Nghiên cứu lên men chủng candida bombicola từ rỉ đường và dầu đậu nành để thu nhận sophorolipid nhằm ứng dụng cho mỹ phẩm

ỦY BAN NHÂN DÂN ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HCM TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH SỞ KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ CHƯƠNG TRÌNH KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CẤP THÀNH PHỐ BÁO CÁO TỔNG HỢP KẾT QUẢ NHIỆM VỤ NGHIÊN CỨU KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ “NGHIÊN CỨU LÊN MEN CHỦNG Candida bombicola TỪ RỈ ĐƯỜNG VÀ DẦU ĐẬU NÀNH ĐỂ THU NHẬN SOPHOROLIPIDS NHẰM ỨNG DỤNG CHO MỸ PHẨM” Cơ quan chủ trì nhiệm vụ: Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Đại học Quốc gia Tp HCM Chủ nhiệm nhiệm vụ: TS Nguyễn Thị Bạch Huệ Thành phố Hồ Chí Minh - 2019 ỦY BAN NHÂN DÂN ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HCM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN SỞ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ CHƯƠNG TRÌNH KHOA HỌC VÀ CƠNG NGHỆ CẤP THÀNH PHỐ BÁO CÁO TỔNG HỢP KẾT QUẢ NHIỆM VỤ NGHIÊN CỨU KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ “NGHIÊN CỨU LÊN MEN CHỦNG Candida bombicola TỪ RỈ ĐƯỜNG VÀ DẦU ĐẬU NÀNH ĐỂ THU NHẬN SOPHOROLIPIDS NHẰM ỨNG DỤNG CHO MỸ PHẨM” (Đã chỉnh sửa theo kết luận Hội đồng nghiệm thu ngày 23/04/2019) Chủ nhiệm nhiệm vụ: TS Nguyễn Thị Bạch Huệ Cơ quan chủ trì nhiệm vụ Thành phố Hồ Chí Minh - 2019 ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HCM TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN TP HCM CỘNG HOÀ XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM Độc lập - Tự - Hạnh phúc Tp HCM, ngày 23 tháng 04 năm 2019 BÁO CÁO THỐNG KÊ KẾT QUẢ THỰC HIỆN NHIỆM VỤ NGHIÊN CỨU KH&CN I THÔNG TIN CHUNG Tên nhiệm vụ: “Nghiên cứu lên men chủng Candida bombicola từ rỉ đường dầu đậu nành để thu nhận sophorolipid nhằm ứng dụng cho mỹ phẩm” Thuộc: Chương trình/lĩnh vực: Cơng nghệ sinh học Chủ nhiệm nhiệm vụ: Họ tên: NGUYỄN THỊ BẠCH HUỆ Ngày, tháng, năm sinh: 01/09/1980 Nam/ Nữ: Nữ Học hàm, học vị: Tiến sỹ Chức danh khoa học: Chức vụ Điện thoại: Tổ chức: 028.54439.63 Nhà riêng: Mobile: 0903914179 Fax: (84.8) 3.8350096 E-mail: ntbhue@hcmus.edu.vn Tên tổ chức công tác: Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQG Tp HCM Địa tổ chức: 227 Nguyễn Văn Cừ, P 4, Q 5, Tp HCM Địa nhà riêng: 443/35A Lê Văn Sỹ, P 12, Q 3, Tp HCM Tổ chức chủ trì nhiệm vụ: Tên tổ chức chủ trì nhiệm vụ: Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQG Tp HCM Điện thoại: (84.8) 38353.193 Fax: (84.8) 3.8350096 Website: http://hcmus.edu.vn/ Địa chỉ: 227 Nguyễn Văn Cừ, P.4, Q.5, Tp Hồ Chí Minh Họ tên thủ trưởng tổ chức: GS TS Trần Linh Thước Số tài khoản: 3713.0.1056908.00000 Tên quan chủ quản đề tài: Trường Đại học Khoa học Tự nhiên II TÌNH HÌNH THỰC HIỆN Thời gian thực nhiệm vụ: - Theo Hợp đồng ký kết: từ tháng 11/ 2016 đến 11/2018 - Thực tế thực hiện: từ tháng 11/2016 đến 05/2019 - Được gia hạn (nếu có): - Lần từ tháng 12/2018 đến 05/2019 Kinh phí sử dụng kinh phí: a) Tổng số kinh phí thực hiện: 560 triệu đồng, đó: + Kính phí hỗ trợ từ ngân sách khoa học: 560 triệu đồng + Kinh phí từ nguồn khác: triệu đồng b) Tình hình cấp sử dụng kinh phí từ nguồn ngân sách khoa học: Theo kế hoạch Thực tế đạt Số Ghi (Số đề nghị Thời gian Kinh phí Thời gian Kinh phí (Tháng, năm) (Tr.đ) (Tháng, năm) (Tr.