Tiêu chuẩn hóa cao chiết lạc tiên tây passiflora incarnata l và khảo sát tác dụng chống stress

ỦY BAN NHÂN DÂN TP.HCM THÀNH ĐOÀN TP.HCM SỞ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ TRUNG TÂM PHÁT TRIỂN THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ TRẺ BÁO CÁO NGHIỆM THU Đề tài: TIÊU CHUẨN HÓA CAO CHIẾT LẠC TIÊN TÂY (PASSIFLORA INCARNATA L.) VÀ KHẢO SÁT TÁC DỤNG CHỐNG STRESS Chủ nhiệm đề tài: CN Đào Trần Mộng THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH THÁNG 5/2016 ỦY BAN NHÂN DÂN TP.HCM SỞ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ BÁO CÁO NGHIỆM THU Đề tài: TIÊU CHUẨN HÓA CAO CHIẾT LẠC TIÊN TÂY (PASSIFLORA INCARNATA L.) VÀ KHẢO SÁT TÁC DỤNG CHỐNG STRESS Chủ nhiệm đề tài: CN Đào Trần Mộng CƠ QUAN QUẢN LÝ CƠ QUAN CHỦ TRÌ (Ký tên/đóng dầu xác nhận) (Ký tên/đóng dầu xác nhận) THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH THÁNG 5/2016 TĨM TẮT NỘI DUNG NGHIÊN CỨU TIÊU CHUẨN HÓA CAO CHIẾT LẠC TIÊN TÂY (PASSIFLORA INCARNATA L.) VÀ KHẢO SÁT TÁC DỤNG CHỐNG STRESS Đề tài tiến hành thực tiêu chuẩn sở dược liệu cao chiết Lạc tiên tây, tiêu chuẩn hóa cao chiết nước tiềm theo DĐVN IV đạt yêu cầu tiêu “mất khối lượng làm khơ”, “tro tồn phần”, “giới hạn kim loại nặng”, “giới hạn nhiễm khuẩn” Hàm lượng flavonoid tổng theo chuẩn isovitexin nguyên liệu 0,48% cao chiết nước 1,04% Thực nghiệm giấc ngủ gây pentobarbital thực nghiệm co giật gây pentylentetrazol sử dụng để sàng lọc cao chiết tiềm Cao chiết nước, cao chiết cồn 45% cao chiết cồn 70% cho uống với liều tương đương với 2,5 g g dược liệu Kết thực nghiệm cho thấy cao chiết Lạc tiên tây giảm mức độ co giật gây pentylentetrazol, nhiên có lô uống cao chiết nước Lạc tiên tây liều 1,52 g/kg có giá trị điểm trung bình co giật giảm khác biệt đạt ý nghĩa thống kê so với lô chứng, tương tự diazepam (liều mg/kg), thể tác dụng chống co giật Các lô uống cao chiết Lạc tiên tây liều tương đương g dược liệu/kg kéo dài thời gian ngủ chuột thực nghiệm giấc ngủ gây pentobarbital, tương tự diazepam, thể tác dụng an thần Từ kết thực nghiệm chọn cao chiết nước cao chiết tiềm cho thực nghiệm mơ hình chuột stress Đề tài khảo sát tác dụng chống stress cao chiết nước Lạc tiên tây mơ hình chuột stress lập qua thực nghiệm buồng sáng tối thực nghiệm giấc ngủ gây pentobarbital Kết thực nghiệm cho thấy cao chiết nước Lạc tiên tây liều 0,76 g/kg 1,52 g/kg có tác dụng giảm tiềm thời ngăn sáng, tăng thời gian lưu lại buồng sáng thực nghiệm buồng sáng tối kéo dài thời gian ngủ thực nghiệm giấc ngủ gây pentobarbital, tương tự diazepam I SUMMARY OF RESEARCH CONTENT STANDARDIZATION AND ANTI – STRESS STUDIES ON PASSIFLORA INCARNATA L EXTRACT This study made basic standardization of P.incarnata leaves and buds extracts P.incarnata aqueous extract were standardized based on Vietnamese Pharmacopeia IV which meet requirement about “loss on drying”, “total ash”, “microbial quality” and “heavy metals” Total flavonoid contents quantified following isovitexin were 48% for raw materials and 1,04% for P.incarnata aquaous extract Pentylentetrazole – induced convulsant test and pentobarbital – induced sleep test were used for screening study on potential extract Aqueous extract and 45% or 70% ethanol extracts were oral administered at the doses equivalent to 2.5 g and g of raw materials The results showed that P.incarnata extracts decreased seizure scores average caused by pentylentetrazole in which aqueous extract showed significant anti – convulsant effect which