Phân lập, nuôi cấy tế bào gốc trung mô từ mô mỡ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƢỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH  NGUYỄN MINH PHƢƠNG PHÂN LẬP, NUÔI CẤY TẾ BÀO GỐC TRUNG MÔ TỪ MÔ MỠ Chuyên ngành: XÉT NGHIỆM Mã số: 60 72 03 33 LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP THẠC SĨ Hƣớng dẫn khoa học: PGS TS BS TRẦN CÔNG TOẠI THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH – 2016 LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu khoa học riêng Các số liệu luận văn hồn tồn trung thực chƣa cơng bố cơng trình khác Tác giả : Nguyễn Minh Phương MỤC LỤC Trang Trang phụ bìa Mục lục Các chữ viết tắt Danh mục bảng đồ thị Danh mục hình ĐẶT VẤN ĐỀ MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU Chƣơng TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU TRONG NƢỚC VÀ NGỒI NƢỚC 1.1.1 Ngoài nƣớc 1.1.2 Trong nƣớc 1.2 MÔ MỠ 1.2.1 Cấu tạo 1.2.2 Chức 10 1.2.3 Phân loại 11 1.3 TẾ BÀO GỐC TRUNG MÔ 11 1.3.1 Định nghĩa tế bào gốc 11 1.3.2 Phân loại tế bào gốc 13 1.3.3 Tế bào gốc trung mô 14 1.4 TẾ BÀO GỐC TRUNG MÔ TỪ MÔ MỠ 19 1.4.1 Giới thiệu chung 19 1.4.2 Marker bề mặt tế bào gốc trung mô 20 1.4.3 Tiềm biệt hóa 23 1.5 KỸ THUẬT NUÔI CẤY TẾ BÀO 24 1.5.1 Nuôi cấy sơ cấp 24 1.5.2 Nuôi cấy thứ cấp 25 1.6 MỘT SỐ PHƢƠNG PHÁP ĐỊNH LƢỢNG TẾ BÀO 26 1.6.1 Đếm tế bào buồng đếm hồng cầu 26 1.6.2 Kỹ thuật đếm dòng chảy tế bào (flow cytometry) 27 Chƣơng PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 28 2.1.THIẾT KẾ THÍ NGHỆM 28 2.2 ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU 28 2.3 TIÊU CHUẨN CHỌN MẪU 28 2.4 TIÊU CHUẨN LOẠI TRỪ 28 2.5 VẬT LIỆU 28 2.5.1 Dụng cụ - thiết bị 28 2.5.2 Hóa chất thí nghiệm 32 2.6 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 38 2.6.1 Phƣơng pháp thu nhận mỡ 39 2.6.2 Phƣơng pháp phân lập nuôi cấy tế bào gốc từ mô mỡ 39 2.6.3 Phƣơng pháp xác định tế bào gốc trung mô 42 2.6.3.1 Dựa vào khả bám dính 42 2.6.3.2 Dựa vào marker bề mặt 43 2.6.3.3 Dựa vào khả biệt hóa in vitro 46 Chƣơng KẾT QUẢ 51 3.1 KẾT QUẢ PHÂN LẬP VÀ NUÔI CẤY 51 3.1.1 Kết phân lập nuôi cấy 51 3.1.2 Kết đánh giá tăng sinh tế bào 52 3.2 KẾT QUẢ ĐỊNH DANH TẾ BÀO GỐC TRUNG MÔ TỪ MÔ MỠ 54 3.2.1 Đặc điểm bám dính tế bào 55 3.2.2 Kết biểu marker bề mặt 57 3.2.3 Kết biệt hóa in vitro 62 3.2.3.1 Kết biệt hóa thành tế bào mỡ 62 3.2.3.2 Kết biệt hóa thành tế bào xƣơng 65 3.2.3.3 Kết biệt hóa thành tế bào sụn 67 Chƣơng BÀN LUẬN 68 4.1 KẾT QUẢ PHÂN LẬP VÀ NUÔI CẤY 68 4.2 ĐỊNH DANH TẾ BÀO GỐC TRUNG MÔ TỪ MÔ MỠ 68 4.2.1 Khả bám dính tế bào 68 4.2.2 Kết biểu marker bề mặt 70 4.2.3 Kết biệt hóa in vitro 71 4.2.3.1 Kết biệt hóa thành tế bào mỡ 71 4.2.3.2 Kết biệt hóa thành tế bào xƣơng 72 4.2.3.3 Kết biệt hóa thành