Phát triển quy trình định lượng sự có mặt bắp biến đổi gen gmo trong thức ăn chăn nuôi bằng phương pháp realtime pcr

U TRUN HU T MN G GHI N ỨU V P G GH T TR ỂN N N N T HCM P N N O BÁO CÁO NGHI M THU PHÁT TRIỂN QUY TRÌN ĐỊN LƢỢNG SỰ CĨ MẶT BẮP BIẾN ĐỔI GEN (GMO) TRONG THỨ ĂN BẰN P ƢƠN P P REALTIME PCR CN Nguyễn Văn Lượng KS Nguyễn Thoại Ân Th nh ph ĂN NU Ch Minh, h ng 01/2017 BAN QU N LÝ KHU NÔNG NGHI P CÔNG NGH CAO TRUNG TÂM NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN NÔNG NGHI P CÔNG NGH CAO BÁO CÁO NGHI M THU (Đã chỉnh sửa theo góp ý Hội đ ng nghiệm thu) PHÁT TRIỂN QUY TRÌN ĐỊN LƢỢNG SỰ CÓ MẶT BẮP BIẾN ĐỔI GEN (GMO) TRONG THỨ ĂN BẰN P ƢƠN P Ơ QU N Ủ TRÌ (Ký tên, đóng dấu xác nhận) Th nh ph ĂN NU P RE LT ME P R CHỦ NHI M ĐỀ TÀI (Ký tên) Ch Minh, h ng 01/2017 TÓM TẮT ĐỀ T Cùng với phát triển kỹ thuật phát sinh vật biến đổi gen GMO, kỹ thuật PCR chủ lực phát GMO real time PCR phƣơng pháp quan trọng hiệu để định lƣợng GMO Chiến lƣợc phát chuyên biệt kiện dựa vào trình tự tiếp hợp chuyên biệt gen vật chủ gen du nhập đƣợc phát triển mang tính đặc hiệu cao Nghiên cứu xây dựng phƣơng pháp phát chun biệt kiện cho ba dịng ngơ chuyển gen GA21, Bt11 Bt176 hƣơng pháp real time R sử dụng Taqman probe đƣợc phát triển tối ƣu hóa với tỉ lệ nồng độ mồi zSSll-1/2 900nM/300nM cho gen đặc trƣng ngô zSSllb, Q-GA211F/2R 300nM/300nM cho ngô GA21, Q-Bt11-1F/2R 300nM/900nM cho ngô Bt11 E176 2-5/2-3 900nM/900nM cho ngô Bt176; nồng độ probe 150nM cho gen đặc trƣng ngô zSSllb, 200nM cho ngô GA2, 100nM cho ngô Bt11 250nM cho ngô Bt176 Nghiên cứu sử dụng phân tử tham chiếu chuẩn chứa trình tự đặc hiệu ba dịng ngơ chuyển gen gen đặc trƣng ngơ zSSllb phân tích định lƣợng thay cho chất tham chiếu ngô chuyển gen đƣợc chứng nhận Giới hạn phát LOD giới hạn định lƣợng LOQ phƣơng pháp 40 copy Độ xác phƣơng pháp thể qua độ chệch khoảng từ đến 42% độ chụm phƣơng pháp thể thông qua độ lệch chuẩn tƣơng đối từ 2,32 đến 32,65% Nghiên cứu phát triển quy trình định lƣợng có mặt sản phẩm biến đổi gen có thức ăn chăn ni từ ba dịng ngơ chuyển gen kiện G 21, t11 t176 đƣợc cấp phép trồng Việt Nam, xuất với số lƣợng lớn thị trƣờng chƣa đƣợc kiểm sốt chặt chẽ Quy trình định lƣợng ngô biến đổi gen GA21, Bt11 Bt176 phƣơng pháp chuyên biệt kiện cho phép xác định xác ba dịng ngơ chuyển gen GA21, Bt11 Bt176, khả định lƣợng tƣơng đối hiệu so với quy trình định lƣợng ngơ chuyển gen kiện đƣợc cơng bố áp dụng phân tích kiểm nghiệm Từ khóa: Chuyên biệt kiện, GMO, LOD, LOQ, real time PCR, II MỤ LỤ Trang phụ bìa Tóm tắt đề tài Mục lục Danh mục chữ viết tắt Danh mục bảng Danh mục hình TH G TI ĐỀ TÀI MỞ ĐẦU hƣơng TỔNG QUAN TÀI LI U 1.1 Sơ lƣợc về trồng biến đổi gen 1.2 Sơ lƣợc ngô chuyển gen 1.3 Thông tin ngô chuyển gen Bt11, Bt176 GA21 1.3.1 Ngô chuyển gen Bt11 1.3.2 Ngô chuyển gen Bt176 1.3.3 Ngô chuyển gen GA21 1.4 ác phƣơng pháp chuyển gen 1.4.1 hƣơng pháp trực tiếp 1.4.2 hƣơng pháp gián tiếp 1.5 ác phƣơng pháp phát trồng biến đổi gen 1.6 Các nghiên cứu nƣớc hƣơng ỘI DUNG VÀ HƢƠ G HÁ GHIÊ ỨU 2.1 Thời gian địa điểm nghiên cứu 2.2 hƣơng tiện thí nghiệm 2.2.1 Vật liệu thí nghiệm 2.2.2 Hóa chất 2.2.3 Thí bị thí nghiệm 2.3 hƣơng pháp bố trí thí nghiệm 2.3.1 Nội dung 1: Thiết kế mồi Taqman probe đặc hiệu để phát ngô chuyển gen GA21, Bt11 Bt176 2.3.2 Tạo dòng cho mẫu đối chứng dƣơng 2.3.3 Tối ƣu hóa phản ứng real-time PCR cho gen đích 2.3.3.1 Tối ƣu hóa nồng độ mồi 2.3.3.2 Tối ƣu hóa nồng độ probe 2.3.4 Chứng thực quy trình định lƣợng ngơ biến đổi gen GA21, Bt11 Bt176 2.3.4.1 Đánh giá độ lặp lại phản ứng real-time PCR gen kiện GA21, Bt11, Bt176 gen tham chiếu zSSllb phản ứng real-time PCR sử dụng plasmid DNA 2.3.4.2 Định lƣợng dịng ngơ biến đổi gen GA21, Bt11, Bt176 cách sử plasmid DNA tham chiếu 2.3.5 Định lƣợng ngô chuyển gen có sản phẩm thức ăn chăn ni 2.3.5.1 Ly trích DNA III Trang i ii iii vi viii x 4 5 6 7 11 14 14 14 14 14 15 16 16 17 18 18 19 20 20 21 22 22 2.3.5.2 Kiểm tra định lƣợng định tính DNA 2.3.5.3 Định lƣợng hàm lƣợng GMO có sản phẩm thức ăn chăn ni ly trích D hƣơng ẾT QU VÀ TH O LUẬN 3.1 Nội dung 1: Thiết kế mồi Taqman probe đặc hiệu để phát ngô chuyển gen GA21, Bt11 Bt176 3.1.1 Tổng hợp plasmid chứa trình mục tiêu ba dịng ngô chuyển gen GA21, Bt11, Bt176 gen đặc trƣng ngô zSSllb 3.1.2 Kiểm tra độ đặc hiệu mồi R định tính chuyên biệt kiện 3.1.3 Kiểm tra khả khuếch đại cặp mồi probe real time PCR 3.2 Nội dung 1: Tối ƣu hóa phản ứng real-time PCR cho trình tự mục tiêu 3.2.1 Tối ƣu hóa nồng độ mồi cho trình tự mục tiêu 3.2.1.1 Tối ƣu hóa nồng độ mồi zSSll-1/zSSll-2 cho trình tự mục tiêu zSSllb 3.2.1.2 Tối ƣu hóa nồng độ mồi Q-GA21-1F/Q-GA21-2R cho trình tự mục tiêu GA21 3.2.1.3 Tối ƣu hóa nồng độ mồi Q-Bt11-1F/Q-GA21-2R cho trình tự mục tiêu Bt11 3.2.1.4 Tối ƣu hóa nồng độ mồi E176 2-5/E176 2-3 cho trình tự mục tiêu Bt176 3.2.2 Tối ƣu hóa nồng độ Taqman probe cho cặp mồi 3.2.2.1 Tối ƣu hóa nồng độ Taqman probe zSSll-P với cặp mồi zSSll1/2 3.2.2.2 Tối ƣu hóa nồng độ Taqman probe Q-GA21-P với cặp mồi QGA21-1F/2R 3.2.2.3 Tối ƣu hóa nồng độ Taqman probe Q-Bt11-P với cặp mồi QBt11-1F/2R 3.2.2.4 Tối ƣu hóa nồng độ Taqman probe E176-P với cặp mồi E176 2-5/2-3 3.3 Nội dung 4: Chứng thực quy trình định lƣợng ngơ biến đổi gen GA21, Bt11 Bt176 3.3.1 hân tích R định lƣợng ba dịng ngơ chuyển gen kiện DNA plasmid tham chiếu 3.3.2 Chứng thực phƣơng pháp định lƣợng dòng ngô chuyển gen kiện GA21, Bt11 Bt176 mẫu ngô chuẩn 3.4 Kiểm tra định lƣợng định tính DNA mẫu ngơ thu thập thị trƣờng hƣơng IV ẾT LUẬ VÀ ĐỀ NGHỊ 4.1 Kết luận 4.2 Kiến nghị TÀI LI U THAM KH O PHỤ LỤC IV 24 24 25 25 25 27 29 32 32 32 32 33 33 34 34 34 35 35 36 36 40 43 46 46 46 47 50 D N MỤ Ữ V ẾT TẮT VIẾT TẮT THUẬT NGỮ TIẾNG VI T LOD Limit of Detection LOQ Limit of Quatification NAC Non Amplified Control NTC Non Template Control PCR Polymerase Chain Reaction SD Standard Deviation RSD Relative Standard Deviation TAE Tris Acetate EDTA V D N MỤ BẢN Số Tên bảng số liệu Trang 2.1 Trình tự oligonucleotide primer probe dùng real time PCR 16 2.2 Thành phần cho phản ứng PCR cho cặp mồi GA21, Bt11, Bt176 zSSllb 16 2.3 hƣơng trình cho phản ứng PCR với cặp mồi GA21, Bt11, Bt176 zSSllb 17 2.4 Trình tự oligonucleotide đoạn gen đích để tổng hợp plasmid 18 2.5 Tỉ lệ nồng độ mồi xi mồi ngƣợc cho gen đích 18 2.6 Thành phần phản ứng real-time PCR 19 2.7 Chu trình nhiệt cho multiplex real-time PCR 19 2.8 Thành phần phản ứng real-time PCR tối ƣu hóa Taqman probe 20 2.9 Chu trình nhiệt cho real-time PCR tối ƣu hóa TaqMan probe 22 2.10 Chu trình nhiệt cho real-time PCR 21 3.1 Kết tối ƣu nồng độ mồi zSSll-1/zSSll-2 cho trình tự mục tiêu zSSllb 28 3.2 Kết tối ƣu nồng độ mồi Q-GA21-1F/2R cho trình tự mục tiêu GA21 33 3.3 Kết tối ƣu nồng độ mồi Q-Bt11-1F/2R cho trình tự mục tiêu Bt11 33 3.4 Kết tối ƣu nồng độ mồi E176 2-5/2-3 cho trình tự mục tiêu Bt176 34 3.5 Kết tối ƣu nồng độ probe zSSll-P với cặp mồi zSSll-1/2 34 Kết tối ƣu nồng độ probe Q-GA21-P với cặp mồi 3.6 35 Q-GA21-1F/2R VI Số Tên bảng số liệu Trang 3.7 Kết tối ƣu nồng độ probe Q-Bt11-P với cặp mồi Q-Bt111F/2R 35 3.8 Kết tối ƣu nồng độ probe E176-P với cặp mồi E176 25/2-3 35 3.9 ích thƣớc khối lƣợng pIDTSMART-AMP chứa trình tự mục tiêu 36 3.10 Nồng độ plasmid pIDTSMART-AMP chứa trình tự mục tiêu GA21, Bt11, Bt176 gen đặc trƣng ngô zSSllb 37 3.11 Độ lặp độ tái lập plasmid pIDTSMART-AMP chứa trình tự mục tiêu ba