Trong nghiên cứu này, phương pháp thu nhận và nuôi cấy sơ cấp tế bào tôm từ cơ quan gan-tụy và lympho của tôm sú Penaeus monodon đã được thử nghiệm và đã cho kết quả tương đối khả quan.
THÔNG TIN CHUNG
1 Tên nhiệm vụ: Thiết lập quy trình thu nhận và nuôi cấy tế bào tôm làm mô hình nghiên cứu in vitro (Mã số: ĐV01/15-16)
2 Đơn vị chủ trì: Phòng CNSH Động vật
3 Đơn vị phối hợp chính: Không
4 Chủ nhiệm nhiệm vụ: ThS Nguyễn Thị Nhật Uyên - Phòng CNSH Động vật
5 Cán bộ tham gia thực hiện:
ThS Âu Dương Tuyết Mai - Phòng CNSH Động vật
ThS Nguyễn Thị Thanh Giang – Phòng CNSH Động vật
ThS Phan Thị Nhàn - Phòng CNSH Động vật
6 Thời gian thực hiện: 24 tháng (Từ 01/01/2015 đến 31/12/2016)
Kinh phí đã sử dụng: Năm 2015: 204.957.940 VNĐ
Năm 2016: 197.886.750 VNĐ Tổng kinh phí đã sử dụng: 402.844.690 VNĐ
8.1 Mục tiêu chung: Có được quy trình thu nhận và nuôi cấy sơ cấp tế bào tôm, nhằm tạo nguyên liệu cho các nghiên cứu in vitro
- Xây dựng quy trình phân lập và thu nhận tế bào tôm của tôm P monodon
- Phân lập được tế bào tôm sơ cấp
- Xác định môi trường, điều kiện nuôi phù hợp đối với tế bào tôm
9 Các nội dung nghiên cứu đã thực hiện được so với đề cương đăng ký
Thời gian (bắt đầu – kết thúc)
Kết quả thực hiện Đánh giá
Có được phương pháp phân lập tế bào tôm sơ cấp 1/2015 -
- Có được quy trình phân lập tế bào tôm sơ cấp từ mô gan- tụy và cơ quan lympho
- Tìm ra được môi trường nuôi phù hợp nhất đối với sự Đạt
2 Có được tế bào tôm sơ cấp
- Tế bào gan-tụy tôm duy trì được 6 ngày
- Tế bào lympho tôm duy trì được 15 ngày
Không đạt (Tế bào sống trên
3 Đánh giá ảnh hưởng của các yếu tố tăng trưởng khi bổ sung vào môi trường nuôi cấy lên sự phát triển tế bào tôm
- Môi trường nuôi cấy bổ sung IGF-I 10 ng/ml và bFGF
20 ng/ml cho thấy tế bào phát triển tốt Đạt
4 Bài báo đăng trong hội nghị khoa học hoặc tạp chí chuyên ngành trong nước
- Đang gửi bài báo, chờ phản biện (Tạp chí Đại học Cần Thơ)
NỘI DUNG KHOA HỌC
ĐẶT VẤN ĐỀ
Nuôi tôm là ngành kinh tế quan trọng, tạo việc làm và thu nhập cao cho nhiều người dân Việt Nam, đang phát triển mạnh mẽ và đóng góp đáng kể vào nền kinh tế quốc gia, theo báo cáo của Tổng cục Thủy sản.
Năm 2016, Việt Nam đạt sản lượng tôm nước lợ 650 nghìn tấn (tôm sú 260 nghìn tấn, tôm thẻ 390 nghìn tấn) và kim ngạch xuất khẩu 3,1 tỷ USD, tăng 4% so với năm 2015 Tuy nhiên, thâm canh và mở rộng diện tích nuôi tôm dẫn đến dịch bệnh, đe dọa năng suất và sự phát triển bền vững, gây thiệt hại kinh tế lớn do sử dụng giống nhân tạo, mật độ cao, thức ăn công nghiệp, và lai tạo gây ra nhiều bệnh nguy hiểm, đặc biệt là bệnh virus.