đ) 11/2016 280 triệu 11/2016 280 triệu 280 triệu 11/2017 224 triệu 3/2019 224 triệu 224 triệu 11/2018 56 triệu 5/2019 54,5 triệu 54,5 triệu TT toán) c) Kết sử dụng kinh phí theo khoản chi: Đối với đề tài: Đơn vị tính: Triệu đồng Theo kế hoạch Số Nội dung TT khoản chi Tổng Thực tế đạt Nguồn NSKH Tổng NSKH khác khác Trả công lao động (khoa học, phổ 292,638.5 292,638.5 292,638.5 292,638.5 205,340 205,340 205,340 205,340 62,021.5 62,021.5 60,521.5 60,521.5 thông) Nguyên, vật liệu, lượng Thiết bị, máy móc Xây dựng, sửa chữa nhỏ Chi khác Tổng cộng Nguồn Các văn hành q trình thực đề tài/dự án: (Liệt kê định, văn quan quản lý từ công đoạn xét duyệt, phê duyệt kinh phí, hợp đồng, điều chỉnh (thời gian, nội dung, kinh phí thực có); văn tổ chức chủ trì nhiệm vụ (đơn, kiến nghị điều chỉnh có) Số Số, thời gian ban hành TT văn 58/2018/PLHĐ-SKHCN, Tên văn Phụ lục gia hạn Hợp đồng Ghi Gia hạn thời gian thực đề tài thêm 06 tháng, ngày 30/10/2018 từ 12/2018 đến 05/2019 Tổ chức phối hợp thực nhiệm vụ: khơng có Cá nhân tham gia thực nhiệm vụ: (Người tham gia thực đề tài thuộc tổ chức chủ trì quan phối hợp, không 10 người kể chủ nhiệm) Tên cá Tên cá Nội nhân dung tham gia tham thực gia TS TS 1, 3, - Điều kiện thích hợp cho lên men sản Nguyễn Nguyễn 4, xuất SL từ chủng C bombicola sử dụng Thị Bạch Thị Bạch Huệ Huệ nhân Số TT đăng ký theo Thuyết minh Sản phẩm chủ yếu đạt nguồn chất rỉ đường dầu đậu nành - Quy trình lên men mẻ lên men mẻ bổ sung sản xuất SL quy mô lít bioreactor lít - Quy trình tách chiết SL để hiệu suất thu nhận SL từ dịch lên men C bombicola Ghi chú* Đạt cao - Báo cáo đánh giá, tổng kết đề tài 1, 2, - Điều kiện thích hợp cho lên men sản TS TS Nguyễn Nguyễn xuất SL từ chủng C bombicola sử dụng Hoàng Hoàng nguồn chất rỉ đường dầu đậu nành Dũng Dũng - Điều kiện tối ưu cho quy trình sản xuất Đạt SL - Báo cáo đánh giá, tổng kết đề tài 5, - Cấu trúc SL thu nhận TS TS Hồng Hồng - Kết đặc tính sinh lý, sinh hóa Quốc Quốc SL thu nhận Khánh Khánh TS Trần TS Trần Thị Thị Thanh Thanh Loan Loan TS TS Nguyễn Nguyễn Thị Thảo Thị Thảo Trân Trân ThS Lê ThS Lê Quỳnh Quỳnh xuất SL từ chủng C bombicola sử dụng Loan Loan nguồn chất rỉ đường dầu đậu nành 5, - Cấu trúc SL thu nhận Đạt Đạt - Kết đặc tính sinh lý, sinh hóa SL thu nhận - Kết đặc tính sinh lý, sinh hóa Đạt SL thu nhận 1, - Điều kiện thích hợp cho lên men sản Đạt - Cấu trúc SL thu nhận 1, 5, - Điều kiện thích hợp cho lên men sản CN Lê CN Lê Phước Phước xuất SL từ chủng C bombicola sử dụng Thọ Thọ nguồn chất rỉ đường dầu đậu nành Đạt - Cấu trúc SL thu nhận - Kết đặc tính sinh lý, sinh hóa SL thu nhận 3, - Quy trình lên men mẻ lên men mẻ CN CN Hoàng Hoàng bổ sung sản xuất SL quy mơ lít Trọng Trọng bioreactor lít Minh Minh - Quy trình tách chiết SL để hiệu suất thu Quân Quân nhận SL từ dịch lên men C bombicola Đạt cao CN Ngô CN Ngô Đức Duy Đức Duy 1, - Điều kiện thích hợp cho lên men sản Đạt xuất SL từ chủng C bombicola sử dụng nguồn chất rỉ đường dầu đậu nành - Cấu trúc SL thu nhận 3, - Quy trình lên men mẻ lên men mẻ CN CN Dương Dương Thị Thị Thanh Thanh - Quy trình tách chiết SL để hiệu suất thu Thảo Thảo nhận SL từ dịch lên men C bombicola bổ sung sản xuất SL quy mơ lít bioreactor lít cao Tình hình hợp tác quốc tế: khơng có Tình hình tổ chức hội thảo, hội nghị: khơng có Đạt Tóm tắt nội dung, công việc chủ yếu: (Nêu mục 15 thuyết minh, không bao gồm: Hội thảo khoa học, điều tra khảo sát nước nước ngoài) Thời gian Số (Bắt đầu, kết thúc Các nội dung, công việc - tháng … năm) chủ yếu TT (Các mốc đánh giá chủ yếu) Theo kế Thực tế đạt hoạch Người, quan thực Nội dung 1: Khảo sát trình lên Từ 12/2016 Từ 12/2016 Huệ, Dũng, men sản xuất SL từ chủng đến 03/2017 đến 03/2017 Loan, Thọ, C.bombicola sử dụng nguồn Duy chất rỉ đường dầu đậu nành Nội dung 2: Tối ưu hóa quy trình Từ 04/2017 Từ 04/2017 Dũng, Loan, sản xuất SL, khảo sát yếu tố đến 06/2017 đến 06/2017 Duy Nội dung 3: Thiết lập quy trình lên Từ 07/2017 Từ 07/2017 Huệ, Khánh, men sản xuất SL quy mô đến 09/2017 đến 12/2017 Quân, Thảo ảnh hưởng đếnsinh trưởng C bombicola sản lượng SL bioreactor 2-5lít cho