was similar to that of diazepam (2 mg/kg) P.incarnata extracts at doses equivalent to g of raw material as well as diazepam (0.5 mg/kg) prolonged sleeping time caused by pentobarbital, indicating the sedative effect Therefore, P.incarnata aqueous extract was choosen as potential extract This study investigated anti – stress of P.incarnata aqueous extract on social isolation stress mice model based on pentobarbital – induced sleep test and light/dark box test The results showed that P.incarnata aqueous extract at the doses of 0.76 g/kg and 1.52 g/kg reduced the entering latency to light area (chamber), increased the amount of time spent in the light area (or chamber) and prolonged sleeping time caused by pentobarbital, similar diazepam This study demonstrated that P.incarnata aquaous extract have anti – stress and anti – anxiety effects II MỤC LỤC TÓM TẮT NỘI DUNG NGHIÊN CỨU i DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT vii DANH SÁCH BẢNG viii DANH MỤC SƠ ĐỒ viii DANH SÁCH HÌNH ix PHẦN MỞ ĐẦU TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan Lạc tiên tây (Passiflora incarnata L.) 1.2 Tổng quan stress Sơ lược stress Các mơ hình gây stress thực nghiệm 10 1.3 Mơ hình thử nghiệm dược lý thần kinh liên quan đến stress 12 Thực nghiệm buồng sáng tối (Light/ Dark box test) 12 Thực nghiệm giấc ngủ gây pentobarbital 13 1.4 Một số thuốc dùng trình thực nghiệm 13 Diazepam 13 Pentylentetrazol 14 Pentobarbital 14 Nội dung phương pháp nghiên cứu 16 2.1 Nguyên vật liệu hóa chất, thiết bị 17 Nguyên vật liệu 17 Động vật nghiên cứu 17 Thiết bị, dụng cụ hóa chất .18 III 2.2 Tiêu chuẩn hóa dược liệu .20 Xác định khối lượng làm khô 20 Xác định độ tro 20 Định tính flavonoid 21 Định lượng flavonoid theo chuẩn isovitexin phương pháp quang phổ UV – Vis 22 Sản phẩm nội dung cần đạt 23 2.3 Chiết dược liệu .23 Chiết dược liệu phương pháp sắc hãm 23 Chiết dược liệu phương pháp ngấm kiệt 24 Mất khối lượng làm khô, độ tro cao chiết Lạc tiên tây 24 Sản phẩm nội dung cần đạt 24 2.4 Sơ thành phần hóa thực vật .24 2.5 Khảo sát độc tính cấp đường uống cao chiết Lạc tiên tây .26 2.6 Sàng lọc tác dụng hệ thần kinh trung ương cao chiết Lạc tiên tây……… .27 Thực nghiệm co giật gây pentylentetrazol (PTZ) .27 Thực nghiệm giấc ngủ gây pentobarbital 29 Nội dung sản phẩm cần đạt 29 2.7 Tiêu chuẩn hóa cao chiết tiềm .30 Xác định giới hạn kim loại nặng 30 Thử giới hạn nhiễm khuẩn 30 Sản phẩm nội dung cần đạt 30 2.8 Khảo sát tác dụng chống stress cao chiết tiềm .31 IV Khảo sát tác dụng giải lo âu mơ hình buồng sáng tối .31 Khảo sát ảnh hưởng giấc ngủ gây pentobarbital 32 2.9 Đánh giá kết 33 Kết bàn luận 34 3.1 Tiêu chuẩn hóa dược liệu .34 Mất khối lượng làm khô .34 Độ tro 34 Định tính flavonoid 35 Định lượng flavonoid phương pháp quang phổ UV – Vis theo chuẩn isovitexin .37 3.2 Chiết xuất .39 Hiệu suất chiết 39 Mất khối lượng làm khô .39 Độ tro 40 3.3 Kết phân tích sơ thành phần hóa thực vật 41 3.4 Khảo sát độc tính cấp đường uống cao chiết Lạc tiên tây .42 3.5 Sàng lọc tác dụng hệ thần kinh trung ương cao chiết Lạc tiên tây……… .42 Thực nghiệm co giật gây pentylentetrazol 42 Thực nghiệm giấc ngủ gây pentobarbital 43 Bàn luận chung 44 Kết luận 44 Kết sàng lọc cao chiết tiềm 45 3.6 Tiêu chuẩn hóa cao chiết tiềm .45 V Kết chiết xuất dược liệu 45 Mất khối lượng làm khô .46 Độ tro 47 Giới hạn kim loại nặng 47 Thử giới hạn nhiễm khuẩn 48 Định tính flavonoid 49 Định lượng flavonoid theo chuẩn isovitexin phương pháp quang phổ UV – Vis 50 3.7 Khảo sát