Trên 1100 loài virus gây bệnh cho động vật không xương sống, trong đó 22 loại tấn công tôm, đe dọa nghiêm trọng ngành nuôi tôm toàn cầu Hiểu biết về cơ chế gây bệnh của virus trên tôm còn hạn chế, nuôi cấy tế bào tôm là giải pháp quan trọng nhưng chưa được thương mại hóa Nghiên cứu mô hình dịch bệnh in vitro giúp hiểu rõ cơ chế xâm nhiễm ở cấp độ tế bào và phân tử, đóng góp quan trọng về khoa học và ứng dụng sản xuất vaccine tôm.
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1 Nhu cầu sử dụng tế bào tôm
Nhu cầu thủy sản toàn cầu tăng mạnh nhưng nguồn đánh bắt hạn chế, dẫn đến thiếu hụt cung Nuôi trồng thủy sản, đặc biệt là nuôi tôm (mang lại hơn 10 tỷ USD mỗi năm), trở nên quan trọng Tuy nhiên, dịch bệnh, nhất là bệnh virus, gây thiệt hại lớn, đòi hỏi phải tăng cường phòng ngừa và điều trị bệnh cho động vật thủy sản.
Bảo vệ sức khỏe động vật thủy sản giảm thiệt hại kinh tế do bệnh gây ra (Subasinghe, 1997) Nghiên cứu bệnh lý in vivo trước đây gặp nhiều hạn chế về thời gian và độ chính xác (Maeda và cs, 2003) Nghiên cứu in vitro là giải pháp tiềm năng, giúp nghiên cứu sâu hơn về gene, cơ chế tương tác vật chủ-virus và hệ miễn dịch, vượt qua hạn chế của phương pháp in vivo (Freshney).
Nuôi cấy tế bào giúp nghiên cứu tương tác vật chủ-ký sinh trên tôm ở cấp độ tế bào và phân tử, nhưng thiếu dòng tế bào tôm bất tử hạn chế việc phân lập và nuôi cấy virus, gây khó khăn cho chẩn đoán và điều trị bệnh Phương pháp nuôi cấy tế bào riêng lẻ từng loại virus (thay vì hỗn hợp) đã được áp dụng từ năm 2005 (Owen, 1997), nhưng vẫn gặp trở ngại do thiếu tế bào bất tử thích hợp.
Nuôi cấy sơ cấp tế bào tôm hỗ trợ phân lập nhiều loại virus tôm như baculovirus, virus gây bệnh đầu vàng (YHV), và virus gây bệnh đốm trắng (WSSV) Các nghiên cứu sử dụng tế bào từ cơ quan lympho, buồng trứng, gan-tụy và tạo máu, đánh giá sự nhiễm virus chủ yếu qua dấu hiệu bệnh tích tế bào (CPE): co tròn, co cụm, bong tróc và ly giải Nuôi cấy tế bào giáp xác là công cụ quan trọng nghiên cứu virus tôm và tác động lên vật chủ.
Dòng tế bào được ứng dụng rộng rãi trong đánh giá độc tính chất gây ô nhiễm môi trường, đặc biệt là từ công nghiệp và nuôi trồng thủy sản, đe dọa hệ sinh thái và sức khỏe con người qua chuỗi thức ăn Tuy nhiên, việc dùng tế bào tôm đánh giá độc tính kim loại nặng và thuốc trừ sâu còn hạn chế Do đó, dòng tế bào tôm bất tử hứa hẹn là mô hình tiềm năng trong tương lai để xác định và đánh giá độc tính các chất gây ô nhiễm môi trường.
Phát triển dòng tế bào tôm bất tử mở ra hướng nghiên cứu mới về bệnh, miễn dịch và sinh lý tôm, hỗ trợ phát triển vaccine và thuốc Sử dụng dòng tế bào này giảm nhu cầu sử dụng động vật thí nghiệm, giải quyết vấn đề đạo đức và tôn giáo.
