ỦY BAN NHÂN DÂN TP HCM ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP HCM SỞ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ TRUNG TÂM KHCN DƯỢC SÀI GÒN BÁO CÁO NGHIỆM THU ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU Tên đề tài NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ MỸ PHẨM "GEL DƯƠNG CAM CÚC (Matrica[.]
ỦY BAN NHÂN DÂN TP.HCM SỞ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP.HCM TRUNG TÂM KHCN DƯỢC SÀI GÒN BÁO CÁO NGHIỆM THU ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU Tên đề tài: NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ MỸ PHẨM "GEL DƯƠNG CAM CÚC (Matricaria chamomilla L.) – LIPOSOMES" HỖ TRỢ ĐIỀU TRỊ DA BỊ VIÊM VÀ DỊ ỨNG Chủ nhiệm đề tài: TS TRẦN VĂN THÀNH Thời gian thực hiện: từ 12/2013 đến tháng 12/2016 THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH THÁNG 12 / 2016 TÓM TẮT NỘI DUNG NGHIÊN CỨU Tại Việt Nam, Dương cam cúc (Matricaria chamomilla L.) (DCC) di thực từ năm 60 Hiện nay, Việt Nam, cơng trình nghiên cứu bào chế sản phẩm từ DCC chưa nhiều, chủ yếu nhóm nghiên cứu TS Trần Anh Vũ, khoa Dược, đại học Y Dược thành phố Hồ Chí Minh thực Đề tài công bố hai dạng bào chế từ cao toàn phần tinh dầu DCC kem thoa da gel rửa Tinh dầu DCC ức chế in vitro Staphylococus aureus, Bacillus subtilis, ức chế vi khuẩn gram (+) mạnh so với vi khuẩn gram (-) ức chế nảy mầm bào tử men, mốc, nấm da thử nghiệm Tác dụng chống viêm cao DCC chứng minh chuột cống trắng ban đỏ gây tia tử ngoại chuột lang Trong nghiên cứu này, cao DCC kiểm tra cảm quan, định tính flavonoid định lượng apigenin-7-glucosid phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao Tinh dầu DCC kiểm tra cảm quan, định tính định lượng bisabolol oxid chamazulene sắc ký khí Nguyên liệu đạt tiêu chuẩn sở trước đưa vào nghiên cứu điều chế liposome-DCC Về công thức điều chế LPS-DCC: Các kết nghiên cứu cho thấy vai trò Tween 80 cần thiết để tạo hệ liposome có kích thước nhỏ có phân bố kích thước tiểu phân đỉnh Liposome tạo thành dạng MUV, xác định thông qua quan sát kính hiển vi điện tử truyền qua (TEM) Mặt khác, cholesterol đóng vai trị quan trọng việc ổn định màng liposome trình bảo quản Cholesterol giúp ổn định lượng cao DCC nang hóa bên liposome theo thời gian Sau tuần bảo quản lạnh, LPS-DCC chưa có thay đổi cảm quan Về qui trình điều chế LPS-DCC: phương pháp điều chế nghiên cứu phương pháp hydrat hóa màng phim lipid phương pháp tiêm ethanol Các thông số nghiên cứu xác định để tạo hệ LPS-DCC có kích thước nano (dưới 400 nm) chứa cao tinh dầu DCC Tuy nhiên, phương pháp hydrat hóa màng phim lipid không phù hợp với cao DCC, trình bảo quản, hàm lượng cao DCC giảm phổ sắc ký apigenin-7-glucosid bị thay đổi Phương pháp tiêm ethanol giúp tạo liposome có kích thước nhỏ, hiệu suất bắt giữ cao DCC 14% toàn tinh dầu DCC nằm lớp màng lipid liposome Về công thức điều chế gel LPS-DCC: Tá