tế bào sụn 74 KẾT LUẬN 75 KIẾN NGHỊ 76 TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT TÀI LIỆU TIẾNG ANH PHỤ LỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Thuật ngữ Tiếng việt ADSC Adipose Derived Stem Cells AP Alkaline Phosphatase Tế bào gốc thu nhận từ mô mỡ Phosphatase kiềm AR Alizarin Red BAT Brown adipose tissue Mô mỡ nâu BM- MSC Bone Marrow – Mesenchymal Stem Cell Bone Marrow Progenitor Cell Tế bào gốc trung mô thu nhận từ tủy xƣơng Tế bào tiền thân tủy xƣơng Tế bào tủy xƣơng BMPC BMSC Bone Marrow Stromal Cell cAMP Cyclic adenosine monophosphate AMP vòng CD Cluster of differentiation Cụm tế bào biệt hóa CS Cộng CSC Cancer Stem Cell Tế bào gốc ung thƣ DMEM Môi trƣờng DMEM ECM Dulbecco’s Modification of Eagle’s Medium Extra Cellular Matrix EDTA Ethylene Diaminetetraacetic Acid Ex vivo FBS Fetal Bovine Serum HEPES 4-(2-hydroxyelthyl)-1-piperazineethanesulfonic acid Chất ngoại bào Thực thể Huyết bào thai bò HLA Human Leukocyte Antigen HSC Hematopoietic Stem Cell IMDM Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium Kháng nguyên bạch cầu ngƣời Tế bào gốc tạo máu Thực phịng In vitro thí nghiệm In vivo Thực thể sống Tế bào gốc vạn cảm ứng Hiệp Hội Quốc Tế cho Liệu Pháp Tế Bào iPS Induced Pluripotent Stem cell KGF The International Society for Cellular Therapy Keratinocyte Growth Factor KTBH Kích thích biệt hóa LPL Lipoprotein lipase MPC Mesenchymal Progenitor Cell MSC Mesenchymal Stem Cell PBS Phosphate Buffer Solution PLA Processed lipoaspirate RNA Ribonucleic Acid RT – PCR Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction Scanning Electron Microscopy ISCT Enzyme thủy phân chất béo Tế bào tiền thân trung mô Tế bào gốc trung mô Dung dịch đệm phosphate Tế bào từ mỡ hút đƣợc xử lý TB Phản ứng chép ngƣợc chuỗi polymer Kính hiển vi điện tử qt Trung Bình TBG Tế Bào Gốc SEM WAT White adipose tissue Mô mỡ trắng DANH MỤC BẢNG VÀ ĐỒ THỊ Bảng 2.1: Các thiết bị sử dụng nghiên cứu 29 Bảng 2.2 Các dụng cụ sử dụng thí nghiệm 30 Bảng 2.3: Các kháng nguyên bề mặt cần xác định MSC 45 Bảng 3.1 Thống kê mật độ tế bào thu đƣợc mẫu mô tiến hành phân lập 52 Bảng 3.2 Sự tăng sinh tế bào thu nhận từ mô mỡ sau lần cấy chuyền thứ 53 Bảng 3.3 Kết phân tích phần trăm tế bào mẫu số biểu dƣơng tính marker bề mặt 57 Bảng 3.4 Kết phân tích phần trăm tế bào mẫu số biểu dƣơng tính marker bề mặt 59 Bảng 3.5 Kết phân tích phần trăm tế bào mẫu số biểu dƣơng tính marker bề mặt 60 Đồ thị 3.1 Sự tăng trƣởng tế bào thu nhận từ mô mỡ sau lần cấy chuyền thứ 54 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Cấu tạo tế bào mỡ Hình 1.2 Một số vị trí tích trữ mơ mỡ phổ biến thể 10 Hình 1.3 Tiềm biệt hóa MSC thu nhận từ mơ mỡ 24 Hình 1.4 Cấu tạo buồng đếm hồng cầu