Nuôi cấy dòng tế bào mô sẹo nhằm mục đích nhân giống vô tính cây tam thất hoang panax stipuleanatus h t tsai et k m feng

BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH -CHƯƠNG TRÌNH KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP CƠ SỞ BÁO CÁO TỔNG HỢP KẾT QUẢ ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC NI CẤY DỊNG TẾ BÀO MƠ SẸO NHẰM MỤC ĐÍCH NHÂN GIỐNG VƠ TÍNH CÂY TAM THẤT HOANG (PANAX STIPULEANATUS H.T.TSAI ET K.M.FENG) Cơ quan chủ trì nhiệm vụ: Khoa Dược Chủ trì nhiệm vụ: TS Nguyễn Thị Ngọc Hương ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH CHƯƠNG TRÌNH KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP CƠ SỞ BÁO CÁO TỔNG HỢP KẾT QUẢ NHIỆM VỤ NGHIÊN CỨU KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ NI CẤY DỊNG TẾ BÀO MƠ SẸO NHẰM MỤC ĐÍCH NHÂN GIỐNG VƠ TÍNH CÂY TAM THẤT HOANG PANAX STIPULEANATUS H.T.TSAI ET K.M.FENG (Đã chỉnh sửa theo kết luận Hội đồng nghiệm thu ngày 18/10/2022) Cơ quan chủ quản Chủ trì nhiệm vụ (ký tên đóng dấu) (ký tên) Nguyễn Thị Ngọc Hương Cơ quan chủ trì nhiệm vụ (ký tên đóng dấu) MỤC LỤC MỤC LỤC i DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT i ĐẶT VẤN ĐỀ 1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan Tam thất hoang .3 1.1.1 Vị trí phân loại phân bố .3 1.1.2 Đặc điểm hình thái 1.1.3 Chu kỳ phát triển 1.1.4 Thành phần hóa học Tam thất hoang 1.1.5 Tác dụng dược lý công dụng .5 1.1.6 Acid oleanolic 1.1.7 Các nghiên cứu Tam thất hoang 1.2 Phát sinh hình thái thực vật 1.2.1 Sự phát triển thực vật 1.2.2 Sự khử phân hóa hình thành mơ sẹo thực vật 1.2.3 Sự phát sinh phơi vơ tính CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 10 2.1 VẬT LIỆU 10 2.2 PHƯƠNG PHÁP 11 2.2.1 Phân tích chu kỳ tăng trưởng dịng mơ sẹo từ thân rễ 11 2.2.2 Cảm ứng tạo phôi soma chồi bất định 13 2.2.3 Xử lý thống kê 15 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 16 3.1 Chu kỳ tăng trưởng dịng mơ sẹo từ thân rễ 16 3.1.1 Ảnh hưởng 2,4-D nồng độ khác hình thành ổn định mô sẹo 16 i 3.1.2 Ảnh hưởng thời gian cấy chuyền kích thước sinh lý tế bào mô sẹo 18 3.1.3 Đặc điểm sinh lý dịng tế bào mơ sẹo (cường độ hô hấp, hàm lượng đường, tinh bột) 23 3.2 Tạo phôi soma chồi bất định 25 3.2.1 Ảnh hưởng NAA nồng độ khác lên tạo phơi chồi 25 3.2.2 Xác định kích thước tỷ lệ tế bào mơ sẹo có khả sinh phôi .26 3.3 Nội dung : Tạo hồn chỉnh từ phơi chồi 29 3.3.1 Kiểm soát tăng trưởng phôi chồi thành BA GA3 29 3.3.2 Ảnh hưởng nồng độ NAA lên phát sinh rễ Tam thất hoang in vitro .32 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 35 3.1 KẾT LUẬN 35 3.2 KIẾN NGHỊ .36 TÀI LIỆU THAM KHẢO 40 ii DANH MỤC HÌNH Hình 1……………………………………………………….……Trang Hình 2………………………………………………………….