BỘ KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ - BỘ Y TẾ
Viện Được liệu
3B Quang Trung - Hà nội
BÁO CÁO TỔNG KẾT KHOA HỌC VÀ KỸ THUẬT
ĐỀ TÀI NHÁNH CỬA ĐỂ TÀI ĐỘC LẬP CẤP NHÀ NƯỚC
Ten dé tai:
NGHIÊN CỨU THUỐC DIHACHARIN DIEU TRI BENH VIEM GAN TU CAY DIfP HA CHAU DANG
(Phyllanthus amarus Schum et Thoan.}
Chủ nhiệm đề tài: PGS TSKH Đỗ Trung Dam
Hà nội, 08 - 2004
Bản thảo viết xong tháng 9/2004
Tài liệu này được chuẩn bị trên cơ sở kết quả thực hiện đề tài nhánh của đề tài độc lập cấp nhà nước, mã số ĐLNN — 02
Trang 2DANH SACH NHUNG NGƯỜI THỰC HIỆN
Danh sách những người thực hiện chính:
PGS.TSKH Đỗ Trung Đàm TS Pham Van Thanh
ThS Lê Việt Dũng
DS Trinh Thi Diép
DS Nguyén Ngoc Chi TS Nguyén Minh Khai DS Nguyễn Kim Phượng
BS Lê Minh Phương
D§ Nguyễn Thị Dung TS Quách Mai Loan
TS Phạm Thanh Trúc TS Lê Kim Loan
DS Nguyén Minh Chau
PGS.TS Bùi Thi Bằng TS Nguyễn Tập
CN, Ngơ Văn Trai
GS.TS Nguyễn Văn Mùi
PGS.TS Nguyễn Hồng Tuấn TS, Trịnh Xuân Hồ
TS Đỗ Bình
'Viện Dược liệu Viện Dược liệu Viện Dược liệu Viện Dược liệu
Viện Dược liệu
Viện Dược liệu Viên Dược liệu Viện Dược liệu Viện Dược liệu Viện Dược liệu
Viện Dược liệu Viện Dược liệu
Viện Dược liệu
Trang 3BAI TOM TAT CAC KET QUA CUA DE TAL
Mục tiêu của đẻ tài
Mục tiêu của để tài là nghiên cứu tác dụng, độ an tồn và kỹ thuật sản xuất của thuốc Dihacharin để chữa bệnh viêm gan từ cây Diệp ha chau ding Phyllanthus amarus Schum
et Thonn., một nguồn nguyên liệu trong nước
Đồng gĩp mới của để tài
Đã phân biệt rõ hai cây Diệp hạ châu đắng và cây Chĩ để răng cưa (Phyllanthus
urinaria L.) dựa trên mơ tả thực vật, vi phẫu, soi bột và thành phẩn hố học để tránh nhầm lẫn khi sử đụng,
Đã nghiên cứu chiết xuất ra bột Dihacharin gồm phân đoạn taninoid và flavonoid từ cây Diệp hạ châu đắng cĩ loại rạp để tạo ra được một bán thành phẩm ổn định cĩ
tác dụng dược lý và tác dụng điều trị
Đã chứng mính tác dụng bảo vệ gan, phục hồi chức năng gan của Dihacharin trên các nghiệm pháp dược lý:
ø_ Gây tổn thương gan thực nghiệm bằng hố chất, kết hợp dùng Dihacharin để đánh giá tác dụng bảo vệ gan, phục hồi chức năng gan
©_ Gây xơ gan thực nghiệm bằng hố chất, kết hợp dùng Dihacharin để đánh giá tác dụng ức chế xơ gan, tác dụng trên giải phẫu bệnh lý gan và tác dụng chống oxy hố ở gan
© _'Tác dụng trên khả năng tiết mật, vì khi gan bị bệnh sẽ ảnh hưởng rất lớn
đến khả năng tiết mật
©_ Tác dựng chống viêm cấp tính cũng là một khía cạnh của viêm gan
o_ Tác dụng lợi tiểu cũng gĩp phần vào tác dụng giải độc gan khi gan bị ién
thương
Đã bào chế viên nang, xây dựng tiêu chuẩn và nghiên cứu độ ổn định của viên nang Đihacharin
Trang 4triệu chứng lâm sàng nhanh hơn tỷ lệ hỏi phục các xét nghiệm hố sinh về gan tốt hon, néng do HBsAg va tỷ lệ HBeAg(+) giảm nhanh hơn so với lơ chứng,
Kết quả cụ thể
1 Kết quả nghiên cứu về thực vật
~_ Về mơ tả thực vật: Thân cây Diệp hạ chàu đắng màu xanh, cồn thân cây Chĩ đẻ
rang cua mau nâu đỏ
- Vé vi phdu: Thân của Diệp ha châu đắng trịn đều, cịn thân của cây Chĩ đẻ rang
cưa cĩ các mỏ lỗi; Diệp hạ châu đáng cĩ các hàng mạch gỗ tơ xếp cách nhau, cịn Chĩ để răng cưa cĩ các mạch gỗ xếp thành hàng đều đạn
2 Kết quả nghiên cứu hố hoe
Những kết quả nghiên cứu về hố học cho thấy:
~ Cả hai cây Diệp ha chau đắng và Chĩ dé ring cua déu cé taninoid, flavonoid, đường khử, acid hữu cơ, caroten cả hai cây đếu khơng cớ coumarin, anthraglycosid, glycosid tìm, steroid và chất béo Chỉ cĩ Điệp hạ châu đáng mới cĩ alcatoid - _ Hầm lượng flavonoid tồn phần của Diệp hạ châu đáng là 1,00 + 0,12%, xấp xỉ với Chĩ đề răng cưa là 1,15 + 0,06% - Ham lượng taninoid trong Diệp hạ châu đắng là 7,78 + 0,12% cịn trong Chĩ đẻ rang cua là 9,11 + 0,55%
3 Kết quả nghiên cứu chiết xuất
-_ Nghiên cứu chiết xuất trong điều kiện phịng thí nghiệm với qui mơ 100g hoặc 200g/mé, hàm lượng trung bình bột bán thành phẩm Dihacharin chiết được là 7,03 %
~_ Nghiên cứu chiết xuất ở xưởng sản xuất thí điểm với qui mơ 40kg/mẻ, hàn lượng
trung bình bột bán thành phẩm Dihacharin chiết được là 6,98
- _ Bột bán thành phẩm Dthacharin cĩ hàm lượng trung bình của taninoid là 20%, 4 Nghiên cứu độc tình
Trang 5nặng) chuột đều khoẻ mạnh khơng cĩ con nào chết, chứng tỏ Dihacharin an tồn về mặt độc tính cấp
- Trong thử nghiệm vẻ độc tính bán trường điễn bột Dihacharin cho thỏ uống hàng ngày với liều 0,7 g/kg, trong 30 ngày liên tục, khĩng làm ảnh hưởng đến chức năng gan thận và chức năng tạo máu, cũng như khơng gây những biến đổi khác thường
về mơ bệnh học ở các cơ quan gan, thận và thượng thận của thỏ sau khi uống thuốc đài ngày
5 Kết quả nghiên cứu được lý
Những kết quả nghiên cứu được lý đã chứng mình:
- - Nghiên cứu tác dụng bảo vệ gan trên mơ hình gây tổn thương gan thực nghiệm
bằng CCI, ở thỏ cha thấy:
o_ Về hàm lượng enzym transanminase AST và ALT, ở lơ bình thường khơng
dùng CCI, và khơng dùng thuốc, hàm lượng AST là 50,0 UA va ALT la 117,7 UA Ding CCl,, gây ra tổn thương gan nặng, nên hàm lượng AST là 210,6 U/ gấp 4,2 lần; cịn hàm lượng ALT là 382,2 U/1 tăng gần 5 lân Õ lị dùng CCL, cĩ kết hợp dùng thuốc, hàm lượng AST 12 83,7 U/ giảm 2,5 lần
va ALT là 198,7 Ư/ giảm 2,9 lần so với lơ chỉ dùng CCI, và cĩ khuynh
hướng trở về gần bình thường
œ Vé giải phẫu mơ bệnh học gan, ở lơ gây tổn thương gan bang CCL, các bè
gan bị phá huý, tế bào gan sưng to, nhiều chỗ tế bào gan bị mất nhân Ở lơ dùng CCI, cĩ kết hợp với thuốc, các tổn thương gan giảm rõ rệt
o_ Vẻ khối lượng cơ thể thỏ, ở lơ dùng CC1,, cân nặng thỏ trung bình là 2,13 +
0,04 kg, sau 15 ngày, giảm cịn 2,00 + 0,05 kg, trong khi ở lơ dùng CCL, kết
hợp với thuốc, khối lượng thổ trước thí nghiệm là 2,07 + 0,04 kg; sau 15
ngày, khối lượng thơ vẫn giữ mức 2.07 + 0,05 kg Nhưng sự khác nhau giữa
hai lơ khơng cĩ ý nghĩa thống kê
© Vé him lượng bilirubin trong huyết thanh, ba ngày sau khi gây tổn thương gan bằng CC, bilirubin tăng 77,5%; cịn lơ CC, kết hợp đùng thuốc,
Trang 6o Vé ham lugng protein tồn phần trong huyết thanh, ở cả hai lơ trứơc, trong
va sau CCl, protein đều khơng thay đổi cĩ ý nghĩa thống kê
~_ Nghiên cửu tắc dụng ức chế xơ gan và chống peroxy hố ở tế bào gan chuột cổng
trắng, trên mơ hình gây xơ gan thực nghiệm bằng CCI,, cho thấy:
o_ Hàm lượng colagen ở lơ chuột bình thường là 147,5 + 3,6 mg/100 g gan tươi; ở lơ gây xơ là 206,9 + 11,5 mg/100 g tăng 40% với P<0,001 Ở lơ gây
xơ kết hợp đùng thuốc, hàm lượng colagen gan là 166,8 + 4.0 mg/100g giảm
19,4%, và xấp xÌ với lơ hình thường,
© Hàm lượng MDA trong gan ở lơ chuột gây xơ tăng so với lơ chuột bình
thường là 73,4%, trong khi ở lơ gây xơ cĩ dùng thuốc, hàm lượng MDA chi
tăng là 23,6% Như vậy hoạt tính chống peroxy hố cuả thuốc là 28,7%