vùng buồng đếm 26 Hình 2.1 Một số thiết bị dùng nghiên cứu 31 Hình 2.2 Một số dụng cụ dùng nghiên cứu 32 Hình 2.3 Sơ đồ bố trí thí nghiệm phân lập, ni cấy định danh MSC từ mô mỡ 38 Hình 3.1A Hình ảnh phân lập mẫu mơ mỡ 51 Hình 3.1B Hình ảnh phân lập mẫu mô mỡ 51 Hình 3.2 Tế bào gốc sau ngày ni cấy chai ni 55 Hình 3.3 Tế bào gốc sau ngày nuôi cấy chai ni 56 Hình 3.4 Tế bào gốc sau ngày nuôi cấy chai nuôi 56 Hình 3.5 Kết phân tích biểu marker tế bào mẫu số 58 Hình 3.6 Kết phân tích biểu marker tế bào mẫu số 59 Hình 3.7 Kết phân tích biểu marker tế bào mẫu số 60 Hình 3.8 Tế bào gốc đƣợc biệt hóa nhuộm đĩa ni 24 giếng 62 Hình 3.9 Tế bào gốc biệt hóa thành tế bào mỡ 63 Hình 3.10 Tế bào gốc biệt hóa thành tế bào mỡ nhuộm Oil Red 64 Hình 3.11 Tế bào gốc tích tụ nhiều giọt mỡ bên tế bào chất 65 Hình 3.12 Tế bào gốc biệt hóa thành tế bào xƣơng 66 Hình 3.13 Tế bào gốc biệt hóa thành tế bào sụn 67 Định nghĩa số thuật ngữ DMEM: Dulbecco’s Modification of Eagle’s Medium ISCT: International Society Cell Therapy (Hiệp hội liệu pháp tế bào quốc tế) MSC: Mesenchymal Stem Cell (Tế bào gốc trung mô) PBS: Phosphate Buffer Solution (Dung dịch đệm phosphate) Nguyên tắc Mô mỡ loại mô thể trƣởng thành đƣợc xác định có chứa tế bào gốc trƣởng thành (tế bào gốc trung mô) [2,4,5,6,8] Các tế bào gốc đƣợc phân lập khỏi mơ mỡ cách tách học ngâm hỗn hợp enzyme collagenase-Dispase Các tế bào sau đƣợc thu nhận nuôi cấy môi trƣờng nuôi cấy nhƣ DMEM/F12 có bổ sung 15% FBS kháng sinh Sau nuôi cấy ngày thay môi trƣờng nuôi lần tiến hành đem định danh tế bào Thiết bị vật liệu - Máy ly tâm lạnh - Tủ ấm CO2 - Nồi hấp tiệt trùng - Tủ sấy - Tủ thao tác vô trùng - Kính hiển vi đảo ngƣợc - Cân điện tử - Máy đo pH, Kính hiển vi quan sát đơi - Tủ lạnh 4⁰C - Tủ lạnh - 20⁰C Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn trích dẫn - Cốc thủy tinh - Bình định mức - Bình tam giác (Erlen) - Bình thủy tinh (Duran) - Bơm tiêm vô trùng:5 ml, 10 ml - Pipette man :10 µl - 100 µl, 100 µl - 1000 µl, ml- 10 ml - Ống ly tâm 15 ml - Buồng đếm hồng cầu - Màng lọc vô trùng 0,2 µm - Chai ni tế bào 25 cm2 - Đĩa nuôi tế bào 4,6,24 96 giếng - Ống bảo quản tế bào - Màng lọc tế bào (cell strainer) 70 µm, Eppendorf 0.5 mL, 1.5 mL - Đầu typ 0.1 mL (vàng), mL (xanh), 10 mL (trắng) - Đũa thủy tinh - Giấy nhôm - Parafin - Giấy lọc - Găng tay vơ trùng Hóa chất dùng để phân lập tế bào: Mg2+) Dung dịch ly giải hồng cầu Dung dịch collagenase 0.2% Dung dịch dispase 1% Dung dịch DPBS (Muối đệm phosphate khơng có ion Ca2+, Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn trích dẫn Dung dịch kháng sinh Dung dịch tách tế bào Trypsin - EDTA Môi trường nuôi cấy tế bào: Môi trường nuôi cấy bản: Sử dụng môi trƣờng DMEM/ F12-Phenol red bột bổ sung huyết thanh, kháng sinh số muối đệm Biện pháp phịng ngừa an tồn Mơ mỡ đƣợc xử lý làm tạp chất máu, xem nhƣ vật liệu truyền nhiễm bệnh Mang găng găng vơ trùng q trình vận chuyển thao tác xử lý mẫu, để tránh nhiễm khuẩn mẫu Mẫu nghiên cứu 7.1 Thu nhận mẫu Khi thu nhận vận chuyển mẫu mơ mỡ Phịng thí nghiệm bị nhiễm khuẩn Do đó, thu nhận bảo quản đƣợc mẫu mô mỡ vô trùng tiêu chí đƣợc đƣa để đảm bảo nguồn nguyên liệu cho nghiên cứu thí nghiệm 7.2  Quy trình thu nhận mẫu Mơ mỡ đƣợc thu nhận trƣờng hợp hút mỡ (trong phẫu thuật thẩm mỹ) từ vùng mô mỡ thừa điều kiện vô trùng Bệnh viện  Sau thu nhận, mẫu mơ mỡ đƣợc giữ lọ vơ trùng có chứa mơi trƣờng bảo quản mẫu DMEM/F12 có bổ sung kháng sinh (Pen/Strep) nhanh chóng chuyển mẫu phịng thí nghiệm Mẫu mơ đƣợc giữ qua đêm nhiệt độ 40C  Đánh giá nhiễm khuẩn cách quan sát môi trƣờng nuôi mẫu Nếu môi trƣờng nuôi trở nên đục đổi màu sau ngày tiến hành kiểm tra vi sinh để đánh giá tình trạng nhiễm mẫu Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn trích dẫn Quy trình thực Mẫu mơ mỡ đƣợc thu nhận DPBS – kháng sinh Rửa mẫu với dung dịch DPBS rửa máu loại bỏ mô tạp Dùng kéo cắt nhuyễn mẫu mô mỡ thành mảnh nhỏ Ủ hỗn hợp enzyme Collagenase 0.2% - Dispase 1% (tỉ lệ 1:2), 90 phút, 370 C, lắc mẫu 10 phút Ly tâm 3000 vòng/phút, 5phút, thu phần cặn lắng.Ủ Ủ dung dịch ly giải hồng cầu 8-10 phút.Ly tâm 3000 vòng/phút phút, thu phần cặn lắng, Huyền phù cặn tế bào, lọc qua phễu 70μm Ly tâm 3000 vòng/phút phút, thu phần cặn lắng Nuôi tế bào môi trƣờng nuôi cấy 370 C , 5% CO2, mật độ105 tế bào/ml Thay môi trƣờng ngày/lần Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn trích dẫn Đánh giá kết Sau phân lập ni cấy, quan sát dƣới kính hiển vi đảo ngƣợc, thấy tế bào chiếm khoảng 70-80% diện tích bề mặt chai ni đem cấy chuyền, đánh giá khả tăng sinh tiếp tục định danh tế bào Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn trích dẫn PHỤ LỤC 2: QUY TRÌNH ĐỊNH DANH TẾ BÀO GỐC TRUNG MÔ TỪ MÔ MỠ Mục tiêu: Để xác định tế bào gốc phân lập, ni cấy thu nhận đƣợc có phải tế bào gốc trung mô hay không, ta cần định danh tế bào dựa theo tiêu chí Ủy ban TBG mô trung mô Hiệp Hội liệu pháp tế bào quốc tế (International Society for Cell Therapy – ISCT) Phƣơng pháp: Phƣơng pháp đƣợc thực phƣơng pháp thực nghiệm mô tả Định danh tế bào dựa vào hình thái, biểu marker khả biệt hóa theo tiêu chuẩn ISCT Định nghĩa số thuật ngữ: AR: Thuốc nhuộm biệt hóa xƣơng Alizarin Red AP: Thuốc nhuộm biệt hóa xƣơng Alkaline phosphatase Nguyên tắc : Sau khoảng thời gian nuôi cấy, tế bào đƣợc định danh cách dựa vào tiêu chí ISCT [1]: - Dựa vào hình thái (nhuộm giemsa): giống hình thái nguyên bào sợi, tế bào có khả bám dính - Dựa vào biểu marker: CD105, CD90, CD73 dƣơng tính (95%) CD45, CD34, CD14 hay CD11b, CD79a CD19, HLA-DR âm tính (2%) phƣơng pháp flow cytometry - Dựa vào tiềm biệt hóa in vitro (được đánh giá phương pháp nhuộm in vitro): biệt hóa MSC thành tế bào mỡ (nhuộm Oil Red), biệt hóa MSC thành tế bào xƣơng (nhuộm Alizarin Red nhuộm Alkaline Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn trích dẫn phosphatase) biệt hóa MSC thành tế bào sụn (nhuộm Alcian blue) [3], [7], [9], [10] Thiết bị vật liệu: - Máy ly tâm lạnh - Tủ ấm CO2 - Nồi hấp tiệt trùng - Tủ sấy - Tủ thao tác vô trùng - Kính hiển vi đảo ngƣợc - Cân điện tử - Máy đo pH, Kính hiển vi quan sát đơi - Tủ lạnh 4⁰C - Tủ lạnh – 20⁰C - Cốc thủy tinh - Bình định mức - Bình tam giác (Erlen) - Bình thủy tinh (Duran) - Bơm tiêm vơ trùng:5 ml, 10 ml - Pipette man :10 µl - 100 µl, 100 µl - 1000 µl, ml- 10 ml - Ống ly tâm 15 ml - Buồng đếm hồng cầu - Màng lọc vơ trùng 0,2 µm - Chai nuôi tế bào 25 cm2 - Đĩa nuôi tế bào 4,6,24 96 giếng Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn trích dẫn - Ống bảo quản tế bào - Màng lọc tế bào (cell strainer) 70 µm, Eppendorf 0.5 mL, 1.5 mL - Đầu typ 0.1 mL (vàng), mL (xanh), 10 mL (trắng) - Đũa thủy tinh - Giấy nhôm - Parafin - Giấy lọc - Găng tay vô trùng Môi trường nuôi cấy bản: Sử dụng môi trƣờng DMEM/ F12-Phenol red bột bổ sung huyết thanh, kháng sinh số muối đệm Mơi trường biệt hóa: - Biệt hóa thành tế bào mỡ: Sử dụng kit thƣơng mại StemPro® Adipogenesis differentiation Kit thực theo quy trình nhà sản xuất [11] - Biệt hóa thành tế bào xương: Sử dụng kit thƣơng mại StemPro® Osteogenesis differentiation Kit thực theo quy trình nhà sản xuất [13] - Biệt hóa thành tế bào sụn: Sử dụng kit thƣơng mại StemPro® Chondrogenesis differentiation Kit thực theo quy trình nhà sản xuất [12] Hóa chất nhuộm tế bào Dung dịch đệm formalin cố định tế bào 10% Neutral Formalin Buffer (NFB) Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn trích dẫn Thuốc nhuộm Trypan blue Thuốc nhuộm trypan blue (C₃₄H₂₄N₆O₁₄S₄Na₄) đƣợc sử dụng nồng độ 0,4% (Sigma) Trypan blue độc hại nuốt hít phải Nó gây bỏng cho mắt da tiếp xúc trực tiếp Ngồi cịn hóa chất gây ung thƣ Vì cần có vật dụng bảo hộ (nhƣ găng tay, trang, kính mắt, áo blouse) thao tác với trypan blue Thuốc nhuộm Giemsa: + ml Giemsa solution + ml Methanol + ml Aid Citric + ml Na2HPO4 + Bổ sung nƣớc cất cho đủ 200 ml Thuốc nhuộm Oil- Red O:  Oil red O: 300mg  Isopropanol: 100ml Thuốc nhuộm Alizarin Red - Bột Alizarin red - Nƣớc cất : 0.2 mg : 10 ml Lắc tan hoàn toàn Lọc qua giấy lọc Whatman No.1 Bảo quản nhiệt độ phòng Thuốc nhuộm Alkaline Phosphastase :  Naphthol AS MX-PO4 0.005 g  N,N-Dimethylformamide (DMF) 200 µL  0.2 M Tris-HCL pH 8.3 25 