dược poloxamer 407 phù hợp với nghiên cứu có tạo gel thuận nghịch theo nhiệt độ Trong giai đoạn đầu tiên, dung dịch poloxamer giữ lạnh trạng thái lỏng, phối hợp với hệ LPS-DCC dễ dàng thông qua việc khuấy trộn Sau hệ poloxamer - LPS-DCC phối hợp đồng Sự gia tăng nhiệt độ nhiệt độ phòng làm tăng độ nhớt chuyển hỗn hợp thể gel suốt Các thử nghiệm đánh giá cho thấy hệ gel LPS-DCC có tác dụng làm da, giữ ẩm, kháng viêm kháng khuẩn Thừ nghiệm độ ổn định điều kiện thực cho thấy thời gian khảo sát 12 tháng gel LPS-DCC ổn định II SUMMARY OF RESEARCH CONTENT In Vietnam, Matricaria chamomilla L (DCC) were acclimatized from 1960 Today, the publication on DCC is limited, mainly by Dr Tran Anh Vu, Faculty of Pharmacy, University of Medicine and Pharmacy in Ho Chi Minh City These publications have announced two dosage forms oil and gel skin lotion containing of DCC extraction DCC oil shows in vitro inhibition of Staphylococus aureus, Bacillus subtilis, inhibition of gram (+) bacteria stronger than Gram (-) and inhibits the germination of spores, yeast, mold, fungal skin High anti-inflammatory effects of DCC extraction was demonstrated on white rats and erythema caused by ultraviolet rays in guinea pigs In this study, DCC extraction were tested for sensory, qualitative and quantitative of apigenin-7-glucosid by means of high-performance liquid chromatography DCC oils were tested for sensory, qualitative and quantitative of chamazulene and bisabolol oxide by gas chromatography For the formulation of LPS-DCC: Results of the study showed that Tween 80 is necessary to create a small sized liposome system with peak of particle size distribution Liposomes are formed of MUV, which is determined through observations under the transmission electron microscopy (TEM) On the other hand, cholesterol plays an important role in stabilizing the liposome membrane during storage Cholesterol help stabilize DCC encapsulated inside liposomes After week of preparation, LPS-DCC has not changed the outlook For the preparation process of LPS-DCC: methods have been studied as method lipid film hydration and ethanol injection method The parameters studied were determined to create LPS-DCC system nanoscale (below 400 nm) and high DCC oil containing However, film hydration method is inconsistent with DCC extraction, the chromatographic spectrum of apigenin-7-glucosid was altered Ethanol injection method helps create small sized liposomes, high encapsulation efficiency of DCC extraction (14%) and the entire DCC oil are encapsulated within the lipid layer of liposomes membrane For the preparation of gel LPS-DCC: poloxamer 407 is suitable for this study because of the reversible gelling temperature phenomenons In the first phase, poloxamer solution is kept in a liquid state by cold temperature, that could mixed easily with the LPS-DCC through agitation After