…Trang 10 Hình 3…………………………………………………………… Trang 16 Hình 4…………………………………………………………… Trang 20 Hình 5…………………………………………………………… Trang 27 Hình 6…………………………………………… …………… Trang 29 Hình 7…………………………………………………………….Trang 30 DANH MỤC BẢNG Bảng 1……………………………………………………………Trang 17 Bảng 2……………………………………………………………Trang 25 Bảng 3……………………………………………………………Trang 33 DANH MỤC BIỂU ĐỒ Biểu đồ 1…………………………………………………………Trang 21 Biểu đồ 2…………………………………………………………Trang 22 Biểu đồ 3…………………………………………………………Trang 24 Biểu đồ 4…………………………………………………………Trang 26 Biểu đồ 5…………………………………………………………Trang 31 Biểu đồ 6…………………………………………………………Trang 34 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT 2,4-D: acid 2,4-Dichlorophenoxy acetic ABA: acid abcisic BA: benzyl adenin B5: Gamborg GA3: acid gibberellic IAA: acid indol acetic IBA: acid indol butyric MS: Murashige Skoog NAA: acid naphthalene acetic SH: Schenk and Hildebrandt TLT: Trọng lượng tươi TLK: Trọng lượng khô iii ĐẶT VẤN ĐỀ Tam thất hoang (Panax stipuleanatus H.T.Tsai et K.M.Feng) loài thuốc thuộc chi Panax, họ Ngũ gia bì Araliaceae [17] Trong ngành y học cổ truyền Việt Nam, thân rễ loài xem dược liệu quý với khả tăng cường thể lực, trí nhớ, giảm nguy bị ung thư thể [25] Những nghiên cứu gần giới cho thấy saponin thuộc nhóm oleanane polyacetylen từ rễ thân rễ Tam thất hoang hợp chất có khả kìm hãm hoạt động số dịng tế bào ung thư [35], [36] Với công dụng trên, nhu cầu sử dụng thân rễ Tam thất hoang tăng nhanh theo thời gian Tuy nhiên, việc thu hoạch thân rễ loài Tam thất đồng ruộng phải từ đến năm [17] Ngoài ra, để đảm bảo chất lượng thân rễ cần kiểm sốt chặt chẽ nhiều yếu tố mơi trường đất trồng, điều kiện nhiệt độ, khí hậu, mầm bệnh sâu bệnh [45] Vì vậy, Việt Nam, Tam thất hoang bị săn lùng khai thác cách bừa bãi khiến cho số lượng cá thể bị giảm sút nghiêm trọng Theo sách đỏ Việt Nam, Tam thất hoang loài cực có nguy bị tuyệt chủng [8] Tuy nhiên, việc nhân giống Tam thất hoang chủ yếu theo phương pháp giâm hom từ đoạn thân rễ với hệ số nhân thấp phụ thuộc nhiều vào số lượng, chất lượng nguồn vật liệu thân rễ vốn khan tự nhiên Với phát triển kỹ thuật nuôi cấy mô, tế bào thực vật, việc nhân giống phôi vô tính thơng qua mơ sẹo ngày thể ưu điểm vượt trội như: từ quan (rễ, thân, lá…) mẹ ban đầu tạo dịng mơ sẹo có khả sinh phơi với sinh khối lớn, dẫn đến hệ số nhân giống cao, đồng mặt di truyền, bệnh không phụ thuộc vào thời tiết mùa vụ Từ đó, chủ động nguồn giống, gia tăng suất trồng Trong nhiều năm qua, việc tạo phơi vơ tính để nhân giống loài thuốc quý thuộc chi Panax Nhân sâm (Panax ginseng C.A.Mey), sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.), Tam thất (Panax notoginseng (Burk.) F.H.Chen) nhà khoa học quan tâm nghiên cứu đạt nhiều thành tựu Tuy nhiên, Tam thất hoang, việc ni cấy tế bào mơ sẹo có khả sinh phơi cịn hạn chế chưa có nhiều nghiên cứu cơng bố nước giới Vì vậy, đề tài này, tập trung nghiên cứu đặc điểm sinh lý, kích thước chu kỳ tăng trưởng mơ sẹo nhằm trì dịng tế bào mơ sẹo tăng trưởng ổn định, có khả phát sinh phơi vơ tính Từ đó, tạo số lượng lớn cụm chồi in vitro phát triển tốt môi trường nuôi cấy phù hợp, hướng tới phục vụ công tác nhân giống phơi vơ tính quy mơ lớn loài thuốc quý tương lai CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan Tam thất hoang 1.1.1 Vị trí phân loại phân bố Cây Tam thất hoang (Panax stipuleanatus H.T.Tsai et K.M.Feng, Ảnh 1.1) hay Dã tam thất 11 loài phổ biến chi Panax định danh (Bảng 1.1) [20], [26] Tam thất hoang ưa ẩm ưa sáng, mọc