tác dụng chống stress cao chiết tiềm .51 Khảo sát tác dụng giải lo âu mơ hình buồng sáng tối .51 Khảo sát ảnh hưởng giấc ngủ gây pentobarbital 52 Bàn luận chung 53 Kết luận 55 Kết luận kiến nghị 56 4.1 Kết luận 56 4.2 Kiến nghị 56 PHỤ LỤC Phụ lục Bảng tiêu chuẩn kỹ thuật dược liệu Lạc tiên tây cảu công ty Hồng Đài Việt Phụ lục Bảng kết kiểm nghiệm giới hạn kim loại nặng viện Khoa học & Công nghệ Phụ lục Tiêu chuẩn sở đề nghị cho cao chiết nước từ đọt non Lạc tiên tây TÀI LIỆU THAM KHẢO VI DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT VIẾT TẮT THUẬT NGỮ TIẾNG VIẾT 3α, 5α – THP 3α, 5α – tetrahydroprogesteron ACTH Adrenocorticotropic hormon AMPA α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic acid BDNF Brain – Derived Neurotrophic Factors CMS Chronic mild stress CRH Corticotropin-releasing hormon EPM Elevated Plus Maze GMP Guanosine monophosphat ICW Immersion in cold water HPA Hypothalamic-pituitary-adrenal TPH2 Tryptophan Hydroxylase PNCs Parvocellular neuroendocrine cells PTSD Post-traumatic stress disorder PTZ Pentylenetetrezol PTX Picrotoxin PTSD Post-traumatic stress disorder VGLUT1 Vesicular glutamate transporter VII DANH SÁCH BẢNG SỐ TÊN BẢNG TRANG 2.1 Danh sách thiết bị dụng cụ sử dụng thực nghiệm 18 2.2 Danh sách hóa chất, thuốc thử dùng thực nghiệm 19 2.3 Phân tích sơ thành phần hóa thực vật 25 2.4 2.5 2.6 2.7 Bố trí thí nghiệm thực nghiệm co giật gây pentylentetrazol Bố trí thí nghiệm thực nghiệm giấc ngủ gây pentobarbital Bố trí thí nghiệm thực nghiệm giải lo âu mơ hình sáng tối chuột stress Bố trí thí nghiệm thực nghiệm giấc ngủ gây pentobarbital chuột stress 27 29 32 32 3.1 Mất khối lượng làm khô dược liệu Lạc tiên tây 34 3.2 Độ tro dược liệu Lạc tiên tây 34 3.3 3.4 Kết đo OD340nm chất chuẩn isovitexin nồng độ khác Giá trị OD hàm lượng flavonoid tổng tính theo chuẩn isovitexin mẫu dược liệu Lạc tiên tây 37 38 3.5 Hiệu suất chiết cao toàn phần 39 3.6 Mất khối lượng làm khô cao chiết Lạc tiên tây 39 3.7 Độ tro cao chiết Lạc tiên tây 40 3.8 3.9 3.10 Kết phân tích thành phần hóa thực vật dược liệu cao chiết Lạc tiên tây Kết thử độc tính liều an tồn cao chiết Lạc tiên tây Tác dụng cao chiết Lạc tiên tây thực nghiệm co giật gây pentylentetrazol VIII 41 42 43 isovitexin, chrysin, apigenin, luteolin scopoletin); benzoflavon có ba nhóm [26], [16] Acid glutamic chất dẫn truyền thần kinh kích thích quan trọng, tiền thân chất dẫn truyền thần kinh ức chế GABA Hơn neuron não chứa glutamat, chứa GABA, chất dẫn truyền thần kinh Sự cân hai hệ thống miêu tả chế kiểm soát quan trọng hệ thần kinh trung ương Sự hoạt hóa thụ thể GABAA trước synap làm giảm dòng ion Ca2+ cảm ứng khử dẫn đến ức chế phóng thích glutamat, thụ thể metabotropic GABAB trước synap có nhiệm vụ phóng thích acid glutamic GABA từ đoạn cuối trước synap Sự kích thích thụ thể GABAA GABAB tạo tác dụng bảo vệ thần kinh cân hệ thống acid glutamic/GABA cofactor quan trọng nhiều bệnh liên quan đến hệ thần kinh trung ương, bao gồm trầm cảm, lo âu, ngủ Sự kích thích thụ thể GABAA có tác dụng giải lo âu [30] Các nghiên cứu thực nghiệm mơ hình mê cung chữ thập nâng cao mơ hình hộp sáng tối Lạc tiên tây có GABA chrysin với chế tác động tương tự diazepam có tác dụng điều chỉnh rối loạn lo âu biểu qua việc tăng thời gian ngăn sáng [23] Ngồi ra, có mặt β–caboline alkaloid có hoạt tính ức chế monoamino oxidase (monoamin oxidase–A inhibitor), tăng giải phóng serotonin cũng làm giảm đáng kể trạng thái lo âu [18] Nghiên cứu Elsas SM cộng [26] cũng