dịng ngơ chuyển gen kiện GA21, Bt11, Bt176 gen đặc trƣng ngô zSSllb 39 3.12 Kết định lƣợng DNA ly trích từ mẫu ngơ chuẩn GA21, Bt11 Bt176 41 3.13 Độ xác độ chụm phƣơng pháp định lƣợng dịng ngơ chuyển gen GA21, Bt11 Bt176 42 3.14 Kết phân tích định lƣợng DNA mẫu ngô nguyên liệu thị trƣờng 44 3.15 Kết phân tích định lƣợng GMO có mẫu ngơ 45 VII D N Số MỤ ÌN Tên hình Trang 3.1 pIDTSMART-AMP tổng hợp chứa trình tự đích gen đặc trƣng ngơ zSSllb 25 3.2 pIDTSMART-AMP plasmid chứa trình tự mục tiêu ngô kiện GA21 26 3.3 pIDTSMART-AMP plasmid chứa trình tự mục tiêu ngơ kiện Bt11 26 3.4 Hình 3.4 pIDTSMART-AMP chứa trình tự mục tiêu ngơ kiện Bt176 27 3.5 Độ đặc hiệu cặp primer cho gen mục tiêu gen đặc trung ngô zSSllb, ngô G 21, t11 t176 đƣợc kiểm tra plasmid có chứa trình gen mục tiêu PCR 28 3.6 Kiểm tra độ đặc hiệu cặp primer gen mục tiêu khác 28 3.7 Kiểm tra độ đặc hiệu cặp primer với gen mục tiêu R đa mồi 29 3.8 Khả khuếch đại gen mục tiêu cặp mồi zSSll-1/2 với Taqman probe zSSll-P DNA plasmid chứa trình tự mục tiêu gen đặc trƣng ngơ zSSllb nồng độ 106 copy 30 3.9 Khả khuếch đại cặp mồi Q-GA21-1F/2R với Taqman probe Q-GA21-P DNA plasmid chứa trình tự mục tiêu ngơ kiện GA21 nồng độ 106 copy 31 3.10 Khả khuếch đại cặp mồi Q-Bt11-1F/2R Taqman probe Q-Bt11-P DNA plasmid chứa trình tự mục tiêu ngơ kiện Bt1 nồng độ 106 copy 31 3.11 Khả khuếch đại cặp mồi E176 2-5/2-3 Taqman probe E176-Taq DNA plasmid chứa trình tự mục tiêu ngô kiện Bt176 32 3.12 Đƣờng chuẩn định lƣợng sử dụng plasmid pIDTSMARTAMP: zSSllb 38 VIII Số Tên hình Trang 3.13 Đƣờng chuẩn định lƣợng sử dụng plasmid pIDTSMARTAMP: GA21 38 3.14 Đƣờng chuẩn định lƣợng sử dụng plasmid pIDTSMARTAMP: Bt11 39 3.15 Đƣờng chuẩn định lƣợng sử dụng plasmid pIDTSMARTAMP: Bt176 39 3.16 Sự tuyến tính giá trị kiểm tra giá trị thực mẫu ngô chuyển gen GA21, Bt11 Bt176 43 3.17 Kết định tính DNA ngơ ly trích phƣơng pháp CTAB gel agarose 2% điện 80V 40 phút 44 IX P Ụ LỤ Phụ lục Kết phân tích ANOVA Phục 1.1 Tối ƣu mồi Mồi zSSllb Summary Statistics for Ct Nong Count Average Standard deviation Coeff of variation 26.38 0.246374 0.933941% 25.7233 0.524817 2.04024% 3 24.76 0.76 3.06947% 25.51 0.0173205 0.0678969% 25.0833 0.294845 1.17546% 25.22 0.282135 1.11869% 24.93 0.147309 0.590891% 24.3467 0.820325 3.36935% 24.96 0.255147 1.02222% Total 27 25.2126 0.683946 2.71271% ANOVA Table for Ct by Nong Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 8.48172 1.06021 5.18 