hiệu suất thu nhận SL cao Nội dung 4: Tối ưu hóa quy trình Từ 10/2017 Từ 07/2017 Huệ, Quân, tách chiết SL để hiệu suất thu nhận đến 12/2017 đến 12/2017 Thảo Nội dung 5: Xác định thành phần Từ 01/2018 Từ 01/2018 Khánh, Loan, cấu trúc SL thu nhận đến 03/2018 đến 03/2018 Thọ Duy SL từ dịch lên men C bombicola cao 7 Nội dung 6: Xác định đặc tính Từ 04/2018 Từ 04/2018 Khánh, Loan, sinh lý, sinh hóa SL thu nhận đến 08/2018 đến 08/2018 Trân, Thọ Nội dung 7: Báo cáo tổng kết đề Từ 09/2018 Từ 09/2018 Huệ, Dũng tài Phân tích, tổng hợp kết đến 11/2018 đến 03/2019 quả, dẫn liệu Trên sở đánh giá, xây dựng quy trình sản xuất SL Viết báo cáo tổng kết III SẢN PHẨM KH&CN CỦA NHIỆM VỤ Sản phẩm KH&CN tạo ra: a) Sản phẩm Dạng I: broth 1:1:1, (v:v:v) with SL extraction efficiency and fat removal capacity from 90% and 97%, respectively, while the total SL and soybean oil in fermentation broth is not exceeded than 20% The recovery performance of solvents: ethyl acetate, methanol, petroleum ether in SL extraction process are from 91 – 92%, 78 – 83%, 32 – 43%, respectively (with content of SL and soybean oil from to 20%) The obtained SL 100 mg/ml has shown a high antimicrobial activity, the highest resistance to Bacillus spizizenii (13.67 ± 0.58 mm), then relatively high resistance to Staphylococcus aureus (12.67 ± 1.15 mm), Pseudomonas aeruginosa (11.33 ± 0.58 mm) and Escherichia coli (9.67 ± 0.58 mm) The antioxidant capacity of SL is highly performed with an IC50 of 6.024 mg/ml These results indicate that SL is one of the most promising microbial biosurfactant with highly potential applications in cosmetics, detergents and other commercial applications related to surfactants Key words: antioxidant, antibacterial, Candida bombicola, extraction, solvent, sophorolipid Classification number: 2.8 Đặt vấn đề Sophorolipid (SL) chất hoạt động bề mặt sinh học thuộc nhóm glycolipid, phân tử lưỡng cực gồm nhóm disaccharide sophorose liên kết với gốc hydroxyl carbon kề cuối mạch chuỗi acid béo C16 – C18 [1] Tác dụng SL khả làm giảm sức căng bề chất lỏng chất lỏng, chất rắn chất khí, chúng kết hợp phân tán dễ dàng nước chất lỏng khác SLcó ưu điểm so với chất hoạt động bề mặt hóa học sử dụng như: khả phân hủy sinh học, có độc tính thấp, có tính dung hợp sinh học tính tiêu hóa được, tính hiệu điều kiện cực đoan nhiệt độ, pH muối [2] Thông thường SL thu nhận tồn dạng hỗn hợp với dạng SL dạng lactone SL dạng acid SL dạng lacton có khả làm giảm sức căng bề mặt hoạt tính kháng khuẩn tốt, dạng acid lại cho thấy có thểtạo bọt hịa tan tốt Hơn nữa, gốc acetyl làm cho phân tử SL tan nước lại tăng cường hiệu kháng virus kháng cytokine chúng [3] SL ứng dụng nhiều lĩnh vực thực phẩm, dược phẩm, mỹ phẩm, chất tẩy rửa [4] Những nghiên cứu gần ghi nhận số ứng dụng cụ thể SL SL bổ sung vào bột giặt với vai trò chất tẩy rửa [5], khả tạo nhũ SL ứng dụng ngành hóa dầu Chúng sử dụng việc thu hồi sản phầm dầu thứ cấp, loại bỏ thành phần hydrocarbon dầu thô SL sử dụng để xử lý đất nước bể bị nhiễm hydrocarbon, hấp thu kim loại nặng có trầm tích cải thiện chất lượng bột mì thực phẩm [5, 6] SL có khả kháng khuẩn việc trị mụn, trị gàu mùi hôi thể, bảo vệ da tóc, kích thích biến dưỡng tế bào fibroblast biểu mơ, kích thích trình tổng hợp collagen làm cho da săn [7, 8] SL cịn có khả ức chế gốc tự do, ức chế hoạt động enzyme elastase gây lão hóa, thúc đẩy q trình làm liền da làm trắng da [9] Các SL diacetyl lactone có khả tiêu diệt nhiều dòng tế bào khác dòng tế bào ung thư gan H7402, giảm tỷ lệ chết shock nhiễm khuẩn mơ hình chuột [10, 11], ức chế trình phát triển tế bào ung thư bạch cầu [12] Nhờ vào đặc tính ưu việt tiềm ứng dụng SL nhiều lĩnh vực khác Trên giới, việc nghiên cứu phát