Nghiên cứu ứng dụng giải trình tự gene để phát hiện các đột biến kháng thuốc kháng sinh của vi khuẩn helicobacter pylori

ỦY BAN NHÂN DÂN THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH SỞ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP HỒ CHÍ MINH CHƯƠNG TRÌNH KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP THÀNH PHỐ BÁO CÁO TỔNG HỢP KẾT QUẢ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ NHIỆM VỤ NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG GIẢI TRÌNH TỰ GENE ĐỂ PHÁT HIỆN CÁC ĐỘT BIẾN KHÁNG THUỐC KHÁNG SINH CỦA VI KHUẨN Helicobacter pylori Cơ quan chủ trì nhiệm vụ: ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP HỒ CHÍ MINH Chủ nhiệm nhiệm vụ: TRẦN THIỆN TRUNG Thành phố Hồ Chí Minh – 2022 ỦY BAN NHÂN DÂN THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH SỞ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP HỒ CHÍ MINH CHƯƠNG TRÌNH KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP THÀNH PHỐ BÁO CÁO TỔNG HỢP KẾT QUẢ KHOA HỌC CÔNG NGHỆ NHIỆM VỤ NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG GIẢI TRÌNH TỰ GENE ĐỂ PHÁT HIỆN CÁC ĐỘT BIẾN KHÁNG THUỐC KHÁNG SINH CỦA VI KHUẨN Helicobacter pylori Chủ nhiệm nhiệm vụ (ký tên) Trần Thiện Trung Cơ quan chủ trì nhiệm vụ (ký tên đóng dấu) Thành phố Hồ Chí Minh - 2022 ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH CỘNG HỒ XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập - Tự - Hạnh phúc TP Hồ Chí Minh, ngày 24 tháng 01 năm 2022 BÁO CÁO THỐNG KÊ KẾT QUẢ THỰC HIỆN NHIỆM VỤ NGHIÊN CỨU KH&CN I THÔNG TIN CHUNG Tên nhiệm vụ: Nghiên cứu ứng dụng giải trình tự gene để phát đột biến kháng thuốc kháng sinh vi khuẩn Helicobacter pylori Thuộc: Chương trình/lĩnh vực (tên chương trình/lĩnh vực): Chủ nhiệm nhiệm vụ: Họ tên: TRẦN THIỆN TRUNG Ngày, tháng, năm sinh: 1959 Nam/ Nữ: Nam Học hàm, học vị: Tiến sỹ Y học Chức danh khoa học: Giáo sư Chức vụ: Điện thoại: Tổ chức: (84.8) 38558411 Mobile: 0903645659 Nhà riêng: 0238538781 Fax: (84.8) 8552304 E-mail: drtranthientrung@ yahoo.com Tên tổ chức cơng tác: Đại học Y Dược thành phố Hồ Chí Minh Địa tổ chức: 217 Hồng Bàng, quận 5, Thành phố Hồ Chí Minh Địa nhà riêng: 44 Phước Hưng, Phường 8, Quận 5, Tp Hồ Chí Minh Tổ chức chủ trì nhiệm vụ: Tên tổ chức chủ trì nhiệm vụ: Đại học Y Dược thành phố Hồ Chí Minh Điện thoại: (84.8) 38558411 E-mail: yds@hcm.vnn.vn Fax: (84.8) 8552304 Website: www.bvdaihoc.com.vn Địa chỉ: 215 Hồng Bàng, quận 5, Thành phố Hồ Chí Minh Họ tên thủ trưởng tổ chức: PGS TS BS Nguyễn Hoàng Bắc Số tài khoản: 3713.0.1057277.00000 Kho bạc: Nhà nước Quận 5, thành phố Hồ Chí Minh Tên quan chủ quản đề tài: Sở Khoa học Cơng nghệ TP Hồ Chí Minh II TÌNH HÌNH THỰC HIỆN Thời gian thực nhiệm vụ: - Theo Hợp đồng ký kết: từ tháng 08/ năm 2019 đến tháng 08/ năm 2021 - Thực tế thực hiện: từ tháng 08/năm 2019 đến tháng 01/năm 2022 - Được gia hạn (nếu có): - Lần từ tháng 08 năm 2021 đến tháng 02 năm 2022 - Lần … Kinh phí sử dụng kinh phí: a) Tổng số kinh phí thực hiện: 2.652 tr.đ, đó: + Kính phí hỗ trợ từ ngân sách khoa học: 2.652 tr.đ + Kinh phí từ nguồn khác: tr.đ b) Tình hình cấp sử dụng kinh phí từ nguồn ngân sách khoa học: Số Theo kế hoạch Thực tế đạt Ghi Thời gian Kinh phí Thời gian Kinh phí (Số đề nghị (Tháng, năm) (Tr.