Thiết lập quy trình phân lập và nuôi cấy tế bào tôm làm mô hình nghiên cứu in vitro

SỞ NÔNG NGHIỆP VÀ PHÁT TRIỂN NÔNG THÔN THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRUNG TÂM CƠNG NGHỆ SINH HỌC BÁO CÁO NGHIỆM THU ĐỀ TÀI KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ CẤP CƠ SỞ Tên nhiệm vụ: THIẾT LẬP QUY TRÌNH THU NHẬN VÀ NUÔI CẤY TẾ BÀO TÔM LÀM MÔ HÌNH NGHIÊN CỨU IN VITRO (Mã số: DV 01/15-16) Đơn vị chủ trì nhiệm vụ: Phịng CNSH Động vật Chủ nhiệm nhiệm vụ: ThS Nguyễn Thị Nhật Uyên Cán tham gia: ThS Âu Dương Tuyết Mai ThS Nguyễn Thị Thanh Giang ThS Phan Thị Nhàn Thành phố Hồ Chí Minh, tháng năm 2018 MỤC LỤC DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT iii DANH SÁCH BẢNG .iv DANH MỤC HÌNH v TÓM TẮT PHẦN THÔNG TIN CHUNG PHẦN NỘI DUNG KHOA HỌC I ĐẶT VẤN ĐỀ II TỔNG QUAN TÀI LIỆU Nhu cầu sử dụng tế bào tôm Lịch sử nuôi cấy tế bào tôm Môi trường nuôi cấy tế bào tôm Các thành phần bổ sung vào môi trường nuôi cấy Những lồi tơm sử dụng nuôi cấy tế bào tôm 10 Những mô, quan sử dụng nuôi cấy tế bào tôm 11 Tuổi thọ số lần cấy chuyền tế bào tôm điều kiện nuôi cấy in vitro 13 III VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15 1.Vật liệu - hóa chất 15 1.1.Vật liệu 15 1.2.Hóa chất 15 2.Phương pháp 15 2.1.Nội dung nghiên cứu 15 2.2.Phương pháp nghiên cứu 16 2.2.1.Sơ đồ bố trí thí nghiệm 16 2.2.2.Chuẩn bị dịch chiết tôm (Shrimp muscle extract - SME) 16 2.2.3 Phân lập nuôi cấy sơ cấp tế bào tôm từ gan-tụy tôm sú Penaeus monodon 17 2.2.4 Phân lập nuôi cấy sơ cấp tế bào tôm từ quan lympho tôm sú Penaeus monodon 19 2.2.5 Khảo sát đánh giá khả tăng sinh tế bào lympho tôm từ quan lympho tôm sú Penaeus monodon nuôi cấy thứ cấp 21 2.2.6 Khảo sát đánh giá ảnh hưởng chất bổ sung vào môi trường nuôi cấy tối ưu phát triển tế bào lympho tôm 22 IV KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 23 Phân lập nuôi cấy sơ cấp tế bào tôm từ mô gan-tụy tôm sú P monodon 23 Phân lập nuôi cấy sơ cấp tế bào tôm từ quan lympho tôm sú P monodon 27 Đánh giá khả tăng sinh tế bào lympho tôm từ quan lympho tôm sú Penaeus monodon nuôi cấy thứ cấp 41 Đánh giá ảnh hưởng chất bổ sung vào môi trường nuôi cấy tối ưu i phát triển tế bào lympho tôm 43 V.KẾT LUẬN 48 VI.KIẾN NGHỊ 48 PHẦN SẢN PHẨM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ 48 PHẦN TÀI LIỆU THAM KHẢO 49 PHỤ LỤC ii DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT SME: Shrimp muscle extract MT: Môi trường NT: Nghiệm thức FBS: Fetal Bovine Serum ITS-X: Insuline – Transferrine – Selenium – Ethanolamine IGF (insulin growth factors: IGF-I, IGF-II): nhân tố tăng trưởng insulin b-FGF (basic fibroblast growth factor): nhân tố tăng trưởng nguyên bào sợi P monodon: Penaeus monodon iii DANH SÁCH BẢNG Bảng 1: Bố trí thí nghiệm đĩa ni tế bào 24 giếng 20 Bảng 2: Công thức môi trường bổ sung yếu tố tăng trưởng 22 Bảng 3: Đánh giá ảnh hưởng loại môi trường lên phát triển tế bào lympho tôm sau 24h; 48h; 72h; 96h nuôi cấy 29 Bảng 4: Kết đánh giá ảnh hưởng bFGF IGF-I lên phát triển tế bào lympho tôm sau 48h 45 iv DANH MỤC HÌNH Hình 1: Các môi trường sử dụng nuôi cấy tế bào tơm Hình 2: Các lồi tôm sử dụng nuôi cấy tế bào tôm 11 Hình 3: Các loại mô sử dụng nuôi cấy tế bào tôm tơm Penaeid 12 Hình 4: Tế bào tơm gan-tụy sau nuôi cấy 4h 24 Hình 5: Tế bào gan-tụy tơm sau 24h nuôi cấy 24 Hình 6: Hình thái tế bào gan-tụy tôm sau 24h nuôi cấy nhuộm Giemsa 25 Hình 7: Tế bào gan-tụy tơm sau ngày nuôi cấy 25 Hình 8: Tế bào gan-tụy tơm sau ngày ni cấy 26 Hình 9: Tình trạng nhiễm nấm mơi trường ni cấy tế bào gan-tụy tơm 26 Hình 10: Tế bào tôm gan-tụy sau ngày nuôi cấy 26 Hình 11: Hình thái tế bào gan-tụy tôm sau rã đông 27 Hình 12: Cơ quan lympho tôm sú Penaeus monodon 28 Hình 13: Cơ quan lympho sau tách 28 Hình 14: Tế bào lympho tơm sau 24h ni cấy nghiệm thức 31 Hình 15: Tế bào lympho tôm sau 48h nuôi cấy nghiệm thức 32 Hình 16: Tế bào lympho tôm sau 72h nuôi cấy nghiệm thức 33 Hình 17: Hiện tượng “sừng hóa” tế bào lympho tơm sau 72h ni cấy nghiệm thức 34 Hình 18: Tế bào lympho tơm sau 96h nuôi cấy nghiệm thức 35 Hình 19: Tế bào lympho tơm sú P monodon phát triển từ mảnh mô sau 4h nuôi cấy 37 Hình 20: Tế bào lympho tôm sú P monodon phát triển từ mảnh mô sau 24h nuôi cấy 38 Hình 21: Tế bào lympho tơm sau 48h nuôi cấy 38 Hình 22: Tế bào lympho tơm sau 48h ni cấy 39 Hình 23: Tế bào biểu mô sơ cấp phát triển từ mảnh mơ lympho sau 48h 39 Hình 24: Lớp đơn tế bào nguyên bào sợi sơ cấp phát triển từ mảnh mô lympho sau 72h nuôi cấy 39 Hình 25: Hình thái tế bào lympho nhuộm Giemsa giai đoạn phân chia sau 48h nuôi cấy 40 v Hình 26: Tế bào lympho thời gian nuôi cấy khác nuôi môi trường (M199 + 10% FBS + 5% SME) 41 Hình 27: Tế bào lympho 24h sau cấy chuyền lần 42 Hình 28: Tế bào lympho 24h sau cấy chuyền lần bắt đầu xuất “nốt sừng” 42 Hình 29: Tế bào lympho sau cấy chuyền lần 43 Hình 30: Tế bào lympho tôm nuôi nghiệm thức sau 48h ni cấy 46 Hình 31: Tế bào lympho tôm nuôi nghiệm thức sau 72h nuôi cấy 47 vi TÓM TẮT Sự phát triển bền vững ngành nuôi trồng thủy sản, đặc biệt ngành nuôi tôm mục tiêu hàng đầu nhiều quốc gia giới Do đó, phịng ngừa kiểm soát dịch bệnh thủy sản, đặc biệt bệnh virus gây nhu cầu cấp thiết cho phát triển tương lai ngành công nghiệp nuôi tôm Thật đáng tiếc, nay, việc thiếu dòng tế bào tôm làm hạn chế nghiên cứu virus gây bệnh tôm Trong nghiên cứu này, phương pháp thu nhận nuôi cấy sơ cấp tế bào tôm từ quan gan-tụy lympho tôm sú Penaeus monodon thử nghiệm cho kết tương đối khả quan Đối với tế bào thu nhận từ quan gantụy tơm tồn ngày môi trường L15, bổ sung 10% huyết bị (FBS), ITS-X 1X, 5% dịch chiết tơm kháng sinh (penicillin (100 IU/ml), streptomycine (100 µg/ml), gentamicin (250 µg/ml)) điều kiện 28oC, 0%CO2 Đối với mảnh mô tách từ quan lympho thử nghiệm nuôi cấy thành công môi trường M199, bổ sung 10% huyết bò (FBS), 5% dịch chiết tôm kháng sinh (penicillin (100 IU/ml), streptomycine (100 µg/ml), gentamicin (250 µg/ml)) điều kiện 28oC, 5%CO2, tế bào tồn 15 ngày phát triển tốt qua lần cấy chuyền Tế bào lympho tơm có dạng tế bào trịn, tế bào biểu mơ chiếm đa số nguyên bào sợi Tuy nhiên, q trình ni cấy, vấn đề bị nhiễm chưa thể kiểm sốt hồn tồn Sau ngày ni cấy, tế bào lympho bao phủ 70% bề mặt ni cấy Bên cạnh đó, việc bổ sung yếu tố tăng trưởng IGF-I bFGF vào môi trường nuôi cấy hỗ trợ việc tăng sinh tế bào lympho tôm không đáng kể thời gian dài PHẦN THÔNG TIN CHUNG Tên nhiệm vụ: Thiết lập quy trình thu nhận ni cấy tế bào tơm làm mơ hình nghiên cứu in vitro (Mã số: ĐV01/15-16) Đơn vị chủ trì: Phịng CNSH Động vật Đơn vị phối hợp chính: Khơng Chủ nhiệm nhiệm vụ: ThS Nguyễn Thị Nhật Uyên - Phòng CNSH Động vật Cán tham gia thực hiện: ThS Âu Dương Tuyết Mai - Phòng CNSH Động vật ThS Nguyễn Thị Thanh Giang – Phòng CNSH Động vật ThS Phan Thị Nhàn - Phòng CNSH Động vật Thời gian thực hiện: 24 tháng (Từ 01/01/2015 đến 31/12/2016) Kinh phí: Tổng dự tốn: 400.000.000 VNĐ Kinh phí sử dụng: Năm 2015: 204.957.940 VNĐ Năm 2016: 197.886.750 VNĐ Tổng kinh phí sử dụng: 402.844.690 VNĐ Mục tiêu nhiệm vụ: 8.1 Mục tiêu chung: Có quy trình thu nhận ni cấy sơ cấp tế bào tôm, nhằm tạo nguyên liệu cho nghiên cứu in vitro 8.2 Mục tiêu cụ thể: - Xây dựng quy trình phân lập thu nhận tế bào tôm tôm P monodon - Phân lập tế bào tôm sơ cấp - Xác định môi trường, điều kiện nuôi phù hợp tế bào tôm Các nội dung nghiên cứu thực so với đề cương đăng ký STT Nội dung Thời gian (bắt đầu – kết thúc) Có phương pháp 1/2015 phân lập tế bào