nước trên thế giới
4.3 Những bệnh nhân được chẩn đốn là DMD nhưng chưa phát
Trang 10BẢN TỰ ĐÁNH GIÁ Vé đnh hình thực hiện và những đĩng gĩp mới của để tài khoa học và cơng nghệ cấp Bộ 1.Tên để
: “ Phát hiện khuyét doan gen dystrophin ở những bệnh nhân loạn dưỡng cơ Duchenne bằng phương pháp Multiplex PCR”
2.Chủ nhiệm để tài: T5 BS Nguyễn Thị Trang
3.Co quan chủ trì đề tài: Trường Đại Học Y Hà Noi
4.Thời gian thực hiện đề fài: Tháng 1 năm 2004 đến tháng 12 năm 2006 5 Tổng kinh phí thực hiện đề tài: 200 triệu đồng
Trong đĩ kinh phí từ NSNN: 200 triệu đồng
6.Tình hình thực hiện đề tài so với đề cương: Đề tài đã hồn thành 2 mục tiêu của để cương:
- Sử dụng phương pháp Multplex PCR với 19 cặp méi để phát hiện khuyết đoạn gen dystrophin ở bệnh nhân loạn dưỡng cơ Duchenne
-_ Bước đầu tìm hiểu exon nào của gen DMD thường xẩy ra khuyết đoạn 6.1 Về mức độ hồn thành khối lượng cơng việc:
-Về số lượng mẫu: theo đề cương đẻ ra là chiết tách ADN tổng số của người
nam bình thường làm chứng(+) và chiết tách ADN của 60 bệnh nhân DMD và thực hiện phản ứng Multiplex PCR với 18 cặp mỏi để phát hiện đột biến mất đoạn gen ở những bệnh nhân DMD
- Để tài đã thực hiện chiết tích ADN của người nam bình thường làm chứng(+) và 62 bệnh nhân DMD, đã thực hiện phản ứng Multiplex PCR với 19 cặp mơi để khảo sát 18 exon của gen dystrophin và vùng promotor cơ, đã điện di sản phẩm PCR trên gel agarose, chụp gel và đọc kết quả PCR cho từng bệnh nhân
Trang 116.2 Về các yêu cầu khoa học và chỉ tiêu cơ bản của các sản phẩm khoa học cơng nghệ
6.21 Yên cầu khoa học trong chọn đối tượng nghiên cứu là những bệnh
nhân DIMD
-Các bệnh nhân DMD được chẩn đốn lâm sàng theo tiêu chuẩn của Duchenne mơ tả và được thực hiện tại khoa Nội tiết-Chuyển hố-Di truyền
Bệnh viện Nhi trung ương
-Xết nghiệm đo hoạt độ enzym creatine kinase huyết thanh để chẩn đốn
bệnh DMD được thực hiện trên máy phân tích sinh hố tự động với kit thuốc
thử được tiêu chuẩn hố quốc tế(điều kiện nhiệt độ 37°C) Các kết quả xét nghiệm của bệnh nhân đều tăng cao trên 20 lần đến 100 lần so với CK nhĩm chứng là các trẻ em bình thường(115+32 TU/) với cùng một điều kiện
6.2.2 Về yêu cầu khoa học và các chỉ tiêu cơ bản của các sản phẩm để tài
-Các mẫu chiết tách ADN, phản ứng Multiplex PCR được thực hiện tại La bơ
trung tâm Y Sinh học, Bộ mơn Y Sinh học-Di truyền Đại học Y Hà Nội và La
bơ di truyền Bệnh viện Nhi trung ương là những nơi được trang bị máy mĩc
đảm bảo, với các dụng cụ và hố chất đã được tiêu chuẩn hố quốc tế
- Các mẫu ADN được chiết tách từ mẫu máu người nam bình thường và 62 bệnh nhân nam DMD đều được kiểm tra độ tình sạch bằng máy quang phổ kế và kiểm tra chất lượng ADN bằng điện di ADN: Các mẫu đều đạt độ tỉnh
sạch(1.6 <OD„z,„.„/OD,ø,„.„ <1,8) và điện đi ADN thể hiện các băng gọn
-Vẻ sản phẩm PCR của các nhĩm cặp mỏi, mỗi cặp mỏi đặc hiệu với từng exon tương ứng của gen dystrophin, kết quả điện di sản phẩm PCR của các bệnh nhân đọc rõ so với Marker thang chuẩn 100bp(base gai) và so với chứng(+) là người nam bình thường, đã chỉ tố mất đoạn exon trên hình ảnh
điện di sản phẩm PCR của bệnh nhân DMD
-Qua đọc kết quả PCR của những bệnh nhân DMD chúng tơi đã phân tích xử:
Trang 12
+ Thife hién phin mg PCR véi 19 cap méi dé khio sét 18 exon và vùng
promotor cơ của gen dystrophin ở 62 bệnh nhân DMD và đã phát hién ti
lệ đột biến mất đoạn gen là 5 1,6%
+ Trong 62 bệnh nhân DMD của 60 gia đình cĩ 44 gia đình cĩ TSDT
khơng tõ(73,3%), l6 gia đình cĩ TSDT rõ(26,7%)
+ Tỉ lệ đột biến mất đoạn gen dystrophin ở nhĩm TSDT rõ và khơng rõ là tương đương nhau: Nhĩm TSDT rõ là 2,9% và TSDT khơng rõ là 5 1,1%
+ Đã nêu ra được phân bố mất đoạn gen dysttophin ở 62 bệnh nhân DMD: Mất đoạn tập trung ở vùng giữa gen từ exon 44-52 là chủ yếu chiếm 89,3%;
Mất đoạn ở vùng từ exon 3-19 và vùng promotor cơ(Pm) hiếm gặp hơn chỉ
chiếm 10,7%
+ Để tài đã khảo sát thêm exon 46 ở 35 bệnh nhân(đã phát hiện đột biến
mất đoạn exon 46 ở 7 trường hợp(20%) 6.3 Vi
iến độ thực hiện: Đẻ tài thực biện hơi chậm một chút so với dự kiến ban đầu do số mẫu bệnh nhân thiếu, vì cơ quao hợp tác để tài phải gửi mẫu
sang Nhật theo hợp tác quốc tế
7 Về những đĩng gĩp mới của đề tài:
Trên cơ sở so sánh với những thơng tin đã được cơng bố trên các ấn
phẩm trong và ngồi nước đế thời điểm kết thúc đẻ tài, đề tài cĩ những điểm mới sau đây:
7.1 Về giải pháp khoa học cơng nghệ:
- Đột biến mất đoạn gen gây bệnh DMD là đa số chiếm tỉ lệ 50-70% trong các loại đột biến gen Để tài đã ưu tiên phát triển phương pháp phát hiện đột biến mất đoạn gen và lựa chọn phương pháp Multiplex PCR là phương pháp cĩ nhiều ưu điểm hơn các phương pháp khác như phương pháp Southern blot,
FISH, RT-PCR, phương pháp này cũng được nhiều nước tiên tiến trên thế
Trang 137.2 Vé phuong pháp nghiên cứu
Kỹ thuật Multiplex PCR đã hồn tồn thực hiện được trong điều kiện
Viet Nam để phục vụ phát hiện đột biến mất đoạn gen dystrophin cho bệnh
nhân DMD
7.3 Những đĩng gĩp mới khác
+* Đã phát hiện tỉ lệ đột biến mất đoạn gen dystrophin ở những bệnh nhân DMD là 5 1,6% để thơng tỉn tư vấn cho gia đình bệnh nhân
+* Đã nêu ra được tỉ lệ đột biến mất đoạn ở nhĩm bệnh nhân DMD TSDT'
rõ là 52,9% và nhĩm TSDT khơng rõ là 5 1,1%
+* Đã nêu ra được phân bố đột biến mất đoạn ở 62 bệnh nhân DMD: Mất đoạn ở vùng trung tâm của gen từ exon 44-52 là chủ yếu(89,3%); vùng tận cùng 5° của gen từ exon 3-19 và vùng Pm hiếm xảy ra hơn(10,7%) +* Để tài đã đồng gĩp đặt cơ sở cho chẩn đốn trước sinh ở những gia
đình với những đột biến đã biết
7.4 Hiệu qua dao tao:
$* Đào tạo được một cử nhân kỹ thuật y học đã bảo vệ thành cơng khố
luận tốt nghiệp năm 2005 đạt loại giỏi với đề tài “ Hồn chỉnh kỹ thuật multiplex PCR với exon 12 va 48 cita gen dystrophin ở nhĩm người nam bình thường” Tên cử nhân: Nguyễn Thị Hồng Lan Quỳnh % Dao tao 1 thạc sĩ y học: - Cừ nhân Sinh học: Mai Kiên Định chuyên nghành Hố sinh- Đại học i Niên khố 2005-2007 quốc gia Hà
