Xây dựng quy trình chiết xuất nọc ong apis mellifera và đánh giá tác dụng dược lý theo hướng sử dụng hỗ trợ điều trị viêm khớp

ỦY BAN NHÂN DÂN TP.HCM SỞ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ  BÁO CÁO NGHIỆM THU (Đã chỉnh sửa theo góp ý Hội đồng nghiệm thu) ĐỀ TÀI: XÂY DỰNG QUI TRÌNH CHIẾT XUẤT NỌC ONG (APIS MELLIFERA) VÀ ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG DƯỢC LÝ THEO HƯỚNG SỬ DỤNG HỖ TRỢ ĐIỀU TRỊ VIÊM KHỚP CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI PGS TS Nguyễn Thị Thanh Mai CƠ QUAN QUẢN LÝ CƠ QUAN CHỦ TRÌ PGS.TS Châu Văn Tạo Thành phố Hồ Chí Minh – 04/ 2016 BÁO CÁO NGHIỆM THU Tên đề tài: XÂY DỰNG QUY TRÌNH CHIẾT XUẤT NỌC ONG (APIS MELLIFERA) VÀ ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG DƯỢC LÝ THEO HƯỚNG SỬ DỤNG HỖ TRỢ ĐIỀU TRỊ VIÊM KHỚP Chủ nhiệm đề tài: NGUYỄN THỊ THANH MAI Cơ quan chủ trì: TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN, ĐHQG-HCM Thời gian thực đề tài: 24 tháng, từ 12/2013 – 12/2015 Kinh phí duyệt: 1.050.000 đồng Kinh phí cấp: 950.000 đồng Mục tiêu: Nghiên cứu xây dựng quy trình chiết xuất nọc ong từ lồi ong mật nuôi Apis mellifera đánh giá tác dụng dược lý theo định hướng sử dụng hỗ trợ điều trị bệnh viêm khớp Nội dung chung: TT Các nội dung, công việc chủ yếu cần thực Kết cần đạt Quy trình chiết xuất nọc ong với đầy đủ Xây dựng quy trình chiết xuất nọc thông số như: thông số thiết bị chiết xuất ong từ loài ong mật Apis mellifera nọc; thời gian chiết xuất; khối lượng nọc; cách làm bảo quản nọc Quy trình phân tích nọc ong phương Xây dựng quy trình đánh giá chất pháp HPLC với đầy đủ thông số như: lượng nọc ong cách xử lý mẫu, thông số cột phân tích, điều kiện chạy máy, pha động,… Phân tích chất lượng nọc ong chiết xuất So sánh chất lượng nọc ong Việt Nam so với nọc ong mua nước khác Xây dựng tiêu chuẩn chất lượng nọc ong - Bảng kết phân tích chất lượng nọc ong chiết xuất nọc ong mua nước khác - Bảng phân tích so sánh chất lượng nọc ong Việt Nam so với nọc ong mua nước khác - Tiêu chuẩn chất lượng nọc ong Nghiên cứu đánh giá độc tính cấp Hồ sơ thử nghiệm độc tính cấp độc tính độc tính bán trường diễn nọc bán trường diễn nọc ong ong động vật thực nghiệm Nghiên cứu đánh giá tác dụng Hồ sơ thử nghiệm tác dụng chống viêm chống viêm khớp, giảm đau khớp, giảm đau, nọc ong nọc ong động vật thực nghiệm Những nội dung thực hiện: TT Công việc dự kiến Công việc thực Xây dựng quy trình chiết xuất nọc Đã hồn thiện quy trình chiết xuất nọc ong từ ong từ loài ong mật Apis mellifera loài ong mật Apis mellifera Đã hồn thiện quy trình đánh giá chất lượng nọc ong phương pháp RP-HPLC/Q-TOF Xây dựng quy trình đánh giá chất Đã hồn thiện quy trình thẩm định phương pháp lượng nọc ong phân tích nọc ong kỹ thuật RP-HPLC/QTOF