tôm sơ cấp 9/2015 Kết thực Đánh giá - Có quy trình phân lập tế bào tơm sơ cấp từ mơ gantụy quan lympho Đạt - Tìm môi trường nuôi phù hợp phát triển tế bào tôm sơ cấp 10/2015- - Tế bào gan-tụy tơm trì Khơng đạt Có tế bào tôm sơ cấp 8/2016 ngày (Tế bào - Tế bào lympho tơm trì sống 30 ngày) 15 ngày Đánh giá ảnh hưởng 9/2016các yếu tố tăng trưởng 12/2016 bổ sung vào môi trường nuôi cấy lên phát triển tế bào tôm - Môi trường nuôi cấy bổ sung IGF-I 10 ng/ml bFGF 20 ng/ml cho thấy tế bào phát triển tốt Bài báo đăng hội nghị khoa học tạp chí chuyên ngành nước - Đang gửi báo, chờ phản biện (Tạp chí Đại học Cần Thơ) Đạt mặt nuôi cấy so với môi trường đối chứng 30% thời điểm Tuy nhiên, tế bào phát triển mạnh đạt 70% bề mặt đĩa nuôi 72h tương tự mật độ tế bào có mơi trường đối chứng thời điểm Trong báo cáo Fan Wang (2002) sử dụng kết hợp yếu tố tăng trưởng IGF-II bFGF để kích thích tăng sinh tế bào phôi từ P chinensis kết cho thấy nồng độ hiệu IGF-II 80ng/ml bFGF 20ng/l cho hiệu tế bào tăng sinh tốt Nếu sử dụng nồng độ cao yếu tố tăng trưởng không đem lại hiệu tốt Vì số lượng thụ thể màng tế bào yếu tố hạn chế việc kích thích truyền tải tín hiệu Dưới điều kiện nuôi khác tế bào lympho tôm phát triển tăng sinh nhanh Các tế bào di chuyển từ mảnh mơ lympho, hình thành lớp đơn sau 72h ni cấy Tuy nhiên khả cấy chuyền thời gian trì tế bào lympho khơng cải thiện bổ sung yếu tố tăng trưởng (hình 24) môi trường nuôi cấy tiến hành nuôi cấy thời gian dài Các tế bào nuôi cấy mơi trường có bổ sung yếu tố tăng trưởng làm cho khả phân chia tế bào lympho tôm nhanh hơn, tốc độ tăng trưởng mật độ tế bào lympho tơm mơi trường có bổ sung chất tăng trưởng gia tăng, có kích thích tế bào kéo dài thời gian sống tăng sinh khơng đáng kể (A) (C) (B) (D) Hình 30: Tế bào lympho tôm nuôi nghiệm thức sau 48h nuôi cấy (100X) (A) NT 1, (B) NT 2, (C) NT3, (D) NT 46 A B Hình 31: Tế bào lympho tơm ni nghiệm thức sau 72h nuôi cấy (100X) (A) NT 1, (B) NT 2, (C) NT3, (D) NT 47 V KẾT LUẬN - Xác lập quy trình phân lập tế bào tôm sơ cấp từ mô gan-tụy tôm sú Penaeus monodon môi trường tối ưu – môi trường L-15 + 10% FBS + ITS-X 1X + 5% dịch chiết tơm có khả kích thích tế bào gan-tụy phát triển Tế bào tăng trưởng nhanh giai đoạn sau 24h ni cấy, trì sống sót tăng sinh ngày - Xác lập quy trình phân lập tế bào lympho tôm từ quan lympho tôm sú Penaeus monodon môi trường tối ưu – môi trường M199 + 10% FBS + 5% dịch chiết tôm cho nuôi cấy tế bào lympho tôm Tế bào tăng trưởng nhanh giai đoạn sau 48h - 72h nuôi cấy đạt mật độ cao vào thời gian sau 72h - Tế bào lympho trì tồn khoảng thời gian 15 ngày với lần cấy chuyền - Tế bào lympho tơm có hình dạng: tế bào tròn, tế bào nguyên bào sợi, tế bào biểu mơ, ngun bào sợi chiếm đa số - Các nhân tố tăng trưởng bFGF IGF-I cho hiệu hỗ trợ tăng sinh tế bào lympho tôm sau 48h nuôi cấy, chưa ghi nhận khác biệt lớn thời gian nuôi cấy dài VI KIẾN NGHỊ - Tế bào tơm có thời gian sinh trưởng, phát triển bình thường ngắn, nguồn mẫu bị nhiễm, nuôi cấy thời gian dài tế bào không tiếp tục tăng sinh được, việc sử dụng bổ sung thêm nhân tố tăng trưởng yếu tố kích thích tế bào phát triển vào mơi trường nuôi cấy khảo sát, hạn chế mặt thời gian kinh phí thực đề tài nên chưa thể đưa khảo sát toàn diện, đề nghị cần thực tiếp tục nghiên cứu để xác định môi trường nuôi cấy tốt để tăng thời gian sinh trưởng tế bào tôm - Nguồn mẫu tôm thương phẩm thu nhận mô lympho khó, mẫu tơm lại thường nhiễm nấm, vi khuẩn xử lý vơ khuẩn khơng Do đó, cần tiếp tục tiến hành nghiên cứu thời gian nồng độ phù hợp bổ sung yếu tố tăng trưởng, kiểm soát yếu tố gây nhiễm từ nguồn tôm - Hướng nghiên cứu phân lập nuôi cấy tế bào tôm hướng hoàn toàn Việt Nam, đề tài bước mở đầu cho nghiên cứu lĩnh