đ) (Tháng, năm) (Tr.đ) toán) 08/2019 1.326 08/2020 1.326 1.326 10/2020 1.060 08/2021 1.060 1.060 TT … c) Kết sử dụng kinh phí theo khoản chi: Đối với đề tài: Đơn vị tính: Triệu đồng Số Nội dung TT khoản chi Theo kế hoạch Thực tế đạt Tổng NSKH Nguồn khác Tổng NSKH Nguồn khác Công lao động trực tiếp (khoa học, phổ thông) 640,275700 640,275700 640,275700 640,275700 Nguyên liệu, nhiên liệu, vật liệu, phụ tùng 554,28 554,28 554,28 554,28 Điều tra, khảo sát 31,40874 31,40874 31,40874 31,40874 Văn phòng phẩm in ấn 10,101091 10,101091 10,101091 10,101091 Hội thảo khoa học 19,7 19,7 19,7 19,7 Chi Hội đồng tư vấn 10,85 10,85 10,85 10,85 Dịch vụ thuê phục vụ nghiên cứu 1.133,3 1.133,3 1.133,3 1.133,3 Quản lý chung nhiệm vụ KH&CN quan chủ trì 99,929411 99,929411 99,929411 99,929411 Chi khác 127,084469 127,084469 127,084469 127,084469 10 Quản lý chung nhiệm vụ KH&CN 125 125 125 125 2652 2652 2652 2652 Tổng cộng - Lý thay đổi (nếu có): Các văn hành trình thực đề tài/dự án: (Liệt kê định, văn quan quản lý từ cơng đoạn xét duyệt, phê duyệt kinh phí, hợp đồng, điều chỉnh (thời gian, nội dung, kinh phí thực có); văn tổ chức chủ trì nhiệm vụ (đơn, kiến nghị điều chỉnh có) Số Số, thời gian ban hành văn Tên văn 572/QĐ-SKHCN, ngày 01/07/2019 Quyết định: việc phê duyệt nhiệm vụ nghiên cứu khoa học công nghệ 374/ĐHYD-HĐĐĐ, ngày 30/07/2019 Chấp thuận Hội đồng đạo đức nghiên cứu Y Sinh học Đại học Y Dược TP Hồ Chí Minh 51/2019/HĐQPTKHCN, ngày 07/08/2019 Hợp đồng thực nhiệm vụ nghiên cứu khoa học công nghệ 417/HĐ-ĐHYD, ngày 23/08/2019 Hợp đồng nghiên cứu khoa học 418/HĐ-ĐHYD, ngày 23/08/2019 Hợp đồng giao khoán chun mơn 01/HĐ-HP, ngày 30/08/2019 Hợp đồng th khốn chuyên môn 941/QĐ-SKHCN, ngày 04/10/2019 Quyết định: việc phê duyệt kế hoạch lựa chọn nhà thầu nhiệm vụ “Nghiên cứu ứng dụng giải trình tự gene để phát đột biến kháng thuốc kháng sinh vi khuẩn Helicobacter pylori” 36/2019/HĐ-KT ngày 15/11/2019 Hợp đồng kinh tế: Cung cấp hóa chất, nguyên vật liệu TT Ghi 02/2020/HĐ-KT ngày 17/02/2020 Hợp đồng kinh tế: Dịch vụ giải trình tự gene, ngoại kiểm, ni cấy làm kháng sinh đồ 10 538/QĐ-SKHCN Quyết định: việc điều chỉnh Quyết định số 572/QĐ-SKHCN ngày 01 tháng năm 2019 Sở Khoa học Công nghệ 11 72/2021/PLHĐQKHCN Phụ lục: Hợp đồng thực nhiệm Gia hạn thời vụ nghiên cứu khoa học công nghệ, gian thực ngày 30/08/2021 đề tài Gia hạn thời gian thực đề tài Tổ chức phối hợp thực nhiệm vụ: Số TT Tên tổ chức đăng ký theo Thuyết minh Tên tổ chức tham gia thực Nội dung tham gia chủ yếu Bệnh viện Đại học Y Dược TP Hồ Chí Minh Cơ sở Bệnh viện Đại - Thu mẫu học Y Dược TP Hồ Chí Minh Cơ sở & Sản phẩm chủ yếu đạt 377 mẫu sinh thiết dương tính với H pylori Ghi chú* Trung tâm Đào tạo Chẩn đoán Y Sinh học phân tử Trung tâm Đào - Phát H tạo Chẩn pylori đoán Y Sinh học PCR phân tử - Tối ưu qui trình nhân gene kháng thuốc kháng sinh - Phát H pylori định kiểu gene cagA & vacA 377 mẫu - Tối ưu qui trình nhân gene kháng thuốc kháng sinh - Phân tích đột biến kháng thuốc kháng sinh - Lý thay đổi (nếu có): Cá nhân tham gia thực nhiệm vụ: (Người tham gia thực đề tài thuộc tổ chức