2 Lịch sử của nuôi cấy tế bào tôm
Nghiên cứu dòng tế bào tôm bất tử suốt 25 năm qua vẫn chưa thành công thương mại, bất chấp nhu cầu ngày càng cao, gây cản trở lớn cho việc phân lập virus gây bệnh tôm.
Năm 1986, nhóm nghiên cứu của Chen tại Đại học Quốc gia Đài Loan tiên phong trong việc nuôi cấy mô và cơ quan tôm sú.
Năm 1986, nghiên cứu nuôi cấy tế bào tôm bắt đầu với *Penaeus monodon* và 9 loài tôm khác Năm 1989, ghi nhận nghiên cứu nuôi cấy tế bào *Penaeus penicillatus* và nuôi cấy in vitro virus tôm trên tế bào tôm sú Từ đó, nhiều nghiên cứu nuôi cấy tế bào từ các mô và cơ quan tôm khác nhau được tiến hành, đồng thời khảo sát độ nhạy của tế bào với virus gây bệnh Những nghiên cứu này đặt nền móng cho việc tạo ra các dòng tế bào tôm trong tương lai, cung cấp thông tin về điều kiện nuôi cấy tối ưu cho sự sống sót và tăng sinh của các mô khác nhau.
Nghiên cứu tế bào tôm 25 năm qua vẫn chưa tạo ra dòng tế bào bất tử Các nghiên cứu hiện tại chủ yếu dựa trên tế bào nuôi cấy sơ cấp, có hạn chế về thời gian sống, khả năng tăng sinh và tính đồng nhất Vì vậy, cần thiết phải có dòng tế bào tôm bất tử, ổn định và đồng nhất để phục vụ nghiên cứu.
3 Môi trường nuôi cấy tế bào tôm
Môi trường nuôi cấy tối ưu là yếu tố quyết định sự sống sót và phát triển của tế bào động vật, đặc biệt là tế bào tôm Thiếu môi trường chuyên biệt đang là trở ngại lớn trong việc tạo dòng tế bào tôm bất tử Hầu hết nghiên cứu hiện nay tập trung vào phát triển môi trường nuôi cấy phù hợp cho tế bào tôm.
Môi trường nuôi cấy tế bào tôm hiện nay chủ yếu dựa trên môi trường tế bào động vật thương mại, thiếu thông tin về ảnh hưởng của điều kiện ngoại sinh (biển/nước ngọt), nội sinh, CO2 và các yếu tố bổ sung đến phát triển tế bào Nhiều thông tin về dinh dưỡng và chất bổ sung cần thiết vẫn chưa được khám phá Chưa có môi trường nuôi cấy tế bào tôm chuyên biệt nào được thương mại hóa.
Môi trường nuôi cấy tế bào côn trùng Grace đã tạo ra bước đột phá, dẫn đến sự phát triển của hơn 500 dòng tế bào côn trùng (Lynn, 1999; Smagghe và cộng sự).
Nuôi cấy tế bào tôm cần phân tích sâu bản chất sinh hóa của các chất trong cơ thể tôm (Shimizu và cs, 2001) và hiểu rõ nhu cầu dinh dưỡng của từng loại tế bào, từng loài tôm để tạo môi trường nuôi cấy riêng biệt (2009).
Nhiều thập kỷ qua, các nhà nghiên cứu đã thử nghiệm hơn 25 loại môi trường nuôi cấy tế bào tôm in vitro, với L-15 và M199 được sử dụng phổ biến nhất và cho kết quả thành công trên nhiều loại mô Mặc dù thành phần khác nhau, tế bào tôm vẫn phát triển tốt trong cả hai môi trường, cho thấy khả năng thích ứng cao L-15 hiện là môi trường được sử dụng nhiều nhất trong nuôi cấy tế bào tôm.
32 nghiên cứu trên 50 nghiên cứu về nuôi cấy tế bào tôm (64%) sử dụng môi trường L-
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Tôm sú Penaeus monodon (15-20g/con) được cung cấp từ phòng CNSH Thủy sản - Trung tâm CNSH TP HCM, đã được kiểm nghiệm bằng bộ kit PCR và xác nhận không nhiễm virus gây bệnh đốm trắng (WSSV), đầu vàng (YHV) và Taura (TSV).