rải rác đất có nhiều mùn, tán rừng kín thường xanh ẩm, độ cao 1600-2300 m Cây thường phân bố tỉnh phía Nam Trung Quốc (Vân Nam) phía Bắc Việt Nam Ở Việt Nam, Tam thất hoang phân bố chủ yếu tỉnh Lào Cai (Sa Pa Bát Xát: núi Hoàng Liên Sơn), Hà Giang (Xín Mần, Hồng Su Phì) [14], [17] Do trạng phá rừng làm nương rẫy với việc thường xuyên bị tìm kiếm, khai thác, Tam thất hoang đứng trước nguy tuyệt chủng quần thể loài bị suy giảm nghiêm trọng Cùng với Sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus), Tam thất hoang Sách đỏ Việt Nam xếp vào mức nguy cấp [8] Hình Cây Tam thất hoang (Panax stipuleanatus H.T.Tsai et K.M.Feng) trồng phương pháp giâm hom vườn quốc gia Hoàng Liên, huyện Sa Pa, tỉnh Lào Cai * Vị trí phân loại Tam thất hoang loài thuộc chi Panax [20], [26] Giới Thực vật (Plantae) Ngành Ngọc lan (Magnoliophyta) Lớp Ngọc lan (Magnoliopsida) Bộ Hoa tán (Apiales) Họ Ngũ gia bì (Araliaceae) Phân họ Ngũ gia bì (Aralioideae) Chi Sâm (Panax) Các lồi Panax notoginseng (San Qi) Panax bipinnatifidus (Seem.) Panax ginseng (C.A Meyer) Panax japonicus (C.A Meyer) Panax quinquefolium (C.A Meyer) Panax vietnamensis (Ha and Grushv) Panax wangianum (Suu) Panax zingiberensis (Wu and Feng.) Panax pseudoginseng (Wall) Panax stipuleanatus (H.T.Tsai et K.M.Feng) Panax trifolium L 1.1.2 Đặc điểm hình thái Cây thân thảo cao 25-75 cm; thân rễ mập, nằm ngang, có nhiều sẹo lõm vết thân rụng để lại, phân nhánh Mỗi khóm thường có thân mang Lá kép chân vịt, gồm 1-3 mọc vòng ngọn; cuống dài 5-10 cm Mỗi kép gồm chét có cuống ngắn, hình thn hay mác thn, dài 5-13 cm, rộng 2-4 cm nhọn đầu Cuống hoa dài 1-1,5 cm Hoa màu vàng xanh với đài nhỏ, cánh hoa, nhị bầu nhụy ngăn Quả mọng hình cầu dẹt, đường kính 0,6-1,2 cm, mang 1-2 hạt màu xám trắng [17] Hình Cây Tam thất hoang in vitro sau tuần cấy chuyền sang mơi trường SH có bổ sung NAA nồng độ mg/L (A), mg/L (B), mg/L (C), mg/L (D) Thanh ngang cm Bảng Chỉ số tăng trưởng Tam thất hoang in vitro sau tuần cấy môi trường SH có bổ sung NAA nồng độ khác Nồng độ NAA (mg/L) Tỷ lệ rễ (%) 0,00 ± 0,00 b 16,67 ± 16,67 b 60,67 ± 7,37 a 64,00 ± 5,81 a Chiều dài rễ (cm) Chiều cao (cm) Khối lượng tươi (g) 2,10 ± 0,15 b 3,20 ± 0,25 a 2,13 ± 0,14 b 2,30 ± 0,10 c 2,32 ± 0,11 c 3,46 ± 0,23 a 2,80 ± 0,05 b 1,35 ± 0,03 c 1,36 ± 0,02 b 2,30 ± 0,06 a 2,05 ± 0,04 b Các số trung bình cột với ký tự khác biệt theo sau khác biệt mức xác suất p=0,05 Mối quan hệ chiều dài rễ với chiều cao khối lượng tươi Tam thất hoang in vitro, dựa liệu thu nhận từ mẫu riêng lẻ, thể thông qua biểu đồ tương quan đa biến (Biểu đồ 6) Phân tích tương quan cho thấy phát sinh rễ Tam thất hoang có mối liên hệ chặt chẽ với sinh trưởng mẫu cấy in vitro, thông qua hệ số tương quan lớn 0,7 Hơn nữa, 33 mẫu Tam thất hoang ni cấy mơi trường khống (SH) đường nhau, sinh khối mẫu cấy tăng có ý nghĩa nghiệm thức có bổ sung NAA (Bảng 3) Điều cho thấy, NAA ngồi việc giúp tạo rễ (vốn không xảy mẫu môi trường khơng bổ sung NAA) cịn làm gia tăng sinh khối mẫu cấy Từ kết đạt được, việc bổ sung mg/L NAA vào mơi trường cảm ứng hình thành rễ Tam thất hoang