chủ trì quan phối hợp, không 10 người kể chủ nhiệm) Số TT Tên cá nhân đăng ký theo Thuyết minh Tên cá nhân tham gia thực Nội dung tham gia Trần Thiện Trung Trần Thiện Trung Chủ nhiệm đề tài; Chịu trách nhiệm điều phối thực đề tài Nguyễn Tuấn Anh Nguyễn Tuấn Anh Chịu trách nhiệm thực nội dung Sản phẩm chủ yếu đạt - Thu mẫu Ghi chú* nghiên cứu đề tài - Phát H pylori định kiểu gene cagA & vacA - Tối ưu qui trình nhân gene kháng - Đọc đột biến kháng thuốc Trần Anh Minh Trần Anh Minh Chịu trách nhiệm nội dung lấy mẫu - Thu mẫu Trần Thiện Khiêm Trần Thiện Khiêm Chịu trách nhiệm nội dung lấy mẫu - Thu mẫu Quách Hữu Lộc Quách Hữu Lộc Chịu trách nhiệm nội dung lấy mẫu - Thu mẫu Quách Trọng Đức Quách Trọng Đức Chịu trách nhiệm nội dung lấy mẫu - Thu mẫu Cao Minh Nga Cao Minh Nga Thư ký - Tổng hợp kết đề tài - Tài đề tài Nguyễn Thanh Danh Nguyễn Thanh Danh Thực - Thu mẫu số khâu kỹ - PCR phát thuật đề tài H pylori định kiểu gene cagA & vacA Ngô Đông Kha Ngô Đông Kha Thực - Thu mẫu số khâu kỹ - PCR phát thuật đề tài H pylori định kiểu gene cagA & vacA - Lý thay đổi ( có): Tình hình hợp tác quốc tế: Số TT Theo kế hoạch Thực tế đạt (Nội dung, thời gian, kinh phí, địa điểm, tên tổ chức hợp tác, số đoàn, số lượng người tham gia ) (Nội dung, thời gian, kinh phí, địa điểm, tên tổ chức hợp tác, số đoàn, số lượng người tham gia ) Ghi chú* - Lý thay đổi (nếu có): Tình hình tổ chức hội thảo, hội nghị: Số TT Theo kế hoạch Thực tế đạt (Nội dung, thời gian, kinh phí, địa điểm ) (Nội dung, thời gian, kinh phí, địa điểm ) Ghi chú* 95 biến đơn kép vùng làm suy yếu tương tác 16S rRNA với thuốc, dẫn đến khả kháng tetracycline Nghiên cứu chứng cho thấy 100% chủng khảo sát (110/110) có kiểu hình nhạy với tetracyclin E-test; giải trình tự gene ghi nhận đột biến gene 16S rRNA Điều cho thấy khả tích lũy đột biến gene 16S rRNA chủng H pylori Việt Nam chưa đủ để chủng thể tính kháng kiểu hình Đặc biệt, có đột biến vị trí coi quan trọng cho tính kháng tetracyclin AAG965-967 thành cGA tGA Ngồi ra, nghiên cứu cịn phát đột biến vị trí C762t, C1120t C1200t Các đột biến liên quan đến nucleotide (19,4%; 73/377) phát nhiều so với đột biến xảy đồng thời vị trí khác (5,6%; 21/377) Các nghiên cứu giới cho thấy đột biến gene 16S rRNA liên quan đến kháng thuốc tetracycline H pylori bao gồm G360a, G383a, delG771, delG942/T C1121t, nhiên đột biến không phát mẫu nghiên cứu chứng Tương tự trường hợp metronidazole, liệu không cho phép đánh giá phù hợp hai phương pháp E-test giải trình tự gene 16S rRNA, tất mẫu khảo sát có kiểu hình nhạy với tetracycline Tuy nhiên, nghiên cứu chứng cho thấy phương pháp giải trình tự gene Sanger giúp phát nhiều đột biến điểm gene 16S rRNA bao gồm C762t, AGA965-967, C1120t C1200t Các đột biến có khả liên quan đến tính kháng thuốc tetracycline vi khuẩn Helicobacter pylori Việt Nam cần làm rõ nghiên cứu 96 3.5.6 Đột biến gene pbp1A kiểu hình kháng amoxicillin H pylori kháng amoxicillin mối quan tâm hàng đầu nằm phác đồ đầu tay, dùng để tiệt trừ H pylori kết hợp với kháng sinh khác chất ức chế bơm proton [57, 58] Những nghiện cứu gần đề nghị tính kháng amoxicillin H pylori kết thay đổi chủ yếu gene pbp1A [14, 58-60] Sự