vực tương lai, đó, cần tạo nghiên cứu liên ngành để hoàn thiện quy trình phát triển ứng dụng từ tế bào tôm nghiên cứu khoa học thực tiễn Đề tài hoàn thành 80% so với tiến độ đề đề cương nghiên cứu, đề nghị Hội đồng khoa học đồng ý nghiệm thu đề tài PHẦN SẢN PHẨM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ 48 TT Tên sản phẩm Có tế bào tơm sơ cấp Có phương pháp phân lập tế bào tơm sơ cấp Bài báo đăng hội nghị khoa học tạp chí chuyên ngành nước Số lượng Chỉ tiêu kinh tế - kỹ thuật Đánh giá Tế bào sống 30 Tế bào trì ngày 15 ngày Phương pháp phân lập Có quy trình ổn định, tế bào sơ cấp phân lập tế bào tôm tạo không bị nhiễm sơ cấp từ quan lympho Đang gửi báo, chờ phản biện (Tạp chí Đại học Cần Thơ) PHẦN TÀI LIỆU THAM KHẢO Assavalapsakul W., Smith D R and Panyim S., 2003 Propagation of infectious yellow head virus particles prior to cytopathic effect in primary lympho cell cultures of Penaeus monodon, Dis Aquat Organ, 55, 253-8 Assavalapsakul W., Smith D R and Panyim S., 2006 Identification and characterization of a Penaeus monodon lympho cell-expressed receptor for the yellow head virus, J Virol, 80, 262-9 Barton E R., DeMeo J., Lei H., 2010 The insulin-like growth factor (IGF)-I Epeptides are required for isoform-specific gene expression and muscle hypertrophy after local IGF-I production, J Appl Physiol, 108, 1069-1076 Bell T.A., Lightner D.V., 1988 A handbook of normal penaeid shrimp histology World Aquaculture Society, pp 114 Catap E.S., Nudo L.P., 2008 Susceptibility of Primary Cultured Cells from the Lymphoid Organ of Penaeusmonodon to MonodonBaculovirus (MBV) and White Spot Syndrome Virus (WSSV) Philipp AgricSci, 91, 450-‐458 Chantanachookin C., Boonyaratpalin S., Kasornchandra J., Direkbusarakom S., Ekpanithanpong U., Supamataya K., Sriurairatana S., Flegel T.W., 1993 Histology and Ultrastructure Reveal a New Granulosis ‐ Like Virus in Penaeusmonodon Affected by Yellow-Head Disease Disease of Aquatic Organisms, 17, 145-‐157 Chen S N Wang C S., 1999 Establishment of cell culture systems from penaeid shrimp and their susceptibility to white spot disease and yellow head viruses, Methods Cell Sci, 21, 199-206 49 Chen S N., Jong K J and Kou G H., 1989 Cell culture derived from tissues of penaeid shrimp, Penaeus pinicillatus, hard clam/Meretrix lusoria Invertebrate cell system applications, Florida: CRC Press Inc, 253-62 Chen S N., Wang C., Kou G H and Liao I C., 1986 Cell culture from tissues of grass prawn, Penaeus monodon, Fish Pathol, 21, 161-6 10 Chen-Lei G., Jin-Sheng S vàJian-Hai X., 2003.Primary culture andcharacteristic morphologies of medulla terminalis neurons in theeyestalks of Chinese shrimp, Fenneropenaeuschinensis Journal of Experimental Marine Biology and Ecology, 290: 71-80 11 Claydon K., 2009 Advances in crustacean cell culture, PhD Thesis, Townsville: Jame Cook University 12 Claydon K., Roper K G and Owens L., 2010 Attempts at producing a hybridised Penaeus mondon cell line by cellular fusion, Fish Shellfish Immunol, 29, 539-43 13 Duangsuwan P., PhoungpetcharaI, TinikuI Y, PoljaroenJ., Wanichanon C.,Sobhon P., 2008 Histological and three dimensional organizations of lymphoid tubules in normal lymphoid organ of Penaeus monodon Fishand Shellfish Immunology, 24, 426-435 14 Ercal N., Gurer-Orhan H and Aykin-Burns N., 2001 Toxic metals and oxidative stress part I: mechanisms involved in metal-induced oxidative damage, Curr Top Med Chem, 1, 529-39 15 Evenden, A.J., 2000 Tissue choices for aquatic inverterate tissue culture in: Mothersill C, A.B (Ed.), Aquatic Invertebrate Cell Culture Springer & Praxis Publishing, Chichester, United Kingdom 16 Fan T.J and Wang X., 2002 In vitro culture of embryonic cells