xác định có diện tryptophan, tiền chất sinh tổng hợp serotonin Lạc tiên tây Thực nghiệm sáng tối thực nghiệm kinh điển để đánh giá tác dụng giải lo âu thuốc [18] Các thuốc thuộc nhóm benzodiazepin diazepam rút ngắn tiềm thời vào vùng sáng, làm tăng hoạt động khám phá - tò mò vùng sáng làm giảm thời gian lưu lại vùng tối súc vật thử nghiệm xem nhóm thuốc có tác dụng giải lo âu điển hình Nghiên cứu gần cho thấy cao Lạc tiên tây có tác dụng giải lo âu chuột bình thường thông qua việc làm tăng tổng thời gian buồng sáng [7] Lô chuột stress uống cao chiết nước Lạc tiên tây sau ngày 14 thể tác dụng tương tự diazepam, làm tăng hoạt động khám phá - tò mò vùng sáng, giảm tình trạng lo lắng bị gia tăng stress lập 54 Một nghiên cứu khả cải thiện trí nhớ, giảm stress tác động lên dẫn truyền thần kinh chuột chứng minh suy yếu acid glutamic nhóm chuột sử dụng dịch chiết Lạc tiên tây Một nghiên cứu tương tự thực nghiệm giấc ngủ gây pentoparpital cho thấy dịch chiết nước Lạc tiên tây có tác dụng an thần liều 400 800 mg/kg [47] Nghiên cứu Elsas SM cộng thực chuột nhắt bình thường xác định cao chiết Lạc tiên tây thể tác dụng lên hệ thần kinh trung ương, làm kéo dài giấc ngủ gây pentobarbital [4] Trong nghiên cứu này, cao chiết Lạc tiên tây thể tác dụng tương tự diazepam mơ hình chuột stress lập, điều hịa hoạt động phức hợp GABAA, tạo nên thay đổi hành vi chuột bị stress như: phục hồi lại thời gian ngủ bị rút ngắn, giảm thời gian bất động chuột stress mức tương đương với chuột bình thường Kết luận Cao chiết nước Lạc tiên tây có tác dụng giải lo âu, chống stress gây stress tâm lý 55 Kết luận kiến nghị 4.1 - Kết luận Đã tiến hành tiêu chuẩn hóa nguyên liệu cao chiết Lạc tiên tây, đạt tiêu chuẩn DĐVN IV đưa tiêu chuẩn sở cho cao chiết tiềm cao chiết nước - Khảo sát độc tính cấp cho liều Dmax cao chiết nước, cao chiết cồn 45% cao chiết cồn 70% 29,44 (g/kg); 37,01 (g/kg) 23,36 (g/kg) Suy liều an toàn cho thử nghiệm dược lý cao chiết nước (0,76 1,52 g/kg); cao chiết cồn 45% (0,89 1,78 g/kg); cao chiết cồn 70% (0,77 1,54 g/kg) - Trong thực nghiệm có giật gây pentylentetrazol có cao nước Lạc tiên tây liều 1,52 g/kg thể tác dụng chống co giật gây pentylentetrazol Trong thực nghiệm giấc ngủ gây pentobarbital cho thấy cao chiết nước liều 1,52g/kg, cao chiết cồn 45% liều 1,78 g/kg cao chiết cồn 70% liều 1,54 g/kg có tác dụng hiệp lực với pentobarbital, làm tăng thời gian ngủ gây pentobarbital Từ kết thực nghiệm chọn cao chiết nước liều 0,76 g/kg 1,52 g/kg cao chiết tiềm năng, dùng tiếp thực nghiệm mơ hình chuột stress lập - Cao chiết nước Lạc tiên tây liều 0,76 g/kg 1,52 g/kg có tác dụng giảm tiềm thời ngăn sáng, tăng thời gian lưu lại buồng sáng thực nghiệm buồng sáng tối kéo dài giấc ngủ thực nghiệm giấc ngủ gây pentobarbital, tương tự diazepam Điều chứng minh cao chiết nước Lạc tiên tây có tác dụng giải lo âu, chống stress 4.2 Kiến nghị Nếu đề tài tiếp tục nghiên cứu - ứng dụng, tiến hành thực nghiên cứu sau:  Tiến hành định lượng phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) chất chuẩn isovitexin  Xác định phân đoạn chứa hoạt chất Lạc tiên tây  Nghiên cứu chế chống stress, giải lo âu Lạc tiên tây 56  Ứng dụng phát triển cao thuốc từ bán thành phẩm lên thành phẩm để ứng dụng rộng rãi lĩnh vực chăm sóc sức khỏe cộng đồng  Tiến hành nghiên cứu lâm sàng tác dụng dược lý có khả điều trị hỡ trợ điều trị bệnh 57 PHỤ LỤC Phụ lục Bảng tiêu chuẩn kỹ thuật dược liệu Lạc tiên tây cảu công ty Hồng Đài Việt Phụ lục Bảng kết kiểm nghiệm giới