© Vẻ giải phẫu mơ bệnh học, ở lơ gây xơ, cĩ hai gan chuột bị xơ nặng, ba xơ
vừa và ba xơ nhẹ Trong khi ở lơ gây xơ kết hợp dùng thuốc, chỉ cĩ một gan
chuột bị xơ vừa, bốn xơ nhẹ và ba khơng xơ -_ Kết quả nghiên cứu tác dụng lợi mật ở chuột lãng
Kết quả nghiên cứu tác dụng tiết mật ở chuột lang cho thấy: Lưu lượng mật ở lơ
chứng khi chưa dùng thuốc, trong 30 phút đầu là 0,33 + 0,02 ml/100 g cân nặng chuột,
ưu lượng trong 30 phút tiếp theo là 0,32 + 0,01 ml/100 g, giảm 3% Trong khí đĩ, ở lơ
dùng thuốc với liều 0,7 g/kg, trước khi dùng thuốc, lưu lượng mật trong 30 phút là 0,34 + 0,03 mi/100 g, và 30 phút sau khi dùng thuốc, lưu lượng mật là 0,32 + 0,05 ml/100
s, tăng 52,9%, Tỷ lệ cận khơ trong mật và hàm lượng bilirubin trong mật khơng khác nhau giữa hai lơ, chứng tổ thuốc làm tăng lưu lượng mật nhưng vẫn giữ được chất lượng của mật
~_ Kết quá nghiên cứu tác dụng chống viêm cấp ở chuột cống trắng
Ở lơ chứng, độ phù chân chuột sau khi gây viêm so với trước khi gây viêm tăng 61,8%, trong khi ở lơ cho uống thuốc với liễu 3,5 g/kg cân nặng, độ tăng phù chỉ là 42,6%,
như vậy tỷ lệ viêm giảm 31,1% với P<0,01 Cịn nếu tiêm thuốc dưới da với liều 0,7
Trang 7- Kế quả nghiên cứu tắc dụng lợi tiểu
Kết quả nghiên cứu tác dụng lợi tiểu ở chuột cổng trắng cho thấy, ở lư chứng, thể tích nước tiểu bài xuất trong 6 giờ là 3,11 ml/100 g chuột; ở lơ dùng thuốc tham chiếu là hydrochlorothiazid với liêu 4 mgfkg, thể tích nước tiểu là 7,40 ml/100 g bing 237,9% so với lõ chứng với P<0,001 Thuốc Dihacharin với liều 0,7 g/kg can nang, thé tích nước tiểu là 4.38 mi/100 g, bằng 140,8% so với lơ chứng: với liều 1,4 g/kg thể tích nước tiểu là 5,56 ml/100g bằng 178,8% so với lơ chứng với P<0,01
6 Bao chế viên nang Dihacharin
Từ bột bán thành phẩm Dihacharin đã bào chế ra viên nang cứng Dihacharin với tá được là tỉnh bột sắn, bột talc và nati carboxymethylcellulose theo phương pháp thơng, thường (phụ lục 3)
7 Xây dựng tiêu chuẩn
Đã tiến hành xây dựng các tiêu chuẩn sau:
-_ Xây đựng tiêu chuẩn được liệu Diệp hạ châu đẳng gồm một số chỉ tiêu theo quy định được ghỉ trong Dược điển Việt nam III (phụ lục 5)
- _ Xây dựng tiêu chuẩn bột bán thành phẩm Dihacharin gồm một số chỉ tiêu, trong đĩ hàm lương taninoid trong chế phẩm khan khơng được thấp hơn 20% (phụ lục 6) - _ Xây dựng tiêu chuẩn chất lượng cấp cơ sở viên nang Dihacharin Ngồi các chỉ tiêu
thơng thường như các loại viên nang khác, viên nang Dihacharin phải đạt tiêu chuẩn độ vơ khuẩn, phải cĩ khối lượng là 0,50 g, phải chứa ít nhất 0,10 g taninoid trong mỗi viên tính theo khối lượng trung bình, được Viện kiểm nghiệm thẩm định và duyệt (phụ lục 4)
8 Nghiên cứu độ ổn định viên nang Dihacharin
Đã nghiên cứu 3 lơ Kết quả cho thấy, tuổi thọ của viên nang Dihacharin đạt 24 tháng
9 Kết quả thử nghiệm hiệu quả điều trí trên lâm sàng
Đã thử 60 bệnh nhân viêm gan virut B mạn tính, 30 bệnh nhân được điều trị bằng
viên nang Dihacharin và 30 bệnh nhân được điều tr] bang placebo CA hai 16 déu duge
điều trị cơ sở như nhau Viên nang Dihacharin mỗi lần uống 3 viên, ngày hai lần, sáng
Trang 8Bệnh nhân viêm gan virut B mạn được điều trị bing Dihacharin cĩ thời gian hết các
triệu chứng làm sàng nhanh hơn
Tỷ lệ hồi phục các xét nghiệm hố sinh về gan tốt hơn placebo cĩ ý nghĩa thống kẽ Nềng độ HBsAg va tý lệ HBeAg(+) giảm nhanh so với chứng Cĩ 20% bệnh nhân điều trị bằng Dihacharin cĩ chuyển đảo huyết thanh, trong khi nhĩm chứng chỉ cĩ 3,8% Nơng độ HBV-DNA ở lơ điều trị bằng Dihacharin cũng giảm rõ so với lơ chứng với P<0,05
Các bệnh nhân điều trị bằng Dihacharin cĩ thể gặp tác dụng khơng mong muốn như đẩy bụng ợ hơi (20%), táo bĩn (13,3%), ngủ kém và vã mồ hơi về đêm (10%) Các triệu chứng trên khơng thật sự làm bệnh nhân khĩ chịu, khơng cẩn ngừng
thuốc và cũng khơng cần xử trí bằng thuốc Dibacharin khơng làm thay đổi các xét
nghiệm huyết học như hồng cấu, bạch cấu, các thơng số hố sinh như urẽ,
Trang 9MỤC LỤC
NGHIÊN CỨU THUỐC DIHACHARIN ĐIỀU TRỊ BỆNH VIÊM GAN
TỪ CÂY DIỆP HẠ CHÂU DANG
Lài mở đầu 1
Chương 1 Tổng quan tình hình nghiên cứu ngồi nước và trong nước |3
1.1 Tinh bình nghiền cứu ở ngồi nước 4
1.2 _ Tình hình nghiên cứu ở trong nước 8
Chương 2 Đổi tượng, vật liệu và phương pháp nghiên cứu 9
2.1 Đối tượng nghiên cứu 9
2.2 Vật liệu nghiên cứu 9
2.3 Phương pháp nghiên cứu 10
2.3.1 Nghiên cứu về thực vật 10
2.3.2 Nghiên cứu vẻ hố học 10
2.3.3 Nghiên cứu chiết xuất i
2.3.4 Nghiên cứu về độc tính 14
2.3.5 Nghiên cứu tác dụng được lý l§
2.3.6 Nghiên cứu bào chế viên nang Dihacharin 19
2.3.7 Nghiên cứu xây dựng tiêu chuẩn 19 2.3.8, Nghiên cứu độ ổn định của viên nang Dihacharin 19
2.3.9 Nghiên cứu lâm sang 20
2.3.10 Xử lý kết quả nghiên cứu 23
Chương 3 Kết quả nghiên cứu 24
3.1 Về thực vật học 24
3.1.1 Mơ tả đặc điểm thực vật 24
3.1.2 Đặc điểm vi phẫu thân của hai lồi 27
3.1.3 Đặc điểm bột được liệu ở hai lồi 29
3.2 Kết quả nghiên cứu thành phân hố học 2
Trang 1032.1 3.2.2, 3.2.3 Định lượng taninoid
3.3 Kết quả nghiên cứu chiết xuất bột bán thành phẩm Dihacharin 3.3.1 Hiệu suất ở qui mơ phịng thí nghiệm
3.3.2 Hiệu suất ở qui mơ pilot 3.4 Kết quả nghiên cứu độc tính
3.4.1 Đặc tính cấp
3.4.2, Doc tính bán trường điển 3.5 Kết quả nghiên cứu tác dụng được lý
nh tính các nhĩm chất chính trong dược liệu
th lượng (lavonoid tồn phần
3.5.1 Tác đụng bảo vệ gan trên mơ hình tổn thương gan bằng CCI, 3.3.2 Tác dụng ức chế xơ gan và chống peroxy hố gan trên mơ hình xơ gan
3.5.3 Tác dụng lợi mật của Dihacharin
3.3.4 Tác dụng chống viêm cấp tính 3.3.5 Tác dụng lợi tiểu
3.6 Bào chế viên nang Dihacharin
.7 Kết quả nghiên cứu xây dựng tiêu chuẩn 3.7.1 Tiêu chuẩn nguyên liệu
3,7:2 Tiêu chuẩn bán thành phẩm và thành phẩm 3.8 Nghiên cứu độ ổn định của thuốc
3.9 Kết quả nghiên cứu lâm sàng
3.9.1 Đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng ở bệnh nhân viêm gan B
mạn trước điểu trị
3.9.2 Kết quả điều trị ở hai nhĩm bệnh nhân viêm gan B mạn
3.9.3 Tác dụng khơng mong muốn của Dihacharin
Trang 11
Pho luc
Phụ lục 1 Cách định tính và kết quả định tinh từng nhĩm chất 80
Phụ lục 2 Cách định tính và kết quả định tính flavonoid bằng SKLM 89
Phụ lục 3, Qui trình sản xuất viên nang Dihacharin 94
Phụ lục 4 Phiếu kiểm nghiệm viên nang Dihacharin của Viện KN 101
Phu Inc 5 Tiéu chudn nguyen lieu.Diép ha chau đắng 102
Phy luc 6, Tiêu chuẩn bán thành phẩm bột Dihacharin 104
Phụ lục 7 Tiêu chuẩn viên nang Dihacharin và phương pháp thử 107
Phụ lục 8 Danh sách bệnh nhân nghiên cứu lâm sàng 14
Phu tục 9 Biên bản họp hội đồng KHCN đánh giá kết quả nghiên cứu để | 117
tài "Nghiên cứa tác dụng điểu trị của Dihacharin chiết xuất từ cây Diệp
tạ châu đẳng ở bệnh nhân viêm gan vinứ B mãn tink"
Trang 12BANG CHU GIAINHUNG CHU VIET TAT