- Môi trường nuôi cấy: M199, L-15 (Sigma) + 10% FBS (Sigma)
- Dung dịch trữ mẫu: PBS + antibiotic (penicillin 1,000 IU/ml (Sigma), streptomycin 1,000 àg/ml (Sigma), gentamycin 250 àg/ml (Sigma))
- ITS-X (insuline – transferrine – selenium - ethanolamine) (Invitrogen – 51500056 – nồng độ 100X)
- Dung dịch nhuộm tế bào: Giemsa (Sigma)
- Nhân tố tăng trưởng: IGF-I, bFGF (Sigma)
- Dung dịch Trypsin/EDTA (Sigma)
- Dung dịch Trypan Blue (Sigma)
- Đĩa nuôi tế bào 06 giếng, 24 giếng, 96 giếng (Nunc); đĩa petri
Nội dung 1: Phân lập và nuôi cấy sơ cấp tế bào tôm
- Chuẩn bị dịch chiết cơ tôm
- Phân lập và nuôi cấy sơ cấp tế bào tôm thu nhận từ mô gan-tụy của tôm sú Penaeus monodon
- Phân lập và nuôi cấy sơ cấp tế bào tôm thu nhận từ cơ quan lympho của tôm sú
Nghiên cứu này khảo sát và đánh giá tác động của các môi trường nuôi cấy khác nhau đến sự phát triển tế bào tôm trong nuôi cấy thứ cấp.
- Đánh giá khả năng sống sót và tăng sinh tế bào lympho tôm của tôm sú Penaeus monodon trong các loại môi trường nuôi cấy thứ cấp
Nghiên cứu này khảo sát và đánh giá tác động của các chất bổ sung lên môi trường nuôi cấy tối ưu, từ đó xác định ảnh hưởng đến sự phát triển của tế bào tôm.
Nghiên cứu này đánh giá hiệu quả tăng sinh tế bào lympho tôm khi bổ sung các yếu tố tăng trưởng vào môi trường nuôi cấy tối ưu.
2.2.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm
2.2.2 Chuẩn bị dịch chiết cơ tôm (Shrimp muscle extract - SME)
Dịch chiết cơ tôm được chuẩn bị theo phương pháp của Kasornchandra và cs
Chuẩn bị tôm sú Penaeus monodon khoảng 15-20gram/con Trước khi tiến hành thí nghiệm, tôm được khử trùng 1 lần bằng ethanol 70 o Sau khi thu cơ tôm, khoảng 4 -
6 gram cơ tôm/con, tiếp tục khử trùng với ethanol 70 o và rửa 5 lần với dung dịch PBS cú bổ sung 1000 IU/ml penicilin, 1000 àg/ml streptomycin, 250 àg/ml gentamycin
Thu cơ quan (gan - tụy, lympho )
Tế bào tôm Nuôi cấy
Môi trường tối ưu Đánh giá tăng sinh
Không nhiễm virus WSSV, YHV, TSV
Sau đó, tiến hành thu dịch chiết cơ tôm theo quy trình như sau:
Cơ tôm được cắt nhỏ và nhuyễn trong dung dịch nước muối sinh lý 9‰ tiệt trùng với tỉ lệ 20 gram cơ tôm/10 ml dung dịch nước muối
Hỗn hợp ly tâm ở tốc độ 5.000g/phút, 30 phút, 4 o C
Thu dịch nổi và ly tâm tiếp ở tốc độ 10.000g/phút, 15 phút, 4 o C
Dịch nổi tiếp tục được thu và ly tâm ở tốc độ 13.000g/phút, 15 phút, 4 o C
Sau đú, toàn bộ dịch nổi được thu và lọc qua phin lọc 0,2àm
Dịch nổi sau khi thu được chia nhỏ vào các ống falcon 15ml, trữ ở nhiệt độ -20 o C để sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo
2.2.3 Phân lập và nuôi cấy sơ cấp tế bào tôm từ gan-tụy của tôm sú Penaeus monodon
- Quy trình phân lập và nuôi cấy tế bào tôm từ mô gan-tụy được thực hiện theo phương pháp của Uma và cs (Uma và cs, 2002)
Tôm được gây mê bằng cách sốc nhiệt trong đá lạnh 10 - 15 phút
Khử trùng tôm bằng dung dịch ethanol 70 o lạnh (2-3 lần)
Tôm được mổ và thu nhận cơ quan gan-tụy, sau đó khử trùng 2 lần bề mặt các cơ quan với ethanol 70 o
Mẫu gan-tụy được bảo quản trong đĩa petri vô trùng chứa dung dịch PBS + kháng sinh (penicillin 1000 IU/ml, streptomycin 1000 µg/ml, gentamycin 250 µg/ml) ở nhiệt độ lạnh.