Phân tích chất lượng nọc ong chiết xuất So sánh chất lượng nọc ong Việt Nam so với nọc ong mua nước khác Xây dựng tiêu chuẩn chất lượng sở nọc ong - Đã hồn thiện phân tích chất lượng nọc ong chiết xuất địa điểm khác - Đã hoàn thiện so sánh chất lượng nọc ong Việt Nam so với nọc ong hãng Sigma Aldrich - Đã hoàn thiện tiêu chuẩn chất lượng sở nọc ong chiết xuất Nghiên cứu đánh giá độc tính cấp Hồ sơ thử nghiệm độc tính cấp độc tính bán độc tính bán trường diễn trường diễn nọc ong nọc ong động vật thực nghiệm Nghiên cứu đánh giá tác dụng Hồ sơ thử nghiệm tác dụng chống viêm khớp, chống viêm khớp, giảm đau giảm đau, nọc ong nọc ong động vật thực nghiệm TÓM TẮT NỘI DUNG NGHIÊN CỨU Từ xa xưa, nọc ong sử dụng thuốc dân gian để trị số bệnh, nhiều đau thấp khớp Các nghiên cứu đại cho thấy nọc ong có khả kháng viêm, giảm đau thành phần nọc ong có chứa enzym, peptide amin Mục tiêu nghiên cứu xây dựng quy trình chiết xuất đánh giá tác dụng kháng viêm, giảm đau nọc ong loài Apis mellifera Kết nghiên cứu đề tài sau: - Nọc ong chiết xuất phương pháp sốc điện sử dụng dụng cụ BVC 0412, IGK electronics, Bulgaria Sử dụng phương pháp xuất không làm chết ong, dễ dàng loại bỏ tạp chất Nọc ong thơ tinh chế đơn giản cách hịa tan nước cất, lọc bỏ cặn bẩn không tan, sau đem đơng 20oC thu nọc ong tinh - Các thành phần nọc ong apamin, phospholipase A2 melittin xác định phương pháp RP-HPLC/Q-TOF Các kết cho thấy nọc ong chiết xuất Việt Nam có thành phần tương tự nọc ong hãng Sigma Aldrich vùng khác Latvia, Szolnok, Ngoài ra, đề tài xây dựng tiêu chuẩn chất lượng sở nọc ong - Nghiên cứu độc tính cấp độc tính bán trường diễn nọc ong cho thấy LD50 20.5 mg/kg Nọc ong liều mg/kg/ngày liều mg /kg/ngày khơng gây độc tính bán trường diễn chuột, thông số AST, ALT, urea, creatinine, cơng thức máu khơng có khác biệt so với lơ chứng - Các thí nghiệm nghiên cứu động vật cịn cho thấy nọc ong có khả giảm đau, kháng viêm liều 1,5 mg/kg, gần tương đương với thuốc mobic liều mg/Kg tiêm da vào huyệt Zusanli Kết sở định hướng cho việc nghiên cứu ứng dụng nọc ong điều trị viêm khớp người Từ kết nghiên cứu này, đề nghị cần tiến hành nghiên cứu tác dụng dược lý khác khả ứng dụng nọc ong, đặc biệt tác dụng kháng viêm giảm đau để định hướng sử dụng nọc ong làm thuốc điều trị bệnh viêm thấp khớp SUMMARY OF RESEARCH CONTENT Bee venom has long been used as one of folk remedies for the arthritis Bee venom known to be effective on the inflammatory diseases and pains is composed of complex mixture of various components including various enzyms, peptides and amines The purpose of this study was to investigate the isolation and anti-inflammatory effects in experimental arthritis rat of bee venom (Apis mellifera) Following are results of the