from the shrimp, P chinensis, J EXP Mar Biol Ecol, 267, 175-84 17 FAO, 2006 The state of world aquaculture, FAO Fisheries Technical Paper, 500, 1-134 18 FAO, 2010 The state of world fisheries and aquaculture 2010, Rome: Food and Agriculture Organization of the United Nations 19 Flegel T W., 2012 Historic emergence, impact and current status of shrimp pathogens in Asia, J Invertebr Pathol, 110, 166-73 20 Frank U., Rabinowitz C and Rinkevich B., 1994 In vitro establishment of continuous cell cultures and cell lines from ten colonical cnidarians, Marine Biology, 120, 491-499 21 Fraser C A and Hall M R., 1999 Studies on primary cell cultures derived from ovarian tissue of Penaeus monodon, Methods Cell Sci, 21, 213-8 50 22 Frerichs G N., 1996 In vitro culture of embryonic cells from the fresh water prawn Macrobrachim rosenbergii, Aquaculture, 143, 227-232 23 Gao C.-L., Sun J.-S J-H.X., 2003 Primary culture and characteristic morphologies of medulla terminalis neurons in the eyestalks of Chineseshrimp, Fennero Penaeus chinensis Journal of Experimental Marine Biology and Ecology, 290: 71-80 24 Garcia S M and Rosenberg A A., 2010 Food security and marine capture fisheries: characteristics, trends, drivers and future perspectives, Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci, 365, 2869-80 25 George S K and Dhar A K., 2010 An improved method of cell culture system from eye stalk, hepatopancreas, muscle, ovary, and hemocytes of Penaeus vannamei, In Vitro Cell Dev Biol Anim, 46, 801-10 26 George S K., Kaizer K N., Betz Y M and Dhar, A K., 2011 Multiplication of Taura syndrome virus in primary hemocyte culture of shrimp (Penaeus vannamei), J Virol Methods, 172, 54-9 27 Ghosh D Ray, A R and Dasmahapatra A K., 1995 Primary culture of prawn hepatocytes in serum free media, In Vitro Cell Dev Biol Anim, 31, 811-3 28 Gutiérrez A, Nieto J, Pozo F, Stern S, Schoofs L , 2007 Effect of insulin/IGF-I like peptides on glucose metabolism in the white shrimp Penaeus vannamei, Gen Comp Endocrinol, 153(1-3):170-5 29 Hasson K.W., Lightner D.V., Mohney L.L., Redman R.M., White B.M., 1999 Role of lymphoid organ spheroids in chronic Taura syndrome virus (TSV) infections in Penaeus vannamei, Dis Aquat Org, 38: 93-105 30 Hsu Y., Yang H N., Chen Y., Tung M., Wu J., Engelking M and Leong, J., 1995 Development of an in vitro subculture system for the oka organ (Lympho tissue) of Penaeus monodon, Aquaculture, 136, 43-55 31 Hu G B., Wang D and Ji-Xiang C., 2010 Retroviral delivery of simian virus 40 large T antigen gene into primary cultured ovary cells of the penaeid shrimp, Penaeus chinensis: indirect evidence of retroviral integration, J World Aquac Soc, 41, 137-43 32 Itami T., Maeda M., Kondo M & Takahashi Y., 1999 Primary culture of lympho organ cells and haemocytes of kuruma shrimp, Penaeus japonicas, Methods Cell Sci, 21, 237-44 33 Jayesh P., 2013 Development of lympho cell culture system from Penaeus monodon and molecular approaches for its transformation Ph.D Thesis Cochin University of Science and Technology, India 34 Jayesh P., Seena J., Philip R., Singh I S B., 2012 A novel medium for the development of in vitro cell culture system from Penaeus monodon, Cytotechnology, 51 65, 307–322 35 Jayesh P., Rosamma Philip, and I S Bright Singh, 2015 Multifactorial interaction of growth factors on Penaeus monodon lymphoid cells and the impact of IGFs in DNA synthesis and metabolic activity in vitro, Cytotechnology, 67(3): 559–571 36 Jiang Y., Zhan W., Wang S and Xing J., 2005 Development of primary shrimp hemocyte cultures of Penaeus chinensis to study white spot syndrome virus (WSSV) infection, Aquaculture, 253, 114-9 37 Jiravanichpaisal, P., Soderhall