phù hợp cho tăng trưởng chiều cao, khối lượng chiều dài rễ Sự phát sinh rễ tốt môi trường giúp cho phát triển tốt, khỏe, nâng cao khả tỷ lệ sống in vitro Biểu đồ Sự tương quan chiều dài rễ, chiều cao khối lượng tươi Tam thất hoang in vitro sau tuần cấy mơi trường SH có bổ sung NAA nồng độ 0, 1, mg/L 34 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 3.1 KẾT LUẬN Phân tích chu kỳ tăng trưởng dịng mơ sẹo từ thân rễ - Mơi trường MS ½ có bổ sung 2,4-D 0,5 mg/L phù hợp cho hình thành tăng sinh mô sẹo thân rễ Tam thất hoang - Chu kỳ tăng trưởng mô sẹo • Giai đoạn 1: từ đến tuần, mơ sẹo tích lũy chất khơ, gia tăng đường nội sinh, tế bào phân chia mạnh, nhóm tế bào kích thc 20 àm cú t l cao (74,2 %) ã Giai đoạn 2: từ đến tuần, mô sẹo tăng nhanh trọng lượng tươi, tế bào tăng rộng, nhóm tế bào kích thước 20 µm có tỷ lệ thấp (dưới 1,9 %) • Giai đoạn 3: từ đến 12 tuần, mô sẹo ngừng tăng trọng lượng khô tuần ngừng tăng trọng lượng tươi tuần 12, khơng cịn diện nhóm tế bào 20 µm - Cấy chuyền mô sẹo tuần lần (trên mơi trường tạo sẹo) để tạo dịng tế bào mô sẹo tăng trưởng ổn định Cảm ứng tạo phơi soma chồi bất định - Nhóm tế bào có khả sinh phơi (kích thước 16 – 20 μm) diện nhiều (62%) môi trường NAA 0,5 mg/L sau tuần nuôi cấy - Phôi chồi hình thành từ mơ sẹo 26 tuần tuổi (ở thời điểm tuần sau cấy chuyền) môi trường NAA 0,5 mg/L sau 24 tuần với tỷ lệ 13,33 % Tạo hồn chỉnh từ phơi chồi - Mơi trường dinh dưỡng khống SH có bổ sung 0,5 mg/L BA mg/L GA3 giúp in vitro tăng chiều cao khối lượng tươi tốt môi trường khác - Bổ sung NAA mg/L giúp hình thành rễ tốt 35 3.2 KIẾN NGHỊ - Tiếp tục nghiên cứu ảnh hưởng loại auxin, môi trường nuôi cấy lên tạo phôi mô sẹo thân rễ Tam thất hoang nhằm tăng tỷ lệ mẫu cấy tạo phôi - Khảo sát thêm điều kiện nuôi cấy in vitro giúp tăng cường sức chống chịu con, hướng tới việc tăng tỷ lệ sống giai đoạn vườn ươm 36 PHỤ LỤC SẢN PHẨM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CỦA ĐỀ TÀI Dạng I: 100 cụm chồi Hình Cây cụm chồi Tam thất hoang in vitro Hình 10 Cây cụm chồi Tam thất hoang 18 tháng tuổi chuẩn bị để đưa huấn luyện vườn ươm 37 Dạng II: Quy trình tạo dịng mơ sẹo Tam thất hoang có khả tái sinh phơi, chồi Phương pháp tái sinh con, cụm chồi in vitro từ mô sẹo Lát cắt thân rễ Tam thất hoang dày 3-5 mm ni mơi trường MS ½ có bổ sung 2,4-D 0,5 mg/L để kích thích tạo mơ sẹo Mô sẹo tuần tuổi tách khỏi mô mẹ cấy chuyền tuần lần (trên mơi trường tạo sẹo) để tạo dịng tế bào mơ sẹo tăng trưởng ổn định Chuyển mô sẹo 26 tuần tuổi thời điểm sau cấy chuyền tuần sang mơi trường MS ½ có bổ sung NAA 0,5 mg/L để tạo tế bào có khả sinh phơi (kích thước 16 – 20 μm) sau 24 tuần Các cấu trúc giống phôi chuyển sang môi trường MS ½ có bổ sung có bổ sung BA 0,5 mg/L GA3 mg/L để hình thành cụm chồi Hình 11 Quy trình tạo dịng mơ sẹo Tam thất hoang có khả tái sinh phơi chồi 38 Phương pháp tái sinh cụm chồi in vitro a Tạo mô sẹo từ thân rễ Tam thất hoang mơi trường MS ½ có bổ sung 2,4-D 0,5 mg/L b Cấy chuyền mô sẹo tuần lần (trên môi trường tạo sẹo) để tạo dịng tế bào mơ sẹo tăng trưởng ổn định c Chuyển mô sẹo 