research: - Bee venom is generally obtained by electric stunning using a bee venom collector (BVC 0412, IGK electronics, Bulgaria) without damaging the honeybees, removing impurities from the collected bee venom (BV) to give crude bee venom Then, dissolving crude bee venom in a distilled water to form a bee venom solution and removing the adsorbent through filtration to afford a pure bee venom solution The resulting filtrate is lyophilized at -20oC to produce pure bee venom as a powder - Major bee venom components, including apamin, phospholipase A2, and melittin were analysed by RP-HPLC/Q-TOF method The results showed that these components in Vietnamese bee venom similar to those of the other sources such as Sigma Aldrich, Latvia, Szolnok, On the other hand, the basic standard and quality of bee venom has been established - Bee venom isolated in Vietnam has been evaluated acute and sub-chronic toxicity in mice with ip injection The median acute toxicity value (LD50) of the bee venom was determined to be 20.5 mg/kg body weight In sub-chronic toxicity study, when working at and mg/kg respectively, no significant differences were observed concerning AST, ALT, urea, creatinine, blood parameters In the same manner, no histopathological alterations had been observed in the kidney and liver structures - Injection of bee venom into Zusalin acupuncture point resulted in antiinflammatory and induced-pain capabilities on rats These effects of bee venom (1.5 mg/kg) are similar to mobic (1 mg/kg) These finding raise the possibility that bee venom may be a candidate for long-term treatment of rheumatoid arthritisinduced pain and inflammation Based on the present results, we propose to continue studies of other pharmacology effects as well as application cappacities of bee venom, especially using bee venom as alternative medicine therapy for the long-term treatment of rheumatoid arthritis MỤC LỤC CHƯƠNG I TỔNG QUAN I.1 TÌNH HÌNH NGHỀ NI ONG MẬT HIỆN NAY Ở NƯỚC TA 18 I.2 TỔNG QUAN VỀ NỌC ONG 18 I.2.1 Giới thiệu nọc ong 18 I.2.2 Tính chất vật lý nọc ong 19 I.2.3 Thành phần hóa học nọc ong 20 I.2.4 Tính chất dược lý 23 I.3 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VỀ NỌC ONG 24 I.3.1 Trong nước 24 I.3.2 Trên giới 24 I.3.2.1 Phương pháp chiết xuất nọc ong10 24 I.3.2.2 Phương pháp phân tích thành phần nọc ong11 .26 I.3.2.3 Các nghiên cứu hoạt tính sinh học nọc ong9, 12, 13 .26 I.4 MỘT SỐ SẢN PHẨM TỪ NỌC ONG 27 I.5 LÝ DO CẦN PHẢI THỰC HIỆN ĐỀ TÀI 27 I.6 MỤC TIÊU CỦA ĐỀ TÀI 28 I.6.1 Mục tiêu tổng quát 28 I.6.2 Mục tiêu cụ thể .28 CHƯƠNG II NỘI DUNG NGHIÊN CỨU II.1 XÂY DỰNG QUY TRÌNH CHIẾT XUẤT NỌC ONG TỪ LỒI ONG MẬT APIS MELLIFERA 30 II.1.1 Hóa chất, dụng cụ, thiết bị địa điểm thực .31 II.1.1.1 