Tên đề tài: “ Phin tích đột biến mất đoạn gen dystophin ở một số bệnh nhân loạn dưỡng cơ Ducbenne” đẻ tài sẽ bảo vệ vào tháng 10 năm 2007
s#* Đào tạo một Bác sĩ: Nguyễn Huyền Anh khố hoc 2001-2007, sẽ tốt
Trang 14Bệnh loạn dưỡng cơ Duchenne(DMD) là bệnh di truyền hay gặp trên lâm sàng, tiên lượng nặng, chưa cĩ biện pháp chữa trị, cĩ thể dẫn đến tàn phế, mất khả năng đi lại và chết trước tuổi trưởng thành Hiện nay bệnh đã cĩ thể
chẩn đốn sớm dựa trên xết nghiệm enzym creatine kinase, tuy nhiên phuơng
pháp này khơng thể phát hiện đột biến gen và chẩn đốn trước sinh để phịng ngừa bệnh Phương pháp multiplex PCR thực hiện được trong điều kiện Việt nam, với những bệnh nhân DMD Việt nam sẽ gĩp phản cho biết:
- Những exon nào hay xảy ra đột biến mất đoạn gen từ đĩ lựa chọn một số cặp mỏi phù hợp hay xẩy ra mất doan(20 exon), dé sing loc dot bién mat đoạn gen cho bệnh nhân nhanh nhằm tăng khả năng phát hiện đột biến (vì gen dystrophin lớn nhất của người chứa 79 exon nếu dị tìm sẽ rất tốn kém và mất thời gian khơng phù hợp với điều kiện kinh tế của Việt nam)
- Phát hiện đột biến ở những bệnh nhân DMD Việt nam sẽ giúp thơng
tin tư vấn di truyền cho gia đình và đặt cơ sở cho chẩn đốn trước sinh ở
những gia đình với những đột biến đã biết khi mẹ bệnh nhân muốn sinh con tiếp theo hoặc chị em gái của bệnh nhân là dị hợp từ lành mang gen bệnh(catrier) xây dựng gia đình muốn sinh con thì mẫu đột biến của bệnh nhân thuộc gia đình này chính là đối chứng bệnh để chẩn đốn trước sinh, nếu thai mang đột biến như vậy cản huỷ thai, nếu thai lành cĩ thể sinh bình thường Điều này cĩ ý nghĩa quan trọng đáp ứng nguyện vọng sinh con khoẻ mạnh ở những gia đình với những đột biến đã biết nhằm hạn chế tới mức thấp sự ra đời của những trẻ bị bệnh DMD
7.6 Ap dụng vào thực tiễn sản xuất và đời sống xã hội:
Hồn chỉnh và triển khai kỹ thuật multiplex PCR trong điều kiện Việt
nam để phát hiện đột biến mất đoạn gen cho các gia đình bệnh nhân DMD sẽ
giúp thơng tin giải thích, tư vấn cho gia đình về nguyên nhân và tác hại của
di truyền đột biến qua nhiều thế hệ để gia đình tự nguyện áp dụng biện pháp
phịng bệnh
Triển vọng của kỹ thuật multiplex PCR được thực hiện với mẫu tế bào
Trang 15nguy cơ trong gia đình muốn sinh con nhằm tránh cho ra đời những trẻ bị bệnh
7⁄7, Thực hiên mục tiêu nghiên cứu:
Đề tài đã thực hiện đủ 2 mục tiêu nghiên cứu của đẻ tài đã được Bộ phê duyệt và cịn khảo sát thêm một số exon khác ở bệnh nhân và xết nghiệm CK cho những người nữ liên quan đến bệnh nhân để tư vấn di truyền
7.8 Cac sin phdm tao ra so với dự kiến của bản để cương:
- Sản phẩm đạt yêu cầu so với dự kiến của bản đề cương với mức độ tốt và tỉa cậy(kết quả trong đề tài và kết quả bài báo đã cơng bổ)
- Đã cơng bố 3 bài báo:
+ Phát hiện đột biến mất đoạn gen dystrophin ở một số bệnh nhân loạn dưỡng cơ Ducheane bằng phương pháp multiplex PCR- Báo cáo khoa học hội
nghị tồn quốc, đăng trong tuyển tập những vấn để nghiên cứu cơ bản trong
khoa học sự sống 3/11/2003, tr 1435-1437
+ Phát hiện đột biến mất đoạn exon 4ố và 3 1 gen dystrophin ở một số
bệnh nhân DMD bằng kỹ thuật PCR Tạp chí nghiên cứu y học, volume 45
(Đ?35)tháng 12/2006; tr 22-26
+ Phát hiện đột biến mất đoạn exon 12và 48 của gen dystrophin ở một
số bệnh nhân DMD bằng kỹ thuật PCR Tạp chí nghiên cứu y học, volume 46
(N®6) tháng 12/2006, tr 32-55
7.9 Đánh giá việc sử dụng kinh phí:
Trang 16PHAN A
TĨM TÁT CÁC KẾT QUÁ NỔI BẬT CỦA ĐỂ TÀI
1 TĨM TẮT CÁC KẾT QUẢ NỒI BẬT CỦA ĐỀ TÀI
a Đồng gĩp mới của để tài:
$* Đã hồn tồn thực hiện kỹ thuật multiplex PCR trong điều kiện Việt
aam để phục vụ phát hiện đột biến mất đoạn gen dystophia cho bệnh nhân DMD
+* Đã phát hiện tỉ lệ đột biến rnất đoạn gen dystrophy ở những bệnh nhân DMD Việt nam là 5 1,6% để thơng tỉn tư vấn cho gia đình bệnh nhân $* Đã nêu ra được tỉ lệ đột biến mất đoạn ở nhĩmn bệnh nhân DMD TSDT
rõ là 32,9% và nhĩm TSDT khơng rõ là 3 1%
$* Đã nêu ra được phân bố đột biến mất đoạn ở 62 bệnh nhân DMD: Mat đoạn ở vùng trung tâm của gen từ exon 44-52 là chủ yếu (89,3%);
vùng tận cùng 5° của gen từ exon 3-19 và vùng Pm hiếm xẩy ra hơn
(10,7%)
s* Để tài đã đồng gĩp đặt cơ sở cho chẩn đốn trước sinh ở những gia
đình với những đột biến đã biết
b Kết qua cu thé:
- Chiết tách ADN của 10 người nam bình thường và 62 bệnh nhân DMD đã
kiểm tra độ tinh sạch và chất lượng ADN
-Thực hiện phản ứng PCR với 19 cặp mổi cho 18 exon và vùng promotor cơ của gen dystrophy ở 62 bệnh nhân nam DMD Việt nam và đã tìm ra tỉ lệ đột biến mất đoạn gen dystrophy là 5 1,6%
-Trong 62 bệnh nhân DMD của 60 gia đình cĩ 44 gia đình TSDT khơng rõ
(73,3%), 16 gia đình TSDT rõ (26,7%); Tỉ lệ đột biến mất đoạn gen ở nhĩm bệnh nhân TSDT khơng rõ (31,1%) và rõ (52,9%)
-Phân bố đột biến mất đoạn gen tập trung ở vùng từ exon 44-52 là chủ yếu
chiếm tỉ lệ (89,3%); vùng tận cùng 3° từ exon 3-19 và vùng promotor cơ
Trang 17- Lập bảng tổng kết so sánh về chẩn đốn lâm sàng, tương ứng với xết nghiệm CK, TSDT trong gia đình và phân tích đột biến mất đoạn gen của 18 exon và vùng promotor cơ (Pm) của ố2 bệnh nhân DMD
- Để tài cũng đã khảo sát thêm exoa 46 cho 35 bệnh nhân (đã phát hiện đột biến mất đoạn exon 46 ở 7 trường hợp DMD)
- Đã xết nghiệm CK cho 20 bà mẹ bệnh nhân DMD và đã phát hiện 8 trường hợp cĩ trị số CK tăng rõ rệt là người DHT lành mang gen bệnh được tư vấn di
truyền
- Đã xét nghiệm CK cho 8 chị em gái của bệnh nhân DMD và đã phát hiện 2 trường hợp cĩ CK tăng rõ là DHT lành mang gen bệnh, những trường hợp
này được báo cho bố mẹ biết để gia đình biết cĩ hướng phịng bệnh c Hiệu quả đào tạo
$* Đào tạo được một cử nhân kỹ thuật y học đã bảo vệ thành cơng khố
luận tốt nghiệp năm 2005 đạt loại giỏi với đề tài “ Hồn chỉnh kỹ thuật multiplex PCR với exon 12 va 48 cita gen dystrophin & ahém người