hạn kim loại nặng viện Khoa học & Công nghệ Từ kết thực nghiệm trên, đề nghị TCCS cho cao chiết từ đọt non Lạc tiên tây (Passiflora incarnata L.) chi tiết mẫu sau: Phụ lục Tiêu chuẩn sở đề nghị cho cao chiết nước từ đọt non Lạc tiên tây VIỆN DƯỢC LIỆU Trang: 1/5 TIÊU CHUẨN CƠ SỞ SỐ TIÊU CHUẨN: TRUNG TÂM SÂM VÀ DƯỢC LIỆU TP.HCM (Đề nghị) TCCS : 2016/ CAOCN CÓ HIỆU LỰC TỪ: NGÀY THÁNG NĂM 2016 CAO CHIẾT LÁ VÀ ĐỌT NON LẠC TIÊN TÂY Tiêu chuẩn áp dụng cho cao chiết nước từ đọt non Lạc tiên tây cung cấp công ty TNHH TM Hồng Đài Việt YÊU CẦU KỸ THUẬT 1.1 Định nghĩa: Chế phẩm dạng cao đặc chiết xuất với dung môi nước phương pháp sắc hãm từ dược liệu đọt non Lạc tiên tây (Passiflora incarnata L.) 1.2 Tiêu chuẩn nguyên liệu: Đạt tiêu chuẩn sở 1.3 Các tiêu chất lượng chủ yếu: 1.3.1 Tính chất: Khối sệt dẻo, có màu nâu đen, có mùi thơm dược liệu 1.3.2 Mất khối lượng làm khô: Không 20% 1.3.3 Tro tồn phần: Khơng q 30% 1.3.4 Định tính: Cho phản ứng màu đặc trưng với thuốc thử định tính flavonoid: Phản ứng với NaOH 10% cho màu đậm dịch chiết ban đầu, phản ứng với dung dịch sắt (III) clorid 5% cho màu xanh đen, phản ứng vói thuốc thử cyanidin cho màu đỏ đậm Thể sắc đồ sắc ký lớp mỏng có vết có Rf tương ứng với isovitexin 1.3.5 Định lượng: Hàm lượng flavonoid tính theo chuẩn isovitexin: Khơng 0,9% tính theo cao khơ tuyệt đối 1.3.6 Giới hạn độ nhiễm khuẩn: Tổng số vi khuẩn hiếu khí sống lại được: Không 5.104 vi khuẩn sống lại 1g (ml) chế phẩm Tổng số vi nấm – nấm mốc: Không 500 g (ml) chế phẩm Trang: 2/5 TIÊU CHUẨN CƠ SỞ SỐ TIÊU CHUẨN: TCCS : 2016/ CAOCN TRUNG TÂM SÂM VÀ CÓ HIỆU LỰC TỪ: (Đề nghị) DƯỢC LIỆU TP.HCM NGÀY THÁNG NĂM 2016 VIỆN DƯỢC LIỆU CAO CHIẾT LÁ VÀ ĐỌT NON LẠC TIÊN TÂY Tổng số Enterobacteria sp.: Không 500 g (ml) chế phẩm Khơng có Escherichia coli, Salmonella sp., Pseudomonas aeruginosa Staphylococcus aureus g (ml) chế phẩm 1.3.7 Giới hạn tối đa hàm lượng kim loại nặng Hàm lượng kim loại nặng (Asen, Cadimi, chì, thủy ngân, đồng): Khơng q 10 ppm PHƯƠNG PHÁP THỬ 2.1 Tính chất: Thử cảm quan 2.2 Mất khối lượng làm khô: Theo Dược điển Việt Nam IV-Phụ lục 9.6, PL-182 2.3 Tro toàn phần: Theo Dược điển Việt Nam IV-Phụ lục 9.8, PL-183 2.4 Định tính 2.4.1 Định tính flavonoid phản ứng màu Cân 0,5 g cao chiết hòa với 20 ml ethanol (TT), chiết siêu âm 15 phút Lọc bỏ phần khơng tan, dịch lọc đến cắn Hịa cắn với 15 ml ethanol 45% (TT), sau đó, thu dịch lọc chuẩn bị cho phản ứng hóa học Dựa vào phản ứng màu đặc trưng Phản ứng với kiềm: ml dịch chiết cồn + vài giọt natri hydroxid 10% (TT) Phản ứng với dung dịch sắt (III) clorid 5% (TT): ml dịch chiết cồn + vài giọt dung dịch sắt (III) clorid 5% (TT) Phản ứng với thuốc thử cyanidin: ml dịch chiết + với bột Magnesi + 0,5 ml acid hydroclorid (TT) đậm đặc VIỆN DƯỢC LIỆU Trang: 3/5 TIÊU CHUẨN CƠ SỞ SỐ TIÊU CHUẨN: TRUNG TÂM SÂM VÀ DƯỢC LIỆU TP.HCM (Đề nghị) TCCS : 2016/ CAOCN CÓ HIỆU LỰC TỪ: NGÀY THÁNG NĂM 2016 CAO CHIẾT LÁ VÀ ĐỌT NON LẠC TIÊN TÂY 2.4.2 Định tính flavonoid theo chuẩn isovitexin phương pháp sắc ký lớp mỏng Dung dịch chuẩn: Hoà tan 0,5 mg isovitexin (TT) ml methanol (TT) để dung dịch chuẩn có chứa 0,5 mg/ml Chiết xuất flavonoid: Cân xác 0,5 g cao chiết, hòa với 20 ml nước cất, lắc phân bố với ether ethylic (TT) ba lần mỗi lần 20 ml để loại màu Dịch nước lắc phân bố với ethyl acetat (TT) đến dịch ethyl acetat khơng cịn cho màu xanh rêu đậm với dung dịch sắt (III) clorid 5% (TT) Gộp tất dịch ethyl acetat, cho bốc dung môi bếp cách thủy đến dịch ethyl acetat khoảng ml Lấy