Hóa chất dụng cụ 31 II.1.1.2 Thiết bị 31 II.1.1.3 Địa điểm thực 31 II.1.2 Phương pháp nghiên cứu quy trình chiết xuất nọc ong .31 II.1.3 Khảo sát yếu tố ảnh hưởng đến quy trình chiết xuất nọc ong .32 II.1.3.1 Khảo sát thời gian chiết xuất nọc ong ngày 33 II.1.3.2 Khảo sát số lần chiết xuất nọc ong ngày .33 II.1.3.3 Khảo sát số lượng ong chết sau lần chiết xuất nọc ong .34 II.1.3.4 Khảo sát sản lượng mật ong trình chiết xuất nọc ong 34 II.1.3.5 Xây dựng quy trình làm bảo quản nọc ong 35 II.2 XÂY DỰNG QUY TRÌNH ĐÁNH GIÁ CHẤT LƯỢNG NỌC ONG 36 II.2.1 Hóa chất, dụng cụ thiết bị .37 II.2.1.1 Hóa chất dụng cụ 37 II.2.1.2 Thiết bị 37 II.2.2 Xây dựng quy trình đánh giá chất lượng nọc ong phương pháp RP/HPLC/Q-TOF 38 II.2.2.1 Chuẩn bị dung dịch .38 II.2.2.2 Quy trình xử lý mẫu 38 II.2.2.3 Tối ưu hóa thơng số hệ thống RP-HPLC .38 II.2.2.4 Phân tích nọc ong theo điều kiện tối ưu 43 II.2.2.5 Thẩm định quy trình phân tích 46 a Tính tương thích hệ thống 46 b Tính đặc hiệu 46 c Tính tuyến tính 47 d Độ 48 e Độ xác 49 f Khoảng xác định .50 g Giới hạn phát (LOD) giới hạn định lượng (LOQ) .50 II.3 SO SÁNH CHẤT LƯỢNG NỌC ONG Ở VIỆT NAM SO VỚI NỌC ONG MUA Ở NƯỚC KHÁC, PHÂN TÍCH, CHẤT LƯỢNG NỌC ONG CHIẾT XUẤT ĐƯỢC, XÂY DỰNG TIÊU CHUẨN CHẤT LƯỢNG CỞ SỞ CỦA NỌC ONG 52 II.3.1 Hóa chất, dụng cụ thiết bị .53 II.3.1.1 Hóa chất dụng cụ 53 II.3.1.2 Thiết bị 53 II.3.2 So sánh chất lượng nọc ong chiết xuất so với nọc ong hãng Sigma Aldrich 53 II.3.3 Phân tích chất lượng nọc ong chiết xuất 54 II.3.4 Xây dựng tiêu chuẩn chất lượng sở nọc ong 55 II.3.4.1 Định tính .55 II.3.4.2 Độ ẩm 55 II.3.4.3 Độ tro toàn phần 56 II.3.4.4 Độ pH 56 II.3.5 Độ tinh khiết mẫu 56 II.3.6 Độ ổn định nọc ong 57 II.4 NGHIÊN CỨU ĐÁNH GIÁ ĐỘC TÍNH CẤP VÀ ĐỘC TÍNH BÁN TRƯỜNG DIỄN CỦA NỌC ONG TRÊN ĐỘNG VẬT THỰC NGHIỆM 59 II.4.1 Đánh giá độc tính cấp nọc ong chuột nhắt trắng 60 II.4.1.1 Nguyên liệu đối tượng nghiên cứu 60 II.4.1.2 Phương pháp nghiên cứu 60 II.4.1.3 Kết nghiên cứu .60 II.4.2 Đánh giá độc tính bán trường diễn nọc ong chuột cống trắng .61 II.4.2.1 Nguyên liệu đối tượng nghiên cứu 61 II.4.1.2 Phương pháp nghiên cứu 61 II.4.2.3 Kết nghiên cứu .62 II.5 NGHIÊN CỨU ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG CHỐNG VIÊM KHỚP, GIẢM ĐAU CỦA NỌC ONG TRÊN ĐỘNG VẬT THỰC NGHIỆM 68 II.5.1 Nguyên liệu đối tượng nghiên cứu 69 II.5.2 Phương pháp gây viêm khớp sử dụng thuốc, nọc ong điều trị 69 II.5.3 Phương pháp đánh giá mức độ viêm đau khớp 71 CHƯƠNG III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN CHƯƠNG IV KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ TÀI LIỆU THAM KHẢO 92 DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH CƠNG BỐ VÀ ĐÀO TẠO 96 DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT MCD peptide : Mast