nam bình thường”
Tên cử nhân: Nguyễn Thị Hồng Lan Quỳnh
% Dao tao 1 thạc sĩ y học:
- Cử nhân Sinh học: Mai Kiên Định chuyên ngành Hố sinh- Đại học quốc gia Hà nội Niên khĩa 2005-2007
: “ Phân tích độ
loạn dưỡng cơ Duchenne bằng phương pháp PCR” đẻ tài sẽ bảo vệ vào tháng Tên để biến gen dystrophin ở một số bệnh nhân
10 năm 2007
s#* Đào tạo một Bác sĩ: Nguyễn Huyền Anh khố hoc 2001-2007, sẽ tốt
nghiệp vào tháng 6 với khố luận “ Phát biện đột biến mất đoạn cxon 46, 51 của gen dysrophia ở một số bệnh nhân loạn dưỡng cơ Duchenne” để tài đã bảo vệ đạt loại xuất sắc
d Hiệu quả về kinh tế xã hội
Trang 18mất khả năng đi lại và chết trước tuổi trưởng thành Hiện nay bệnh đã cĩ thể
chẩn đốn sớm dựa trên xết nghiệm enzym creatine kinase, tuy nhiên phuơng
pháp này khơng thể phát hiện đột biến gen và chẩn đốn trước sinh để phịng ngừa bệnh Phương pháp multiplex PCR thực hiện được trong điều kiện Việt nam, với những bệnh nhân DMD Việt nam sẽ gĩp phản cho biết:
- Những exoa nào hay xẩy ra đột biến mất đoạn gen từ đĩ lựa chọn một số cặp mỏi phù hợp hay xẩy ra mất doan(20 exon), dé sing loc dot bién mat đoạn gen cho bệnh nhân nhanh nhằm tăng khả năng phát hiện đột biến (vì gen dystrophin lớn nhất của người chứa 79 exon nếu dị tìm sẽ rất tốn kém và mất thời gian khơng phù hợp với điều kiện kinh tế của Việt nam)
- Phát hiện đột biến ở những bệnh nhân DMD Việt nam sẽ giúp thơng tỉn cho tư vấn di truyền cho gia đình và đặt cơ sở cho chẩn đốn trước sinh ở những gia đình với những đột biến đã biết khi mẹ bệnh nhân muốn sinh con tiếp theo hoặc chị cm gái của bệnh nhân là di bgp tủ ành mang gen bệnh (cartiet) xây dựng gia đình muốn sinh con thì mẫu đột biếu của bệnh nhân thuộc gia đình này chính là đối chứng bệnh để chẩn đốu trước sinh, nếu thai mang đột biến như vậy cầu huỷ thai, nếu thai lành cĩ thể sinh bình thường Điều nầy cĩ ý nghĩa quan trọng đáp ứng nguyện vọng sinh coa khoẻ mạnh ở những gia đình với những đột biếu đã biết nhằm hạn chế tới rnức thấp sự ta đời của những trẻ bị bệnh DMD
2 ÁP DỤNG VÀO THỰC TIẾN SẢN XUẤT VÀ ĐỜI SONG XA HOI:
Hồn chỉnh và triển khai ky thuat multiplex PCR trong điều kiện Việt nam để phát biện đột biến mất đoạn gen cho các gia đình bệnh nhân DMD sẽ giúp thơng tỉa giải thích, tư vấn cho gia đình vẻ nguyên nhân và tác bại của đi truyền đột biến qua nhiều thế bệ để gia đình tự nguyện áp dụng biện pháp phịng bệnh
Triển vọng của kỹ thuật multiplex PCR được thực hiện với mẫu tế bào
Trang 19nguy cơ trong gia đình muốa sinh con nhằm tránh cho ra đồi những trẻ bị bệnh
3 ĐÁNH GIÁ THUC HIỆN ĐỀ TÀI ĐỐI CHIẾU VỚI ĐỀ CƯƠNG
NGHIÊN CỨU ĐÃ ĐƯỢC PHÊ DUYỆT
a Tiến độ thực hiện
Đề tài thực biện bơi chậm so với dự kiến ban đầu do số mẫu bệnh nhân thiếu, vì cơ quaa hợp tác đẻ tài phải gửi mẫu sang Nhật phân tích
b Thực hiện mục tiêu nghiên cứu:
Đề tài đã thực hiện đủ 2 mục tiêu nghiên cứu của để tài đã được phê
Bộ duyệt và cịn khảo sát thêm một số cxoa khác ở bệnh nhân và xết nghiệm CK cho mẹ bệnh nhân và chị cm gái của bệnh nhân để tư vấn di truyền c Các sản phẩm tạo ra so với dự kiến của bản đề cương: - Sản phẩm đạt yêu cầu so với dự kiến của bản dé cương với mức độ tốt
và tỉa cậy (kết quả trong đẻ tài và kết quả bài báo đã cơng bố) - Đã cơng bố 3 bài báo:
+ Phát hiện đột biến mất đoạn gen dystrophin ở một số bệnh nhân loạn dưỡng cơ Ducheane bằng phương pháp multiplex PCR- Báo cáo khoa học hội
nghị tồn quốc, đăng trong tuyển tập những vấn để nghiên cứu cơ bản trong
khoa học sự sống 3/11/2003, tr 1435-1437
+ Phát hiện đột biến mất đoạn exon 46 và 3 1 gen dysttophin ở một số
bệnh nhân DMD bằng kỹ thuật PCR Tạp chí nghiên cứu y học, vo 45 số 3 )
tháng 12/2006; tr 22-26
+ Phát hiện đột biến mất đoạn exon 12và 48 của gen dystrophin ở một
số bệnh nhân DMD bằng kỹ thuật PCR Tạp chí nghiên cứu y học, vol 46 (số
6),tháng 12/2006; tr 32-35
4 Đánh giá việc sử dụng kinh phí:
Tổng kinh phí của đề tài là 200.000 triệu đồng
Kinh phí cịn: 6.000.000đ
Lý do là để nghiệm thu đề
Trang 20
PHAN B
NOI DUNG BAO CAO CHI TIET KET QUA NGHIEN CỨU ĐỀ TÀI CẤP BỘ
ĐẶT VẤN ĐỀ
loạn dưỡng cơ Duchenne (Duchenne muscular dystrophy (DMD)) là bệnh di truyền lặn liên kết nhiễm sắc thể X và là bệnh di truyền phổ biến cĩ
tần số cao nhất trong các bệnh cơ di truyền Tiên lượng của bệnh nặng, cĩ thể
dẫn đến tàn phế mất khả năng đi lại vào lúc 12-15 tuổi và chết ở lứa tuổi 18-
20 vì tổn thương cơ tim và suy hơ hap [156]
Bệnh gây nên do di truyền hoặc đột biến mới phát sinh trong quá trình tạo giao từ ở bố hoặc mẹ Vì vậy bệnh liên tục xẩy ra ở Việt Nam cũng như các nước trên thế giới
Nguyên nhân của bệnh là do đột biến gen dystrophy (DMD) dẫn tới khơng tổng hợp được dystrophin, protein này tham gia vào cấu trúc và chức
năng bảo vệ màng tế bào cơ, trong bệnh DMD vắng mặt hồn tồn sản phẩm
dystrophia làm màng tế bào cơ bị huỷ hoại giải phĩng cazym đặc hiệu của cơ
là creatiae kinase (CK) vào máu và biểu hiện thành triệu chứng lâm sàng của
trẻ [59]
Gen dystrophy nằm trên nhiềm sắc thể X, nhánh ngắn vùng 2 bing 1
(Xp2.), chigu dai 3000 Kb, chứa 79 exon với ít nhất 8 promotor đặc hiệu
mơ và là gen lớn nhất của người được biết cho tới nay Gen này mã hố ra
mARN 14 Kb và tổng hợp sản phẩm protein tương ứng là dystrophin cĩ mặt
ở màng tế bào cơ [74] [120]
Trang 21nhân đoạn chiếm tỉ lệ 2-7%, cịn lại là những đột biến điểm, thêm đoạn,
chuyển đoạn [27][29] [32] [38] [50] [53] [61] [63] [64]
Ở Việt nam, bệnh DMD đã được nghiên cứu vẻ lâm sàng và giá trị của phương pháp đo hoạt độ creatine kinase(CK) trong chẩn đốn sớm và phát
hiện nữ đị hợp từ để tư vấn đi truyền [11] [13] [14] [18] Phương pháp CK
cho phép sàng lọc chẩn đốn nhanh, khá chính xác bệnh DMD nhưng khơng thể phát hiện đột biến gen bệnh và ứng dụng chẩn đốn trước sinh
Đối với những bệnh di truyền tiên lượng nặng như bệnh DMD xu hướng chung của thế giới là phát hiện đột biến gen ở bệnh nhân, phát hiện những người nữ dị hợp tử, tư vấn di truyền và chẩn đốn trước sinh nhằm mục đích phịng bệnh