triển sản phẩm từ SL nhiều nhóm nghiên cứu tiến hành đăng ký sáng chế số thương mại hóa Tuy nhiên, Việt Nam, cơng trình liên quan đến việc sản xuất chất hoạt động bề mặt có nguồn gốc sinh học nói chung SL nói riêng chưa nghiên cứu thấu đáo Hiện nay, chưa có nhóm nghiên cứu nghiên cứu xây dựng quy trình tách chiết để thu nhận SL từ trình lên men C bombicola với hiệu suất thu nhận SL cao, chi phí thấp, SL thu có độ an tồn, khơng độc hại, có hoạt tính sinh học tốt Chính mà nghiên cứu này, tập trung nghiên cứu điều kiện tách chiết SL đáp ứng yêu cầu Vật liệu phương pháp nghiên cứu Vật liệu Chủng gốc nấm men C bombicola ATCC 22214 cung cấp dạng đông khô giáo sư Kim Eun-Ki, Đại học Inha, Hàn Quốc Chủng nuôi cấy tăng sinh môi trường yeast malt extract (YM); 2,2diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH), 1′,4″-sophorolactone 6′,6″diacetate cung cấp cơng ty hóa chất Sigma (St Louis, Mỹ) Các dung môi hữu cơ: methanol, ethyl acetate, petroliumether, hexan cung cấp cơng ty hóa chất Xilong (Trung Quốc) Nguồn dầu đậu nành Simply sản xuất công ty TNHH dầu thực vật Cái Lân; chủng vi sinh vật để làm thử nghiệm kháng khuẩn cung cấp Trung tâm nghiên cứu hợp chất tự nhiên có hoạt tính sinh học – Đại học khoa học Tự Nhiên TP HCM Phương pháp nghiên cứu Tạo nguồn nguyên liệu để nghiên cứu Hoạt hóa chủng C bombicola trước lên men Nấm men C bombicola dạng đơng khơ hoạt hóa mơi trường yeast malt extract (YM), sau 48 dịch nhân giống cấp cấy chuyền để nhân giống cấp 2; điều kiện hoạt hóa chủng C bombicola: nhiệt độ 28 oC, tốc độ lắc 180 vòng/phút, thời gian 48 Dịch giống cấp sử dụng cho việc lên men tạo nguồn nguyên liệu nghiên cứu Lên men C bombicola erlen 250ml Giống C bombicola cấy vào erlen 250ml chứa 50ml dịch mơi trường (thành phần lít môi trường gồm: glucose 100g, cao nấm men g, KH2PO4 g, MgSO4.7H2O 0,5 g, CaCl2.2H2O 0,1 g, NaCl 0,1 g, peptone 0,7 g, dầu ăn 5% (v/v)) để lên men ngày, tốc độ lắc 180 vòng/phút, nhiệt độ 28oC Xây dựng quy trình phù hợp để tách chiết SL từ dịch lên men C bombicola Thí nghiệm khảo sát hệ dung mơi tỷ lệ dung môi để tách chiết SL từ dịch lên men C bombicola Tiến hành bố trí thí nghiệm yếu tố kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên để khảo sát hệ dung môi tỷ lệ dung môi để tách chiết SL từ dịch lên men C bombicola (mỗi erlen chứa 50 ml dịch lên men chuẩn bị trước) Dịch nuôi cấy thêm ethyl acetate (EtAc) (theo tỷ lệ khác nhau, lần), sau ly tâm với tốc độ 6.000 vòng/phút phút, thu dịch đem cô quay chân không 40 oC để loại EtAc áp suất 240 mPa Tiếp theo, thêm hỗn hợp dung dịch Petroliumether (PE):Methanol (MeOH) Hexan:MeOH (theo tỷ lệ khác nhau, lần) thu nhận lớp (gồm SL thơ methanol), sau đem quay chân không 40 oC để loại bỏ MeOH áp suất 330 mPa cân xác định khối lượng SL thô thu Bảng Các nghiệm thức thí nghiệm khảo sát hệ dụng mơi tỷ lệ dung môi để tách chiết SL từ dịch lên men C bombicola Yếu tố A (tỷ lệ dung môi: dịch lên men) Yếu tố B (hệ dung môi) A1 (1:3) A2 (1:2) A3 (1:1) A4 (2:1) A5 (3:1) B1(EtAC: Hexan/MeOH) A1B1 A2B1 A3B1 A4B1 A5B1 B2 (EtAC: PE/MeOH) A1B2 A2B2 A3B2 A4B2 A5B2 Định tính SL sắc ký lớp mỏng (Thin Layer Chromatography – TLC) Mẫu SL thô chấm lên sắc ký, pha động sử dụng chloroform:methanol:H2O với tỷ lệ 80:10:2 (v:v:v) khoảng 30 phút Hợp chất 1′,4″sophorolactone 6′,6″diacetate sử dụng làm chất chuẩn Sau giải ly, sắc ký phun acid sulphuric 90 % sấy khô 100 oC nhằm quan sát xác định vết mỏng Định tính SL phương pháp phân tích phổ hồng ngoại (Infrared spectroscopy – IR ) Các mẫu SL dạng acid dạng lactone phân tách qua sắc kí cột silicagel (240 – 400 mesh, 40 – 63 µm) theo chế sau: dạng lactone phân tử mạch vòng, phân cực so với dạng acid tự do, nên dạng acid có lực mạnh so