26 tuần tuổi thời điểm sau cấy chuyền tuần sang môi trường MS ½ có bổ sung NAA 0,5 mg/L để tạo tế bào có khả sinh phơi d Chuyển cấu trúc giống phơi sang mơi trường MS ½ có bổ sung có bổ sung BA 0,5 mg/L GA3 mg/L để hình thành cụm chồi e Cây chồi chuyển sang môi trường SH có bổ sung BA 0,5 mg/L GA3 mg/L nhằm đạt chiều cao khối lượng cao f Bổ sung NAA mg/L để chồi tạo rễ tốt 39 TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT Bùi Trang Việt (1992) Tìm hiểu hoạt động chất điều hòa sinh trưởng thực vật thiên nhiên tượng rụng" bông" và" trái non" Tiêu (Piper nigrum L.) Tập san khoa học ĐHTH TPHCM 155-165 Bùi Trang Việt (2016) Sinh lý thực vật đại cương: NXB ĐHQG-HCM Dương Tấn Nhựt, Vũ Quốc Luận, Nguyễn Văn Bình, Phạm Thanh Phong, Bùi Ngọc Huy, Đặng Thị Ngọc Hà, Phan Quốc Tâm, Nguyễn Bá Nam, Vũ Thị Hiền, Bùi Thế Vinh, Lâm Thị Mỹ Hằng, Dương Thị Mộng Ngọc, Lâm Bích Thảo, Trần Công Luận (2009) Một số yếu tố ảnh hưởng đến sinh khối cuả sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) nuôi cấy in vitro bước đầu phân tích hàm lượng saponin Tạp chí Cơng nghệ Sinh học 7(3) 357-370 Hồ Thanh Tâm, Nguyễn Bá Nam, Ngô Thanh Tài, Nguyễn Việt Cường, Nguyễn Phúc Huy, Trần Thị Hương, Trần Hiếu, Nguyễn Thị Nhật Linh, Hoàng Chiến Xuân, Lê Kim Cương Dương Tấn Nhựt (2015) Optimization of culture conditions and medium composition for adventitious root induction from leaves of Panax vietnamensis Ha et Grushv Tạp chí Cơng nghệ Sinh học Việt Nam, 13, 865–873 Hương, L T., Linh, N N., Minh, B M., Hạnh, H H., Huệ, H T T., Hải, N V., Huân, H V., & Hiền, L T T (2018) Application of DNA barcodes in identification of ginseng samples in the genus Panax L Vietnam Journal of Biotechnology, 15(1), 63–72 Lưu, T H T (2018) Bước đầu đánh giá tác dụng chống Oxy hóa ức chế enzym AchE sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus seem.) tam thất hoang (Panax stipuleanatus HT Tsai et KM Feng) thực nghiệm (Doctoral dissertation, H.: ĐHQGHN, Khoa Y-Dược) 40 Nguyễn Bảo Triệu, Nguyễn Thanh Tùng, Trương Thị Bích Phượng (2013) Ni cấy in vitro sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) Hue University Journal of Science (HU JOS) 79(1) Nguyễn Tiến Bân (2009) Sách đỏ Việt Nam (Phần II Thực Vật): NXB Khoa học tự nhiên Công nghệ Hà Nội Nguyễn Thị Liễu, Nguyễn Trung Thành, Nguyễn Văn Kết (2011) Nghiên cứu khả tạo rễ bất định sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis, Ha et Grushv.) nuôi cấy in vitro VNU Journal of Science: Natural Sciences Technology 27(1) 10 Nguyễn Thị Ngọc Hương, Trần Hùng, Trương Thị Đẹp (2016) Tìm hiểu biến đổi hình thái phát sinh rễ Tam thất hoang (Panax stipuleanatus H.T.Tsai et K.M.Feng) ni cấy in vitro bước đầu định tính oleanolic acid rễ tạo thành Công Nghệ Sinh Học, 14(1):49-54 11 Nguyễn Thị Ngọc Hương, Trần Hùng Trương Thị Đẹp (2018), Biến Đổi Hình Thái Trong Phát Sinh Phôi Soma Thông qua Nuôi Cấy Mô Sẹo Tam Thất Hoang (Panax Stipuleanatus H.T.Tsai et K.M.Feng) Tạp chí cơng nghệ sinh học, 16, 279–284 12 Nguyễn Thị Ngọc Hương, Trần Hùng Trương Thị Đẹp (2018), Nghiên Cứu Sự Hình Thành Rễ Từ Cuống Lá Cây Tam Thất Hoang (Panax Stipuleanatus H.T.Tsai et K.M.Feng) in Vitro Bước Đầu Định Lượng Saponin Tồn Phần Trong Rễ Tạo Thành Tạp chí Y học TP HCM, 22, 45–51 13 Nguyễn Thị Ngọc Hương, Trần Hùng Trương Thị Đẹp (2021) Nuôi cấy dịng tế bào mơ sẹo Tam thất hoang (Panax stipuleanatus H T Tsai et K M Feng) để tạo phơi vơ tính Y học thành phố Hồ Chí Minh, 25, 20–28 14 Nguyễn Văn Tập, Phạm Thanh Huyền, Lê Thanh Sơn (2012) Kết nghiên cứu phân bố, sinh thái sâm Vũ Diệp Tam thất hoang Việt Nam Tạp chí Dược liệu 177-180 41 15 Trần Cơng Luận (2002) Nghiên cứu thành phần hóa học số tác dụng dược lý loài sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) tam thất hoang (Panax stipuleanatus Tsai et Feng) Tạp chí Dược liệu 8(2) 9394 16 Trần Công Luận, Lưu Thảo Nguyên, Nguyễn Tập (2009) Nghiên cứu thành phần hóa học hai lồi sâm vũ diệp (Panax bipinnatifidus Seem.) tam thất hoang (Panax stipuleanatus H Tsai et KM Feng) Tạp chí Dược liệu 14(1) 17-23 17 Võ Văn Chi (2012) Từ điển thuốc Việt Nam (Vol 2): Nhà xuất Y học 18 Vũ Thị Hiền, Vũ Quốc Luận, Nguyễn Phúc Huy, Nguyễn Bá Nam, Nguyễn Thị Kim Loan, Nguyễn Thanh Sang, Vũ Thị Thủy, Nguyễn Hồng Hoang, Thái Xuân Du Dương Tấn Nhựt (2015) Sử dụng kỹ thuật nuôi cấy lớp mỏng tế bào nghiên cứu trình phát sinh hình thái sâm Ngọc Linh (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) in vitro Tạp chí Khoa học Phát triển, 13, 657–664 TÀI LIỆU TIẾNG NƯỚC NGOÀI 19 Adil, M., Jeong, B R (2018) In vitro cultivation of Panax ginseng C A Meyer Ind Crops Prod., 122, 239–251 20 Alessandra de Sousa B., Margareth de Fátima F., de ALMEIDA R N (2009) Recent advances in the use of Panax ginseng as an analgesic: a systematic review Boletín Latinoamericano y del Caribe de Plantas Medicinales y Aromáticas 8(3) 188-194 21 Arya, S., Liu, J R., & Eriksson, T (1991) Plant regeneration from protoplasts of Panax ginseng (CA Meyer) through somatic embryogenesis Plant cell reports, 10(6), 277-281 22 Aslam J, Khan SA, Cheruth AJ, MujibA, Sharma MP, Srivastava PS (2011) Somatic embryogenesis, scanning electron microscopy, histology and biochemical analysis at different developing stages of embryogenesis 42 in six date palm (Phoenix dactylifera L.) cultivars Saudi Journal of Biological Sciences,18(4):369-380, 2011 23 Avci, S., & Can, E (2006) Efficient somatic embryogenesis from immature inflorescences of Dallisgrass (Paspalum Dilatatum Poir.) Prop Orn Plants, 6, 134-139 24 Bednarczyk-Cwynar B., Ruszkowski P., Bobkiewicz-Kozlowska T., Zaprutko L (2016) Oleanolic acid A-lactams inhibit the growth of HeLa, KB, MCF-7 and Hep-G2 cancer cell lines at micromolar concentrations Anti-Cancer Agents in Medicinal Chemistry (Formerly Current Medicinal Chemistry-Anti-Cancer Agents) 16(5) 579-592 25 Bich D., Chung D., Chuong B., Dong N., Dam D., Hien P., Lo V., Mai P., Man P., Nhu D (2004) The medicinal plants and animals in Vietnam Hanoi Science and Technology Publishing House, Hanoi 224 26 Bloch R (1941) Wound healing in higher plants The Botanical Review 7(2) 110 27 Borkird C, Choi JH, Sung R (1986) Effect of 