Mất đoạn gen là dạng đột biến phổ cập nhất, để tiết kiệm thời gian và đỡ tốn kém đị tìm 79 exon, các nước thường sử dụng phương pháp Multiplex
PCR dé khảo sát 18 exon, tập trung vào 2 vùng “ hot spots” bay xdy ra mất
đoạn của gen dystrophy
Trong điểu kiện Việt Nam, thật cần thiết ưu tiên phát triển kỹ thuật
Multiplex PCR phát hiện đột biến mất đoạn gen, để biết đột biến mất đoạn hay xẩy ra ở những exon nào, từ đồ lựa chọn những cặp mơi nào phù hợp để
tăng khả năng phát hiện đột biến mất doan geo, giúp cho tư vấn di tru
đặt cơ sở cho chẩn đốu trước sinh ở những gia đình với những đột biến đã biết
Xuất phát từ thực tế trên đề tài này nhàm 2 mục tiêu:
1 Sử dụng phương pháp Muliplex PCR với 19 cặp mỏi để phát hiện khuyết đoạn gen dysttophy ở bệnh nhân loạn dưỡng cơ Duchenne
2 Bước đầu tìm hiểu xem cxon nào của gen dysttophy thường xảy ra mất
Trang 22CHƯƠNG L
TỔNG QUAN TÀI LIỆU LLDAC DIEM DITRUYEN CUA BENH DMD
DMD là bệnh di truyền đơn gen, tuân theo qui luật di truyền lặn liên kết
nhiễm sắc thể X khơng cĩ alen tương ứng trêu NST Y Nguồn gốc của bệnh
do một gen đột biến duy nhất dẫn đến sự bất thường của một loại phan tir
Protểin tương ứng và biểu hiện thành các triệu chứng trên lâm sàng của bệnh
Vẻ mặt lý thuyết : Sáu khả năng cĩ thể xẩy ra trong quản thể đối
với bệnh di truyền gen lặn liên kết NST X khơng cĩ alen tương ứng trên NSTY
- Khả năng I: Bố XPY lành x Mẹ lành XP XP
- Khả năng 2: Bố X°Y lành x Mẹ lành mang gen bệnh(DHT) XP X? -Khả năng 3: Bố XPY lành x Mẹ bệnh X° X4
- Khả năng 4: Bố XPY lành x Mẹ lành mang gen bệnh (DHT) XP X° -Khả năng 5: Bố XY bệnh x Mẹ lành mang gen bệnh (DHT) XP X°
-Khả năng 6: Bố X#Y bệnh x Mẹ bệnh X° X°
Trong quản thể người đối với bệnh DMD khả năng thứ2 là bay gặp nhất Trong bệnh DMD trẻ trai bị bệnh thường dẫn đến tàn phế và chết ở lứa tuổi 18-20 tuổi, cho nên thường khơng cĩ khả năng xây dựng gia đình Trong bệnh BMD (Betker muscular dystrophy) cũng là bệnh di truyền lặn liên kết nhiễm sắc thể X do đột biến gen dystrophy gây nên, nhưng biểu hiện bệnh nhẹ, tuổi thọ của bệnh nhân cĩ thể tới 40 hoặc 50 tuổi cho nên bệnh nhân BMD ngồi khả năng 2 hay gặp, cịn cĩ thể gặp khả năng thứ 4, thứ 5
[21[35][79]
Bệnh di truyền lặn liên kết NST X mang đặc điểm sau:
Trang 23Người nữ cĩ biểu biện bình thường nhưng là di hợp từ mang gen bệnh (catier) cĩ khả năng truyền bệnh cho 50% số con trai và truyền gen bệnh cho 50% số con gái của họ
Gen đột biến khơng bao giờ truyền trực tiếp từ bố sang con trai
Gen đột biến cĩ thể truyền qua nhiêu thế hệ trong dịng họ qua người mang
là nữ
Kết hơn cận huyết khơng làm tăng tỉ lệ bệnh DMD [2]
Nguyên nhân của bệnh DMD cĩ thể do di truyền gen bệnh từ mẹ hoặc do đột biến mới nẩy sinh trong quá trình tạo giao tử ở bố hoặc mẹ
Đột biến gen lặn liên kết NST X gây bệnh DMD xẩy ra trong quá
trình tạo giao từ ở nam qua thụ tính tạo thành hợp từ sẽ đi vào thế
nữ, truyền bệnh cho chấu thuộc giới nam
Gen bệnh sẽ được lưu truyền, lan rộng dần trong đồng họ và quần thể
mà chưa chịu áp lực của chọn lọc tự nhiên vì gen bệnh tồn tại ở dạng dị hợp từ khơng biểu hiện thành bệnh Tuỳ theo mức độ thích ứng mà bệnh được đào thải một phản hoặc ngay thế hệ đĩ
Đột biến gen DMD xẩy ra trong quá trình tạo giao từ ở người nữ thì
qua thụ tỉnh đi vào hợp từ XY sẽ biểu hiện ngay thành bệnh ở gi
i aam và chịu ngay áp lực chọa lọc ở chính thế hệ mang đột biến mới aảy sinh đĩ Nếu đột biến đi vào hợp từ XX, qua các coa chấu thuộc giới nữ, những người nữ nầy sẽ truyền bệnh DMD cho con trai, và truyền gen bệnh DMD cho con gái thuộc các thể hệ tiếp theo làm gen bệnh càng lan rộng và tồn tại thời gian dài trong quản thể [2]
Nữ mang gen biểu hiện bệnh: Biểu hiện bệnh ở giới dữ biến thiên rất rag, cé thé bình thường, nhưng cũng cĩ thể biểu hiện bệnh ở các mức độ nhẹ, trung bình, thậm chí nặng tuỳ tỉ lệ NST X mang gea lành hay
Trang 2412 TÂN SỐ BỆNH LOAN DUGNG CG DUCHENNE
DMD [a béah cé téa số cao trong nhĩm bệnh loạn dưỡng cơ tuần tiến Nhiều nước tiên tiến trên thế giới đã nghiên cứu tần suất bệnh DMD: Theo Engel AG, Banker BQ ở Mỹ năm 1986 tản số bệnh DMD là 1/3500 trẻ trai
mới sinh[36] Theo Jery R Meadell và Robert c Griggs (1991) tần suất của
bệnh là 13-33/ 100.000 trẻ trai mới siah sống [105] Theo Fauci năm 1998 tần số là 30/100.000 trẻ trai mới đẻ sống [39] Theo Behrman năm 1998 tin
số là 1/3600 trẻ trai để sống [35]
bệnh DMD là 1/4215 trẻ trai mới đẻ sống [143] Theo Zoral papp, tia so là 1/2600- 1/2700 trẻ nam mới sinh [151]
Hà Lan theo Van-essen(1992) tần số
Ở Việt Nam, chưa cĩ cơng trình nào nghiên cứu về tần số bệnh DMD
Theo cơng bố của Nguyễn Thu Nhạn và cộng sự năm 1991, thì từ năm
198 Lđến 1990 cĩ 131 bệnh nhân vào điều trị tại khoa Nội tiết Chuyển hố- Di truyền Bệnh viện nhỉ quốc gia Hà Nội, chiếm 0,6% trong tổng số bệnh nhân vào điều trị tại viện [11] Theo Nguyễn Thị Phượng và cộng sự, từ năm 1981 - 1993 cĩ 176 bệnh nhân DMD vào điều trị tại khoa Nội tiét-Chuyéa hố- Di truyền Bệnh viện nhỉ quốc gia Hà Nội [13] Theo Nguyễn Thị Trang từ năm 1994-1999 cĩ 112 bệnh nhân DMD điều trị tại khoa Nội tiết- Chuyển
hố- Di truyền [18]
13 CƠ SỞ DITRUYỀN PHÂN TỦ CỦA BỆNH DMD
1.3.1 Vị trí, cấu trúc và chức năng của gen dystrophy (DMD) 1.3.1.1 VỊ trí của gen dysrophy
Trang 252 SE ng ờnoormaeue cousss pT A Honaaal eysganesis, X¥ type 1B te -Aldnch sựnorcra Anaregonsaanclinny Eenwy Agammagicbulineméa, ype 1 JAbox suncrome Than] -nmunG8fEsaoey, X-Inxed, nh DVpar TM |—xemopnua 8 ago x smmareme [Zarenoouxsesteer L ]Ã2rgaonmreestauroostnv IHemeenua A (Eeleraicanes= 5G: 5araaiagia
Hình I.I Ban 46 NST X va gen Dystrophy nam 6 vi trí khơng tương ứng với NST Y (Trích dẫn bởi Fauci năm 1998 [39]
1-3.1.2.Cấu trúc của gen dystrophy