K and Soderhall I., 2006 Characterization of white spot syndrome virus replication in in vitro - cultured haematopoietic stem cells of freshwater crayfish Pacifastacus leniusculus, General Virology, 87, 847-854 38 Johnson P.T., 1987 A Review of Fixed Phagocytic and Pinocytotic Cells of Decapod Crustaceans, with Remarks on Hemocytes Dev Comp Immunol 11, 679-704 39 Johnson K N., Van Hulten M C and Barnes A C., 2008 "Vaccination" of shrimp against viral pathogens: phenomenology and underlying mechanisms, Vaccine, 26, 4885-92 40 Jose S., Jayesh P., Mohandas A., Philip R and Bright Singh I S., 2011 Application of primary haemocyte culture of Penaeus monodon in the assessment of cytotoxicity and genotoxicity of heavy metals and pesticides, Mar Environ Res, 71, 16977 41 Jose S., Jayesh P., Sudheer N S., Poulose G., Mohandas A., Philip R., Bright I S B., 2012 Lympho organ cell culture system from Penaeus monodon (Fabricius) as a platform for white spot syndrome virus and shrimp immune - related gene expression, J Fish Dis, 35:321–334 42 Jose S., Mohandas A., Philip R and Bright Singh I S., 2010 Primary hemocyte culture of Penaeus monodon as an in vitro model for white spot syndrome virus titration, viral and immune related gene expression and cytotoxicity assays, J Invertebr Pathol, 105, 312-21 43 Kasornchandra J., Khongpradit R., Ekpanithanpong U and Boonyaratpalin S., 1999 Progress in the development of shrimp cell cultures in Thailand, Methods Cell Sci, 21, 231-235 44 Ke H., Liping W., Yumei D and Shuji Z., 1990 Studies on cell culture from the hepatopancreas of the oriental shrimp, Penaeus orientalis Kishinouye, Asian Fisheries Science 3, 299 – 307 45 Kumar S G., Singh I S and Philip R., 2001 Cell culture systems from the eye stalk of Penaeus indicus, Animal cell technology: from target to market Kluwer: 52 London, 261-5 46 Lang G., Nomura N and Matsumura M., 2002 Growth by cell division in shrimp (Penaeus japonicus) cell culture, Aquaculture, 213, 73-83 47 Leudeman R and Lightner D V., 1992 Development of an in vitro primary cell system from the penaeid shrimp, Penaeus stylirostris and Penaeus vannamei, Aquaculture, 101, 205-11 48 Lightner D V., Poulos B T., Tang-Nelson K F., Pantoja C R., Nunan L M., Navarro S A., Redman R M and Mohney L L., 2006 Application of molecular diagnostic methods to penaeid shrimp diseases: advances of the past 10 years for control of viral diseases in farmed shrimp, Dev Biol (Basel), 126, 117-22, 325-6 49 Lu Y., Tapay L M., Loh P C., Brock J A and Gose R., 1995a Development of a quantal assay in primary shrimp cell culture for yellow head baculovirus (YBV) of penaeid shrimp, J Virol Methods, 52, 231-6 50 Lu Y., Tapay L M., Loh P C., Brock J A and Gose R., 1995b Distribution of yellow - head virus in selected tissues and organs of penaeid shrimp Penaeus vannamei, Dis Aquat Organ, 23, 67-70 51 Lycons- A1cantara M., Lambkin H.A., NordmoR, Lyng F., Mothersill C.,2002 Cross reactivity of some antibodies to human epitopes with shrimp Pandalus borealis proteins: a possible aid in validation and characterisation of crustacean cells in vitro Cell Biochemistry and Function, 20,247-256 52 Lynn D E., 1999 Development of insect cell lines: virus susceptibility and applicability to prawn cell culture, Methods Cell Sci, 21, 173-81 53 Machii A., Wada K., Awaji M., Nakaruma H and Townsley S., 1988 Some characters of cells of the midgut gland and chytrids from primary cultures of the prawn Penaeus japonicas, Invertebrates and fish tissue culture, 11-4 54 Maeda M., Mizuki E., Itami T and Ohba, M., 2003 Ovarian primary tissue culture of the kuruma shrimp Marsupenaeus japonicas, In Vitro Cell Dev Biol Anim, 39, 20812 