ALT Alanin aminotransferase
Anti HBc Kháng thể kháng kháng nguyên lõi của HBV (Antibody against Hepatitis B core antigen)
Anti HBe Kháng thể kháng kháng nguyên e của HBV
(Antibody against Hepatitis B e antigen)
AST Aspartat aminotransferase
ATP Adenosin triphosphat
BN Bệnh nhân
CĐRC Ché dé rang cua
DHCĐ Diệp hạ châu đẳng
ĐT Điều trị
ELISA “Thử nghiệm miễn dịch hấp phụ gắn enzym
{enzyme linked immunosorbent assay) etal và những người khác
HBeAg Kháng nguyên e của HBV (Hepatitis B e Andgen)
HBsAg Kháng nguyén bé mat cla HBV (Hepatitis B surface Antigen)
HBV Virut viem gan B (Hepatitis B virus) HPLC Sắc ký lịng hiệu năng cao
(High pressure liquid chromatography)
Trang 13DAT VAN DE
1 Tính cấp thiết của đề tài
Viêm gan được quan tâm đặc biệt của nên ÿ tế nước ta và của thế giới, nhất là hiện nay, tình trạng viêm gan do thuốc, do hố chất, do thuốc trừ sâu diệt cổ, do uống rượu do
virut ngày càng tăng, Chỉ tính riêng viêm gan do virut, tỷ lệ số người mắc rất cao; trong đĩ, theo Tổ chức Y tế thể giới, hiện nay, trên thế giới cĩ khoảng 2 tỷ người nhiễm virut viêm gan B với trên 350 triệu là viêm gan B mạn tính, riêng châu Á là 200 triệu người, Hàng năm, cĩ khoảng 2 triệu người mang virut viêm gan B mạn tính bị chết do xơ gan, ung thư gan
Việt nam ta, cũng như các nước Dong Á, Nam Á, kế cả Trung Quốc, Ấn Độ, nằm trong khu vực virut viêm gan B lưu hành cao của thể giới Theo các điều tra dịch tế học, tỷ lệ người mang virut viêm gan B ở nước ta là 8-15% Do đĩ, việc nghiên cứu tìm ra các thuốc phịng chống viêm gan là rất cấp bách
Các thuốc chống viêm gan, bảo vệ gan, tđũng cường chức năng gan, Tây y cũng
dùng thuốc từ cây cỏ như đùng cao từ quả cây Cúc gai Silybum marianum (L.) Gaertn., hoặc chiết từ quả, chất flavon lignan, thường gọi là silymarin, một hỗn hợp gồm silybin, silydianin, silychristin Người Ấn Độ cịn dùng cao hoặc hỗn hợp glycosid iridoid từ cây Picrorhiza kurroa
“Thuốc cĩ tác dụng trên vinit viêm gan B hiện nay thường dùng, như interferon alpha, lamivudin, cĩ nhiều nhược điểm, như tác dụng cĩ mức độ, cĩ nhiều tác dụng khơng mong muốn và rất đất Trong khi đĩ, cây điệp hạ châu đắng, trước đây cịn gọi là cây chĩ để răng cưa (và hiện nay, vẫn cịn nhiều người gọi như vậy) đã được nhân dân ta từ lâu đời dùng làm thuốc trị viêm gan, vàng da Trong thời gian gần đây, nhiều cĩng trình trên thế
giới đã nghiên cứu và thấy cao chiết từ cây điệp hạ chân đắng, khơng những cĩ tác đụng
bảo vệ gan, chống viêm gan, làm phục hỏi lại chức năng gan, mà cịn cĩ tác dụng ức chế ĐNA polymerase của virut viêm gan B nên ức chế sự phát triển của virut viêm gan B,
Trang 14điệp hạ châu đẳng là một vấn để cấp thiết, mang lai lợi ích khơng những vẻ y tế, xã hội
mà cả về kinh tế, gĩp phần giảm ngoại tệ để nhập thuốc
1 Mục tiêu và nội dung nghiền cứu
Mục tiêu nghiên cứu là chế tạo ra viên nang Dihacharin từ cây diệp hạ châu đắng
để làm thuốc báo vệ gan, chữa viêm gan, phục hổi chức năng gan đã bị tổn thương và ức
chế sự phát triển của vint viêm gan B
Để đạt mục tiêu trên, nội dung nghiên cứu sẽ tiến hành các vấn để sau:
Nghiên cứu về thực vật để xác định rõ đối tượng nghiên cứu, vì hiện nay cịn
nhầm lẫn giữa tên cây điệp hạ châu đắng và cây chĩ để răng cưa
Nghiên cứu vẻ hố học, xác định các nhĩm chất và sơ bộ định lượng một số
nhĩm chất trong cây
Nghiên cứu phương pháp chiết xuất tạo ra bán thành phẩm bột dihacharin cĩ tiêu chuẩn để chế tạo ra dạng thuốc Đĩ là cao chiết cĩ định hướng và loại tạp từ
cây Diệp hạ châu đắng
Nghiên cứu độc tính cấp và độc tính bán trường điển của Dihacharin
Nghiên cứu dược lý theo hướng tác dụng bảo vệ gan, phục hỏi chức năng gan,
chống xơ gan của bán thành phẩm Dihacharin
Nghiên cứu bào chế viên nang Dihacharin để thử lâm sàng
Nghiên cứu xây dựng tiêu chuẩn chất lượng và phương pháp thử của nguyên
liệu diệp hạ châu đắng, của bán thành phẩm Dihacharin và của viên nang
Dihacharin
Nghiên cứu độ ổn định của viên nang Dihacharin
Nghiên cứu tác dụng điểu trị viêm gan virut B mạn tính của viên nang
Trang 15Chương 1
TONG QUAN TINH HINH NGHIEN CCU
NGOAI NUGC VA TRONG NUGC
Khi gan bị tổn thương, dù là tổn thương gan do thuốc {như thuốc chống ung thu, thuốc chống lao, kháng sinh và nhiều thuốc khác cĩ thể gây tổn thương gan), do thuốc trừ
sâu, thuốc diệt cổ, do nhiễm hố chất, đặc biệt là các hố chất cĩ nhân benzen, các chất
halogen hố, do uống nhiều rượu, hoặc do virut đều phải giải quyết hai mặt: Một mặt, phải
cắt đứt nguyên nhân gây bệnh;, mặt khác, phải dùng các thuốc bảo vệ gan, thuốc phục hồi
lại chức năng gan
Đối với các nguyên nhân do thuốc, do thuốc trừ sâu, thuốc điệt cổ, do rượu hoặc hố chất, thì phải ngừng ngay việc dùng hoặc tiếp xúc với các nguyên nhân trên Riêng
đối với nguyên chân do virnt, nếu là nguyên nhân do các virut thơng thường, như virut viêm gan A, thì bệnh thường tự khỏi Ngay đối với nguyên nhân do các virut khác như
virut viêm gan B, C, Ð, cũng cĩ tới 85-90% bệnh nhân viêm gan cấp cĩ thể tự khỏi Số cịn
_ lại, khoảng 10-15%, virut cịn tơn tại lâu đài trong cơ thể, và tiếp tục gây tổn thương gan,
dẫn đến viêm gan mạn tính, xơ gan và ung thư gan
Để điều trị viêm gan mạn hiện nay, nhiều thày thuốc dùng interferon alpha Brook
et al., 1989 [L9] thấy, nhiều bệnh nhân bị nhiễm virut viêm gan B mạn đáp ứng được với interferon aÌpha Thomas et al., 1994 [64] đã nghiên cứu so sánh 3 liều lớn nhỏ khác nhau của interferon alpha trong điều trị viêm gan B mạn hoạt động: cịn Wong, 1998 [73) đã
phân tích giữa giá cả và tính hiệu quả khi dùng interferon để điều trị nhiễm virut viêm gan B hoặc € mạn tính Lamivudin cũng được nhiều thày thuốc ưa dùng But et al., 2001 [20]
đã dùng lamivudin để điều trị viêm gan B mạa tính cho bệnh nhân cĩ anti-HBe dương
tính Dasilva et al., 2001 [23] đã nghiên cứu tính hiệu quả và sự dung nạp khi dùng liều
cao lamivndin để điều trị bệnh nhân viêm gan B mạn tính Qua nghiên cứu, các tác giả thấy, tác dụng của interferon alpha va lamivudin chi cĩ mức đọ, lại cĩ thể gây ra nhiều tác dụng phụ khơng mong muốn, và đặc biệt là giá rất đất Trong y học cổ truyền của nhân
Trang 1611 TĨNH HÌNH NGHIÊN CỨU Ở NGỒI NƯỚC
Những năm gần đây, trên thế giới nhiều tác giả đã nghiên cứu cây diệp hạ châu
đáng
1.1,1 Tác dụng chống tổn thương gan, phục hồi chức năng gan và tác dụng trên
virut viêm gan in vitro
Vẻ tác dụng bảo vệ gan, phục hồi chức năng gan, Saraf et al., 1991 [59] đã nghiên cứu chế phẩm thuốc “Hepatogard”, trong thành phản cĩ điệp hạ châu đắng, và thấy, chế phẩm cĩ tác dụng bảo vệ gan, làm phục hồi chức nâng gan trên tổn thương gan thực nghiệm do CCl, Mehrota et ai, 1991 [42] cũng nghiên cứu tác dung của điệp hạ châu đẳng trên virut viêm gan B in viưo Huang et al 2003 [27] đã chứng mình, một số hợp chất phân lập được từ các lồi thuộc chỉ Phyllanthus cĩ tác dụng in viro trên virut viêm gan B ở người