Gen Dystrophy là một trong những gen lớn nhất của người đã được biết, lớn hơn 1000 lần gen Gl6bia, kích thước khoảng hơn 2000 Kb 135] [59]
Trang 26contomare ° so 1000 190 2000 to | | I I I =e fees 2 —ce soe Be ees a T TT——TTTITINMITE:TL———T T T T T TF)
cou oY $y $ Đlếmnĩngoủa ‘idm nĩng của Y L :
ER Emel doen Ÿ Khuyết đoạn š 3 5 : — 5 ì = gE : Hinh 1.2 Sơ đỏ cấu trúc gen Dystrophy của người Gen Dystrophy là một phức hợp gồm : 1 i
Bộ phận khởi động (Promotor) cho phép gen hoạt động, khi nào đĩng, khi nào mở và sản xuất ra các sản phẩm protêin đặc hiệu mơ tương ứng Cĩ ít
nhất tám promotor đặc hiệu mơ: promofor não, promotor cd, promotor tiéu
não và một số promotor phản xa [108]
Bẩy mươi chín exon: exon là vùng của gen được phiên mã cĩ mặt trong mARN thuần thục, chứa đựng những thơng tia mã hố để tổng hợp ra
protêin
Những intron : Là những đoạn ADN của gen xen kẽ giữa những exon,
được sao mã thành mARN tiền thân, nhưng bị lấy đi trong quá trình tạo
mARN thudao thục (introna khơng cĩ mặt trong mARN thuần thục)
Hai ving (point chaud de delétion) cdn gọi là điểm nĩng của khuyết đoạn, là những vùng hay xẩy ra khuyết đoạn nhất của gen Dystrophy
3.1.3 Chite ning ca gen dystrophy
Gen Dystrophy téng bgp ra mARN thuần thục 14 kb (nghia là chỉ chứa ít
hơn 1% ADN của tồn bộ gen) aARN của gen Dysfrophy tổng hợp ra sản
Trang 2713.2 Cau trúc và chức năng của Dystrophin 13.2.1 Cấu trúc của Dystrophin
Dystrophia sản phẩm của gen Dysfrophy là một protêin cĩ khối lượng 427 kilodaltona và khoảng 3683 axit amin, trình tự axit amia của
chuối polypeptit của dystrophin biết được là suy ra từ cADN [74] [107]
[156] Dystrophin chi chiếm 0,002% tồn bộ protein của cơ [51]
Dystrophin được phát hiện thấy ở cơ tim, cơ trơn, cũng như ở cơ xương
và ở não [35]
132.2 Dysropiin là một thành phẩn của một phúc hợp lớn những protein vé glycoprotein mang sot co van
Xem xét sự sắp xếp và mối liên quan của dystrophin, một sản phẩm của gen DMD với các thành phản khác của phức hợp protein màng sợi cơ là rất cần thiết i | ea a Ị F-Aetn |
Hình1.3 Dystrophia ở bẻ mặt tế bào chất của màng sợi cơ vân
(Trích dẫn bởi Fauci năm 1998 [39])
Trang 28Nhĩm 1; Bao gém Dystrophia va những dysroglycan œ và ÿ Dystrophin gắn với F-actia bởi nhĩm amin cia axit amia tận và gắn với B dystrogLycaa tại nhĩm carboxy| của axit amia tậu B dystroglycaa lại gắn với œ dystroglycan và glycoproteia ngoại bào trong lá nền (basal lamina) œ dystroglycan gắn với lamiaia
Nhĩm 2 : Bao gồm những satcoglycan gồm 4 thành phần protein vận chuyển màng : « sarcoglycaa, B sarcoglycan, ÿ sarcoglycaa và 8 sarcoglycan
Nhĩm 3: Gồm laminin, thành phần cần thiết của lá néo (basal
lamina) [38]
Theo Barnea E năm 1990 đã phát hiện mARN 14 Kb được sản xuất bai gen DMD, đã quan sát thấy ở não, loại mARN này mã hố ra một
protein tương tự dystrophian của cơ, nhưng được điều hồ bởi một
promotor khác [36]
1.3.2.3 Chức năng của Dystrophin
Dystrophin cĩ mặt ở bề mặt trong của màng những tế bào cơ xương,
nĩ liên kết với các protein màng thành một phức hợp cĩ vai trị cấu trúc
nâng đỡ tương tự như những protein khung xương tế bào (alpha acfinin và spectrin) dystrophin cịn được coi như yếu tố bảo vệ màng của tế bào cơ
khỏi bị xé rách khi co cơ [107] Chức năng của mối thành phần trong phức hợp glycoprotein liên kết dystrophin vẫn cịn đang được nghiên cứu (hình 1.3) Tuy nhiên những quan sát quan trọng cũng đã chỉ ra rằng phức hợp glycoprotein liên kết dysttophin làm vững bên màng sợi cơ vân
14 CƠ CHẾ BỆNH SINE CUA DMD
Khi gen dystrophy bị khuyết tật như :khuyết đoạn, nhân đoạn hoặc đột biến điểm làm cho gen khơng hoạt động dẫn đến khơng cĩ hoặc thiếu hụt sản phẩm dystrophin hoặc phân tử dystrophin bị ngắn đi khơng vững
bền, sự thiếu hụt một thành phần của phức hợp kéo theo mất các thành
Trang 29màng tế bào cơ bị xé rách, kếo theo sự huỷ hoại tế bào cơ giải phĩng cazym đặc hiệu của cơ là creatiae kiaase vào máu, sự nối tiếp của những sự kiện xảy ra cứ lặp đi lặp lại như vậy trong suốt thời gian sống của bệnh nhân làm suy yếu cơ, teo cơ, hậu quả là bệnh nhân mất khả năng đi lại, tàn phế, rồi dẫn đến suy kiệt và chết [39] [111]
1.5 CƠ CHẾ DI TRUYỀN CỦA BỆNH DMD 1.51 Gen đột biến cĩ sắn trên NST X của mẹ
Nếu mẹ mang gen đột biến trên NST X cĩ khả năng sinh ra 1/2 số con trai bệnh, 1/2 số coa trai lành và 1/2 số con gái mang gen bệnh, 1/2 số con gái lành Coa trai bị bệnh thường chết ở tuổi xây dựng gia đình cho nên khơng truyền bệnh Những người nữ mang gea lại tiếp tục truyền gen bệnh theo quy luật trên làm gen bệnh ngày càng lan rộng trong đồng họ [59]
Greenberg.CR năm 1987 đã cơng bố một gia hệ cĩ 4 thế hệ cĩ người bị bệnh DMD, càng những thế ê sau số cá thể bị bệnh DMD càng tăng, do gen bệnh DMD đã truyền cho nhiều phụ nữ trong đồng họ [62] 1.5.2 Đột biến mới
Quá trình phát sinh giao từ ở cơ thể bố hoặc mẹ cũng cĩ thể xẩy ra
các đột biến gen, vi dụ : Bố mẹ bình thường, nhưng lại xuất hiện một con trai duy nhất bị bệnh DMD (hình1.4)
ot
Đột biến mới Đột biến mới
Hình I.4 Đột biến mới xẩy ra với bệnh di truyền lặn liên kết NST X (Trich din béi Fauci nam 1998)
Hình trên cho thấy : Mẹ cĩ thể là một người khơng mang gea bệnh, nhưng cĩ thể đồng gĩp một trứng mang NST X với đột biến mới kết hợp
Trang 30với một tỉnh trùng bình thường của bố để tạo hợp tử X9Y là cơ thể nam bị
bệnh, hoặc mẹ là người mang gen bệnh DMD, người mẹ này cĩ thể nhận
được một giao tử với đột biến từ đời trước [39]
Miciak và cộng sự năm 1992 tai Oxford nước Anh đã cơng bố một gia hệ lớn với 3 cậu bé bị bệnh DMD cĩ liên quan họ hàng Tuy nhiên khi nghiên cứu ở mức độ phân từ đã chỉ rằng một cậu bé cĩ một nhân đoạn, một cậu bé khác cĩ một khuyết đoạn và đột biến phân từ cịn chưa được xác định ở cậu bé thứ ba Tất cả 3 NST X của 3 cậu bé bị bệnh cĩ nguồn gốc khác nhau Các tác giả nghĩ đến những cơ chế mà theo cơ chế này locus Duchenne dé xdy ra đột biến và cũng cĩ khả năng gen nhẩy