với dạng lactone Khi sử dụng hệ dung môi cloroform:methanol với tỷ lệ 9,4:0,6, (v:v) dạng lactone dễ dàng dung môi kéo theo, sau thời gian, thu dạng lacton trước, sau đến dạng acid Cả dạng làm khô dung môi, đựng vial gửi phân tích phổ hồng ngoại máy đo quang phổ hồng ngoại, khoa Hóa học, Trường Đại học Khoa Học Tự Nhiên, Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh Thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng hàm lượng SL dầu đậu nành có dịch lên men đến hiệu suất tách chiết SL hiệu suất thu hồi dung môi quy trình Tiến hành bố trí thí nghiệm yếu tố kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên để khảo sát ảnh hưởng hàm lượng SL dầu đậu nành có dịch lên men đến hiệu suất tách chiết SL hiệu suất thu hồi dung môi quy trình Dịch ni cấy (đã loại bỏ SL dầu đậu nành) thêm SL từ – 15% dầu đậu nành từ – 10%, tiến hành quy trình tách chiết thí nghiệm trước xây dựng Chỉ tiêu theo dõi hiệu suất thu nhận SL, khả loại bỏ dầu đậu nành, hiệu suất thu hồi dung môi Bảng Các nghiệm thức thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng hàm lượng SL dầu đậu nành có dịch lên men đến hiệu suất tách chiết SL hiệu suất thu hồi dung mơi quy trình Yếu tố C (hàm lượng SL) Yếu tố D (hàm lượng dầu đậu nành) C1 (1%) C2 (5%) C3 (10%) C4 (15%) D1 (1%) C1D1 C2D1 C3D1 C4D1 D2 (5%) C1D2 C2D2 C3D2 C4D2 D3 (10%) C1D3 C2D3 C3D3 C4D3 Xác định hoạt tính kháng khuẩn Hoạt tính kháng khuẩn xác định theo phương pháp khuếch tán đĩa thạch Các chủng vi khuẩn: Escherichia coli, Staphylococus aureus, Bacillus spizizenii, Pseudomonas aeruginosa cấy môi trường thạch Luria-Bertani (LB), chứng dương sử dụng kháng sinh gentamicin (100µg/ml), chứng âm methanol 90% hút 20 µl mẫu SL 100 mg/ml cho vào đĩa giấy đặt sẵn đĩa môi trường ủ 37 oC – ngày quan sát vòng kháng khuẩn Xác định hoạt tính chống oxi hóa Hoạt tính chống oxi hóa xác định phương pháp DPPH (2,2-diphenyl1picrylhydrazyl) [13] Mẫu SL thơ hịa methanol thành nhiều nồng độ, hút 100 µl mẫu nạp vào giếng đĩa 96 giếng, thêm 100 µl dung dịch DPPH 300 µM trộn Mẫu ủ 37 oC 30 phút sau tiến hành xác định màu máy đọc ELISA ghi nhận phần trăm chống oxy hóa tương ứng với nồng độ Từ đó, xác định đường biểu diễn thể mối liên hệ nồng độ chất phần trăm chống oxy hóa tương ứng SL Phần trăm bắt gốc tự tính theo cơng thức: % chống oxy hóa = (1- OD mẫu/ OD đối chứng) x 100 Sử dụng chứng dương vitamin C (200 µg/ml), chứng âm methanol Kết thảo luận Kết xây dựng quy trình phù hợp để tách chiết SL từ dịch lên men C bombicola Kết khảo sát hệ dụng môi tỷ lệ dung môi để tách chiết SL từ dịch lên men C bombicola Quy trình tách chiết sử dụng hệ dung môi EtAc – MeOH : PE EtAc – MeOH : Hexan cho kết tương tự nghiệm thức, n-hexan dung môi độc, phân loại chất gây ô nhiễm môi trường Cơ quan Bảo vệ Môi trường Hoa Kỳ (Environmental Protection Agency – EPA) chất độc thần kinh Trung tâm Phòng chống Dịch bệnh Hoa Kỳ (Center for Disease Control and Prevention – CDC), dung mơi PE lựa chọn cho quy trình tách chiết SL từ dịch lên men Các tỷ lệ dung môi:dịch lên men 1:1; 2:1; 3:1, (v:v) cho hiệu tách chiết SL tương tự nhau, nên để tiết kiệm lượng dung môi sử dụng tỷ lệ dung mơi:dịch lên men 1:1, (v:v) phù hợp Nghiệm thức A3B2 sử dụng hệ dung mơi EtAc -MeOH : PE q trình tách chiết, tỷ lệ dung môi : dịch lên men với tỷ lệ 1:1, (v:v) có khả tách chiết SL cao với khối lượng là: 2,1722 g/50 ml dịch lên men, nhiên nghiệm thức A3B1, AAB2 có khối lượng SL thu khơng có khác biệt có ý nghĩa với nghiệm thức A3B2 Tuy nhiên, để tiết kiệm lượng dung môi sử dụng, để đảm bảo SL thu nhận an tồn, khơng độc hại nghiệm thức A3B2 phù hợp để tách chiết SL từ dịch lên men Bảng Kết khảo sát hệ dụng môi tỷ lệ dung môi để tách chiết SL từ dịch lên