1.1.2 Tác dụng trên cơ chế của sự phát triển virut viêm gan B
nander, 1991 [69] đã nghiên cứu tạo callus của điệp bạ châu đắng và nghiên cứu tác dụng của cao chiết từ callus ức chế enzym DNA polymerase cia virut va ức chế
enzym sao chép ngược Ych et al., 1993 [751 đã nghiên cứu tác dụng của cao chiết từ điệp
hạ châu đắng trên kháng nguyên bể mặt của virut viêm gan B (HBsAg) ở tế bào u gan của người Lee et al., 1996 [37] thấy điệp hạ châu đắng làm giảm sự phiên mã và sự sao chép RNA thơng tin trong virut viêm gan B Theo Jayarams et al., 1996 [31], diệp hạ châu đắng ức chế sự phát triển của virut viêm gan B, nên ức chế sự tiết HBsÁg của dịng tế bào Alexander Con Ott et al., 1997 [51] lại thấy điệp hạ châu đẳng ức chế virut viêm gan B do
cất đứt sự tương tác giữa yếu tổ phát triển virut viêm gan và yếu tố sao chép tế bào Notka
Trang 171.1.3 Tác dụng in vive trén virut viem gan B ở vịt
Niu et al, 1990 [48] đã gây nhiêm virut viêm gan B ở vịt, rồi cho dùng diệp hạ châu
ding, thấy thuốc cĩ tác dụng ức chế sự nhân lên của virut viêm gan B ở vịt Munshi et al 1993 [44] đã đánh giá tác dụng của diệp hạ châu đắng, thấy thuốc cĩ tác dụng phịng ngừa, sau khi cho vit mới nở phơi nhiễm với virut viem gan B Cũng Munshi et al., 1993 45] thấy diệp hạ châu đắng cĩ tác dụng kháng hepadnavirus ở vịt mang virut viêm gan B này
1.1.4 Tác dụng chống viêm
Mới đây, một số tác giả đã chứng minh điệp hạ châu đắng cĩ rác dụng chống viêm Kassuya et al., 2003 [34] đã nghiên cứu và thấy cao chiết từ điệp hạ châu đắng và các dẫn
chất lignan chiết từ điệp hạ châu đắng cĩ tác đụng giảm đau và giảm phù trên mơ hình đau
đo bệnh lý thần kính và viêm kéo dài Kiemer et al., 2003 {35] thấy điệp hạ châu đẳng cĩ
tác dụng chống viêm mạnh do ức chế iNOS (sự tổng hợp nitric oxyd vơ cơ), COX2 và cytokin qua con đường NF-kappa B Cũng trong năm 2003, Raphael và Kuttan [58] thấy cao điệp hạ châu đắng ức chế viêm và tổn thương đạ dày thực nghiệm Cdn Kumar va
Kuttan, 2004 [36] thấy cao điệp hạ châu đắng cĩ tác dụng phịng ngừa, chống lại tổn
thương do chiếu tỉa X ở chuột nhắt trắng
1.15 Tác dụng trên u, ung thư và đột biến
Jeena et al., 1999 [32] đã nghiên cứu và thấy diệp hạ châu đắng cĩ tác dụng ức chế ung thư gan trên mơ hình gây ung thư gan bảng N-nitrosodiethylamin Gây ung thư tế bào
gan cho chuột cống trắng, rồi dùng cao diệp hạ châu đắng, Rajesbkumar và Kuttan, 2000
[52] thấy ở lị dùng thuốc, chuột cĩ thời gan sống kéo dài hơn nhiều so với lị chứng khơng dùng thuốc Cũng Rajeshlknmar et al, 2002 [53] thấy cao chiết từ diệp hạ châu đắng cĩ tác dụng chống u và tác dụng chống lại ung thư do tác nhân gây ung thư Cùng nghiên cứu song song với Rajeshkumar [53], Sripanidkulchai et al., 2002 [60] cũng thấy điệp ha châu
đắng cĩ tác dụng ức chế ung thư đo một số tác nhân gay ung thư Cùng năm 2002,
Trang 18diệp hạ châu đắng cĩ tác đụng chống lại đột biến được sinh ra đo một số tác nhân khác
nhau
1.1.6 Một số tác dụng được lý khác
Từ 1995, Srividya và Periwall [61] đã nghiên cứu và thấy diệp hạ châu đẳng cĩ tác dụng lợi tiểu, làm hạ huyết áp và hạ glucose huyết Đến năm 2001, Moshi et al 43} thay
cao chiết nước của điệp hạ châu đắng cĩ tác dụng hạ glucose huyết ở bệnh nhân đái tháo đường khơng phụ thuộc insulìn Cịn Raphael et a!, 2002 [56] đã thử và thấy, cao chiết
bằng methano! của diệp hạ châu đắng cĩ tác dụng hạ glucose huyết trên mơ hình gây đái
tháo đường do alloxan ở chuột cống trắng Sự giảm glucose huyết cĩ liên quan đến cường
độ chống oxy hố của cao
Rao va Alice, 2001 (55] đã nghiên cứu và Khơng thấy diệp hạ châu đắng cĩ ảnh hưởng đến khả năng sinh sản của chuột nhất trắng cái Cịn Adedapo et al 2003 [15] đã
thử một sở phân đoạn chiết bằng sắc ký cột của điệp hạ châu đắng cũng khơng thấy cĩ ảnh
hưởng trên hình thái và mơ bệnh học của các cơ quan sinh sản chuột cống trắng đực 1.1.7 Nghiên cứu nuơi trồng
Nhờ tác dụng tốt của điệp hạ châu đắng trên viêm gan, nên như cầu cần nhiều khiến Unander et al., 1995 (70] đã nghiên cứu cách trồng trọt cây dip ha châu đắng, nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến sự nảy mầm, cũng như sự hình thành và phát triển của cây diệp
hạ châu đắng Ngay từ năm 1991, cũng tác giả Unander [69] đã nghiên cứu tao callus & một số lồi thuộc chỉ PhyHlanthus
1.1.8 Tác dụng điền trị bệnh gan và viêm gan B ở người
Trang 1912 TINH HINH NGHIEN CỨU TRONG NƯỚC
Năm 1996, Nguyễn Phương Dung et al [6] đã nghiên cứu tác dụng của chế phẩm Hepamarin được bào chế từ cây Diệp hạ châu đắng trên tốn thương gan thực nghiệm do CC, ở chuột nhất Kết quả cho thấy Hepamarin ở liều uống 4 g/kg trong 15 ngày cĩ khả năng phục hổi tế bào gan bị thối hố và làm giảm hàm lượng AST sau khi đùng thuốc 7 ngày là 36,7%
Sau đĩ cũng đã cĩ một số cơng trình thử lâm sàng trên các bệnh nhân viêm gan,
vàng da và thấy cĩ kết quả tốt Do đĩ, hiện nay trên thị trường, đã cĩ một số mặt hàng
thuốc từ cây Diệp hạ châu đáng và cĩ xí nghiệp đùng cây Chĩ đẻ răng cưa Nhưng về đạng thuốc, cĩ xí nghiệp dùng tồn được liệu phơi khơ tán nhỏ, rây mịn rồi làm viên nén; cĩ xí nghiệp chiết cao tồn phần rồi đĩng vào ống tiêm; cĩ xí nghiệp cũng chiết lấy cao tồn
phẩn rồi trộn với một phần bột được liệu xay mịn hoặc trộn với tá dược tơ để sấy khơ rồi
làm viên nén hoặc viên nang
Trang 20Chương 2
ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1 ĐỔI TƯỢNG NGHIÊN CỨU
Đối tượng nghiên cứu là cây điệp hạ châu đáng, tên khoa học là Phylfanthus
amarus Schum et Thonn., họ Thâu dầu Euphorbiaceae Nhưng do cịn cĩ sự nhầm lẫn về
tên gọi với cay chĩ đề răng cưa, nèn trong phần nghiên cứu về thực vật học và hố học, cĩ
nghiên cửu cả cây chĩ đẻ răng cưa, tên khoa học là Phyllanthus urinaria L., cùng họ Thâu dâu Euphorbiaceae Mẫu được liệu được thu hái vào tháng 6-7 tại huyện Đơng Anh, thành phố Hà nội
Mục đích của để tài là nghiên cứu ra viên nang Dihacharin để điều trị viêm gan từ cây điệp hạ châu đắng Vì vậy, các phần nghiên cứu vẻ thực vật, về hố học và về chiết
xuất là để chế tạo ra bột bán thành phẩm Dihacharin đạt tiêu chuẩn chất lượng cơ sở Việc
nghiên cứu độc tính và dược lý được tiến hành trên bột bán thành phẩm Dihacharin là
dạng sẽ được dùng trực tiếp để bào chế viên nang Dihacharin Việc nghiên cứu xây dựng tiêu chuẩn và phương pháp thử nghiên cứu độ ồn định cũng như nghiên cứu lâm sing
được tiến hành trên viên nang Dihacharin, là dạng thuốc sẽ được sản xuất, lưu hành trên
thị trường sau này để điều trị viêm gan
2.2 VAT LIEU NGHIÊN CỨU