(transposons) được bàn luận Sự kiện 3 đột biến khác nhau trong một gia
hệ là rất hiếm gặp [106]
1.5.3 Dang kham soma tại vùng gen Dystrophy (Somatic
mosaicism at the Duchenne locus)
Trường hợp này là do đột biến trong quá trình phân bào nguyên nhiễm của hợp tử ở giai đoạn phân cắt đầu tiên, hậu quả là hình thành các
cơ thể ở trạng thái khảm
Lebo RV và cộng sự (1990) đã phát hiện dạng khảm soma tại locus Duchenne cĩ nguồn gốc ơng nội ( grand paternal somatic mosaicism) của một gia đình cĩ bệnh DMD thơng qua việc xét nghiệm phân tích tính đa
hình ADN trong gen [91]
Piior và cộng sự năm 1992 ở Columbus đã dùng ADN dị để nghiên
cứu một gia đình cĩ bệnh nhân DMD và đã phát hiện một đoạn nối
khuyết đoạn cĩ mặt trong ADN của bệnh nhân DMD và một ngi gái, nhưng đột biến khơng tìm thấy trong ADN của mẹ[ 144]
Voit và cộng sự năm 1992 đã tìm thấy bằng chứng của dạng khẩm soma ở người mẹ cĩ một con trai bị bệnh BMD và con gái là người mang gen(a carrier daughter) [144]
Trang 31Bunyan va cong sif nim 1994, 1995 đã báo céo dang khim soma (somatic mosaicism) mét người mẹ bệnh nhân DMD và dùng kỹ thuật FISH, RT-PCR và phân tích đa hình (polymorphism) từ vùng khuyết đoạn gen dystrophin cũng đã chỉ ra dạng khảm soma ở bà mẹ bệnh nhân DMD khác [144] Nhiều dạng khảm soma mà ở những người này những dịng tế
bào với đột biến bao gồm một tỷ lệ lớn những tế bào lymphocyte đã trốn
được sự phát hiện, vì thế người mẹ được xem như một người mang đột
biến gen bệnh Điều này nên nghiêng vẻ tỉ lệ giới của những đột biến mới hướng tới nguồn gốc mẹ cao hơn [ 143]
Những trường hợp trên đã chứng tỏ tầm quan trọng của việc xết
nghiệm người mang khuyết đoạn và những gơi ý về lời khuyên di truyền
cho dang khẩm soma [144]
1.5.4 Dang khẩm dịng fế bào mâm (rong bệnh DMD (Germ line mosaicism in DMD/BMD)
Hiện tượng này cũng thường gặp trong những gia đình bệnh nhân DMD/BMD Cả hai dạng khẩm thuộc nguồn gốc mẹ hoặc ơng
nội@natetnaL and grand-pateroal maosaicism) đã được chứng mỉnh và điều nầy nên được xem xét khi diễn giải kết quả trong những gia đình bệnh nhân DMD Đa số những trường hợp gần đây về dạng khẩm thuộc nguồn mẹ Gmatetoal mnosaicism) đã gợi ý tằng khi một người mẹ của một cậu bé
bị bệnh đơa độc (solated affected boy) đã được xem như khơng phải là người mang gea bệnh, bà mẹ này vẫn cịn xấp xỉ nguy cơ 20% là một người mang gea bệnh từ dồng tế bào mầm (germ liae catrier) Bởi vậy trong một gia đình với cậu bé bị bệnh đơn độc với đột biến đã được phát hiện, mà mẹ của cậu bé khơng mang đột biến, bà mẹ này cĩ 3% nguy cơ cĩ một con trai khác bị bệnh
Dạng khảm đồng tế bào mắm trong bệnh DMD được mơ tả đầu tien bởi Bakker và cộng sự năm 1987 [144]
Trang 32Nhiều báo cáo tiếp theo cũng đã nêu, những em trai và những chị em gái của bệnh nhân với một đột biến mới rõ ràng cĩ nguy cơ ước lượng 5-
10% di truyền cùng đột biến do dạng khẩm dịng tế bào mầm [144]
Dạng khảm đồng tế bào mảm cĩ nguồn gốc từ ơng nội( Grand
paternaL germline mosaicism) đã được tìm thấy gián tiếp bằng phương
pháp phân tích đơn bội(haplotype analysis) và phân tích đột biến trực tiếp
[144]
Dang khim té bao mầm của một bệnh nhân DMD do đột biến điểm lần đầu tiên được mơ tả bởi Winton và cộng sự [144]
Dù bệnh DMD là do nguyên nhân di truyền hay đột biến mới đều là hậu quả đột biến cấu trúc của gen Dystrophy
1.6.CAC DẠNG ĐỘT BIẾN CẤU TRÚC CỦA GEN DYSTROPHY (DMD) 1.6.1 Khuyết đoạn gen Dystrophy
Theo Zatz năm 1998 cho thấy cĩ 60-65% những bệnh ahaa DMD [a do khuyết đoạn, cịn lại 35-40% là do đột biếu điểm, thêm đoạn, nhân
đoạn [133]
Theo Bebtman cĩ khoảng 63% những bệnh nhân DMD là do khuyết đoạn, 2-7% là do nhân đoạn [35] Trong cả hai DMD và BMD những khuyết đoạn ADN và nhân đoạn ADN tập trung thành từng đám trong 2 điểm nồng,
một ở sát gần đầu tận cùng 5“ của gen và bao gồm những exons 2-20 (30%)
và một ở cách xa hơn, bao gồm những exons 44-53 (70%) [49] Vi trí và cỡ
của những đột biến này tất đa dạng, cĩ tới vài trăm đoạn mất đã được đếm trên cả thế giới Độ dài đoạn mất rất thay đổi, cĩ thể chỉ là 1 cxoa hoặc cĩ khi vai exons hoặc cĩ khi 18 exons, cĩ khi là vài trăm cặp bazơ (base pait) cĩ khi 6 kb, cĩ khi tới 2000 kb [156]
Theo Bazanziai phân tích khuyết đoạn ở 75 bệnh nhân DMD và BMD ở quản thể Argentina, ơng nhận thấy cĩ 24 bệnh nhân cĩ khuyết đoạn gen Dystrophy, những khuyết đoạn này tập trung chủ yếu vào 2 vùng của gen
Trang 33Dystrophy: Ving 1 ở đầu tận cùng 5' (exons 3-12) chiếm 34%; vùng 2 là những khuyết đoạn nằm ở vùng giữa gen Dystrophy chiếm 64% Những vị trí thường gặp nhất cho những điểm cuối khuyết đoạn là intron 47(13,6%),
intron 44 (11%), 2 (9%), 12 (7%) Như vậy cĩ sự khác nhau vẻ tỉ lệ và phân
bố của những khuyết đoạn ở những bệnh nhân DMD/BMD ở Argentina so với những số liệu được báo cáo ở những quản thể khác [33]
Cĩ một tỉ lệ cao những khuyết đoạn được quan sát ở những trường hợp
bệnh DMD mang tính gia đình chiếm 40% al
DMD trong gia đình chỉ cĩ một con duy nhất bị bệnh(30%) Hiệu quả của khuyết đoạn trên khung đọc thống nhất với kiểu hình ở hầu hết tất cả những bệnh nhân được nghiên cứu Nghiên cứu này sẽ rất ích lợi trong chẩn đốn trước sinh và chẩn đốn cho những bệnh nhân khác ở Argentina
[33][38][6 11[63][64][83]
u hơn là những trường hợp
Theo Albena Todorova năm 1996 đã thực hiện phân tích đột biến lần đầu tiên ở Bulgaria trong 84 bệnh nhân DMD và BMD khơng cĩ quan hệ họ
hàng Tác giả nhận thấy những khuyết đoạn trong gen được phát hiện trong
67,8% những bệnh nhân Những điểm đứt khuyết đoạn rơi vào vùng hay xẩy ra khuyết đoạn, quanh intron 44 và đa số (54%) những khuyết đoạn trong khoảng introns 45-31 Vùng iatron 50 là hay xảy ra khuyết đoạn nhất với quần thể người Bulgaria chiếm 16% So sánh với những số liệu phân tích đột biến của quần thể người Hy Lạp và Thỏ nhĩ Kỳ cho thấy cĩ khả năng < điểm