mL Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn trích dẫn  Red Violet LB salt 0.03 g  Nƣớc cất 25 mL Thuốc nhuộm Alcian Blue: - 60 ml Ethanol (98 - 100%) - 40 ml Acetic Acid (98 - 100%) - 10 mg Alcian Blue GX Biện pháp phịng ngừa an tồn: Tế bào sau đƣợc phân lập, nuôi cấy, cấy chuyền đem định danh cần thực thao tác môi trƣờng tuyệt đối vô trùng, để tránh bị nhiễm Mang găng tay găng tay vô trùng, áo quần bảo hộ, mũ, trang vô trùng, thao tác tủ vô trùng, vật dụng phải đƣợc hấp tiệt trùng, xịt cồn 70⁰ sát trùng tủ thao tác, vật dụng, hóa chất, chai ni…trƣớc tiến hành thực hiện, để tránh mẫu tế bào nuôi bị nhiễm Mẫu nghiên cứu Sau giai đoạn phân lập, nuôi cấy, tế bào đƣợc nuôi ổn định chai ni đạt mật độ dày khoảng 70% diện tích bề mặt chai nuôi, ta bắt đầu đem định danh tế bào dựa vào tiêu chuẩn ISCT Quy trình định danh tế bào gốc trung mơ từ mô mỡ Để định danh tế bào, lần cấy chuyền thứ hai, tế bào đƣợc đánh giá theo tiêu chuẩn ISCT - Dựa vào hình thái: Tiến hành nhuộm tế bào với thuốc nhuộm giemsa nhƣ sau: + Loại bỏ môi trƣờng cũ + Rửa lại lần dung dịch PBS + Cố định tế bào dung dịch NFB 10% 45 phút + Loại bỏ dung dịch cố định rửa lần với dung dịch PBS Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn trích dẫn + Bổ sung ml dung dịch nhuộm Giemsa 15 phút + Rửa lại nƣớc cất + Quan sát, đánh giá chụp hình dƣới kính hiển vi soi ngƣợc - Dựa vào tiềm biệt hóa: + Tiến hành biệt hóa tạo mỡ Quy trình đƣợc sử dụng mơi trƣờng StemPro® Adipogenesis Differentiation Kit [11] Nhuộm Oil red O để đánh giá khả tạo mỡ, tiến hành nhuộm : Loại bỏ môi trƣờng cũ chai nuôi rửa với dung dịch DPBS lần, - Ủ tế bào với dung dịch cố định tế bào (dung dịch formalin-NFB 10%) nhiệt độ phòng, - Loại bỏ dung dịch NFB ngâm tế bào vào dung dịch Oil Red O hoạt động 10 phút, nhiệt độ phòng, - Rửa với nƣớc cất 1-2p (rửa cách nhẹ nhàng tế bào dễ bị rửa trơi khỏi bề mặt nuôi cấy bƣớc này), để khô tự nhiên, - Quan sát dƣới kính hiển vi đảo ngƣợc Kết quả: Tế bào dƣơng tính với Oil Red bắt màu màu đỏ đậm bên bào tƣơng + Tiến hành biệt hóa tạo xương Quy trình biệt hóa đƣợc sử dụng theo quy trình tham khảo nhà sản xuất (hãng Gibco) [13] - Sau tế bào tăng trƣởng khoảng 60-80% diện tích bề mặt chai ni, ta tiến hành biệt hóa - Đổ bỏ mơi trƣờng nuôi cũ chai nuôi Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn trích dẫn - Thay môi trƣờng nuôi cũ môi trƣờng biệt hóa tạo xƣơng (StemPro® Osteogenesis differentiation Kit) - Sau ngày thay mơi trƣờng biệt hóa lần Kết sau 14 ngày biệt hóa ta quan sát dƣới kính hiển vi đảo ngƣợc để đánh giá thay đổi mặt hình thái Tiến hành nhuộm:  Quy trình nhuộm Alizarin red: Tế bào sau đƣợc ni mơi trƣờng biệt hóa 14 ngày đƣợc xác định biệt hóa thành nguyên bào xƣơng với Alizarin