men C bombicola Nghiệm thức Khối lượng SL (g/ 50 Nghiệm thức Khối lượng SL (g/ 50 ml dịch lên men) ml dịch lên men) e A1B1 (TA1) 0,1074 ± 0,0179 A1B2 (TA6) 0,0898e ± 0,0169 d A2B1 (TA2) 1,4911 ± 0,0826 A2B2 (TA7) 1,7504c ± 0,1044 A3B1 (TA3) 2,1259a ± 0,0240 A3B2 (TA8) 2,1722a ± 0,0433 A4B1 (TA4) 2,0757ab ± 0,0342 A4B2 (TA9) 2,1290a ± 0,0270 A5B1 (TA5) 1,9908b ± 0,0376 A5B2 (TA10) 2,0532ab ± 0,0312 Các giá trị trung bình có chữ theo sau khác khác biệt có ý nghĩa thống kê qua phép thử LSD 0,01 Kết định tính SL Để khẳng định quy trình tách chiết phù hợp để tách chiết SL Cao chiết thu xác hỗn hợp SL, tiến hành định tính SL thu nhận sắc ký lớp mỏng phương pháp phân tích phổ hồng ngoại Hình Kết sắc ký mỏng để định tính SL TA1, TA2, , TA10: 10 nghiệm thức với số thứ tự tương ứng thí nghiệm khảo sát hệ dung môi tỷ lệ dung môi để tách chiết SL từ dịch lên men C bombicola, (C): chuẩn 1′,4″sophorolactone 6′,6″diacetate Kết Hình cho thấy, sản phẩm SL thô thu nhận từ nghiệm thức có diện 1′,4″-sophorolactone 6′,6″diacetate với hệ số Rf hình 1a, 1b, 1c, 1d, 1e 0,625; 0,632; 0,600; 0,525; 0,450 Điều chứng tỏ phương pháp tách chiết SL thô hoàn toàn phù hợp để thu nhận hỗn hợp SL có dịch lên men Ngồi ra, vạch sắc ký xuất vị trí khác cho thấy có diện dạng cấu trúc khác hỗn hợp SL thu nhận Do có chuẩn SL dạng lactone nên phương pháp sắc ký mỏng khẳng định SL thu nhận có diện dạng lactone, để kiểm tra thêm SL thu nhận có chứa dạng acid hay khơng, tiến hành phân tích phổ hồng ngoại SL dạng acid dạng lactone sau phân tách qua sắc kí cột silicagel Hai dạng lactone acid thu chủ yếu khác liên kết –C=O-R nhóm carboxylic (trong acid R tương ứng với nhóm –OH, lactone R nguyên tử oxy liên kết với phân tử đường) [3] Do đó, với hai kết phân tích thu được, tập trung phân tích xuất hiện, hình dạng độ hấp thụ mũi phổ điển hình số sóng tương ứng với liên kết tạo nên khác biệt hai dạng phân tử acid lactone: - Ở vùng 2500 – 4000 cm-1, vị trí 3471,89cm-1 cho biết phân tử có nhóm –OH Tuy nhiên lại có khác biệt độ hấp thụ hai mũi kết dạng lactone acid (Hình 3) Chứng tỏ phân tử lactone có nhóm –OH lại so với dạng acid Đây điểm khác biệt lớn hai loại phân tử Ngồi ra, cịn quan sát thấy nhóm –CH2 bất đối xứng –CH2 đối xứng vị trí 2924,18 2854,74 cm-1 - Ở vùng 2000 – 1500 cm-1, có xuất mũi 1458,23 cm-1 tương ứng với liên kết –C=O nhóm carboxyl với độ hấp thụ lớn dạng acid nhỏ Độ truyền qua (%) dạng lactone Vì thấy rõ ràng có mặt nhóm carboxyl kết phân tích phổ dạng acid Một điểm đáng ý thêm xuất mũi phổ 1712,85 cm-1 tương ứng với –C=O cấu trúc phân tử lacton Hình - Vùng 1500 – 500 (vùng vân tay), Hình quan sát thấy độ hấp thụ lớn mũi vị trí 1458,23 cm-1 tương ứng với liên kết –C-O –C-OH nhóm carboxyl Ở kết lactone thấy mũi lại nhiều Liên kết –C-O –CO-O-C phân tử lactone tìm thấy 1165 cm-1 Bằng phương pháp phân tích phổ hồng ngoại xác định cấu trúc lactone tách có liên kết –CO-OC- khác với liên kết nhóm carboxyl acid Cùng với khác biệt số lượng nhóm –OH, liên kết –C=O nhóm carboxyl giúp khẳng định hỗn hợp SL thu nhận có dạng acid dạng lactone Số sóng (cm -1) Độ truyền qua (%) Hình Kết phân tích phổ hồng ngoại SL dạng lactone Số sóng (cm -1) Hình Kết phân tích phổ hồng ngoại SL dạng acid SL thu nhận có dạng lactone dạng acid, điều thuận lợi lớn cho việc ứng dụng SL vào lĩnh vực khác SL dạng lactone phù hợp cho mục đích chế tạo kem, serum dưỡng da, SL dạng acid lại phù hợp để sửa rửa mặt, chất tẩy rửa, bổ sung vào xà bơng đặc tính tạo bọt tốt SL dạng Kết khảo sát ảnh hưởng hàm lượng SL dầu đậu nành có dịch lên men đến hiệu suất tách chiết SL hiệu suất thu hồi dung môi quy trình Từ Bảng nhận thấy, hiệu suất tách chiết SL quy trình cao từ 90% trở lên hàm lượng tổng SL dầu