Động vật nghiên cứu gồm thỏ, chuột cống trắng, chuột nhắt trắng, khoẻ mạnh, dat
yêu cầu của từng loại thí nghiệm
Các loại dung mơi, hố chất đạt yêu cầu vẻ chất lượng và độ tình khiết do các hãng trong nước và ngồi nước cung cấp
Các dụng cụ và máy mĩc nghiên cứu thực vật như máy cắt tiêu bản, nhuộm tiêu
bản, kính hiển ví thường và kính hiển vi cĩ độ phĩng đại cao
Các dụng cụ, máy mĩc để chiết xuất và thu hỏi dung mơi trong phịng thí nghiệm và ở xưởng pilot như bộ ngấm kiệt, máy cất quay Buchi, tủ sấy thường, tử sấy chân khơng,
Trang 21Các dụng cụ, máy mĩc phân tích hố học như máy do điểm chảy, máy đo phổ các loại gồm may Varian 1, Cary 1E, sic ky lớp mĩng
Các máy mĩc để nghiên cứu độc tính và tác đụng dược lý như máy phân tích sinh
hố bán tự động Scout, máy phổ quang kế UV-VIS UVMini 1240, cdc kit thuốc thữ để định lượng máy cắt tiêu bản, máy đúc tiêu bản, máy nhuộm tiêu bản gan thận, thượng
thận, bộ dẫn lưu mật, máy đo biến đổi thể tích chân chuột, bộ thư nước tiểu
Các dụng cụ và máy nghiên cứu bào chế như rây, sàng, máy trộn, máy sấy, máy làm nang, máy thử độ rã Các dụng cụ và máy xác định các chỉ số của tiêu chuẩn và nghiên cứu độ ổn định của thuốc
Đối tượng bệnh nhân và các dụng cụ, máy nghiên cứu lâm sàng như các máy xét nghiệm huyết học, xét nghiệm nước tiểu, xét nghiệm chức nàng gan, máy ELISA dùng kít cila hing Sanofi dé dinh lugng HBsAg, anti-HBc-IgM, anti-HBe-IgG: ding kit cia hang GMC (General Biological Corp.) dé dink lugng HBeAg, anti-HBe, anti-HBs, , anti-HBc-
IgM; xét nghigm HBV va HBV-DNA ding kj thuat PCR
2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3.1 Nghiên cứu về thực vật
Việc định tên khoa học, cũng như vi phẫu và soi bột dược liệu theo phương pháp
thường quy vẫn được áp dụng [2], cĩ đốt chiếu với nhiều tài liệu [1], [5], [10] [MI], [121, (4)
2.3.2 Nghiên cứu về hố học
3.8.3.1 Định tính các nhơm chất hiữu cơ
Việc định tính các nhĩm chất hữu cơ được tiến hành theo sách "Phương pháp
nghiên cứu hố học cây thuốc” [9]
3.3.3.2 Định lượng flavonoid
Flavonoid được định lượng theo phương pháp cân [1] Cụ thể như sau:
Can chính xác khoảng 20 g bột dược liệu Xác định độ ẩm được liệu trên máy Grainer I Tham ém được
Trang 22thu hồi dung mơi đến gần cạn Tiếp tục bay hơi trên nồi cách thuỷ đến hết cồn Thêm vào cắn 30ml nước cất, tiếp tục đun cách thuỷ trong 30 phút Lọc lấy địch nước Chiết bằng nước 2-3 lần như vậy cho hết flavonoid Gọp địch nước vào một bình gạn dung tích 300ml Chiết bing ethylacetat 6 lần, mỗi lần 50ml Gọp địch ethylacetat rồi bay hơi trên
nổi cách thuỷ đến khơ Sấy cắn ở 80 °C đến khối lượng khơng đổi Can trên cân phân tích
rồi tính ham lugng flavonoid
2.3.2.3 Định lượng taninoid
Việc định lượng taninoid được tiến hành theo phương pháp ghi trong Dược điển °
Việt nam 3 [3] Cụ thể như sau: ~~
Cân chính xác 2g được liệu đã tán nhỏ (ray số 36) cho vào một bình nĩn Đổ thêm
50ml nước sơi và đun cách thuỷ, vừa đun vừa khuấy trong 30 phút Để yên vài phút, lọc qua bơng cho vào bình định mức 250ml Tiếp tục chiết như trên nhiều lần cho tối khi địch chiết khơng cho phản ứng của tanin (thử với sắt II clorid hoặc phèn sắt amoni) Làm nguội chất lỏng trong bình định mức và thêm nước vừa đủ tới vạch
Lấy 25ml đung dịch trên cho vào một bình nĩn dung tích 1000ml, them 750m! nước và 25ml dung dịch sunfo-indigo (CT) Dinh lugng bing dung dich kali permanganat 0,1N cho tới khi chuyển sang mầu vàng,
1ml KMnO, 0.1N tương đương 0,004157g taninoid
Song song tiến hành một mẫu trắng gồm 25ml dung dịch sunfo-indigo (CT) và 750ml nước Ham lượng % taninoid trong được liệu được tính theo cơng thức: (a-b) x 0,004157 x 250 x 100 —— 25x2
Trong đĩ: — alàsố ml KMnO,0,1N dùng cho mẫu thử b là số ml KMnO, 0,1N dùng cho mẫu trắng
2.3.2.4 Sắc ký lớp tỗng với chất hấp phụ là silicagel G của Viện Kiểm nghiệm
2.3.3 Nghiên cứu chiết xuất
Trang 23Qua nghiên cứu vẻ thành phân hố học của diệp hạ châu đắng, thấy cĩ nhiều qaninoid và fiavonoid là những thành phần cĩ tác dụng trên viêm gan Do đĩ, cách chiết ra tán thành phẩm bột Dihacharin theo hướng cách chiết để lấy phân đoạn flavonoid và raninoid
1.3.3.1 Chiết xuất trong phịng thí nghiệm
aJ Xử lý nguyên liệu
Dược liệu thu mua vào thời gian cĩ hoa qùa (tháng 6-7) Phơi khơ Khi phơi lá
rụng nhiêu, chú ý thu lấy cả phần lá rụng vì hoạt chất nằm nhiều trong lá Cây, cành được
chặt thành các đoạn ngắn 3-4 cm, sau đĩ cho vào máy xay cỡ nhỏ (loại máy xay cánh bứa)
xay thành bột thơ,
bị Chiết xuất
Dược liệu đã xay và dung mơi là cơn cho vào bình câu cĩ lắp sinh hàn ngược, đặt trên bếp cách thuỷ, thực hiện chiết hồi lưu
Chiết 4 lần:
+ Vẻ lượng dung mơi:
Lân!: 1 phần được liệu/6 phần dung mơi (Khối lượng/ thể tích)
Lần 2,3,4: 1 phần dược liệu/5 phần dung mơi + Về thời gian:
Lần 1,2,3: Mỗi lần Igiờ 30 phút tính từ khi sơi Lần 4: Chiết I giờ
Mỗi lần chiết xong, lọc địch chiết bằng giấy lọc gấp nếp trên phếu thuỷ
tỉnh thường Bã được liệu nạp thêm dung mơi mới để chiết tiếp lần khác, of Thu héi dung mot
Dịch chiết của các lần chiết được thu hồi dung mơi bằng máy cất quay Buchi R- 200 Dung mơi thu hồi được dùng để chiết mẻ khác Dịch chiết được cơ đặc cho đạt tỷ lệ
1/1 (1 khối lượng được liệu / 1 thể tích cao) (Nếu cao này để lầu chưa xử lý nên bảo quản
trong tủ lạnh)
Trang 24Cao lỏng được loại tạp và lọc qua giấy lọc trên phểu lọc Buchner ( Cé hit chan
khơng)
el Sly, xay
Dịch chiết đã được loại tạp được cất thu hồi dung mới, rồi để bay hơi trên bếp cách
thuỷ cho hết dung mdi và sấy trong tủ sấy chân khơng Heareus ở nhiệt độ 60- 70*C đến
khd (BO dm 3 - 4%) Sau đĩ nghiển trong cối sứ thành bột, đựng trong lọ thuỷ tỉnh nút
kín Bột này được gọi là Dihacharin
3.3.3.2 Chiết xuất ở quy mơ Piiốt
ai XỈ lệ nguyên liệu
Cho dược liệu vào máy xay thành bột thơ
bị Chiết xuất
~ Cân khoảng 40 kg dược liệu đã xay cho vào túi vải để sẵn trong bình chiết (bình
chiết cĩ dung tích 250 lít) Đậy lắp và văn chốt
- Bom nạp 200 tít cồn vào bình chiết, điều chỉnh áp suất hơi nĩng sao cho dung mơi
sối và hồi lưu một cách điều hơà (nếu nĩng quá dung mơi sẽ sơi trào ra ngồi theo đường,
sinh hàn)
~ Cứ 30 phút bơm đảo dung mơi 3 phút
~ Khi đạt thời gian chiết xuất (lần thứ nhất, thứ 2, thứ 3 mỗi lần chiết 1 giờ 30 phút
tính từ lúc dung mơi trong bình chiết sởi đến khi mở van tháo dịch, lần thứ 4 chiết với thời
gian 1 giờ) mở van tháo dịch chiết vào thùng chứa, rồi bơm dung mơi mới vào bình chiết
tiếp (lần chiết thứ 2, thứ 3, thứ 4, mỗi lần bơm nạp 160 lít)
~ Thu hổi cồn từ bã được liệu : Sau khi dịch chiết lẫn thứ 4 chảy hết vào bình chứa
Bã được liệu được xục hơi nĩng trực tiếp đồng thời táng nhiệt độ của bình đun, khi đĩ tượng cẩn cịn lại trong bã dược liệu sẽ bay hơi tiếp và ngưng tụ ở ống sinh hàn rồi chây về