dịch cịn lại đem tiến hành định tính Cách tiến hành: Chấm riêng biệt lên mỏng silica gel F254 khoảng 20 - 50 l mỗi dịch chiết phân đoạn ethyl acetat dung dịch chuẩn Tiến hành triển khai hệ dung môi ethyl acetat – acid formic - nước (86 : : 9), để khô mỏng nhiệt độ phòng Quan sát ánh sáng tử ngoại bước sóng 254 nm 365 nm, sắc ký đồ dung dịch thử phải có vết phát quang màu nâu Hiện màu dung dịch sắt (III) clorid 5% (TT) methanol (TT) Sấy mỏng 100oC vết rõ Trên sắc đồ dung dịch thử phải có vết màu giá trị Rf với vết isovitexin chuẩn 2.5 Định lượng flavonoid tổng theo chuẩn isovitexin Dung dịch chuẩn: Cân xác 0,5 mg isovitexin (TT), hòa tan với 10 ml methanol (TT) bình định mức 10 ml (50 µg/ml) Sau đó, pha lỗng mẫu thành nồng độ 6; 8; 10; 12; 14; 80 µg/ml Trang: 4/5 TIÊU CHUẨN CƠ SỞ SỐ TIÊU CHUẨN: TCCS : 2016/ CAOCN TRUNG TÂM SÂM VÀ CÓ HIỆU LỰC TỪ: (Đề nghị) DƯỢC LIỆU TP.HCM NGÀY THÁNG NĂM 2016 VIỆN DƯỢC LIỆU CAO CHIẾT LÁ VÀ ĐỌT NON LẠC TIÊN TÂY Xây dựng đường chuẩn: Tiến hành đo quang mẫu dịch chuẩn mỗi nồng độ pha lỗng bước sóng 340 nm Mẫu thử: Chiết xuất mẫu tương tự phần 2.4.2 Phân đoạn ethyl acetat đến cắn thay cịn khoảng ml, hoà tan cắn với methanol (TT) bình định mức 10 ml, pha loãng mẫu tiến hành đo quang bước sóng 340 nm Hàm lượng phần trăm flavonoid (F %) tính theo isovitexin xác định cơng thức: F (%) = At × Cc × k Ac × a × 100 × (100 − A) Trong đó, At: Độ hấp thu dung dịch thử a: Khối lượng cao chiết (g) Ac: Độ hấp thu dung dịch chuẩn k: Độ pha loãng mẫu Cc: Nồng độ (μg/ml) dung dịch chuẩn A: Độ ẩm cao chiết (%) 2.6 Giới hạn độ nhiễm khuẩn: Theo Dược điển Việt Nam IV-Phụ lục 13.6, PL258-266 2.7 Giới hạn kim loại nặng: Theo Dược điển Việt Nam IV-Phụ lục 9.4.11, PL-179-180 2.8 Lấy mẫu-Bảo quản: Lấy mẫu theo Qui trình thao tác chuẩn hành Lượng mẫu để thử vi sinh: 20 g, để thử tiêu hóa lý: 30 g Chế phẩm đóng gói lớp bao bì PP PE Có nhãn ghi thơng tin chế phẩm: Một nhãn dán ngồi bao bì, nhãn cho vào hai lớp bao Bảo quản nơi khô mát TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT [1] [2] [3] [4] [5] [6] [7] Nguyễn Huy Công et al (2005), Dược liệu, Nhà xuất Y học Hà Nội, pp 24 Đàm Đỗ Trung (1996), Phương pháp xác định độc tính cấp thuốc NXB Y học Hà Nội Trần Hùng (2010), Bài giảng phương pháp nghiên cứu dược liệu, Đại học Y Dược thành phố Hồ Chí Minh, pp 126 Nguyễn Thị Thu Hương et al (2015), Tác dụng lên hệ thần kinh trung ương cao chiết từ và đọt non Lạc tiên tây di thực trồng tại Việt Nam, Tạp chí Dược liệu Bộ Y tế (2009), Dược điển Việt Nam IV, Nhà xuất Y học Hà Nội Nguyễn Thị Thu Hương et al (2005), Nghiên cứu số tác dụng dược lý sâm việt nam, Tạp chí Dược liệu, 10 (1), pp 27-32 Nguyễn Phương Dung et al (2014), Đánh giá tác dụng an thần giải lo âu cao cồn Lạc tiên tây (Passiflora incarnata L.) chuột nhắt trắng, Y học thành phố Hồ Chính Minh 18, pp 123-128 TÀI LIỆU TIẾNG ANH [8] [9] [10] [11] [12] [13] [14] Brown E et al (2007), Evaluation of the anxiolytic effects of chrysin, a Passiflora incarnata extract, in the laboratory rat, Association of Nurse Anesthetists Journal 75 (5), pp 333-337 A Speroni E and Minghetti (1988), Neuropharmacological Activity of Extracts from Passiflora incarnata, Planta Med 54 (06), pp 488-491 Abelaira H M Reus G Z , Quevedo J (2013), Animal models as tools to study the pathophysiology of depression, Rev Bras Psiquiatr 35 (2), pp 112120 Akhondzadeh S et al (2001), Passionflower in the treatment of opiates withdrawal: a double-blind randomized controlled trial, J Clin