Red - Đổ bỏ môi trƣờng nuôi, rửa đĩa nuôi dung dịch PBS, để khô - Ủ tế bào với dung dịch cố định tế bào (dung dịch formalin-NFB 10%) nhiệt độ phòng, - Loại bỏ dung dịch NFB bổ sung 1-2 giọt Alizarin vào đĩa nuôi tế bào Đợi 30 phút để calci phản ứng với thuốc nhuộm Hút bỏ thuốc nhuộm - Rửa mẫu lại dung dịch PBS lần Bổ sung vài giọt PBS vào đĩa nuôi trƣớc quan sát để tránh tế bào bị khơ - Kiểm tra mẫu nhuộm dƣới kính hiển vi đảo ngƣợc Kết quả: Tế bào biệt hóa xƣơng thành công nhuộm Alizarin red bắt màu đỏ  Quy trình nhuộm Alkaline phosphatase: Tế bào sau đƣợc ni mơi trƣờng biệt hóa 14 ngày đƣợc xác định biệt hóa thành nguyên bào xƣơng với Alkalin Phosphastase - Đổ bỏ môi trƣờng nuôi, rửa đĩa nuôi dung dịch PBS, để khô - Ủ tế bào với dung dịch cố định tế bào (dung dịch formalin-NFB 10%) nhiệt độ phòng, Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn trích dẫn - Loại bỏ dung dịch NFB bổ sung 1-2 giọt Alkalin Phosphastase vào đĩa nuôi tế bào, để tối Đợi 45 phút để calci phản ứng với thuốc nhuộm Hút bỏ thuốc nhuộm - Rửa mẫu lại dung dịch PBS lần - Rửa lại mẫu với nƣớc cất lần - Kiểm tra mẫu nhuộm dƣới kính hiển vi đảo ngƣợc Kết quả: Tế bào dƣơng tính với alkaline phosphatase bắt màu tím + Tiến hành biệt hóa tạo sụn: Quy trình đƣợc sử dụng mơi trƣờng StemPro® Chondrogenesis Differentiation Kit [12] Nhuộm Alcian blue để đánh giá khả tạo sụn, tiến hành nhƣ sau: Tế bào sau đƣợc nuôi mơi trƣờng biệt hóa 14 ngày đƣợc xác định biệt hóa thành tế bào sụn với thuốc nhuộm Alcian Blue - Đổ bỏ môi trƣờng nuôi, rửa đĩa nuôi dung dịch PBS, để khô - Ủ tế bào với dung dịch cố định tế bào (dung dịch formalin-NFB 10%) nhiệt độ phòng, - Loại bỏ dung dịch NFB bổ sung 1-2 giọt Alcian Blue 1% vào đĩa nuôi tế bào Đợi 30 phút Hút bỏ thuốc nhuộm - Rửa mẫu lại dung dịch PBS lần Rửa lại với nƣớc cất - Kiểm tra mẫu nhuộm đƣợc xem dƣới kính hiển vi đảo ngƣợc Kết quả: Tế bào dƣơng tính với Alcian blue bắt màu xanh dƣơng Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn trích dẫn - Dựa vào khả biểu marker bề mặt Chạy Flow cytometry với marker CD105, CD90, CD73, CD45, CD34, CD14 hay CD11b, CD79a hay CD19, HLA-DR để đánh giá biểu marker Dƣơng tính (95%) âm tính (2%) Kiểu hình miễn dịch MSC: CD105, CD90, CD73 dƣơng tính marker CD45, CD34, CD14 hay CD11b, CD79a hay CD19, HLA-DR âm tính Đánh giá kết Tế bào gốc trung mô thu nhận từ mô mỡ phải thỏa mãn tiêu chuẩn theo ISCT, có hình thái giống ngun bào sợi, có khả bám dính bề mặt nuôi cấy, biểu đƣợc marker bề mặt đặc trƣng cho tế bào gốc trung mơ, có khả biệt hóa thành tế bào mỡ, sụn xƣơng 10 Tài liệu tham khảo Dominici, M, Le Blanc, K, Mueller, I, Slaper-Cortenbach, I, Marini, F, Krause, D, Deans, R, Keating, A, Prockop, D, and Horwitz, E (2006) Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells The International Society for Cellular Therapy position statement Cytotherapy, volume (4), pp.315–317 Dubois SG et al (2008) Isolation of human adipose-derived stem cell from biopsies and liposuction specimens Methods Mol Biol Chapter 449, pp.69-79 Gimble J M., Guilak F (2003), Differentiation potential of adipose derived adult stem (ADAS) cells, Current Topics in Developmental Biology, chapter 58, pp.137–160 Gimble J., Guilak F (2003), Adipose-derived adult stem cells: isolation, characterization, and differentiation potential, Cytotherapy, chapter 5, pp 362–369 Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn trích dẫn Michelle Locke, John Windsor, P Rod Dunbar (2009) Human adiposederived stem cells: isolation, characterization and applications in surgery ANZ J Surg, chapter 79, pp 235–244 Niemelä SM, Miettinen S, Konttinen Y, Waris T, Kellomäki M, Ashammakhi NA, Ylikomi T (2007) Fat tissue: views on reconstruction and exploitation J Craniofac Surg Mar, volume 18 (2), pp 325-335 Pittenger MF et al (1999) Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cell Science (New York, N.Y) chapter 284, pp 143-147 Sen A et al (2001) Adipogenic potential of human adipose derived stromal cells from multiple donors is heterogeneous J Cell Biochem Chapter 8311, pp 2-319 Yanxia Zhu, Tianqing Liu, Kedong Song, Xiubo Fan, Xuehu Ma, Zhanfeng Cui (2008), Adipose-derived stem cell: a better stem cell than bone marrow stem cell, Cell Biochemistry Function, chapter 26, pp 664–675 10 Zuk P.A Zhu M Mizuno H Huang J Futrell J.W Katz A.J Benhaim P Lorenz H.P Hedrick M.H (2001) Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies Tissue Eng, chapter 7, pp 211 11 StemPro® Adipogenesis differentiation Kit, Publication Number MAN0000693, Rev 2.00, 2014 12 StemPro® Chondrogenesis differentiation Kit, Publication Number MAN0000696, Rev 2.00, 2014 13 StemPro® Osteogenesis differentiation Kit, Publication Number MAN0000694, Rev 2.00, 2014 Tuân thủ Luật Sở hữu trí tuệ Quy định truy cập tài liệu điện tử Ghi rõ nguồn trích dẫn ... tế bào tế bào gốc nhƣ tế bào nội mạch, nguyên 20 bào sợi, tế bào máu, tế bào tiền thân tạo mỡ tế bào quanh mao mạch Để phân lập tế bào gốc trung mô khỏi tế bào khác, tế bào đƣợc nuôi bề mặt nuôi. .. loại tế bào khác tìm thấy phân đoạn mạch nền, bao gồm đại thực bào, nguyên bào sợi, tế bào ngoại mạch ,tế bào máu, tế bào nội mô, tiền bào mỡ, tế bào gốc trung mô từ mô mỡ [7] Tỷ lệ số lƣợng tế bào. .. pháp phân lập nuôi cấy tế bào gốc từ mô mỡ - Phân lập tế bào gốc từ mô mỡ Nguyên tắc Các tế bào động vật khối mô liên kết chặt chẽ với với chất ngoại bào nhờ liên kết protein hình thành tế bào