0.0018 Within groups 3.6806 18 0.204478 Total (Corr.) 12.1623 26 Multiple Range Tests for Ct by Nong Method: 95.0 percent LSD Nong Count Mean Homogeneous Groups 24.3467 X 3 24.76 XX 24.93 XX 24.96 XXX 49 XXX 25.0833 25.22 XX 25.51 XX 25.7233 26.38 X Contrast Sig Difference +/- Limits 0.656667 0.77569 1-2 XX 1-3 * 1.62 0.77569 1-4 * 0.87 0.77569 1-5 * 1.29667 0.77569 1-6 * 1.16 0.77569 1-7 * 1.45 0.77569 1-8 * 2.03333 0.77569 1-9 * 1.42 0.77569 2-3 * 0.963333 0.77569 2-4 0.213333 0.77569 2-5 0.64 0.77569 2-6 0.503333 0.77569 2-7 * 0.793333 0.77569 2-8 * 1.37667 0.77569 2-9 0.763333 0.77569 3-4 -0.75 0.77569 3-5 -0.323333 0.77569 3-6 -0.46 0.77569 3-7 -0.17 0.77569 3-8 0.413333 0.77569 3-9 -0.2 0.77569 4-5 0.426667 0.77569 4-6 0.29 0.77569 4-7 0.58 0.77569 1.16333 0.77569 0.55 0.77569 4-8 4-9 * 50 5-6 -0.136667 0.77569 5-7 0.153333 0.77569 5-8 0.736667 0.77569 5-9 0.123333 0.77569 6-7 0.29 0.77569 0.873333 0.77569 6-9 0.26 0.77569 7-8 0.583333 0.77569 7-9 -0.03 0.77569 8-9 -0.613333 0.77569 6-8 * * denotes a statistically significant difference Mồi GA21 Summary Statistics for Ct Nong Count Average Standard deviation Coeff of variation 33.7267 0.122202 0.362331% 32.1133 0.514036 1.60069% 3 33.62 1.59352 4.73979% 30.03 0.155242 0.516956% 27.7033 1.55667 5.61908% 28.2933 0.23029 0.813936% 30.0567 0.285715 0.950589% 28.1033 0.109697 0.390333% 27.7567 0.344287 1.24037% Total 27 30.1559 2.44356 8.10308% ANOVA Table for Ct by Nong Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 144.184 18.0229 29.33 0.0000 Within groups 11.0621 18 0.614559 Total (Corr.) 155.246 26 51 Multiple Range Tests for Ct by Nong Method: 95.0 percent LSD Nong Count Mean Homogeneous Groups 27.7033 X 27.7567 X 28.1033 X 28.2933 X 30.03 X 30.0567 X 32.1133 3 33.62 X 33.7267 X Contrast Sig Difference +/- Limits 1-2 * 1.61333 1.34477 0.106667 1.34477 1-3 X 1-4 * 3.69667 1.34477 1-5 * 6.02333 1.34477 1-6 * 5.43333 1.34477 1-7 * 3.67 1.34477 1-8 * 5.62333 1.34477 1-9 * 5.97 1.34477 2-3 * -1.50667 1.34477 2-4 * 2.08333 1.34477 2-5 * 4.41 1.34477 2-6 * 3.82 1.34477 2-7 * 2.05667 1.34477 2-8 * 4.01 1.34477 2-9 * 4.35667 1.34477 3-4 * 3.59 1.34477 3-5 * 5.91667 1.34477 3-6 * 5.32667 1.34477 52 3-7 * 3.56333 1.34477 3-8 * 5.51667 1.34477 3-9 * 5.86333 1.34477 4-5 * 2.32667 1.34477 4-6 * 1.73667 1.34477 -0.0266667 1.34477 4-7 4-8 * 1.92667 1.34477 4-9 * 2.27333 1.34477 -0.59 1.34477 -2.35333 1.34477 5-8 -0.4 1.34477 5-9 -0.0533333 