Pharm Ther 26 (5), pp 369-373 V Quercia at al (1978), Identification and determination of vitexin and isovitexin in Passiflora incarnata extracts, Journal of Chromatography 396 - 402 Alessandro Ieraci Alessandra Mallei, and Maurizio Popoli (2015), Social isolation stress induces anxious-depressive-like behavior and alterations of neuroplasticity-related genes in adult male mice, Hindawi Publishing Corporation 2016, pp 1-13 Appel K et al (2011), Modulation of the gamma-aminobutyric acid (GABA) system by Passiflora incarnata L, Phytother Res 25 (6), pp 838-843 [15] [16] [17] [18] [19] [20] [21] [22] [23] [24] [25] [26] [27] [28] [29] [30] Arthur Kimberly Ann (2002), Pentobarbital sleep time in mouse lines selected for resistance and susceptibility to fescue toxicosis, Master of Science Thesis, Virginia Polytechnic Institute and State University, pp 13 - 14 B Shrestha K Gauthaman et al (2009), Passiflora incarnata Linn: A phytopharmacological review, Original Article, pp 277-278 Bains J S et al (2015), Stress-related synaptic plasticity in the hypothalamus, Nat Rev Neurosci 16 (7), pp 377-388 Bourin M et al (2003), The mouse light/dark box test, Eur J Pharmacol 463 (1-3), pp 55-65 Brown E Hurd N S et al (2007), Evaluation of the anxiolytic effects of chrysin, a Passiflora incarnata extract, in the laboratory rat, AANA J 75 (5), pp 333-337 Campos A C et al (2013), Animal models of anxiety disorders and stress, Rev Bras Psiquiatr 35 Suppl 2, pp S101-111 Carratu B et al (2008), Free amino acids in botanicals and botanical preparations, J Food Sci 73 (5), pp C323-328 Dareuosh Shackebaei Md et al (2009), The effect of repeated diazepam administration on myocardial funtion in the ischemia - reperfused isolated rat heart, Saudi Med J 30 (6), pp 755 - 759 Dhawan K et al (2004), Passiflora: a review update, J Ethnopharmacol 94 (1), pp 1-23 Dr Chandrashekar R Prabhakar Adake et al (2013), Anticonvulsant activity of ethanolic extract of Acorus calamus rhizome in swiss albino mice, Journal of Scientific and Innovative Research (5), pp 846 - 851 E Costa A Guidotti, G Toffano (1978), Molecular mechanisms mediating the action of diazepam on GABA receptors, The British Journal of Psychiatry 133, pp 239 - 248 Elsas S.M Rossi D.J et al (2010), Passiflora incarnata L (Passionflower) extracts eclicit GABA currents in hippocampal neurons in vitro, and show anxiogenic and anticonvulsant effects in vivo, varying with extraction method, Phytomedicine 17 (12), pp 940-949 Grundmann O Wähling C et al (2009), Anxiolytic effects of a passion flower (Passiflora incarnata L.) extract in the elevated plus maze in mice, Die Pharmazie - An International Journal of Pharmaceutical Sciences 64 (1), pp 63-64 Grundmann O Wang J et al (2008), Anxiolytic activity of a phytochemically characterized Passiflora incarnata extract is mediated via the GABAergic system, Planta Med(74), pp 1769-1773 Jaggi A S et al (2011), A review on animal models for screening potential anti-stress agents, Neurol Sci 32 (6), pp 993-1005 Katarzyna Jawna-Zboińska Kamilla Blecharz-Klin et al (2016), Passiflora incarnataL Improves Spatial Memory, Reduces Stress, and Affects Neurotransmission in Rats, Phytotherapy Research [31] [32] [33] [34] [35] [36] [37] [38] [39] [40] [41] [42] [43] [44] [45] M D Cotrim I V Figueiredo et al (1998), Behavioural test to identify anxiolytic activity of drugs, ARQ Paltol, pp 29-32 Ma X C et al (2011), Social isolation-induced aggression potentiates