Đình ngưng trung gian, khi hứng được khoảng 30 tít thì kết thúc phân thu hồi dung mơi từ bã được liệu
el Cơ dịch chiết
Dịch chiết được đưa vào máy cơ màng mơng để thu hồi dung mơi bằng bơm hit
chân khơng Điều chỉnh tốc độ dịng chảy của dịch chiết vào máy cơ, điều chỉnh áp suất
Trang 25hơi nĩng và độ chân khơng sao chơ phù hợp để dung mơi thu hổi chảy nhiều và đều vào thùng chứa dung mơi thu hối của máy và phần dịch chiết đã được cơ cũng chảy đều vào
bình chứa dịch cơ của may
Cơ đến thành đạng cao đặc 1/1 (Ikg được liệu được 1 lít cao) df Kitt cao
Cao lỏng được loại tạp và lọc qua vải trên thùng lọc cĩ hút chân khơng (cho nhanh)
ef Sấy, xay
Dịch chiết đã loại tạp được sấy khơ trong tủ sấy chân khơng ở nhiệt độ 60-70" C cho đến khơ (độ ẩm cịn khoảng 39)
Sau đĩ xay thành bột và bảo quản trong túi PE Bột cĩ màu nâu hoặc nâu bơi xanh, vị đẳng và cĩ mùi thơm đặc biệt Bột này được gọi là Dihacharin
2.3.4 Nghiên cứu độc tính
2.3.4.1 Nghiên cứu độc tính cáp
Việc xác định độc tính cấp được tiến hành theo sách “Phương pháp nghiên cứu độc tính cấp của thuốc” [7] Cụ thể như sau:
“Thí nghiệm được tiến hành trên chuột nhắt trắng khoẻ mạnh, khơng phân biệt đực
cái cĩ khối lượng 19-22 g do Viên Vệ sinh địch tế cung cấp Cho chuột nhìn đĩi 16 giờ
trước khi dùng thuốc
Bột Dihacharin được nghiển trong cối chày sứ và hồ với nước đến đậm độ thích hợp, rồi cho chuột uống bằng cách dùng một bơm tiêm cho thuốc trực tiếp vào dạ dày qua một kim cong đầu tù Thuốc được dùng một lần Sau khi dùng thuốc, chuột được theo đối
trong 3 ngày Liêu lượng thuốc được tính theo bột Dihacharin cho 1 kg cân nặng chuột
2.3.4.2 Nghiên cứu độc tính bán trường diễn
AI Quá trình thí nghiệm
Trang 26liệu 7 ngày trước khí thí nghiệm để ổn định điều kiện sống Khi bất đầu thí nghiệm, lấy
máu lần đầu để xác định các thơng số bình thường của thơ trước khí uống thuốc Sau đĩ, ở 1© thử thuốc, cho thỏ uống bột bán thành phẩm Dihacharin với liễu mỗi ngày 0.7 g/kg hồ
trong 3 ml nước, tính ra được liệu khơ là 10 g/kẹ Lơ chứng, cho thỏ uống nước cất với
cùng thể tích (3 ml/kg/ngay) Cả 2 lơ đều cho uống liên 30 ngày
Sau 15 ngày uống thuốc và sau khi ngừng thuốc, lấy máu thỏ để kiểm tra các thơng số huyết học và hố sinh Khi ngừng thuốc, sau khí lấy máu thỏ xong, lấy gan, thận,
thượng thận để xét nghiệm đại thể va vi thé BỊ Các thơng số đánh giá: - Các thơng số huyết học, được đánh giá trên máy phân tích máu Sysmex KX21 hố chất do hãng Sysmex cung cấp, gồm: + Số lượng bạch cầu + Số lượng hồng cấu + Tỷ lệ huyết sắc tố
- Các thơng số hố sinh để đánh giá chức năng gan và thận, được định lượng trên máy
định lượng sinh hố bán tự động Scout, kit do hãng Hưman cung cấp, gầm:
+ Định lượng hoạt độ các enzym AST và ALT trong huyết thanh theo phương pháp
của Reitman- Frankel sửa đổi bởi Sevela dùng 2 cơ chất là L-Alamin và L-Aspartat [29] [30}
+ Định lượng protein tồn phần trong huyết thanh bằng phương pháp Biurê [39] + Định lượng urea trong huyết thanh theo phơng pháp dùng enzym urease cia
Rappoport [67]
+ Định lượng creatinin trong huyết thanh bằng phân ứng Jaffé [40]
~ Về giải phẫu bệnh lý, đã tiến hành xét nghiệm đại thể và vi thể của gan, thận, thượng, thận để xem ảnh hưởng cuả thuốc đến các cơ quan này
2.3.5, Nghiên cứu tác dụng dược lý
Đúng ra, để nghiên cứu tác dụng dược lý của Dihacharin, phải nghiên cứu cả 2 loại tác dụng:
Trang 27Nghiên cứu tác dụng trên virut viêm gan B: Trong điều kiện hiện nay, chúng tơi
chưa nghiên cứu được tác dụng trên virut viêm gan B thực nghiệm Phần này, phải dành cho bệnh viện 103 nghiên cứu tác dụng của Dihacharin trên virut viêm
gan B ở người bị viêm gan B mạn hoạt động
Nghiên cứu tác dụng bảo vệ gan, phục hỏi lại chức năng gan: Để nghiên cứu
loại tác dụng này, chúng tơi đã nghiên cứu các tác dụng sau;
~_ Gây tổn thương gan thực nghiệm bằng hố chất, kết hop ding Dihacharin dé
đánh giá tác dụng bảo vệ gan, phục hỏi chức năng gan
- Gay xo gan thực nghiệm bằng hố chất, kết hợp dùng Dihacharin để đánh
giá tác dụng ức chế xơ gan, tác dụng trên giải phẫu bệnh lý gan và tác dụng
chống oxy hố
-_ Tác dụng trên khả năng tiết mật, vì khi gan bị bệnh sẽ ảnh hướng rất lớn đến
khả năng tiết mật,
-_ Tác dụng chống viêm cấp tính cũng là một khía cạnh của viêm gan
~_ Tác dụng lợi tiểu cũng gĩp phần váo tác dụng giải độc gan khi gan bị tổn thương
2.3.5.1 Nghiên cứu tác dụng bảo vệ gan trên mơ hình gây tổn thương gan bằng CCl, Thí nghiệm được tiến hành ở thỏ theo phương pháp của Turner cĩ cải tiến [68] CC, được tiêm trong màng bụng với tiểu 1 ml/kg hồ trong dấu 6 liu, Dihacharin được nghiền trong cối chày sứ với nước cất đến đậm độ thích hợp và cho uống với liêu hàng ngày là 0,5 g/kg từ 3 ngày trước và kéo dài cho đến 15 ngày sau CCl, Các thơng số sau đây được xác định:
Khối lượng cơ thể của thỏ
Hàm lượng bilirubin trong huyết thanh,
Hàm lượng các enzym transaminase AST va ALT
Protein tồn phần trong huyết thanh
Trang 282.3.5.2 Nghiên cứu tác dụng ức chế xơ gan và chống peroxy hố trên mơ hình gây xơ
gon bằng CCI, [41]
"Trên động vật thí nghiệm, nếu dùng CCI, liều thấp và ít lần sẽ gây tổn thương gan Nhưng nếu dùng CCI, kéo dài thì tổn thương gan tiến triển, dẫn đến xơ gan Xơ là kết quả của quá trình tăng tổng hợp và tích tụ colagen ở gan
Thí nghiệm được tiến hành kéo dài 12 tuần trên chuột cống trắng khoẻ mạnh, khơng phân biệt đực cái, cân nặng 85-100g, Chuột được chia thành 3 lị:
-_ Lơ 1: Lơ chứng, chuột khong gay xơ để đối chứng
~_ Lê 2: Lơ gây xơ Tiêm dudi da dung dich CCl, trong dau 6 liu, 2 lần một tuần trong 12 tuần Nơng độ CCI, và liều đùng tuỳ theo thời gian:
4 tuần đầu: Tỷ lệ CCL,:đâu ơ liu là 4:1, liễu mỗi lần 0,20 ml/100g 4 tuần sau: Tỷ lệ CCI,:đầu ư lìu là 4:2, liều mỗi lần 0,30 m1/100g
4 tuần cuối: Tỷ lệ CCl,:dầu ơ liu là 3:2, liều mỗi lần 0,40 ml/100g
-_ Lơ 3: Lơ gây xơ + thuốc Cách gây xơ như lơ 2, nhưng sau 4 tuần, cho chuột uống thuốc Dihacharin hàng ngày với liêu 0,7 g/kg
Sau 12 tuần, giết chuột bằng cách lấy một thanh gỗ, đập mạnh vào đầu chuột Mổ bụng,
chuột, bĩc tách lấy gan để xác định các thơng số sau:
~ _ Hàm lượng colagen gan là thơng số biểu thị cho xơ gan
- Ham lượng MDA trong gan là thơng số biểu thị cho quá trình peroxy hố gan
-_ Xét nghiệm giải phẫu mơ bệnh học gan
Ham lượng colagen được định lượng theo phương pháp Newran Logan [47]
Nguyên tác của phương pháp là thuỷ phân gan để giải phĩng ra hydroxyprolin (HP) Cho
HP phân ứng với paradimethylaminobenzaldehyd sẽ sinh ra một chất màu Do quang ở bước sĩng 557 nm So sánh với đỏ thị chuẩn HP, từ đĩ suy ra hàm lượng colagen gan
(Immol HP tương đương I mg colagen)