Sau đó, mô gan-tụy được cắt thành những mảnh mô nhỏ và tiến hành khuấy từ, với tốc độ 600g/phút trong 3 phút
Lọc dung dịch huyền phù qua màng lọc tế bào 70m để thu tế bào tôm
Ly tâm dung dịch huyền phù ở 1,500g/phút, 5 phút, 4 o C Loại bỏ dịch nổi, thu cặn tế bào Quá trình này lặp lại 2 lần
Cặn tế bào (1x104 tế bào/giếng) được gieo vào đĩa 24 giếng để đánh giá khả năng sống sót và xác định môi trường tối ưu cho nuôi cấy tế bào gan-tụy tôm.
- Khảo sát và đánh giá môi trường nuôi cấy phù hợp cho tế bào tôm từ mô gan- tụy
Môi trường L15 bổ sung 10% FBS được nhiều nghiên cứu (Owens và Smith, 1999; Roper và cs, 2001) chứng minh là tối ưu cho nuôi cấy tế bào gan-tụy tôm, hiệu quả hơn so với nồng độ 5% và 20% FBS (Toullec, 1996) Do đó, chúng tôi lựa chọn môi trường này cho nghiên cứu.
10% FBS để tiến hành thử nghiệm nuôi cấy tế bào gan-tụy
Dịch chiết cơ tôm thúc đẩy tăng trưởng và sinh sản tế bào tôm Luedeman và Lightner (1992) chứng minh hiệu quả này trên tế bào buồng trứng của *P stylirostris* và *P vannamei* Dịch chiết này dường như cung cấp các yếu tố tăng trưởng thiết yếu cho tế bào tôm.
Nghiên cứu của Xia Liu (2014) cho thấy chất hỗ trợ ITS-X kết hợp với FBS làm tăng sinh tế bào hiệu quả hơn so với chỉ sử dụng FBS.
Nghiên cứu khảo sát khả năng sống sót và tăng sinh của tế bào gan-tụy tôm sau phân lập, sử dụng 6 nghiệm thức với các môi trường nuôi cấy khác nhau.
Nghiệm thức 1: L-15 + 10% FBS + ITS-X 0X + 0% SME
Nghiệm thức 2: L-15 + 10% FBS + ITS-X 0X + 5% SME
Nghiệm thức 3: L-15 + 10% FBS + ITS-X 0X + 10% SME
Nghiệm thức 4: L-15 + 10% FBS + ITS-X 1X + 0% SME
Nghiệm thức 5: L-15 + 10% FBS + ITS-X 1X + 5% SME
Nghiệm thức 6: L-15 + 10% FBS + ITS-X 1X + 10% SME
Tất cả cỏc nghiệm thức trờn đều bổ sung 100IU/ml penicilin, 100àg/ml streptomycin, 250àg/ml gentamycin
Môi trường nuôi cấy được thay mới sau 24 giờ phân lập ban đầu, và tiếp tục thay mới mỗi 2-3 ngày để đảm bảo điều kiện nuôi cấy tối ưu cho từng nhóm nghiên cứu.