poloxamer-LPS-DCC systems are homogeneous, the rise in the temperature to the room temperature will increase the viscosity and can transfer the mixture into transparent gel The experimental evaluation showed that gel LPS-DCC system had skin cleansing, moisturizing, anti-inflammatory and antibacterial effect Stability testing in real conditions showed that after 12-month LPS-DCC gel remained stable MỤC LỤC Mục lục Danh sách chữ viết tắt Danh sách bảng Danh sách hình CHƯƠNG TỔNG QUAN Trang I III IV VII 1.1 DƯƠNG CAM CÚC 1.1.1 Thành phần hóa học 1.1.2 Tác dụng dược lý 1.2 LIPOSOME 1.2.1 Tình hình nghiên cứu liposome giới Việt Nam 1.2.2 Phân loại 1.2.3 Thành phần cấu tạo liposome 1.2.4 Ưu nhược điểm liposome 1.2.5 Phương pháp bào chế 1.2.6 Dạng bào chế gel liposome 1.2.7 Đánh giá kết cơng trình nghiên cứu cơng bố thành phẩm DCC 1 5 7 11 12 CHƯƠNG NỘI DUNG NGHIÊN CỨU VÀ PHƯƠNG PHÁP 14 2.1 DUNG MƠI, HĨA CHẤT, THIẾT BỊ, DỤNG CỤ SỬ DỤNG TRONG NGHIÊN CỨU 2.2 KIỂM NGHIỆM NGUYÊN LIỆU CAO DƯƠNG CAM CÚC VÀ TINH DẦU DƯƠNG CAM CÚC 2.2.1 Cao Dương cam cúc 2.2.2 Tinh dầu Dương cam cúc 2.3 NGHIÊN CỨU ĐIÊU CHẾ LIPOSOME CHỨA CAO VÀ TINH DẦU DƯƠNG CAM CÚC (DCC-LPS) 2.3.1 Nghiên cứu điều chế liposome chứa cao tinh dầu Dương cam cúc phương pháp hydrat hóa màng phim 2.3.2 Nghiên cứu điều chế liposome chứa cao tinh dầu Dương cam cúc phương pháp tiêm ethanol 2.3.3 Phương pháp đánh giá liposome 2.4 NGHIÊN CỨU ĐIỀU CHẾ GEL DƯƠNG CAM CÚC – LIPOSOMES 2.4.1 Khảo sát tá dược phương pháp bào chế gel liposome DCC 2.4.2 Phương pháp đánh giá gel liposome Dương cam cúc 2.5 NGHIÊN CỨU ĐỘ ỔN ĐỊNH CỦA GEL LIPOSOME-DƯƠNG CAM CÚC TRONG ĐIỀU KIỆN THỰC 14 15 15 17 18 18 20 21 27 27 28 37 I CHƯƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 38 3.1 KIỂM NGHIỆM NGUYÊN LIỆU CAO DƯƠNG CAM CÚC VÀ TINH DẦU DƯƠNG CAM CÚC 3.1.1 Kết kiểm nghiệm cao Dương cam cúc 3.1.2 Kết kiểm nghiệm tinh dầu Dương cam cúc 3.2 KẾT QUẢ ĐIỀU CHẾ HỆ LIPOSOME CHỨA CAO VÀ TINH DẦU DƯƠNG CAM CÚC 3.2.1 Điều chế liposome chứa cao DCC tinh dầu DCC phương pháp hydrat hóa màng phim lipid 3.2.2 Điều chế liposome chứa cao DCC tinh dầu DCC phương pháp tiêm ethanol 3.2.3 Đánh giá lựa chọn hệ liposome chứa cao tinh dầu DCC 3.2.4 Cơng thức, qui trình điều chế tiêu chuẩn sở cho bán thành phẩm LPS-DCC 3.3 NGHIÊN CỨU ĐIỀU CHẾ GEL-LIPOSOME DƯƠNG CAM CÚC 3.3.1 Xây dựng cơng thức qui trình điều chế gel LPS-DCC 3.3.2 Đánh giá gel LPS-DCC tạo thành 3.3.3 Nâng cấp cỡ bào chế kg gel Liposome DCC 3.4 ĐÁNH GIÁ ĐỘ ỔN ĐỊNH CỦA GEL LIPOSOME DƯƠNG CAM CÚC TRONG ĐIỀU KIỆN THỰC CHƯƠNG KẾT LUẬN TÀI LIỆU THAM KHẢO 38 38 39 40 40 44 54 65 68 68 71 82 84 85 87 II DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT Từ viết tắt DCC LPS A7G P90G v/p Chol KHV TEM Tg Tm SUV MUV LUV MLV PEG ĐNH EF MIC MHA TSA TSB MRSA PBKC vđ Sol-gel Từ đầy đủ Liposome Apigenin-7-glucoside Phospholipon 90G Cholesterol Transmission