Cell Degranulating peptide PLA2 : Phospholipase A2 TFA : Acid trifluoroacetic TEA : Triethylamine HPLC : High Performance Liquid Chromatography (Sắc kí lỏng hiệu cao) MS : Mass spectrometry LOD : Limit of detection (Giới hạn phát hiện) LOQ : limit of quantitation (Giới hạn định lượng) RSD : Relative Standard Deviation (Độ lệch chuẩn tương đối) DĐVN IV : Dược điển Việt Nam IV LD50 : Liều lượng hoạt chất có khả gây chết 50% số cá thể nghiên cứu LYM : Thơng số phân tích huyết học Lymphocyte MID : Thơng số phân tích huyết học Mid-Sized Cell GRAN : Thơng số phân tích huyết họcGranulocyte 10 PHỤ LỤC 3: Khảo sát số lần chiết suất nọc ong ngày (40 phút/5 lần/5 khung giờ/1 ngày) Ký hiệu thùng ong 07h-9h 9h-11h 11h-13h 13h-15h 15-17h 12,50 18,26 1,93 5,23 7,42 6,24 20,36 4,25 7,26 3,95 10,50 22,02 2,36 8,03 2,20 9,52 20,65 1,65 7,25 3,56 6,01 22,80 2,36 5,23 5,52 8,45 23,56 4,99 5,25 2,36 6,32 22,93 1,20 2,65 5,98 TB 5,02 8,07 ± 3,26 17,82 21,05 ± 2,56 1,98 2,59 ± 1,26 4,46 5,67 ± 2,37 9,25 5,03 ± 2,47 Khối lượng nọc ong (mg) PHỤ LỤC 4: Khảo sát sản lượng mật thu trình chiết xuất nọc ong STT 10 TB Sau tuần chiết xuất (lít) Blank Mẫu 3,8 3,8 3,9 4,2 4,2 3,6 4,6 4,1 4,3 4,0 4,5 4,6 4,0 4,3 3,9 3,9 3,7 3,9 4,5 4,2 4,1 ± 4,1 ± 0,3 0,3 Sau tuần chiết xuất (lít) Blank Mẫu 4,0 4,2 3,9 4,6 4,2 4,3 4,8 4,2 4,3 4,6 4,2 4,1 4,4 3,6 3,8 3,7 4,5 3,9 4,2 4,1 4,2 ± 4,1 ± 0,3 0,3 Sau tuần chiết xuất (lít) Blank Mẫu 4,3 4,3 3,8 4,1 3,9 4,2 3,8 4,0 4,2 3,6 4,2 4,5 4,2 4,2 4,6 4,2 3,8 3,8 4,5 3,3 4,1 ± 4,0 ± 0,3 0,4 Sau tuần chiết xuất (lít) Blank Mẫu 3,9 4,0 4,2 4,0 4,2 4,3 4,6 4,2 4,2 3,8 4,3 3,9 4,8 3,8 3,5 4,2 3,9 4,1 3,9 4,6 4,2 ± 4,1 ± 0,4 0,2 PHỤ LỤC 5: Dữ liệu số khảo sát độ Apamin PLA2 Melittin S T T Cthêm chuẩn (µg/mL) Sthêm chuẩn vào mẫu (mV.s) Cthêm chuẩn (µg/mL) Sthêm chuẩn vào mẫu (mV.s) Cthêm chuẩn (µg/mL) Sthêm chuẩn vào mẫu (mV.s) 1.5 173569 25 674589 45 17489758 1.5 174625 25 688965 45 17625482 1.5 173986 25 698546 45 17523654 229496 30 923654 50 19408498 235469 30 888654 50 19532546 237402 30 896545 50 19568542 2.5 295478 35 1125462 55 21427238 2.5 295430 35 1123554 55 21354236 2.5 290243 35 1095324 55 21185463 PHỤ LỤC 6: Dữ liệu số khảo sát độ lặp lại STT C nọc ong (µg/mL) SApamin (mV.s) SPLA2 (mV.s) SMelittin (mV.s) 100 256340 301088 19610269 100 255904 303206 19583623 100 257817 298848 19639753 100 258971 295154 19472848 100 258601 303219 19548053 100 258089 288661 19529952 PHỤ LỤC 7: Dữ liệu số khảo sát độ xác trung gian STT C nọc ong (µg/mL) SApamin (mV.s) SPLA2 (mV.s) SMelittin (mV.s) 100 256081 298481 19655141 100 256508 295218 19673848 100 257484 303415 19581875 100 258196 301776 19640771 100 257379 295214 19607117 100 256474 304180 19529952 PHỤ LỤC 8: Phương pháp xác định hàm lượng