thay amino acid vùng acyl transpeptidase protein PBP1A có vai trị quan trọng cho tính kháng với amoxicillin [59, 60], đặc biệt thay F473L gần phát nhân tố di truyền quan trọng cho tính kháng amoxicillin chủng H pylori Campuchia [61] Tuy nhiên, chế khác liên quan đến gia tăng giá trị MIC đóng góp vào mức độ kháng amoxicillin chủng H pylori kháng amoxicillin, ví dụ giảm tính thấm màng thay đổi protein porin (HopC, HopH), gia tăng hoạt động bơm đẩy kháng sinh khỏi tế bào, chí giảm khả liên kết kháng sinh với protein PBP khác, ví dụ PBP2 [62, 63] Trong nghiên cứu này, phát tỷ lệ H pylori kháng amoxicillin cao Việt Nam [64] Để phát đột biến gene pbp1A chịu trách nhiệm cho tính kháng amoxicillin, trình tự pbp1A phân tích Chúng tơi đánh giá xuất tất đột biến xuất vùng gene giải trình tự, chủ yếu bao phủ vùng BPB-motif thứ (STGK338-341 | AGCACCGGTAAG), thứ (SKN402-404 | AGTAAAAAC) thứ (KTG555-557 | AAAACGGGG) Các đột biến nằm hay gần motif gắn penicillin pbp1A tạo tính kháng amoxicillin H pylori [60] Kết cho thấy bên cạnh diện đột biến y văn giới nói đến tạo nên tính kháng với amoxicillin S543R (0,125 – 0,5 mg/L), E406A, T556S (1 – mg/L) hay N562T (1 – mg/L) Tuy nhiên, điều đặc biệt phát đột biến chủng có kiểu hình kháng amoxicillin, đột biến vị trí amino acid 366, 414, ins 464-465, 469, 473, 97 479 ins 595-596 Trong số này, đột biến thay Ser414 thành Arg chứng minh nhân tố chủ đạo tính kháng amoxicillin chủng Hardenberg phương pháp gây đột biến điểm (site-directed mutagenesis) [59] phổ biến chủng kháng amoxicillin lâm sàng phương pháp biến nạp tự nhiên [60, 65] Sự thay Phe366 thành Leu báo cáo diện chủng lâm sàng SZ79 kháng amoxicillin kết hợp với thay Ser414 thành Arg [60] Phe473 phát chủng H pylori nhạy với amoxicillin xuất chủng thí nghiệm kháng amoxicillin điều kiện khơng có đột biến thay Ser414 thành Arg [14]; Val473 phổ biến mẫu kháng amoxicillin điều kiện có đột biến thay Ser414 thành Arg nghiên cứu chứng [64] Mặc dù, chứng cho thấy thay đổi amino acid tạo tính kháng amoxicillin thay đổi tùy theo nguồn gốc địa lý chủng vi khuẩn H pylori [14], liệu khẳng định vai trò kết hợp nhiều đột biến thay amino acid đột biến nhiều locus khác tính kháng amoxicillin [60] Để khám phá mối liên hệ, kết hợp đột biến khác trình tự pbp1A kháng amoxicillin, chứng xây dựng phân lồi dựa 85 trình tự phân đoạn gene pbp1A thu nghiên cứu Kết xây dựng phát lồi dựa trình tự gene pbp1A cho thấy khả tính kháng amoxicillin H pylori Việt Nam chế khác chi phối bên cạnh xuất đột biến gene pbp1A, số nghiên cứu khác cho thấy chế kháng kháng sinh khác đóng góp vai trị quan trọng tính kháng amoxicillin vi khuẩn H pylori [60] 98 Hình 3.50 Cây phát sinh loài xây dựng từ 85 trình tự pbp1A 3.6 NGOẠI KIỂM Kết so sánh với kit HelicoDR (Hain LifeSciences, Germany) thể sau: 3.6.1 Phát đột biến kháng clarithromycin Kết so sánh việc phát đột biến kháng clarithromycin giải trình tự gene 23S rRNA phương pháp lai phân tử (kit HelicoDR, Hain LifeSciences, Germany) thể Bảng 3.48 99 Bảng 3.48 So sánh giải trình tự gene 23S rRNA kit HelicoDR Giải trình tự gene 23S rRNA HelicoDR + Tổng p Kappa A2142G+A2143G A2142G A2143G + - Tổng + - Tổng + 49 49 20 22