nĩng của khuyết đoạn > hay xẩy ra ở vùng infron 30, cĩ thể là đặc trưng của
những quần thể người vùng Balkan [27]
Vùng hay xẩy ra khuyết đoạn “hot spot° và mẫu khuyết đoạn của gen Dystrophy cĩ sự khác nhau giữa các chủng tộc Vì vậy nhiều nước trên thế giới đã nghiên cứu phân tích mẫu khuyết đoạn của gen Dystrophy, để tìm ra đặc trưng riêng cho chùng tộc của mình phục vụ cho mục đích “Chẩn đốn
trước sinh bệnh DMD” như ở : ở Liên xơ [32]; Argentina [33] Singapore [93]; ở Hà Lan [144]; ở; ở Trung quốc [84][146][152]; ở Pháp [109]; ở Ấn
Trang 34Độ [130]; ở Anh [117]; ở Serbia [116] ở Đức, Tiệp, Hung [53] [128]; ở Chỉ Lê [75][129]; ở Nhật [132]
1.6.2 Đột biến nhân đoan trong gen Dystrophy
Đột biến nhân đoạn trong gen Dystrophy chiếm một tỉ lệ rất nhỏ khoảng 2-7% [27] [35] Theo Albena khi nghiên cứu đột biến ở gen
Dystrophy của 84 bệnh nhân DMD và BMD khơng cĩ liên quan họ hàng đã gặp 57 bệnh nhân DMD là do khuyết đoạn (67,8%) và 2 bệnh nhân DMD là
do nhân đoạn (2,4 %) Một bệnh nhân nhân đoạn xẩy ra từ (exon 2-32), một
bệnh nhân nhân đoạn thuộc vùng exon 30
1.63 Đột biến điểm xẩy ra trong gen Dystrophy
Đột biến điểm cũng như nhân đoạn, thêm đoạn hiếm xẩy ra hơn so với kiểu
đột biến mất đoạn trong gen Dystrophy
Roest PA nim 1996 đã sử dụng phương pháp phát hiện đột biến dựa trên ARN để sàng lọc tồn bộ vùng mã hố của gen dystrophy ở 1 bệnh nhân DMD và | bệnh nhân BMD mà ở những người này, những
phương pháp phát hiện đột biến dựa trên ADN đã khơng phát hiện được
trong cả 2 trường hợp Bằng phương pháp RT-PCR va PIT (protein
truncation test) ơng và cộng sự đã nhận ra những đột biến điểm trong cả
hai trường hợp; trường hợp 1: bệnh nhân DMD cĩ một đột biến thay T
bằng A (T->A) 6 intron 59 tai vị trí 9, trường hợp 2: bệnh nhân BMD mang đột biến Œ thay bằng C tại vị trí +5 của intron 64 [119]
Roberts RG năm 1992 cho biết những đột biến trong 1/3 những bệnh nhân DMD cồn lại chưa được biết, bởi vì chúng là những đột biến quá nhỏ trong gen dystrophy rất khĩ thấy Họ đã sử dụng phương pháp (PCR lỏng) “nested PCR” và phương pháp cắt liên kết khơng tương xứng hố
học để phân tích trình tự của những bản sao ngược từ mARN của gen
dystrophy (nARN—»cADN) từ những bạch cầu lympho máu ngoại vi Họ đã phân tích vùng mã hố tồn bộ của gen Dystrophy 11 kilobases ở 7
Trang 35bệnh nhân, kết quả họ đã phát hiện được thay đổi trong 1 trường hợp với biểu hiện đầy đủ bệnh DMD điển hình [118]
1.6.4 Đội biến kiểu chuyển đoan gây bệnh DMD ớ trẻ gái :
Bệnh DMD ở những trẻ gái về nguyên nhân là do đột biến kiểu chuyển
đoạn giữa NST X và NST thường (Translocation (X; autosome)) diém đứt xảy
ra ở NST X luơn hằng định tại Xg2.1, nhưng điểm đứt ở các NST thường luơn thay đổi Chuyển đoạn cĩ thể xẩy ra giữa NST X với một trong các NST
thường sau: t Œ, 1); t2), t Œ, 3), t &, 4), t %5), t %6), t Œ8); t (X9), t KL), t (K15), t Œ, 2D), t (X22) [29][37 [50]
Những trẻ gái bị bệnh DMD cĩ một trong hai NST X mang chuyển đoạn (X autosome) cda NST X kia bình thường, những người nữ này là dị hợp từ: (carriers) tuy nhiên biểu hiện bệnh được giải thích là: theo giả thuyết cĩ một tỉ lệ những NST X bình thường bị bất hoạt, cịn NST X kia mang chuyển đoạn (X; autosome) lại hoạt động làm cho biểu hiện lâm sing day
đủ của bệnh DMD [138]
17 CÁC PHƯƠNG PHÁPXÉT NGHIỆM TRONG CHAN DOAN BENH DMD
1.7.1 Phương pháp định lượng hoạt đơ creafine kinase trong huyết thanh 1.7.1.1 Cơ sở phân tử và vai trị của creatine linase huyết thanh
Creatine kinase (CK) hay cịn gọi là photphocreatine kinase (CPK) là
một enzym tập trung chủ yếu ở màng sợi cơ vân Gen tổng hợp ra enzym nằm
trên NST số 19 tại vị trí q1.3.2 [78] Vai trị của Creatiae kinase được biểu thị theo cơng thức sau :
Trang 36
Phosphocreatine Adenosine diphosphate (Creatine phosphate, CrP) (ADP)
Photphocreatine là dạng dự trữ năng lượng dưới dạng photphoryl hố
cần thiết cho quá trình co cơ và chuyển hố trong tế bào cơ[69] [96] 1.7.1.2 Ý nghĩa lâm sàng của xét nghiệm creatine kinase huyét thanh
Ebashi và cộng sự năm 1939 là người đầu tiên áp dụng định lượng CK huyết thanh trong chẩn đốn các bệnh cơ [Trích dẫn từ tài liệu 69]
Các tác giả thấy rằng hoạt tính CK cao trong các thể loạn dưỡng cơ đặc
biệt trong bệnh DMD hoạt tính CK tăng cao từ 20-100 lần hoặc hơn so
với giới hạn của người bình thường Hoạt tính CK tang rat sém ngay khi
mới đẻ và giai đoạn ấu thơ, trẻ em từ 7-10 tuổi hoạt tính CK cao duy trì
đến giai đoạn cuối của bệnh, rổi giảm xuống vì cơ khơng hoạt động và
teo nhiều Do vậy mức CK tăng vọt cĩ thể chẩn đốn trẻ trai bị bệnh rất
sớm Trong trường hop CK huyết thanh bình thường thì khơng phù hợp với chẩn đốn bệnh loạn dưỡng cơ Duchenne (trừ giai đoạn cuối của
bệnh) [35] [59] [69] [96][105] Trong những bệnh thần kinh cơ, xơ cứng
cột bên teo da cơ, viêm tuỷ sống và Patkinson hoạt tính CK huyết thanh bình thường Trong viêm đa cơ CK huyết thanh tăng nhẹ, trong teo cơ cột
sống CK bình thường [69]
Phân tích CK cịa được sử dụng để phát hiện dị hợp từ cho những người aữ cĩ quan hệ với bệnh nhân như me, dì theo đồng họ mẹ, chi em
Trang 37gái của bệnh nhân DMD để cho lời khuyên di truyền cho họ khi họ kết hơn hoặc muốn sinh con tiếp theo [131] Định lượng CK cho phép phát hiện 2/3 trường hợp dị hợp từ bắt buộc [38][151] Nhiều tác giả nhận
định, định lượng CK huyết thanh là một test ích lợi nhất cho phát hiện
người mang nhưng chỉ phát hiện được 50% -80% những người mang cĩ
hoạt tính CK tăng [43][66][ 100]
Ngày nay với sự hiểu biết gen khuyết tật trong bệnh DMD đã mở ra khả năng lớa trong việc phát hiện đị hợp từ để tư vấn di truyền và chẩn đốn trước sinh bằng phương pháp tái tổ hợp ADN, tuy nhiên xét nghiệm sàng lọc CK vẫn giữ vai trồ bước đầu rất quan trọng để chẩn đốn và phát hiện dị hợp tử vì
giá thành xết nghiệm khơng cao và cho kết quả nhanh [3]
1.7.2 Phương pháp thăm đị điện sinh lý cơ ( ghỉ điện cơ )