1.34477 -1.76333 1.34477 6-8 0.19 1.34477 6-9 0.536667 1.34477 5-6 5-7 6-7 * * 7-8 * 1.95333 1.34477 7-9 * 2.3 1.34477 0.346667 1.34477 8-9 * denotes a statistically significant difference Mồi Bt11 Summary Statistics for Ct Nong Count Average Standard deviation Coeff of variation 31.3433 0.207926 0.663383% 29.1067 0.413078 1.41919% 3 29.2533 0.410528 1.40335% 29.68 0.986509 3.32382% 28.1033 0.420278 1.49547% 28.1 0.368646 1.31191% 30.9833 0.618574 1.99647% 29.73 0.5469 1.83956% 28.6333 0.450037 1.57172% 53 Total 27 29.437 1.18776 4.03492% ANOVA Table for Ct by Nong Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 31.5754 3.94692 13.92 0.0000 Within groups 5.1048 18 0.2836 Total (Corr.) 36.6802 26 Multiple Range Tests for Ct by Nong Method: 95.0 percent LSD Nong Count Mean Homogeneous Groups 28.1 X 28.1033 X 28.6333 XX 29.1067 XX 3 29.2533 XX 29.68 X 29.73 X 30.9833 X 31.3433 X Contrast Sig Difference +/- Limits 1-2 * 2.23667 0.913521 1-3 * 2.09 0.913521 1-4 * 1.66333 0.913521 1-5 * 3.24 0.913521 1-6 * 3.24333 0.913521 0.36 0.913521 1-7 1-8 * 1.61333 0.913521 1-9 * 2.71 0.913521 2-3 -0.146667 0.913521 2-4 -0.573333 0.913521 54 2-5 * 1.00333 0.913521 2-6 * 1.00667 0.913521 2-7 * -1.87667 0.913521 2-8 -0.623333 0.913521 2-9 0.473333 0.913521 3-4 -0.426667 0.913521 3-5 * 1.15 0.913521 3-6 * 1.15333 0.913521 3-7 * -1.73 0.913521 3-8 -0.476667 0.913521 3-9 0.62 0.913521 4-5 * 1.57667 0.913521 4-6 * 1.58 0.913521 4-7 * -1.30333 0.913521 -0.05 0.913521 1.04667 0.913521 0.00333333 0.913521 4-8 4-9 * 5-6 5-7 * -2.88 0.913521 5-8 * -1.62667 0.913521 -0.53 0.913521 5-9 6-7 * -2.88333 0.913521 6-8 * -1.63 0.913521 -0.533333 0.913521 6-9 7-8 * 1.25333 0.913521 7-9 * 2.35 0.913521 8-9 * 1.09667 0.913521 * denotes a statistically significant difference Mồi Bt176 Summary Statistics for B.Ct B.Nong Count Average Standard deviation Coeff of variation 19.49 0.144222 0.73998% 18.4833 0.269506 1.4581% 55 3 18.21 0.199249 1.09417% 18.6 0.0519615 0.279363% 17.54 0.072111 0.411123% 17.4467 0.150111 0.8604% 17.9133 0.12741 0.711258% 16.9867 0.0814453 0.479466% 16.9333 0.0550757 0.32525% Total 27 17.9559 0.807885 4.49927% ANOVA Table for B.Ct by B.Nong Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 16.5907 2.07384 98.51 0.0000 Within groups 0.378933 18 0.0210519 Total (Corr.) 16.9697 26 Multiple Range Tests for B.Ct by B.Nong Method: 95.0 percent LSD B.Nong Count Mean Homogeneous Groups 16.9333 X 16.9867 X 