electron microscopy Glass transition temperature Melting temperature Small unilamellar vesicle Medium unilamellar vesicle Large unilamellar vesicle Multi-lamellar vescicle Polyethylene glycol Encapsulation efficiency Minimum inhibitory concentration Mueller-Hinton agar Tryptone casein soy agar Tryptic soy broth Methicillin-resistant Staphylococcus aureus Solution – gel Nghĩa tiếng việt Dương cam cúc Liposome Apigenin-7-glucoside Phospholipon 90G vịng / phút Cholesterol Kính hiển vi Kính hiển vi điện tử truyền qua Nhiệt độ hóa kính Nhiệt độ nóng chảy Liposome màng đơn nhỏ Liposome màng đơn vừa Liposome màng đơn lớn Liposome đa màng Đồng hóa Hiệu suất nang hóa Nồng độ tối thiểu ức chế vi khuẩn Thạch Mueller Hinton Thạch tryptone casein soy Canh thang Trypticase Soy Tụ cầu vàng kháng methicillin Phân bố kích cỡ vừa đủ chuyển pha từ dạng lỏng sang dạng gel III DANH SÁCH BẢNG Trang Bảng 1 So sánh định tính tinh dầu theo USP 38 BP 2016 Bảng Hợp chất phenolic có hoạt tính sinh học cao DCC Bảng So sánh định tính flavonoid theo BP 2016 Eu Phar Bảng Điều kiện sắc ký lỏng hiệu cao định lượng hàm lượng apigen-7-glucosid cao toàn phần DCC Bảng Một số chế phẩm liposome thị trường giới Bảng Một số chế phẩm chứa DCC (Matricaria chamomilla L.) 13 giới Bảng Hóa chất, dung mơi dùng nghiên cứu 14 Bảng 2 Thiết bị dùng nghiên cứu 14 Bảng Chương trình gradient chạy sắc ký định lượng apigenin-7-glucosid 16 Bảng Tóm tắt thơng số quy trình tráng phim hydrat hố phim 18 Bảng Chương trình chạy gradient định lượng apigenin-7-glucosid 22 Bảng Các thông số xử lý mẫu LPS – DCC 24 Bảng Pha dung dịch khảo sát độ LPS – DCC 26 Bảng Các thông số xử lý mẫu gel 26 Bảng Pha dung dịch khảo sát độ gel LPS – DCC 31 Bảng 2.10 Mức độ phản ứng da thỏ 33 Bảng 2.11 Phân loại phản ứng thử da thỏ 33 Bảng 2.12 Độ ẩm mặt sau cánh tay da 35 Bảng Kết định tính cao Dương cam cúc phản ứng hóa học 38 Bảng Hàm lượng flavonoid toàn phần cao Dương cam cúc 39 Bảng 3 Hàm lượng Apigenin-7-glucosid cao Dương cam cúc 39 Bảng Hàm lượng bisabolol oxid A, B chamazulen tinh dầu 40 DCC Bảng Các cơng thức bào chế liposome có khơng có Tween 80 41 Bảng Các cơng thức bào chế liposome với thời điểm thêm Tween 80 41 khác Bảng Các công thức bào chế liposome với tỉ lệ phospholipid khác 42 Bảng Các công thức bào chế liposome với nồng độ Tween 80 khác 42 Bảng Các công thức bào chế liposome với tốc độ đánh ĐNH khác 43 Bảng 10 Kết đánh giá khảo sát lựa chọn tỉ lệ pha ethanol : pha nước 45 Bảng 11 Đánh giá độ tan cao DCC dung môi 46 Bảng 12 Thành phần cơng thức khảo sát kỹ thuật nang hóa tinh dầu DCC 47 Bảng 13 Các công thức bào chế liposome có khơng có Tween 80 47 Bảng 14 Các công thức bào chế liposome với thể tích pha cồn khác 48 Bảng 15 Các công thức kết đánh giá liposome với lượng lipid khác 49 IV Bảng 16 Các công thức bào chế liposome với lượng Tween 80 khác Bảng 17 Các công thức bào