55 Maeda M., Saitoh H., Mizuki E., Itami T and Ohba M., 2004 Replication of white spot syndrome virus in ovarian primary cultures from the kuruma shrimp, Marsupenaeus japonicas, J Virol Methods, 116, 89-94 56 Martin G.G., Hose J.E., Minka G., Rosenberg S., 1996 Clearance of bacteria injected into the hemolymph of the ridgeback prawn, Sicyoniaingentis (Crustacea: Decapoda): Role of hematopoietic tissue J Morphol, 227, 227-233 57 Mitsuhashi J., 2001 Development of highly nutritive culture media, In Vitro Cell Dev Biol Anim, 37, 330-7 53 58 Mulford A L., Lyng F., Mothersill C and Austin B., 2001 Development and characterization of primary cell cultures from the hematopoietic tissues of the Dublin Bay prawn, Nephrops norvegicus, Methods Cell Sci, 22, 265-75 59 Nadala E C., Loh P C and Lu P C., 1993 Primary culture of lympho, nerve, and ovary cells from Penaeus stylirostris and Penaeus vannamei, In Vitro Cell Dev Biol Anim, 29A, 620-2 60 Oka M., 1969 Studies onPenaeus orientalis Kishinouye-VIII Structure of the newly found lymphoid organ Bull Jap Soc Sci Fish, 35, 245-‐250 61 Owens L and Smith J., 1999 Early attempts at production of prawn cell lines, Methods Cell Sci, 21, 207-12 62 P.J Hatt, C Liebon, M Morinière, H Oberlander, and P Porchero, 1997 Activity of Insulin Growth Factors and Shrimp Neurosecretory Organ Extracts on a Lepidopteran Cell Line, Archives of Insect Biochemistry and Physiology 34:313–328 63 Pulido M D and Parrish A R., 2003 Metal-induced apoptosis: mechanisms, Mutat Res, 533, 227-41 64 Richardson N A., Anderson A J., Sara V R., 1997 The effects of insulin/IGF-I on glucose and leucine metabolism in the redclaw crayfish (Cherax quadricarinatus), Gen Comp Endocr, 105: 287–293 65 Rinkevich B., 1999 Cell cultures from marine invertebrates: obstacles, new approaches and recent improvements, J Biotechonl, 70, 133-53 66 Rodriguez J., Bayot B., Amano Y., Panchana F., de Blas I., Alday V., Calderon J., 2003 White spot syndrome virus infection in cultured Penaeus vannamei (Boone) in Ecuador with emphasis on histopathology and ultrastructure J Fish Dis, 26, 439‐450 67 Roper K G., Owens L and West L., 2001 The media used in primary cell cultures of prawn tissues: a review and a comparative study, Asian Fish Sci, 14, 61-75 68 Shimizu C., Shike H., Klimpel K R and Burns J C., 2001 Hemolymph analysis and evaluation of newly formulated media for culture of shrimp cells (Penaeus stylirostris), In Vitro Cell Dev Biol Anim, 37, 322-9 69 Smagghe G., Goodman C L and Stanley D., 2009 Insect cell culture and applications to research and pest management, In Vitro Cell Dev Biol Anim, 45, 93-105 70 Tang K.F.J, Pantoja C.J., Poulos B.T., Redman R.M., Lightner D.V., 2005 In situ hybridization demonstrates that Litopenaeus vannamei, L stylirostris and Penaeus monodon are susceptible to experimental infection with infectious myonecrosis virus (IMNV), Dis Aquat Org, 63: 261-265 71 Tapay L M., Lu Y., Brock J A., Nadala E C.Jr and Loh P C., 1995 54 Transformation of primary cultures of shrimp (Penaeus stylirostris) lympho (Oka) organ with Simian virus-40 (T) antigen, Proc Soc Exp Biol Med, 209, 73-8 72 Tirasophon W., Roshorm Y., Panyim S., 2005 Silencing of yellow head virus replication in penaeid shrimp cells by dsRNA Biochem Bioph Res Co, 334, 102-‐ 107 73 Tong S L and Miao H Z., 1996.Attempt stoinitiate cell cultures from Penaeus chinensis tissue, Aquaculture, 147, 151-157 74 Toullec J Y., 1999 Crustacean primary cell culture: A technical approach, Methods Cell Sci, 21, 193-8 75 Uma A., Prabhakar T G., Koteeswaran A and Rvikumar G., 2002 Establishment of primary cell culture from hepatopancreas of Penaeus monodon for the study of white