Giỉ điện cơ hay điện cơ đồ là phương pháp nghiên cứu hoạt điện của cơ băng cách ghỉ lại điện thể hoạt động của các sợi cơ ở các trạng thấi khác nhau Mục đích của kết quả điệu cơ đỏ cho biết tình trạng suy yếu cơ là do tổn thương cơ hay do thần kinh Trong bệnh loạn dưỡng cơ Duchenae hình ảnh tỏa thương trên điện cơ đỏ điển hình cho bệnh thuộc vẻ nguồn gốc cơ
chứ khơng đặc hiệu cho bệnh DMD[12] [30]
1.7.3 Sinh thiết cơ , chẩn đốn giải phẫu bệnh vi thể trong xác định tổn thương cơ ổ bệnh nhân DMD
Từ thế kỉ thứ 19 (1852 ) Edward Meryon và vài năm sau là
Duchenne de Bouloque (1868) đã áp dụng phương pháp sinh thiết cơ trong thực hành lâm sàng để chẩn đốn bệnh loạn dưỡng cơ Duchenne
phương pháp này được coi như một xết nghiệm cĩ giá trị trong một thời
gian đài đã giúp cho các nhà lâm sàng trong chẩn đốn xác định bệnh DMD và chẩn đốn phân biệt với các bệnh lí khác [30]
+ Tổn thương đại thể : Cơ nhợt và xơ hố ,trong các cơ giả phì đại cĩ hiện tượng thối hố mỡ, làm cơ cĩ mầu vàng đặc hiệu trên mặt cắt [30]
Trang 38+ Tổn thương vì thể: Những bằng chứng của thối hố tế bào ,cĩ những thay đổi đường kính sợi cơ, một số cĩ vẻ nhỏ lại, một số khác to phỏng lên Hiện
tượng tích tụ nhân được tìm thấy dọc theo bao cơ Cĩ sự tăng sinh của các mơ
tiếp nối và huỷ hoại những sợi cơ, ở nơi nào cĩ hoại từ thì cĩ thể gặp hiện tượng xâm nhập và thực bào bởi các mơ bào, từng thớ cơ bị tách rời nhau bởi mơ mỡ, mơ liên kết Trong giai đoạn cuối của bệnh, mơ liên kết thay thế
phần lớn khối cơ, hãn hữu mới thấy các thớ cơ nhỏ, thối hố [30] [151]
1.7.4 Phương pháp miễn dịch huỳnh quang chẩn đốn sư thiếu hut hộc vắng mặt hồn tồn sản phẩm dystrophin trên màng sợi cơ
Kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang (MDHQ): Là kỹ thuật đánh dấu chất mầu huỳnh quang (Fluorocrome) vào kháng thể nên cịn gọi là kỹ
thuật kháng thể huỳnh quang Nhờ tính chất phát quang của các chất mầu
huỳnh quang nằm trong kết hợp kháng nguyên -kháng thể khi chiếu tỉa
cực tím ta cĩ thể phát hiện được dễ dàng phức hợp KN-KT trên tiêu bản
tổ chức học qua thị kính hiển vỉ huỳnh quang, như vậy MDHQ là phương pháp hố tổ chức miễn dịch học trong đĩ kháng thể gắn chất mầu huỳnh quang phản ứng trực tiếp hoặc gián tiếp với kháng nguyên hoặc kháng thể
trên tiêu bản tổ chức [ 1]
Ở người bình thường dystrophia cĩ mặt ở màng plasma của sợi cơ
vân, cơ từm, cơ trơn và não [22] [39] [156] Dystrophin là một protein, do
đĩ dystrophin cĩ tính sinh kháng thể Vì vậy cĩ thể phát hiện sự cĩ mặt
của dystrophin hay khơng ở màng sợi cơ vân trên tiêu bản mơ cơ cắt lạnh
từ mẫu sinh thiết cơ của bệnh nhân DMD bằng phương pháp MDHQ Đọc tiêu bản dưới kính hiển vì huỳnh quang cho thấy ở những tế bào cơ bình thường thì dystrophin định khu ở màng sợi cơ, ở đĩ cĩ phản ứng kết hợp KN-KT, thể hiện đường viền của những sợi cơ với những đường phát sáng huỳnh quang mảnh và liên tục khơng bị ngắt quãng Trong khi ở những người bệnh DMD khơng cĩ phản ứng của dystrophia và khơng cĩ sự phát sáng huỳnh quang, khơng thấy rõ ranh giới màng tế bào cơ [22] [23] [24]
[74]
Trang 39Ảnh miễn dich huynh quang(Trich din béi Jean Claude Kaplan[156]
A: Ngudi binh thudng
Người bệnh DMD 1.7.5 Xét nghiệm ADN
Xét nghiệm ADN để tìm kiếm những bất thường trong cấu trúc của
gen dystrophy trên nhiễm sắc thể X của người bệnh Hiện nay những xết nghiệm la bơ cĩ thể phát hiện khuyết đoạn trong gen dystrophy ở 70% những cậu bé bị bệnh DMD, khi những khuyết đoạn gen dysttophy được tìm ra ở những cậu bé, thì người ta sẽ cố gắng tìm ra những khuyết đoạn gen ở những người nữ liên quan như mẹ bệnh nhân Một thuận lợi của xết nghiệm ADN là cĩ thể sử dụng để phát hiện những thai nam bị bệnh trong 8-10 tuần của thời kỳ thai nghén, điều này cho phép những gia đình với những người nữ mang gen bệnh cĩ thể cĩ thể sinh một con trai bình thường Nếu khuyết đoạn gen khơng được phát hiện ở cậu bé bị bệnh thì
cĩ một số phương pháp khác dựa trên kiến thức của gen dystrophy và
những gen liên quan trên NST X để xác định người nữ là người mang gen bệnh (carriet) hoặc người nam bị bệnh, phương pháp này gọi là phương pháp phân tích liên kết (linkage analysis)[73]
Trang 401.8 CAC PHUGNG PHAP PHAT HIEN DOT BIEN GEN DYSTROPHY 1.8.1 Phát hiện những tổn thương lớn của gen dystrophy
18.11 Phương pháp PCR
Phương pháp PCR để phát biện đột biến mất đoạn gen dysttophy thường sử dụng 18 cặp mỏi cĩ khả năng bao phủ 18 exon trong những vùng hay xẩy ta đột biến khuyết đoạn * hot spots” cia gen dystrophy cé khả năng phát biện 98% những khuyết đoạn gen dystrophy [26]]I42]I45]-
- Ở những bệnh nhân những cxoa khuyết đoạn sẽ khơng cĩ mặt băng tương ứng trên bình ảnh điện di sản phẩm PCR Những nhân đoạn cĩ thể phát hiện bằng phương pháp PCR định lượng với sự so sánh kiểm chứng
với người bình thường
- Ở những người mang gen (carriers)
Chứng minh dị hợp từ hoặc bán hợp tử dựa trên những marker đa hình trong những vùng tương xứng với khuyết đoạn ở bệnh nhân, từ đĩ cho phếp suy luận chính xác tình trạng người mang gen Đây là phương pháp được lựa chọn đầu tiên cho phát hiện người mang gen dị hợp tử [144] Những marker vệ tính nhỏ (Microsatellite markers) rất ích lợi cho phát hiện đột biến ở bệnh nhân và người mang gen Tuy nhiên những marker sắn cĩ khơng thể cung cấp đủ thơng tin dé cho kết quả cho mọi
gia đình Ở những gia đình khơng cĩ thơng tin để phát hiện người mang gen: phương pháp phân tích liễu gen của những sản phẩm PCR ở những
người nữ liên quan trong gia đình được dùng [25][77]I82][127]1149]
Phương pháp PCR cạnh tranh (Competitive PCR) được dùng để phát hiện
dị hợp từ khuyết đoạn gen Phương pháp nầy nhằm so sánh hiệu quả tăng lượng của vùng gen bị khuyết đoạn ở những người mang gen(carriers) va những người kiểm chứng (coatrols), phương pháp này đã phát hiện thành cơng 80% những gia đình bệnh nhân với khuyết đoạn gen [61] Phương