chế liposome với Tỉ lệ P90G: Chol khác Bảng 18 Các công thức kết đánh giá liposome với tỉ lệ lipid/cao DCC khác Bảng 19 Các công thức bào chế liposome với lượng tinh dầu khác Bảng 20 Kết định lượng A7G mẫu LPS – aceton Bảng 21 Kết khảo sát quy trình xử lý mẫu triton – X Bảng 22 Kết khảo sát lựa chọn quy trình xử lý mẫu LPS - DCC Bảng 23 Kết khảo sát tốc độ ly tâm Bảng 24 Kết khảo sát thể tích salin sử dụng Bảng 25 Kết hiệu suất nang hóa DCC vào liposomes Bảng 26 Kết xác định tính thích hợp hệ thống Bảng 27 Thơng số sắc ký mẫu chuẩn mẫu thử Bảng 28 Kết xác định phương trình hồi quy hệ số tuyến tính Bảng 29 Kết xác định độ lặp lại LPS – DCC Bảng 30 Kết xác định độ xác trung gian LPS – DCC Bảng 31 Kết xác định độ mẫu LPS – DCC Bảng 32 Kết qủa đánh giá LPS-DCC điều chế theo phương pháp Bảng 3.33 Kết đánh giá mẫu liên tiếp điều chế phương pháp tiêm ethanol Bảng 3.34 Kết khảo sát hai phương pháp bào chế gel liposome DCC Bảng 3.35 Nồng độ thời gian tạo gel Poloxamer 407 Bảng 3.36 Kết khảo sát tỷ lệ phối hợp hệ liposome dung dịch poloxamer 407 nồng độ khác Bảng 3.37 Kết lựa chọn chất giữ ẩm Bảng 3.38 Mức khảo sát ba biến số độc lập Bảng 3.39 Kết mơ hình thực nghiệm thiết kế thí nghiệm Bảng 3.40 Kết độ bền vật lý gel liposome bào chế theo công thức 10 Bảng 3.41 Độ đồng gel lipsome DCC Bảng 3.42 Kết theo dõi độ ổn định chu kỳ nhiệt gel LPS-DCC Bảng 3.43 Kết đo pH gel liposome DCC Bảng 3.44 Kết định tính flavonoid gel liposome DCC Bảng 3.45 Kết khảo sát dung môi pha mẫu gel LPS – DCC Bảng 3.46 Kết khảo sát lượng triton – X sử dụng Bảng 3.47 Thông số sắc ký mẫu chuẩn mẫu thử Bảng 3.48 Kết xác định độ lặp lại gel LPS – DCC Bảng 3.49 Kết xác định độ xác trung gian gel LPS – DCC Bảng 3.50 Kết xác định độ gel LPS – DCC Bảng 3.51 Kết định lượng mẫu gel LPS – DCC Bảng 3.52 Kết đánh giá tính kích ứng da da thỏ 50 51 52 52 54 54 55 55 56 56 57 58 59 60 61 62 64 65 67 67 67 68 69 70 71 71 72 72 73 73 73 74 75 76 77 78 79 V Bảng 3.53 Định tính khả kháng khuẩn (đường kính vịng kháng khuẩn, mm) Bảng 3.54 MIC gel liposome DCC (µg/ml) Bảng 3.55 Kết đánh giá độ ẩm cho da Bảng 3.56 Kết đánh giá độ ẩm cho da Bảng 3.57 Tiêu chuẩn chế phẩm gel liposome DCC Bảng 3.58 Đánh giá lô gel LPS-DCC so với lô nghiên cứu Bảng 3.59 Kết đánh giá độ ổn định gel LPS-DCC 80 80 81 81 82 83 84 VI Bảng 3.44 Kết định tính flavonoid gel liposome DCC Mẫu NaOH 1% AlCl3 FeCl3 Chì acetat Mg/ 1% 1% HCl đđ Gel LPS-DCC + + + + + Định lượng A7G gel liposome DCC Xây dựng quy trình xử lý mẫu định lượng A7G gel LPS – DCC phương pháp HPLC Khảo sát dung môi pha mẫu Tiến hành sắc ký mẫu với dung môi pha mẫu nước methanol – nước (1:1) Nhận xét: mẫu pha dung môi methanol – nước nước đạt thông số sắc ký, mẫu RSD = 1,38% < 2%, pha mẫu dung môi nước methanol – nước Bảng 3.45 Kết khảo sát dung môi pha mẫu gel LPS – DCC Diện tích pic chuẩn = 825,00 (mAU*s) Nước Methanol – nước STT