17.4467 X 17.54 X 17.9133 3 18.21 18.4833 X 18.6 X 19.49 X Contrast Sig Difference +/- Limits 1-2 * 1.00667 0.248892 1-3 * 1.28 0.248892 1-4 * 0.89 0.248892 X X 56 1-5 * 1.95 0.248892 1-6 * 2.04333 0.248892 1-7 * 1.57667 0.248892 1-8 * 2.50333 0.248892 1-9 * 2.55667 0.248892 2-3 * 0.273333 0.248892 -0.116667 0.248892 2-4 2-5 * 0.943333 0.248892 2-6 * 1.03667 0.248892 2-7 * 0.57 0.248892 2-8 * 1.49667 0.248892 2-9 * 1.55 0.248892 3-4 * -0.39 0.248892 3-5 * 0.67 0.248892 3-6 * 0.763333 0.248892 3-7 * 0.296667 0.248892 3-8 * 1.22333 0.248892 3-9 * 1.27667 0.248892 4-5 * 1.06 0.248892 4-6 * 1.15333 0.248892 4-7 * 0.686667 0.248892 4-8 * 1.61333 0.248892 4-9 * 1.66667 0.248892 0.0933333 0.248892 5-6 5-7 * -0.373333 0.248892 5-8 * 0.553333 0.248892 5-9 * 0.606667 0.248892 6-7 * -0.466667 0.248892 6-8 * 0.46 0.248892 6-9 * 0.513333 0.248892 7-8 * 0.926667 0.248892 7-9 * 0.98 0.248892 0.0533333 0.248892 8-9 57 * denotes a statistically significant difference Phụ lục 1.2 Tối ƣu hóa Taqman probe 1.2.1 Probe zSSllb Summary Statistics for Ct Nong Count Average Standard deviation Coeff of variation 21.4867 0.0896289 0.417137% 21.0333 0.234592 1.11533% 3 20.4033 0.20306 0.995229% 20.09 0.563205 2.80341% 20.4733 0.267644 1.30728% Total 15 20.6973 0.580055 2.80256% Stnd kurtosis 0.0151104 ANOVA Table for Ct by Nong Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 3.72423 0.931057 9.44 0.0020 Within groups 0.986267 10 0.0986267 Total (Corr.) 4.71049 14 Multiple Range Tests for Ct by Nong Method: 95.0 percent LSD Nong Count Mean Homogeneous Groups 20.09 X 3 20.4033 X 20.4733 XX 21.0333 XX 21.4867 X Contrast Sig 1-2 1-3 * Difference +/- Limits 0.453333 0.57134 1.08333 0.57134 58 1-4 * 1.39667 0.57134 1-5 * 1.01333 0.57134 2-3 * 0.63 0.57134 2-4 * 0.943333 0.57134 2-5 0.56 0.57134 3-4 0.313333 0.57134 3-5 -0.07 0.57134 4-5 -0.383333 0.57134 * denotes a statistically significant difference 1.1.2 Probe GA21 Summary Statistics for Ct Nong Count Average Standard deviation Coeff of variation 26.4233 0.545924 2.06607% 26.5133 0.189033 0.712972% 3 26.6033 0.261598 0.983327% 26.0433 0.189297 0.726854% 26.4133 0.110604 0.418745% Total 15 26.3993 0.32148 1.21776% ANOVA Table for Ct by Nong Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 0.54636 0.13659 1.52 0.2697 Within groups 0.900533 10 0.0900533 Total (Corr.) 1.44689 14 Multiple Range Tests for Ct by Nong Method: 95.0 percent LSD Nong Count Mean Homogeneous