spot syndrome virus (WSSV), Asian Fish Sci, 15, 365-370 76 Van de Braak C.B.T., Botterblom M.H.A, Taveme N., Van W.B.,Muiswinkel J.H., Rombout W.M., van der Knaap W.P.W., 2002b Theroles of haemocytes and the lymphoid organ in the clearance of injected Vibrio bacteria in Penaeusmonodon shrimp Fish and ShellfishImmunology, 13, 293-309 77 Van de Braak.C.B.T., 2002a Haemocytic defense in black tiger shrimp (Penaeus monodon), Ph D thesis, Wageningen University, The Netherlands 78 Vogt G., 2012 Hidden treasures in stem cells of indeterminately growing bilaterian invertebrates, Stem Cell Rev, 8, 305-17 79 Walker P J and Winton J R., 2010 Emerging viral diseases of fish and shrimp, Vet Res, 41, 51 80 Wang C H., Yang H N., Tang C Y., Lu C H., Kou G H and Lo C F., 2000 Ultrastructure of white spot syndrome virus development in primary lympho organ cell cultures, Dis Aquat Organ, 41, 91-104 81 Wheatly M G., 1999 Calcium homeostasis in crustacea: the evolving role of branchial, renal, digestive and hypodermal epithelia, J Exp Zool, 283, 620- 40 82 Wieloch M., Kaminski P., Ossowska A., Koim-Puchowska B., Stuczynski T., Kuligowska-Prusinska M., Dymek G., Mankowska A and Odrowaz-Sypniewska G., 2012 Do toxic heavy metals affect antioxidant defense mechanisms in humans, Ecotoxicol Environ Saf, 78, 195-205 83 Zwart M P., Dieu B T., Hemerik L and Vlak J M., 2010 Evolutionary trajectory of white spot syndrome virus (WSSV) genome shrinkage during spread in Asia, PLos One, 5, e13400 ………, ngày tháng năm 20 ………, ngày tháng năm 20 55 Đơn vị chủ trì thực Chủ nhiệm đề tài ThS Nguyễn Thị Nhật Uyên TS Nguyễn Trọng Bình ………, ngày tháng năm 20 ………, ngày tháng năm 20 Phó Giám đốc phụ trách Phòng QLKH - HTQT TS Nguyễn Đăng Quân ………, ngày tháng năm 20 Giám đốc PGS TS Dương Hoa Xô 56 Phụ Lục Kết phân lập nuôi cấy tế bào gan – tụy tơm P monodon qua lơ thí nghiệm Lô 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 NT1 NT2 NT3 NT4 NT5 NT6 * * * * * * * * * * * +* * * * - * * * * * * * * - * * * * * - * * * * * * * * * * * * + * (+): Tế bào sống tăng sinh (-): Tế bào chết (*): Nhiễm * * +* +* * * * * - * * * * - * * * * * * * * * * * * * * * +* * * * * * * * * * * * + * * * * * Đánh giá 2% 0% 0% 2% 10% 0% Lô Giếng NT1 NT2 NT3 NT4 NT5 NT6 Lô * * * * * * * * * * * - * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * - * * * * * * * * - +* * * * - * * * * - +* * * * - * * * - Giếng NT1 NT2 NT3 NT4 NT5 NT6 * * * * * - * * * * * - * * * * * - * * * * * - Giếng NT1 NT2 NT3 NT4 NT5 NT6 * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * - Giếng NT1 NT2 NT3 NT4 NT5 NT6 * * * - * * * * * * * * * * * * * * + * * * + * * * + * * * - Lô 10 Lô Giếng NT1 NT2 NT3 NT4 NT5 NT6 * * * - Lô Lô Giếng NT1 NT2 NT3 NT4 NT5 NT6 * * * - Lô Lô Giếng NT1 NT2 NT3 NT4 NT5 NT6 * * * - Lô Lô Giếng NT1 NT2 NT3 NT4 NT5 NT6 Giếng NT1 NT2 NT3 NT4 NT5 NT6 * * * * * * * * * * * * - * * * * * * Giếng NT1 NT2 NT3 NT4 NT5 NT6 +* * Lô 11 Giếng NT1 NT2 NT3 NT4 NT5 NT6 Lô 16 * * - * * - * * - * * - + +* +* +* +* +* +* + * * * * Lô 12 Giếng NT1 NT2 NT3 NT4 NT5 NT6 * * * - * * * - * * * - * * * - * * * * - * * * * - * * * * - * * * * - * * * +* * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * + * * * * + * * * * + * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * + * Giếng NT1 NT2 NT3 NT4 NT5 NT6 Giếng NT1 NT2 NT3 NT4 NT5 NT6 Lô 19 * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * Lô 15 Giếng NT1 NT2 NT3 NT4 NT5 NT6 * * * +* * Lô 18 Lô 14 Giếng NT1 NT2 NT3 NT4 NT5 NT6 * * * +* * Lô 17 Lô 13 Giếng NT1 NT2 NT3 NT4 NT5 NT6 Giếng NT1 NT2 NT3 NT4 NT5 NT6 Giếng NT1 NT2 NT3 NT4 NT5 NT6 + * Lô 20 * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * Giếng NT1 NT2 NT3 NT4 NT5 NT6