Mỗi nghiệm thức được thực hiện với 4 giếng, và lặp lại 20 lần, nuôi cấy ở điều kiện
Nuôi cấy tế bào đến mật độ phủ 80% bề mặt đĩa để kiểm tra khả năng sống sót và xác định số lượng tế bào cần thiết cho cấy chuyền.
Nghiên cứu này đánh giá khả năng sống sót và tăng sinh của tế bào gan-tụy tôm dựa trên hình thái tế bào, đặc điểm tế bào học và mật độ tế bào trong quá trình nuôi cấy.
Hình thái tế bào và dịch nuôi cấy được theo dõi hàng ngày bằng kính hiển vi ngược, kết quả được ghi hình.
- Khảo sát đông lạnh, bảo quản dòng tế bà o
Huyền phù tế bào với mật độ 10 5 tế bào/ml trong môi trường đông lạnh
Ước lượng vào mỗi cryotube 1ml huyền phù tế bào
Lưu trữ các cryotube ở - 80°C qua đêm
Chuyển vào nitơ lỏng để lưu trữ lâu dài
- Kiểm tra hiệu quả đông lạnh
Giải đông vial chứa tế bào
Chuyển toàn bộ tế bào vào trong một falcon có chứa 15ml môi trường tăng trưởng phù hợp đã được làm ấm đến 28 o C
Ly tâm 1000-1200RPM (RCF 200-300g) trong 5 phút
Loại bỏ dịch nổi và tái huyền phù các tế bào với 1ml môi trường tăng trưởng phù hợp
Chuyển toàn bộ tế bào vào đĩa nuôi cấy với môi trường tăng trưởng phù hợp, nuôi cấy ở điều kiện 28 o C, 0%CO2
Xác định tỷ lệ sống chết của tế bào thông qua phương pháp nhuộm Trypan Blue và đếm mật độ tế bào
Xác định tình trạng nhiễm vi sinh vật
2.2.4 Phân lập và nuôi cấy sơ cấp tế bào tôm từ cơ quan lympho của tôm sú
Nghiên cứu cho thấy tế bào từ nhiều mô (cuống mắt, gan-tụy, cơ) khó nuôi cấy in vitro lâu dài (2-10 ngày), ngoại trừ tế bào lympho (cơ quan Oka) Tế bào lympho tôm tăng sinh mạnh, duy trì ổn định ít nhất 2-3 tuần, thậm chí đến 54 ngày Vì khả năng duy trì lâu dài và là mục tiêu chính của mầm bệnh, cơ quan lympho là nguồn tế bào lý tưởng cho nghiên cứu lây nhiễm.
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
1 Phân lập và nuôi cấy sơ cấp tế bào tôm từ mô gan-tụy của tôm sú P monodon
Tôm sú khỏe mạnh, không nhiễm virus, được cung cấp từ Phòng CNSH Thủy sản, Trung tâm Công nghệ sinh học TP.HCM, đạt trọng lượng tiêu chuẩn sau nuôi dưỡng Trước khi thí nghiệm, tôm được gây mê bằng sốc nhiệt (đá lạnh, 10-15 phút) và khử trùng bằng ethanol lạnh.
Mô gan-tụy tôm được giải phẫu tại 70°C và ngay lập tức được đặt vào đĩa petri vô trùng chứa PBS lạnh có kháng sinh Do tính dễ tổn thương, mô cần được xử lý và thí nghiệm ngay sau thu nhận, đồng thời khử trùng nhiều lần bằng kháng sinh để hạn chế nhiễm khuẩn Phân lập mô gan-tụy để thu nhận tế bào được thực hiện bằng phương pháp cơ học (Toullec, 1996).
Phương pháp phân tách mô gan-tụy bằng enzyme gây giảm khả năng sống sót của tế bào, không phù hợp với nghiên cứu Phân tách cơ học, đặc biệt là khuấy từ, hiệu quả hơn cho mô lỏng lẻo, giúp giải phóng nhiều tế bào hơn Vì vậy, chúng tôi đã sử dụng phương pháp khuấy từ để thu nhận tế bào gan-tụy.