đậu nành có dịch lên men không vượt 20%, hiệu suất tách chiết SL giảm mạnh xuống 77,46 75,06% tổng hàm lượng SL dầu đậu nành dịch lên men 20% 25% Khả loại béo quy trình tốt đạt từ 97% trở lên tất nghiệm thức, điều chứng tỏ sản phẩm SL thu nhận khơng cịn lẫn dầu, SL có độ tinh cao Bảng Kết khảo sát ảnh hưởng hàm lượng SL dầu đậu nành dịch lên men đến hiệu suất tách chiết SL hiệu suất thu hồi dung mơi quy trình Hiệu suất Hiệu suất Hiệu suất thu hồi dung môi (%) tách chiết SL loại bỏ dầu EtAc MeOH PE (%) (%) C1D1 99,20ab ± 3,52 98,51 ± 1,88 91,33 ± 1,15 81,67 ± 2,89 41,67 ± 2,89 C2D1 99,98a ± 0,63 97,41± 1,10 92,00 ± 0,00 80,00 ± 0,00 40,00 ± 10,00 C3D1 92,59cd± 1,08 99,13 ± 1,16 91,33 ± 1,15 83,33 ± 2,89 38,33 ± 12,58 C4D1 98,71ab ± 0,28 97,99 ± 1,99 91,33 ± 1,15 81,67 ± 2,89 41,67 ± 7,64 a C1D2 100,21 ± 3,85 98,95 ± 0,47 92,00 ± 0,00 81,67 ± 2,89 40,00 ± 13,23 C2D2 99,40a ± 0,42 99,81 ± 0,21 92,00 ± 0,00 80,00 ± 0,00 41,67 ± 7,64 bc C3D2 95,00 ± 0,63 99,39 ± 0,84 91,33 ± 1,15 80,00 ± 0,00 31,67 ± 7,64 e C4D2 77,46 ± 1,96 99,91 ± 0,83 92,00 ± 0,00 78,89 ± 1,92 34,33 ± 5,09 C1D3 98,77ab ± 2,10 97,81 ± 0,65 92,00 ± 0,00 81,67 ± 2,89 41,67 ± 2,87 ab C2D3 98,57 ± 0,59 97,11 ± 0,89 92,00 ± 0,00 80,00 ± 0,00 43,33 ± 5,77 C3D3 90,52d ± 1,48 97,23 ± 0,90 91,33 ± 1,15 81,67 ± 2,89 33,33 ± 5,77 e C4D3 75,06 ±1,36 98,08 ± 1,67 92,00 ± 0,00 77,78 ± 1,92 37,67 ± 3,85 Các giá trị trung bình cột có chữ theo sau khác khác biệt có ý nghĩa thống kê qua phép thử LSD 0,01 Nghiệm thức Hiệu suất thu hồi loại dung môi sử dụng trình tách chiết biến động Dung mơi EtAc MeOH có hiệu suất thu hồi ổn định tất nghiệm thức 91 – 92% 78 – 83% Trong đó, dung mơi PE có hiệu suất thu hồi thấp đạt từ 33 – 43%, có biến động lớn nghiệm thức lần lặp lại, nguyên nhân dung môi PE sử dụng có nhiệt độ bay thấp từ 30 – 600C, nên tiến hành thí nghiệm điều kiện nhiệt độ phòng, tốc độ bay dung mơi PE diễn nhanh Chính vậy, dẫn đến hao hụt PE trình tách chiết Từ kết thu được, xây dựng quy trình thích hợp để tách chiết SL từ dịch lên men có hiệu suất cao, ổn định Hình Dịch lên men Ethyl acetate (1:1, v:v) Lớp trên: ethyl acetat (Sophorolipid + dầu) Lớp dưới: nước (môi trường + sinh khối tế bào) Li tâm phút, 6000 vòng /phút Pha nổi: ethyl acetat + sophorolipids + dầu Pha tủa: cạn tế bào + tạp chất Cô quay quan Dịch nâu: sophorolipids Dịch vàng: dầu dư Lớp dưới: methanol (Sophorolipid) Petrolium Ether: Methanol (1:1, v:v) Cô quay Lớp trên: Petrolium Ether (dầu dư) Sophorolipid thô quan Hình Quy trình để tách chiết thu nhận SL từ dịch lên men Như vậy, để tách chiết SL từ dịch lên men C bombicola sử dụng hệ dung môi EtAc:dịch lên men 1:1 (v:v); sử dụng hệ dung môi PE:MeOH:dịch lên men 1:1:1 (v:v:v) nhằm loại bỏ lượng dầu dư trình lên men C bombicola để thu SL có độ tinh cao Điều phù hợp với nghiên cứu Bogaert (2008), cho SL chiết xuất từ dịch lên men với dung môi hữu ethyl acetate Tuy nhiên, nguồn carbon lipid dư tách chiết đồng thời, gây khó khăn trình ứng dụng sau Vì lý này, cần thêm dung môi hexane dung môi khác pentane hay t-butyl metyl ether, petroleum ether để loại nguồn carbon lipid dư Kết khảo sát khả kháng khuẩn SL Bảng Kết đường kính vịng kháng SL vi sinh vật Chủng vi sinh vật Đường kính vịng kháng khuẩn SL (mm) 13,68 ± 0,58 B spizizenii 9,67 ± 0,58 E coli 11,33 ± 0,58 P aeruginosa 12,67 ± 1,15 S aureus Dựa vào Hình Bảng 5, thấy SL kháng tốt chủng B spizizenii, đến S aureus; cuối kháng yếu chủng P aeruginosa E coli Như bước đầu kết luận SL thu nhận cho khả kháng vi khuẩn Gram (+) mạnh vi khuẩn Gram (-) Kết tương đồng với nghiên cứu Jose cs (1999) [14], Kim cs (2005) [11] Phần trăm chống oxy hóa (%) Hình Kết kháng khuẩn SL với phương pháp đĩa giấy, (+): chứng