thành phần nọc ong Phương pháp tính tốn hàm lượng thành phần apamin, PLA2, melittin phụ thuộc vào đường tuyến tính tỉ lệ thành phần với chất nội chuẩn isulin Từ bảng số liệu 16.1, tiến hành xây dựng đường chuẩn tỉ lệ thành phần apamin, PLA2, melittin với chất nội chuẩn insulin (Hình 16.1) Dựa vào kết này, thực phép tính tốn tương tự để hàm lượng xác thành phần Bảng 15.1: Số liệu xây dựng đường chuẩn tỉ lệ thành phần apamin, PLA2, melittin với chất nội chuẩn insulin Apamin PLA2 Melittin tR (phút) SApa (mV.s) SIns (mV.s) SApa/SIns 0,12 10399 10487 0,99 0,24 29952 10636 2,82 0,72 73354 10459 7,01 1,2 141692 10504 13,49 2,4 281105 10563 26,61 4,8 563641 10495 53,71 tR (phút) SMel (mV,s) SPLA2/SIns 10 134683 SIns (mV,s) 10369 15 309848 25 687272 35 1089753 60 2095520 100 3642249 tR (phút) SMel (mV,s) 2,5 658354 7,5 2148465 15 5383632 30 11409521 60 24202039 100 25664930 10486 10498 10689 10544 10368 SIns (mV,s) 10478 10548 10268 10556 10879 10548 12,84 29,13 65,71 103,75 198,38 347,05 SMel/SIns 62,78 202,00 514,74 1086,21 2291,21 2433,71 Hình 15.1 Phương trình đường chuẩn tỉ lệ thành phần nọc ong với insulin PHỤ LỤC 9: Dữ liệu số phân tích hàm lượng thành phần mẫu nọc ong Mẫu nọc ong (100 µg/mL) S1 (mV.s) S2 (mV.s) S3 (mV.s) SIns (mV.s) S1/SIns S2/SIns S3/SIns Chuẩn Sigma 312546 298456 290025 10356 30,18 28,82 28,01 Giồng Trôm (BT) 256081 256508 257484 9658 26,51 26,56 26,66 235265 245876 235545 9521 24,71 25,82 24,74 Bình Đại (BT) 302456 276543 314938 10998 27,50 25,14 28,64 Vĩnh Linh (QT) 354524 342513 324520 10325 34,34 33,17 31,43 Chuẩn Sigma 120215 135425 140724 10356 11,61 13,08 13,59 Giồng Trôm (BT) 298480 295218 303415 9658 30,90 30,57 31,42 158263 148212 171052 9521 16,62 14,31 16,52 Bình Đại (BT) 230265 229565 264713 10998 20,94 22,17 25,56 Vĩnh Linh (QT) 207224 188546 200560 10325 20,07 18,21 19,37 Thạnh Hóa (LA) Thạnh Hóa (LA) Apamin PLA2 Chuẩn Sigma 19645632 19746892 19672361 10356 1897,03 1906,81 1899,61 Giồng Trôm (BT) 19655141 19673848 19581875 9658 2035,12 2037,05 2027,53 19325615 19432545 19495191 9521 2029,79 2041,02 2047,60 Bình Đại (BT) 20932546 21120211 21045570 10998 1903,30 1920,37 1913,58 Vĩnh Linh (QT) 19925632 20012543 20180492 10325 1929,84 1938,26 1954,53 Thạnh Hóa (LA) Melittin PHỤ LỤC 10: Phương pháp tính tốn xây dựng đường chuẩn theo phương pháp lan truyền sai số Với n: số điểm đường chuẩn ● Các hệ số a, b ● Phương sai dư ● Độ lệch chuẩn cho hệ số hồi quy a, b ● Khoảng tin cậy hệ số a, b ● Vậy phương trình đường chuẩn là: b PHỤ LỤC 11: Số liệu thực nghiệm xác định độ ẩm nọc ong STT mbì (g) 56,2396 mbì + mẫu (g) mbì + mẫu sau làm khô Độ ẩm (%) 57,2556 57,2156 3,94 55,0786 56,1316 56,0856 4,37 54,0279 55,0309 54,9919 3,89 PHỤ LỤC 12: Số liệu thực nghiệm xác định