Nghiên cứu khả năng sống sót của tế bào gan-tụy tôm được nuôi cấy trong 6 môi trường khác nhau nhằm xác định môi trường tối ưu cho nuôi cấy.
Nghiệm thức 5 (môi trường L-15 + 10% FBS + ITS-X 1X + 5% dịch chiết cơ tôm) là môi trường duy nhất giúp tế bào gan-tụy tôm sống sót trong 6 nghiệm thức khảo sát Kết quả này cho thấy ITS-X 1X kết hợp với 10% FBS thúc đẩy tăng sinh tế bào đáng kể.
Mỗi lô thí nghiệm được lặp lại 20 lần và các tiêu chí đánh giá của quá trình này:
2 Sự thay đổi và mức độ đồng bộ về hình thái tế bào
3 Tốc độ tăng sinh của quần thể tế bào trong môi trường nuôi cấy ở điều kiện 28 o C, 0%CO2 thông qua đánh giá cảm quan sự gia tăng số lượng tế bào trong quần thể
Nghiên cứu quan sát sự thay đổi hình thái, khả năng phân chia tế bào gan-tụy tôm và tích tụ vật chất lạ trong môi trường L-15 + 10% FBS + ITS-X 1X + 5% dịch chiết cơ tôm dưới kính hiển vi ngược vào các ngày 0, 1, 2, 4 và 6 sau khi nuôi cấy.
Thử nghiệm nuôi cấy tế bào gan-tụy tôm đạt tỉ lệ sống sót 10%, thu được một số kết quả nhất định.
Ngày 0, tế bào gan-tụy hình tròn (Ke và cs, 1996) bám xuống bề mặt nuôi cấy nhưng chưa chắc chắn Sau 4 giờ, một số tế bào bám dính, số khác vẫn trôi nổi (Hình 4).
Hình 4: Tế bào tôm gan-tụy sau khi nuôi cấy 4h (100X)
Sau ngày nuôi cấy thứ nhất, tế bào bắt đầu bám dính và thay đổi hình dạng, đồng thời xuất hiện các thể đen dạng chấm trên bề mặt đĩa nuôi cấy, tăng mật độ theo thời gian Nhuộm Giemsa cho thấy tế bào gan-tụy tôm chủ yếu là biểu mô và nguyên bào sợi.
Hình 5: Tế bào gan-tụy tôm sau 24h nuôi cấy (100X) a b
Hình 6: Hình thái của tế bào gan-tụy tôm sau 24h nuôi cấy được nhuộm Giemsa
(100X) (a) Tế bào biểu mô, (b) Nguyên bào sợi
Ngày thứ hai nuôi cấy, tế bào trải đều, bám chắc và phát triển tốt, chủ yếu là nguyên bào sợi, 40% tạo lớp đơn (Hình 7) Các thể đen vẫn tồn tại sau khi thay môi trường.
Hình 7: Tế bào gan-tụy tôm sau 2 ngày nuôi cấy (100X)
Sau 4 ngày nuôi cấy, tế bào tôm ngừng tăng sinh, giảm mật độ và xuất hiện nhiễm nấm, vi khuẩn (Hình 8,9) Nhiễm nấm trong nuôi cấy tế bào tôm đã được ghi nhận, ví dụ như nhiễm nấm trong nuôi cấy tế bào phôi (Fan và Wang, 2002) và nhiễm nấm men trong nuôi cấy tế bào lympho tôm P monodon (Hsu và cs, 1995).
Kiểm tra môi trường nuôi cấy LB trên các giếng không nhiễm trong lô thí nghiệm cho kết quả âm tính với vi sinh vật.
Hình 8: Tế bào gan-tụy tôm sau 4 ngày nuôi cấy (100X)
Hình 9: Tình trạng nhiễm nấm của môi trường nuôi cấy tế bào gan-tụy tôm
Mô gan-tụy tôm nuôi cấy sơ cấp chỉ sống sót tối đa 6 ngày, không thể cấy truyền do tế bào bị sần sùi, tăng kích thước, bong tróc, vỡ và chết.