anxiety and depressive-like behavior in male mice subjected to unpredictable chronic mild stress, PLoS One (6), pp e20955 Makkar S R Zhang S Q et al (2010), Behavioral and neural analysis of GABA in the acquisition, consolidation, reconsolidation, and extinction of fear memory Neuropsychopharmacology 35 (8), pp 1625-1652 Matsumoto K et al (2005), Social isolation stress-induced aggression in mice: a model to study the pharmacology of neurosteroidogenesis, Stress (2), pp 85-93 Matsumoto K et al (1999), Psychological stress-induced enhancement of brain lipid peroxidation via nitric oxide systems and its modulation by anxiolytic and anxiogenic drugs in mice, Brain Res 839 (1), pp 74-84 McEwen B S et al (2015), Mechanisms of stress in the brain, Nat Neurosci 18 (10), pp 1353-1363 McEwen Bruce S (2007), Physiology and Neurobiology of Stress and Adaptation: Central Role of the Brain, The American Physiological Society, pp 874-879 Mitsue Ishisaka Kazuhiro Tsuruma et al (2013), Increased Seizure Susceptibility in a Mouse with Diacylglycerol Kinase β Deficiency, Neuroscience & Medicine 4, pp 117-122 Miyakawa Tsuyoshi (2006), Light – Dark box test, Journal of Visualized Experiments 104, pp 1-2 Nassiri-Asl M et al (2007), Anticonvulsant effects of aerial parts of Passiflora incarnata extract in mice: involvement of benzodiazepine and opioid receptors, BMC Complement Altern Med 7, pp 26 Ojima K et al (1997), Flumazenil reverses the decrease in the hypnotic activity of pentobarbital by social isolation stress: are endogenous benzodiazepine receptor ligands involved?, Brain Res 745 (1-2), pp 127-133 Ren-Qi Huang Cathy L Bell-Horner, Mohammed I Dibas, et al (2001), Pentylenetetrazole-induced inhibition of recombinant aminobutyric acid type a (GABAA) receptors: Mechanism and site of action, The journal of pharmacology and experimental therapeutics 298, pp 986–995 Roy E Twyman Carl J Rogers, and Robert L Macdonald (1989), Dfierential regulation of y- aminobutyric acid receptor channels by diazepam and phenobarbital, Annals of Neurology 25 (3), pp 213 - 220 Ruggero Serafini John Bracamontes, Joe Henry Steinbach (2000), Structural domains of the human GABAA receptor β3 subunit involved in the actions of pentobarbital, Journal of Physiology 524 (3), pp 649 - 676 S Mora S Moraa et al (2005), Central nervous system activity of the hydroalcoholic extract of Casimiroa edulis in rats and mice, J Ethnopharmacol 97 (2) [46] [47] [48] [49] [50] Sanket P Borole Rajesh J Oswal et al (2011), Evaluation of anti-epileptic activity of Cuscuta reflexa Roxb, Research Journal of Pharmaceutical, Biological and Chemical Sciences (1), pp 657 - 663 Soulimani R Younos C., Jarmouni S et al (1997), Behavioural effects of Passiflora incarnata L and its indole alkaloid and flavonoid derivatives and maltol in the mouse, J Ethnopharmacol 57 (1), pp 11-20 Steimer Thierry (2011), Animal models of anxiety disorders in rats and mouse: some conceptual issues, Dialogues Clin Neurosci 13, pp 495-506 Sudipta Das Sanjib Bhattacharya, Biswakanth Kar, et al (2012), Anticonvulsant activity of Diospyros cordifolia bark against experimentally induced convulsions in Swiss albino mice, , Pharmacologia (7), pp 196 199 Matsumoto K Puia G et al (2007), GABA(A) receptor neurotransmission dysfunction in a mouse model of social isolation-induced stress: possible insights into a non-serotonergic mechanism of action of SSRIs in mood and anxiety disorders, Stress 10 (1), pp 3-12