2,4-D on the expression of embryogenic program in carrot Plant Physiol, 81:1143-1146 28 Cruz, G S., Canhoto, J M., & Abreu, M A V (1990) Somatic embryogenesis and plant regeneration from zygotic embryos of Feijoa sellowiana Berg Plant Science, 66(2), 263-270 29 Hunková, J., Gajdošová, A., Szabóová, M (2020) Effect of mesos components (MgSO4, CaCl2, KH2PO4) on in vitro shoot growth of blackberry, blueberry, and saskatoon Plants, 9, 1–8 30 Gamborg, O L., Miller, R A., Ojima, K (1968) Nutrient requirements of suspension cultures of soybean root cells Exp Cell Res., 50, 151–158 31 Ikeuchi M., Sugimoto K., Iwase A (2013) Plant callus: mechanisms of induction and repression The Plant Cell 25(9) 3159-3173 43 32 Jopling C., Boue S., Belmonte J C I (2011) Dedifferentiation, transdifferentiation and reprogramming: three routes to regeneration Nature reviews Molecular cell biology 12(2) 79 33 Krishnamurthy K (2015) Growth and Development in Plants (Textbook Series: 21st Century Biology and Agriculture): Scientific Publishers ISBN: 9386237202 34 Lazzeri, P A., Hildebrand, D F., & Collins, G B (1987) Soybean somatic embryogenesis: effects of hormones and culture manipulations Plant Cell, Tissue and Organ Culture, 10(3), 197-208 35 Liang C., Ding Y., Kim J A., Yang S Y., Boo H.-J., Kang H.-K., Nguyen M C., Kim Y H (2011) Polyacetylenes from Panax stipuleanatus and their Cytotoxic Effects on Human Cancer Cells Notes 32(9) 3513 36 Liang C., Ding Y., Nguyen H T., Kim J.-A., Boo H.-J., Kang H.-K., Nguyen M C., Kim Y H (2010) Oleanane-type triterpenoids from Panax stipuleanatus and their anticancer activities Bioorganic medicinal chemistry letters 20(23) 7110-7115 37 Liang C., Ding Y., Song S B., Kim J A., Cuong N M., Ma J Y., Kim Y H (2013) Oleanane-triterpenoids from Panax stipuleanatus inhibit NFκB Journal of ginseng research 37(1) 74 38 Maadon SN, Rohani ER, Ismail I, Baharum SN, Normah MN (2016) Somatic embryogenesis and metabolic differences between embryogenic and non-embryogenic structures in mangosteen Plant Cell, Tissue and Organ Culture (PCTOC), 127(2), 443-459 39 Masuko T., Minami A., Iwasaki N., Majima T., Nishimura S.-I., Lee Y C (2005) Carbohydrate analysis by a phenol–sulfuric acid method in microplate format Analytical biochemistry 339(1) 69-72 40 Miller G L (1959) Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugar Analytical chemistry 31(3) 426-428 44 41 Murashige T., Skoog F (1962) A revised medium for rapid growth and bio assays with tobacco tissue cultures Physiologia plantarum 15(3) 473497 42 Nagata T., Takebe I (1971) Plating of isolated tobacco mesophyll protoplasts on agar medium Planta 99(1) 12-20 43 Nhut, D T., Huy, N P., Luan, V Q., van Binh, N., Nam, N B., Thuy, L N M., Ha, D.T N., Chien, H X., Huong, T T., van Cuong, H., et al (2011), Shoot regeneration and micropropagation of Panax vietnamensis Ha et Grushv from ex vitro leaf-derived callus African J Biotechnol., 10, 19499–19504 44 Poothong, S., Reed, B M (2014) Modeling the effects of mineral nutrition for improving growth and development of micropropagated red raspberries Sci Hortic (Amsterdam), 165, 132–141 45 Paek K.