Hình 10: Tế bào tôm gan-tụy sau 6 ngày nuôi cấy (100X)
- Khảo sát đông lạnh, bảo quản dòng tế bào gan-tụy tôm
Tế bào gan-tụy tôm có thời gian sống sót 6 ngày, giảm mật độ sau 4 ngày nuôi cấy Để bảo quản tế bào, chúng tôi tiến hành đông lạnh ở ngày thứ 3, khi tăng trưởng ổn định và chưa có hiện tượng apoptosis.
KẾT LUẬN
Nghiên cứu đã thành công trong việc phân lập tế bào gan-tụy sơ cấp từ tôm sú Penaeus monodon, với môi trường L-15 + 10% FBS + ITS-X 1X + 5% dịch chiết cơ tôm được xác định là môi trường tối ưu, hỗ trợ tăng trưởng tế bào nhanh chóng sau 24 giờ và duy trì khả năng sống sót, tăng sinh trong 6 ngày.
- Xác lập được quy trình phân lập tế bào lympho tôm từ cơ quan lympho của tôm sú
Môi trường M199 bổ sung 10% FBS và 5% dịch chiết cơ tôm (M199 + 10% FBS + 5% dịch chiết) tối ưu cho nuôi cấy tế bào lympho tôm Penaeus monodon Tế bào tăng trưởng mạnh sau 48-72 giờ và đạt mật độ tối đa ở 72 giờ.
- Tế bào lympho có thể duy trì và tồn tại trong khoảng thời gian 15 ngày với 3 lần cấy chuyền
- Tế bào lympho tôm có 3 hình dạng: tế bào tròn, tế bào nguyên bào sợi, tế bào biểu mô, trong đó nguyên bào sợi chiếm đa số
bFGF và IGF-I thúc đẩy tăng sinh tế bào lympho tôm sau 48 giờ nuôi cấy, tuy nhiên hiệu quả này không duy trì sự khác biệt đáng kể ở thời gian nuôi cấy kéo dài hơn.
KIẾN NGHỊ
Tế bào tôm có thời gian sinh trưởng ngắn, dễ nhiễm khuẩn và khó nuôi cấy lâu dài Nghiên cứu bổ sung các yếu tố tăng trưởng cho thấy tiềm năng nhưng cần nghiên cứu thêm để tối ưu môi trường nuôi cấy và kéo dài thời gian sinh trưởng của tế bào.
Khó khăn trong việc thu nhận mô lympho từ tôm thương phẩm, cộng với tình trạng nhiễm nấm, vi khuẩn và khó khăn trong xử lý vô khuẩn, đòi hỏi nghiên cứu tiếp theo về tối ưu thời gian và nồng độ yếu tố tăng trưởng, cũng như kiểm soát nhiễm khuẩn nguồn tôm.
Nghiên cứu phân lập và nuôi cấy tế bào tôm là hướng đi tiên phong tại Việt Nam, mở đường cho các nghiên cứu tương lai Đề tài đã đạt 80% tiến độ, cần nghiên cứu liên ngành để hoàn thiện quy trình và ứng dụng tế bào tôm, đề nghị Hội đồng khoa học nghiệm thu.
SẢN PHẨM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ
TT Tên sản phẩm Số lượng Chỉ tiêu kinh tế - kỹ thuật Đánh giá
1 Có được tế bào tôm sơ cấp 1 Tế bào sống trên 30 ngày
Tế bào chỉ duy trì được 15 ngày
Có được phương pháp phân lập tế bào tôm sơ cấp
Phương pháp phân lập ổn định, tế bào sơ cấp tạo ra không bị nhiễm
Có được quy trình phân lập tế bào tôm sơ cấp từ cơ quan lympho
Bài báo đăng trong hội nghị khoa học hoặc tạp chí chuyên ngành trong nước
1 Đang gửi bài báo, chờ phản biện (Tạp chí Đại học Cần Thơ)