Groups 26.0433 X 26.4133 XX 26.4233 XX 26.5133 XX 59 3 Contrast Sig 26.6033 X Difference +/- Limits 1-2 -0.09 0.545943 1-3 -0.18 0.545943 1-4 0.38 0.545943 1-5 0.01 0.545943 2-3 -0.09 0.545943 2-4 0.47 0.545943 2-5 0.1 0.545943 0.56 0.545943 3-5 0.19 0.545943 4-5 -0.37 0.545943 3-4 * * denotes a statistically significant difference 1.2.3 Probe Q-Bt11-p Summary Statistics for Ct Nong Count Average Standard deviation Coeff of variation 26.0033 0.269506 1.03643% 24.4767 0.260256 1.06328% 3 25.7267 0.122202 0.475001% 25.9367 0.172434 0.664825% 26.9033 1.19425 4.43904% Total 15 25.8093 0.938201 3.63512% ANOVA Table for Ct by Nong Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 9.10056 2.27514 7.06 0.0057 Within groups 3.22253 10 0.322253 Total (Corr.) 12.3231 14 Multiple Range Tests for Ct by Nong Method: 95.0 percent LSD 60 Nong Count Mean Homogeneous Groups 24.4767 X 3 25.7267 X 25.9367 XX 26.0033 XX 26.9033 X Contrast Sig Difference +/- Limits 1-2 * 1.52667 1.03275 1-3 0.276667 1.03275 1-4 0.0666667 1.03275 1-5 -0.9 1.03275 2-3 * -1.25 1.03275 2-4 * -1.46 1.03275 2-5 * -2.42667 1.03275 -0.21 1.03275 -1.17667 1.03275 -0.966667 1.03275 3-4 3-5 * 4-5 * denotes a statistically significant difference 1.2.4 Probe E176-Taq Summary Statistics for Ct Nong Count Average Standard deviation Coeff of variation 26.8767 1.03394 3.84698% 24.8433 1.00301 4.03735% 3 24.7267 0.270247 1.09294% 24.1933 0.150444 0.62184% 23.0933 1.17219 5.07589% Total 15 24.7467 1.46015 5.90039% ANOVA Table for Ct by Nong Source Sum of Squares Df Mean Square F-Ratio P-Value Between groups 22.759 5.68975 8.03 0.0036 Within groups 7.08953 10 0.708953 61 Total (Corr.) 29.8485 14 Multiple Range Tests for Ct by Nong Method: 95.0 percent LSD Nong Count Mean Homogeneous Groups 23.0933 X 24.1933 XX 3 24.7267 X 24.8433 X 26.8767 Contrast Sig Difference +/- Limits 1-2 * 2.03333 1.53182 1-3 * 2.15 1.53182 1-4 * 2.68333 1.53182 1-5 * 3.78333 1.53182 2-3 0.116667 1.53182 2-4 0.65 1.53182 1.75 1.53182 0.533333 1.53182 1.63333 1.53182 1.1 1.53182 2-5 * 3-4 3-5 4-5 * X * denotes a statistically significant difference Phụ lục uy trình định lƣợng ngơ biến đổi gen GA21, Bt11 Bt176 62 Ly trích DNA Ly trích 200mg/mẫu phương pháp CTAB Đinh lượng DNA máy đo quang phổ PCR Thành phần phản ứng Chu trình nhiệt Phân tích định lượng Đường chuẩn định lượng Xác định số copy gen mục tiêu 63 Định tính DNA gel agarose 2% điện 80V 60 phút Xác định % GMO