'Xác định hàm lượng MDA trong gan bằng cách lấy gan, nghiền đồng thé, ly tam dé lấy địch nồi, rồi cho phản ứng với acid thiobarbituric để tạo thành một phức hợp màu hồng [62] Do cường độ màu để xác định hàm lượng MDA trong mẫu thử Thuốc cĩ tác dụng chống oxy hố thì lượng MDA hình thành trong gan ft hơn so với lơ chứng Hoạt tính chống oxy hố được tính theo hàm lượng MDA giảm theo % so với lơ chứng
Trang 29Xét nghiệm mơ bệnh học đại thé va vi thể của gan bằng phương pháp quan sắt trực tiếp bằng mắt thường và bằng cách cắt tiêu bản, nhuộm màu, rồi soi trên kính hiển vi cĩ độ phĩng đại cao
2.3.5.3 Nghiên cứu tác dụng lợi mật
Tác dụng lợi mật được tiến hành ở chuột lang [50] Đã xác định các thơng số sau:
-_ Lưu lượng mật [56]
~_ Căn khơ của mật,
- _ Định lượng bilirubin trong dich mat [54]
2.3.5.4 Tác đụng chống viêm cấp tính
Tác dụng chống viêm cấp tính được tiến hành theo phương pháp gây phù thực nghiệm bằng carragenin [72], Thí nghiệm được tiến hành ở chuột cống trắng, khơng phân biệt đực cái, cân năng 100-1308 Thể tích chân chuột được xác định bằng máy biến đổi
thể tích (Piethysmograph) trước (V,) và 3 giờ sau khi gày viêm (V;) Carragenin được pha
trong nước thành dung địch 1% Tiêm 0,L ml dung dịch carragenin vào dưới da gan bàn chân phải sau của chuột Để đánh giá cả tắc dụng phịng ngừa, cả tác dụng điều trị, thuốc Dihacharin được cho uống 3 lần: 1 giờ, rồi 30 phút trước carragenin, và 1 giờ sau
carragenin Lơ chứng được cho uống thay thuốc bằng nước cất với cùng thể tích Xác định
sự tăng phù của mỗi lơ, rồi so sánh giữa lị thuốc với lơ chứng 3.3.5.5 Tác dụng lợi tiểu
“Thí nghiệm được tiến hành trên chuột cống trắng cân nặng 150-200g {33] Chuột được chỉa làm 4 lơ:
~ _ Lơ chứng : Cho uống dung dịch NaCI 0,9% với thể tích 4 ml/100g
- Lơ tham chiếu: Cho uống hypothiazid với liều 4 mg/kg chuột Thuốc được pha trong,
dung dich NaCl 0,9% véi độ lỗng vừa di để cho uống 4 ml/190g
Trang 30~ LO thude liều cao: Cho uống Dihacharin với liểu 1.4 g/kg (tính ra dược liệu khơ là 20 g/kg) Bot Dihacharin được hồ trong nước với độ lỗng đủ để cho uống với thể
tích 4 ml/100g chuột
Cả 4 lơ chuột đều cho uống 1 lần duy nhất vào sáng sớm Sau đĩ cho vào một dụng
cụ đặc biệt để thụ nước tiểu bài tiết ra
Hàm lượng natri trong nước tiểu được định lượng bằng phương pháp so màu, dùng kit thuốc thử đo hãng Human cung cấp và máy định lượng sinh hố bán tự động Scout
126]
Kali trong nước tiểu, ở mơi trường kiểm, phần ứng với natri tetrapheny!boron tao ra
kali tevaphenylboron là một huyền phù, Độ đục đo được ở 578 am tỷ lệ với hàm lượng
kại trong nước tiểu Kit sử dụng đo hãng Human cung cấp và thực hiện trên máy sinh hố bán tự động Scout [25]
2.3.6 Nghiên cứu bào chế viên nang Dihacharin
'Việc bào chế viên nang Dihacharin được tiến hành theo phương pháp thơng thường Trọn, tạo hạt, sấy khơ, trộn với bột talc, rây, vào nang, đánh bĩng nang, vào lọ theo cách
thức đơn giản
2.3.7 Nghiên cứu xảy dựng tiêu chuẩn nguyên liệu, bán thành phẩm và thành phẩm
Xây đụng các chỉ tiêu nguyên liệu, bán thành phẩm và thành phẩm theo các yêu cầu chung đã được quy định trong Dược điển Việt nam 3
2.3.8 Nghiên cứu độ ổn định của viên nang Dihacharin
Các mẫu thuốc được bảo quản ở nhiệt độ 30 ° + 2 °C; độ ẩm tương đối là 75% + 5%, tránh ánh sáng
Bao bì đĩng gĩi: Viên nang được đĩng trong lọ nhựa PVC, phía trên cĩ một lớp bơng mổ và một gĩi silicagel nhỏ, lọ cĩ 2 nắp đậy kín
Thời gian theo dõi là 2 năm
Trang 31Phương pháp khảo sát: Theo tiêu chuẩn cơ sở, với các chỉ tiều quy định trong Dược
điển Việt nam 3 và cách xác định độ ổn định thuốc [4]
2.3.9 Nghiên cứu làm sàng 2.3.9.1 Đối tượng nghiên cứu
AI Tiêu chuẩn lựa chọn các nhơm nghiên cửu
"Tiêu chuẩn lựa chọn bệnh nhân VỚB mạn: căn cứ theo tiêu chuẩn Dienstag 1998
và tiêu chuẩn Shaw-Stiffel-2000:
- Lam sàng: BN cĩ biểu hiện bệnh gan > 6 tháng, khơng tự hồi phục
+ AST, ALT ting trên mức bình thường ít nhất 2 lần - HBsAg (+), Anti-HBe-IgM (-), Anti-HBc-IgG (+) 8 Tiêu chuẩn loại trữ:
Những BN sau khơng lấy vào nhĩm nghiên cứu là: - _ BN khơng tự nguyện nghiên cứu
- _ Trẻ em < 16 tuổi và người già > 60 tuổi hoặc phụ nữ cĩ thai hoặc đang cho con bú ~ _ BN bị viêm gan do các nguyên nhận khác: đo thuốc, do hố chất, đo rượu
-_BN bị VGB kết hợp các virus khác (cĩ Anti HCV (+), And HIV (+) hoặc kết hợp với các bệnh khác (như sốt rét viêm đường mật, đái đường, bệnh tìm mạch )
- BN xo gan, ung thư gan hoặc các bệnh gan khác cĩ HBsAg (+)
2.3.9.2 Phương pháp nghiên cứu AI Phân chia các nhĩm nghiên cứu:
60 BN đủ tiêu chuẩn lựa chọn, phân chia ngẫu nhiên thành 2 nhĩm tương đương nhau:
~_ Nhĩm điều trị (viết tắt: Nhớm ĐT}: điều trị Dihacharin + điều trị cơ sở ~_ Nhĩm đối chứng: điểu trị cơ sở, khơng đùng Dihacharin
BỊ Phác đồ điều trị:
Tihacharin (viên nhộng) 0,5gam: liễu dùng 6 viên/ ngày, uống, chia làm 2 lần (sáng, chiều), uống hàng ngày trong thời gian 3 tháng (90 ngày)
Trang 32Tất cả các BN điều trị cơ sở hàng ngày bằng: „ Glucose bột - Vitamin By :— Sviên, ViaminC0,l0 : — 5viên .ViaminB,Ú05 ¡ — 2viên Fortec 15mg : — 4viên, €j Theo đối:
Các BN đều được điều trị tại khoa Truyền nhiễm Rệnh viện 103, các BN được đăng ký theo một mẫu thống nhất các nội dung như sau:
Khám lâm sàng hàng ngày, theo đối diễn biến các triệu chứng lâm sàng và phát
hiện các dấu hiệu bất thường (các triệu chứng khơng mong muốn)
Xét nghiệm thường qui: bao gồm Cơng thức máu, tốc độ lắng máu
„ Xét nghiệm nước tiểu thường qui
Xét nghiệm hố sinh: Bilirubin (tồn phần, gián tiếp, trực tiếp), AST, ALT, urê,
creatinin
Các xét nghiệm trên được làm ít nhất 5 lần vào các thời điểm: trước điều trị, sau 2,
3, 4 tuần, sau 3 tháng điều trị
Các xét nghiệm trên làm tại khoa Huyết học và Hố sinh Bệnh viện 103 Xét nghiệm cdc marker cia HBV:
HBsAg: duge phat hign bang kf thuat ELISA, sit dung Kit cia hing Sanofi trén
nguyên lý “bánh kẹp” (Sandwich) Kết quả được đọc ở bước sĩng 450nm Huyét thanh BN
được coi là cĩ HBsAg (+) khi cĩ chỉ số OD > giá trị ngưỡng Tính nồng độ HBsAg (ng/m) trên máy theo sự thay đổi mật độ quang hoc Khi HBsAg < 5ng/ml coi như âm
tính
HBeAg: duge phat hiện bằng kỹ thuật ELISA, sit dung Kit cia hang GBC (General Biologicals Corp) trên nguyên lý “bánh kẹp” Kết quả được đọc ở bước sĩng
492nm Huyết thanh BN được coi là cĩ HBeAg (+) khí cĩ chỉ số OD > giá trị ngưỡng
Trang 33Anti-HBe: được phát hiện bằng kỹ thuật ELISA, sử dụng Kit của hãng GBC trên
nguyên lý trung hồ (Neutralization Principle) Kết quả được đọc ở bước sĩng 492nm
Huyết thanh BN được coi là cĩ Anti-HBe (+) khí cĩ chỉ số OD > giá trị ngưỡng
Anh - HBs: được phát hiện bằng kỹ thuật ELISA, sử dụng Kit của hãng GBC trên nguyên lý “bánh kẹp” Kết quả được đọc ở bước sĩng 492nm Huyết thanh BN được coi là
cĩ Anti-HBs (+) khi cĩ chỉ số OD > giá trị ngưỡng