độ tro toàn phần STT mbì (g) mbì + mẫu (g) mbì + mẫu sau nung Độ tro toàn phần (%) 26,8146 27,8326 26,8282 1,34 27,5102 28,6069 27,5204 0,93 20,0355 21,0266 20,0466 1,12 PHỤ LỤC 13: Khảo sát độ tinh khiết mẫu Tiến hành phân tích mẫu nồng độ 100 µg mL-1, kết trình bày Mẫu Stổng (mV.s) Stạp chất (mV.s) Độ tinh khiết (%) Vĩnh Linh – Quảng Trị 82319192 232637 99,72 Thạnh Hóa – Long An 76270846 272814 99,68 Giồng Trôm – Bến Tre 87025162 100 Bình Đại – Bến Tre 84658213 100 PHỤ LỤC 14: Kết phân tích độ ổn định nọc ong Dữ liệu phân tích thành phần apamin, PLA2, melittin mẫu nọc ong sau lọc, lưu giữ điều kiện -4oC nồng độ 100 µg/mL Thành phần Apamin PLA2 Melittin Thời gian lưu giữ (ngày) S1 (mV.s) S2 (mV.s) S3 (mV.s) SIns (mV.s) S1/SIns S2/SIns S3/SIns Hàm lượng (%m/m) 256081 256508 257484 9658 26,51 26,56 26,66 2,392 ± 0,016 265896 268745 258963 10265 25,90 26,18 25,23 2,32 ± 0,10 265420 268254 2654186 10546 25,17 25,44 25,17 2,274 ± 0,032 30 260245 246586 250458 9985 26,06 24,70 25,08 2,28 ± 0,15 180 240365 235448 245698 9987 23,42 22,94 23,94 2,11 ± 0,10 360 235465 223644 229856 10265 22,94 21,79 22,39 2,02 ± 0,12 298480 295218 303415 9658 30,90 30,57 31,42 15,33 ± 0,27 316542 325465 326545 10265 30,84 31,71 31,81 15,47 ± 0,34 321542 310265 302154 10546 30,49 30,23 29,44 15,09 ± 0,35 30 286564 279654 286546 9985 28,70 27,24 27,91 14,53 ± 0,46 180 254876 268956 268445 9985 25,53 26,20 26,15 13,99 ± 0,24 360 226548 226985 216548 10265 22,07 22,11 21,10 12,87 ± 0,36 19655141 19673848 19581875 9658 2035,12 2037,05 2027,53 54,38 ± 0,31 22021252 21876954 20212542 10265 2145,28 2131,22 1969,07 55,6 ± 6,0 21548756 20154989 21102144 10546 2043,31 1911,15 2000,96 53,1 ± 4,1 30 18965644 19684575 19325687 9985 1899,41 1971,41 1935,47 51,8 ± 2,2 180 17854625 17254695 17854625 9985 1788,14 1728,06 1788,14 47,5 ± 2,1 360 16854876 16985472 15623564 10265 1641,98 1654,70 1522,02 43,3 ± 4,5 PHỤ LỤC 15: Phương pháp tính đánh giá độc tính cấp nọc ong chuột nhắt trắng Lô - Liều dùng (mg/kg) 12 16 20 24 28 32 Số chuột thử (ni) 8 8 8 Số chuột chết (ri) Số chuột sống (si) 2 Tích số risi 12 16 12 14 - zi=2k-1-2i - Tích số rizi 14 20 18 - LD50 tính theo phương pháp xác định độc tính thuốc21 ta có: (trong d bước nhảy, n số vật có lô, k số lô thử, ri số chuột chết lô i, i giá trị chạy từ tới k-1) Do LD50= 32 - 4/2 – 4/8 x 19 = 20.5 mg/kg Vậy ta có: LD50 = 20,5 mg/kg - Sai số chuẩn LD50 SE (trong d bước nhảy, n số vật có lơ, ri số chuột chết, si số chuột sống lô i, i giá trị chạy từ tới k-1) Vậy LD50 = 20,5 ± 1,39 mg/kg - Giới hạn tin cậy LD50 Khoảng tin cậy µ = Như giới hạn tin cậy là: Ld = LD50- µ = 20,5 – 2,96 = 17,54 mg/kg Lt = LD50+ µ = 20,5 – 2,96 = 23,46 mg/kg Cuối cùng: LD50 = 20,5 (17,54 ÷ 23,46) mg/kg p=0,05