-Y., Murthy H N., Hahn E.-J., Zhong J.-J (2009) Large scale culture of ginseng adventitious roots for production of ginsenosides Biotechnology in China I (pp 151-176): Springer 46 Quiroz-figueroa F; Fuentes-cerda, CFJ, Rojas-herrera R, Loyolavargas VM (2012) Histological studies on the developmental stages and differentiation of two different somatic embryogenesis systems of Coffea arabica Plant Cell Reports, 20(12):1141-1149, 2002 47 Ribas, AF, Dechamp E, Champion A, et al (2011) Agrobacteriummediated genetic transformation of Coffea arabica (L.) is greatly enhanced by using established mbryogenic callus cultures BMC Plant Biology, 11(1):1-15 48 Ng TLM, Karim R, Tan YS, Teh HF, Danial AD, Ho LS, et al (2016) Amino acid and secondary metabolite production in embryogenic and nonembryogenic callus of fingerroot ginger (Boesenbergia rotunda) PloS one, 11(6):e0156714 45 49 Sandal I, Kumar A, Bhattacharya A, Sharma M, Shanker M, Ahuja PS (2005) Gradual depletion of 2,4-D in the culture medium for indirect shoot regeneration from leaf explants of Camellia sinesis (L) Plant Growth Regulation, 47(2-3):121-127 50 Schmitt P, Mandonnet E, Perdreau A (2013) Effects of slice thickness and head rotation when measuring glioma sizes on MRI: in support versus two largest diameters methods J Neurooncol, 112(2):165-172 51 Schenk, R O Y U.; Hildebrandt, A C (1972) Medium and techniques for induction and growth of monocotyledonous and dicotyledonous plant cell cultures Can J Bot., 50, 199–233 52 Song X., Liu C.-C., Hong Y.-R., Zhu X.-C (2015) Anticancer activity of novel oleanolic acid methyl ester derivative in HeLa cervical cancer cells is mediated through apoptosis induction and reactive oxygen species production Bangladesh Journal of Pharmacology 10(4) 896-902 53 Steward F., Mapes M O., Mears K (1958) Growth and organized development of cultured cells II Organization in cultures grown from freely suspended cell American Journal of Botany 45(10) 705-708 54 Sugimoto K., Gordon S P., Meyerowitz E M (2011) Regeneration in plants and animals: dedifferentiation, transdifferentiation, or just differentiation? , Trends in cell biology 21(4) 212-218 55 Takhtajan A (2009) Flowering plants: Springer Science & Business Media ISBN: 1402096097 56 Uchendu, E E., Paliyath, G., Brown, D C W., Saxena, P K (2011) in vitro propagation of north American ginseng (Panax quinquefolius L.) Vitr Cell Dev Biol., 47, 710 - 718 57 White, P R (1963) Controlled differentiation in a plant tissue culture Bull Torrey Bot Club, 86, 507 - 660 46 58 Yang C., Jiang Z., Zhou J., Kasai R., Tanaka O (1985) Two new oleanolic acid-type saponins from Panax stipuleanatus Acta Botanica Yunnanica 7(1) 103-108 59 Taiz, L & Zeiger, E (2002) Plant Physiology, 3rd Edition Benjamin Cummings Publishing Company, California 60 You, X.L., Tan, X., Dai, J.L., Li, Y.H., Choi, Y.E., 2012 Large-scale somatic embryogenesis and regeneration of Panax notoginseng Plant Cell Tiss Organ Cult, 108(2): 333-338 47