Anti-HBc-IgM: được phát hiện bằng kỹ thuật ELISA, sử dụng Kit của hãng GBC trên nguyên lý trung hồ (Neutralization Principle) Kết quả được đọc ở bước sĩng 450nm Huyết thanh BN được coi là cĩ Anti-HBc-IgM (+) khi cĩ chỉ số OD > giá trị ngưỡng
„ Xét nghiệm HBV-DNA được thực hiện theo kỹ thuật Nested-PCR” cập mồi của
hãng Takara (Nhật Bản) sản xuất Nhận định kết quả bán định lượng theo các mức độ: < 5
copies/ml, 5 ~ 10 copies/mlvà > 10 copies/ml
Các xét nghiệm Marker HBV và HBV-DNA được thực hiện tại Labo Vi sinh vật —
Vien Ve sinh phịng dịch Quân đội Các bệnh nhân đều được xét nghiệm hai lần: lần trước
điều trị và sau điều trị (hết tháng thứ 3)
ĐI Đánh giá kết quả:
- Lâm sàng: theo đõi diễn biến và thời gian hết các triệu chứng lâm sàng (như: mệt
mỏi, chán an, rối loạn tiêu hố, vàng da, nước tiểu sẫm màu, buồn nơn và nơn, đau tức hạ sườn phải, gan to )
- _ Cận lâm sàng: thời gian phục hồi các xét nghiệm hố sinh về gan (Bilirubin huyết
thanh, Bilirubin niệu, AST, ALT) trở về bình thường
-_ Đánh giá kết quả điều tị bằng so sánh thời gian mất các triệu chứng lâm sàng và
phục hồi các xét nghiệm cận lâm sàng giữa Nhĩm diéu trị và Nhĩm đối chứng càng
ngắn càng tốt
Xét nghiệm Marker HBV và HBV-DNA, tuỳ theo mức độ: Tốt ít: giám ndng do HBsAg va HBV-DNA
'Tốt nhiều: chuyển đảo huyết thanh (đối với BN cĩ HBeAg (+)
Rất tốt: HBV-DNA (-) cĩ thể xuất hiện Anti HBs (+)
Trang 34~ _ Đánh giá tác dụng khơng meng muốn (tác dụng phụ): xuất hiện các triệu chứng bất thường trong và sau khi dùng thuốc cĩ như: sốt, nhức đầu, mất ngủ, ia long, ban 1.3.10 Xứ lý kết quả nghiên cứa
Các kết quả nghiên cứu được tính theo giá trị trung bình + sai số chuẩn (M + SE)
Riêng trong nghiên cứu lãm sàng được biểu thị bằng giá trị trung bình + độ lệch chuẩn
(M+ SD) Đánh giá xác suất thống kê so sánh giữa hai số trung bình được tính theo test “t”
cha Student ding Microsoft — Excel
Trang 35Chuong 3
KET QUA NGHIEN CUU 31 VE THUC VAT HOC
Cay Phyllanthus amarus Schum et Thom và cay Phyllanthus urinaria L là 2 cày
khác nhau, nhưng nhân dân ta vẫn gọi lẫn lộn là cây diệp hạ chau đắng hoặc chĩ dé ring
cưa Để dễ phân biệt, chúng tơi tạm gọi cy Phyllanthus amarus Schum, et Thonn la cây diệp hạ châu đắng, cịn cây Phyllanthus urinaria L là cây chĩ để răng cưa hoặc gọi tắt là cây chĩ đẻ Để phân biệt 2 cây này, nhằm tránh nhầm lẫn khi sử dụng, chúng tơi đã nghiên cứu về nhiều mặt,
3.L.L Mo ta dac diém thực vật
Quan sat trên thực địa, chúng tơi thấy:
3.1.1.1 Cây diép ha chau dang (PhyHlanthus amarus Schum et Thonn.)
Cây thảo, sống hàng năm, cao 40-80 cm, thân trịn, bĩng, màu xanh, ít khi chia nhánh Lá nguyên, phiến lá hình bầu dục, đài 5-10 mm, rộng 3-6 mm, màu xanh sắm ở trên, màu xanh nhạt ở dưới, xếp thành 2 dãy, cĩ mũi nhọn, nhấn Mỗi cành nom như một lá kép lịng chữa gồm nhiều lá chết Hoa đơn tính, ở nách lá màu lục nhạt, khơng cĩ cánh hoa Hoa đực cĩ cuống ngắn 1-2 mm, đài 5, cĩ tuyến mật; nhị 3, chỉ nhị dính nhau Hoa
cái cĩ cuống dài hơn hoa đực Quả nang nhấn, hình cầu, dẹp, nhắn, đường kính 1,8-2 mm,
cĩ đài tổn tại Hạt 6, hình tam giác, đường kính 1 mm, cĩ sọc dọc ở lưng và lần ngang Cây mọc hoang ở nhiều nơi (Hình 2a)
3.1.1.2 Cây chĩ để răng cưa (Phụllanthus urinaria L.)
Cây thảo sống 1 năm hay vài năm, thàn cứng, cao 20-30 cm, cĩ màu đỏ, thường
phân cành nhiều, cành đài 5-10 cm, hơi cĩ cạnh Lá mọc sơ le, xếp 2 dãy sít nhau, do đĩ
mỗi cành nom như một lá kép lơng chìm; phiến lá hình thuơn bẩu dục hay trái xoan
Trang 36Hinh 1b: Sơ đồ tổng quát vi phẫu thân P urinaria L Hinh 2b:
Sơ đồ tổng quất ví phẫu
Trang 37nhạc, mặt dưới hơi mốc, cuống ngắn khoảng 2 mm Hoa đơn tính, mọc ở nách lá, khơng cĩ cánh hoa: hoa đực ở ngọn cành, hoa cái ở gốc cành, tất cả hầu như khơng cĩ cuống, hoặc cĩ cuống ngắn; đài 6, màu trắng, nhị 3, chỉ nhị đính nhau, Hoa cái cĩ 6 tuyến mật Quả nang hơi đỏ khơng cuổng, hình cầu đường kính 2 - 2,5 mm, đính ở mặt đưới lá, cĩ gai nhỏ, chứa 6 hạt hình tam giác, cao khoảng 1 mm, mau sơcÐla nhạt Hạt cĩ những vân ngang vuơng gĩc với chiều dai hạt (Hình La)
Nhận xét: Những đặc điểm thực vật khác nhau quan trọng nhất là:
Đặc điểm P urinaria L P amarus Schum et Thonn
‘Than Cĩ màu nâu đỏ “Thân màu xanh
“Than hơi cĩ cạnh Thân trịn bĩng Phân cành nhiều Ít phân cành
tá Mặt trên mầu xanh Mặt trên màu xanh thắm
Mật dưới hơi mốc Mặt dưới màu xanh nhạt
Đài 6 5
Quả Cĩ gai nhỏ Nhãn
Hạt Cĩ văn ngang vuơng gốc | Cĩ sọc dọc ở lưng và lần ngang
với chiều dài hạt
Trang 38
3.1.2 Đặc điểm vĩ phẫu thân của hai lồi
Sau khí cắt, tẩy, nhuộm kép, rồi quan sát đưới kính hiển vị, thấy các đặc điểm: P amarus (Hình 2b, 2c} P urinaria (Hinh 1b, 1c} 1 | Thân cĩ các mị lồi
2 _ | Biểu bì gồm I hàng tế bào đều đặn
3 | Sát biểu bì là mơ dày gồm 2-3 hàng tế bào «_ | Mơ mềm vơ gồm những tế bào trịn thành mỗng _ | Các bĩ sợi đếu đặn 3 Vong libe liên tục 6 ¬ gỗ liên tục, các mạch gỗ xếp thành hàng đẻu đặn sát nhau Mơ mềm ruột gồm những tế bào to 8 _ | hình trịn thành mỏng ‘Than trịn đều
Biểu bì gồm 1 hàng tế bào đều đặn Sát biểu bì là 2-3 hàng tế bào mở dày Mơ mềm vỏ gồm những tế bào trịn thành mỏng Các bĩ sợi du dan Vong libe liên tục Vàng gỗ liên tục, các mạch gỗ xếp thành hàng, hàng mạch gỗ to xếp cách nhau Mơ mềm ruột gồm những tế bào to trình trịn thành mỏng
Nhận xét: Đặc điểm vi phẫu thân của 2 lồi khơng khác nhau nhiều, ngoại trừ ở P.urinaria L ĩ các mấu tỏi và vịng gỗ gồm các mạch gỗ kích thước đều nhau, xếp thành
hàng sát nhau
Trang 39
Hình 3: Một số đặc điểm bột dược liệu
Chĩ đẻ răng cưa ( P urmaria L.)
Hình 4: Một số đặc điểm bột được liệu
Trang 40
3.1.3 Đặc điểm bột được liệu ở 2 lồi
Dược liệu tán thành bột mịn đem soi dưới kính hiển vì quan sát thấy các đặc điểm:
Cây Điệp hạ châu đẳng
{P amams) (Hình 4) Cây chá để răng cưa (P urinaria ) (Hinh 3) ~ Mach ngan dang vach (1) 10) - Manh lép vd trong của hạt (5) ~ Mảnh mơ chứa mạch (6) > Soi (7) ~ Lỗ khí (9) ~ Mảnh mơ mềm (2) ~ Mạch xoắn (8)
- Mảnh lớp vỗ ngồi của hạt (3, 4, ~ Mạch ngàn dạng vạch (1, 7) - Mánh lớp vỏ ngồi của hạt (2, 9) ~ Mảnh lớp võ trong của qua (3) - Mảnh mơ chứa mạch (4) - Sơi (6) ~ Lễ khí (8) ~ Mảnh mơ mềm (5)
3.2 KẾT QUÁ NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HỐ HỌC 3.2.1 Đính tính các nhĩm chất chính trong dược liệu
Kết quả định tính các nhĩm chất chính trong dược liệu được trình bày trong bằng 1 Bảng 1: Kết quả định tính các nhĩm chất chính trong được liệu TT| Nhĩm Phản ứng định tính CĐ&C DHCD chát & urinaria P amarus KG KL KQ KL T [Flavonoid [- Phan tmg Cyanidin +r + - Phản ứng voi dd FeCl, } +++ | C6 +++ | Cĩ 5% ++ {| flavonoid |++ | flavonoid - Phản ứng với kiểm
2 JAlcalod |- Phẩánứng với TTMayer |- Khơng cĩ |+ co