dương; (-): chứng âm Kết khảo sát khả chống oxy hóa sophorolipid gốc tự DPPH (1,1-Diphenyl-2 picrylhydrazyl) 90 80 70 60 50 40 30 20 10 y = 21.039ln(x) + 12.218 R² = 0.9587 10 15 20 25 30 Nồng độ sophorolipid (mg/ml) Hình Đồ thị biểu diễn phần trăm chống oxy hóa sophorolipid phương pháp DPPH Từ Hình 6, tính giá trị IC50 6,024 mg/ml, so với nghiên cứu Loan cs (2016) giá trị IC50= 1,4063 mg/ml [13] nghiên cứu giá trị IC50 có cao độ chênh lệch không nhiều, cần lượng nhỏ SL để ức chế gốc tự bất lợi Điều ứng dụng SL để làm thành phần chống oxy hóa hữu ích lĩnh vực mỹ phẩm kem dưỡng da, nhằm mục tiêu chăm sóc, bảo vệ da, ngăn ngừa lão hóa, chất chống oxi hóa thực phẩm, ngành thức ăn chăn ni, bột giặt, xà phịng, LỜI CẢM ƠN Cảm ơn giáo sư Kim Eun-Ki, Đại học Inha, Hàn Quốc cung cấp chủng nấm men C bombicola Xin cảm ơn Sở Khoa học Công nghệ Thành phố Hồ Chí Minh tài trợ cho nghiên cứu TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] Jose A.C and G.O Felix, (1999),“Sophorolipid production by Candida bombicola: Medium composition and culture method”, J Biosci Bioeng, 88, pp 488 494 [2] Phạm Thành Hổ, Chương 8: sản phẩm công nghệ lên men, “Nhập môn Công nghệ sinh học”, (2006), tái lần 1, nhà xuất Giáo dục, pp 191 - 194 [3] Bogaert I N V (2008), "Literature Review on microbial production and application of the biosurfactant sophorolipids, in Microbial synthesis of sophorolipids by the yeast Candida bombicola", PhD-thesis, Faculty of Bioscience Engineering, Ghent University, Ghent, Belgium, pp 1-40 [4] Bogaert I N V., Saerens K., De Muynck C., Develter D., Soetaert W., and E J Vandamme,(2007), “Microbial production and application of sophorolipids”, Appl Microbiol Biotechnol, 76, pp 23-34 [5] Gobbert U., Lang S and F Wagner, (1984), “Sophorose lipid formation by resting cells of Torulopsis bombicola”, Biotechnol Lett, 6, pp 225-230 [6] Daniel H J., Reuss M and C Syldatk, (1998), “Production of sophorolipids in high concentration from deproteinized whey and rapeseed oil in a two stage fed batch process using Candida bombicola ATCC 22214 and Cryptococcus curvatus ATCC 20509”, Biotechnol Lett, 20, pp 1153-1156 [7] Cooper D G and D A Paddock, (1984), “Production of a biosurfactant from Torulopsis bombicola”, Appl Environ Microbiol, 47, pp 173-176 [8] Gorin P A J, Spencer J F T and A P Tulloch, (1961), “Hydroxy fatty acid glycosides of sophorose from Torulopsis magnolia”, Can J Chem, 39, pp 846-855 [9] Isoda H., Kitamoto D., Shinmoto H., Matsumura M., and T Nakahara, (1997), “Microbial extracellular glycolipid induction of differentiation and inhibition of the protein kinase C activity of human promyelocytic leukemia cell line HL60”, Biosci Biotechnol Biochem, 61, pp 609-614 [10] Daverey A and K Pakshirajan, (2009),“Production, characterization, and properties of sophorolipids from the yeast Candida bombicola using a low-cost fermentative medium”, Appl Biochem Biotechnol, 158, pp 663-674 [11] Kim H S., Kim Y B., Lee B S and E K Kim, (2005), “Sophorolipid production by Candida bombicola ATCC 22214 from a corn-oil processing by product”, J Microbiol Biotechnol, 15, pp 55 - 58 [12] Spencer J F T, Gorin P A J and A P Tulloch, (1970), “Torulopsis bombicola sp.”, Antonie Van Leeuwenhoek, 36, pp 129-133 [13] Lê Quỳnh Loan, Ngô Đức Duy, Hoàng Quốc Khánh, Nguyễn Hoàng Dũng, Nguyễn Lương Hiếu Hòa, Nguyễn Thị Bạch Huệ, (2016) “Nghiên cứu thu nhận khảo sát số hoạt tính sophorolipid từ trình lên men chủng Candida bombicola từ dầu dừa”, Tạp chí phát triển KH&CN, 19, pp 15-25 [14] Jose A.C and G.O Felix, (1999),“Sophorolipid production by Candida bombicola: Medium composition and culture method”, J Biosci Bioeng, 88, pp 488 494 Phụ lục Minh chứng kết đào tạo