Khối lượng gel Diện tích Nồng độ Khối lượng gel Diện tích Nồng độ 2,0096 678,90 20,47 1,9900 689,10 20,99 1,9730 685,74 21,06 1,9824 698,46 21,35 2,0237 697,58 20,89 1,9961 693,60 21,06 TB 20,81 21,13 RSD 1,46 0,92 Khảo sát lượng triton – X sử dụng Tiến hành sắc ký mẫu với lượng triton – X thay đổi sau: 0,5 ml; 1,0 ml; 1,5 ml Bảng 3.46 Kết khảo sát lượng triton – X sử dụng Diện tích chuẩn = 825,00 (mAU*s) Mẫu Khối lượng cân (g) Diện tích Nồng độ 0,5 ml 2,0347 756,15 22,52 1,0 ml 1,9908 771,85 23,50 1,5 ml 2,0106 773,70 23,32 Nhận xét: Kết định lượng sắc ký đồ cho thấy lượng triton-X thêm vào 0,5 ml cho pic có nồng độ thấp pic có gù chân Với lượng triton-X thêm vào 1,5 ml pic đạt thông số mẫu tạo bọt nhiều Chọn lượng triton X 10% thêm vào 1,0 ml Thẩm định quy trình định lượng A7G gel LPS – DCC phương pháp HPLC Độ đặc hiệu/chọn lọc Tiến hành sắc ký mẫu trắng, mẫu placebo – gel, mẫu chuẩn, mẫu thử gel LPS – DCC mẫu tự tạo – gel Kết minh họa Hình 3.24, 3.25 Bảng 3.47 73 *DAD1 A, Sig=335,4 Ref=off (D:\HOAPT\HIEN\160902\MEOH-H2O.D) *DAD1 A, Sig=335,4 Ref=off (D:\HOAPT\HIEN\160902\PLACEBO-GEL.D) *DAD1 A, Sig=335,4 Ref=off (D:\HOAPT\HIEN\160909\DAC HIEU 2016-09-09\005-0501.D) *DAD1 A, Sig=335,4 Ref=off (D:\HOAPT\HIEN\160903\DO DUNG GEL 2016-09-03\004-0401.D) *DAD1 A, Sig=335,4 Ref=off (D:\HOAPT\HIEN\160903\LAP LAI GEL 2016-09-03\002-0101.D) mAU 60 50 40 e 30 d c 20 b 10 a 0 10 15 20 25 30 35 40 45 Hình 3.24 (a) Sắc ký đồ mẫu trắng, (b) sắc ký đồ mẫu placebo – gel, (c) sắc ký đồ mẫu chuẩn, (d) sắc ký đồ mẫu tự tạo – gel, (e) sắc ký đồ mẫu gel LPS – DCC Bảng 3.47 Thông số sắc ký mẫu chuẩn mẫu thử TR Diện tích pic Chiều cao Mẫu Purity As (phút) (mAU*s) pic (mAU) Mẫu chuẩn 19,530 824,403 34,717 999,991 0,975 Mẫu thử 20,015 786,10 32,60 999,889 0,97 N 15460 15394 (a) (b) Hình 3.25 Phổ UV – Vis biểu đồ minh họa độ tinh khiết pic A7G mẫu chuẩn (a) mẫu gel LPS – DCC (b) Nhận xét: Sắc ký đồ mẫu trắng mẫu placebo – gel không xuất pic khoảng thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu chất chuẩn Sắc ký đồ mẫu thử gel LPS – DCC mẫu tự tạo – gel cho pic có thời gian lưu tương tự với pic chất chuẩn sắc ký đồ mẫu chuẩn Trên sắc ký đồ mẫu thử có 01 pic tạp sau pic chất chuẩn A7G, pic hoạt chất phân tích tách hồn tồn pic tạp với độ phân giải 1,58, đáp ứng yêu cầu độ phân giải (Rs ≥ 1,5) phương pháp sắc ký lỏng quy định Dược điển Việt Nam IV => Như quy trình có tính chọn lọc Tính tuyến tính – khoảng xác định Kết tuyết tính khoảng xác định giống định lượng A7G LPS-DCC Độ lặp lại Tiến hành sắc ký mẫu thử gel LPS – DCC, mẫu lần Kết minh họa Hình 3.26 Bảng 3.48 *DAD1 A, Sig=335,4 Ref=off (D:\HOAPT\HIEN\160903\LAP LAI GEL-1.D) *DAD1 A, Sig=335,4 Ref=off (D:\HOAPT\HIEN\160903\LAP LAI GEL 2016-09-03\002-0101.D) *DAD1 A, Sig=335,4 Ref=off (D:\HOAPT\HIEN\160903\LAP LAI GEL 2016-09-03\003-0201.D) *DAD1 A, Sig=335,4 Ref=off (D:\HOAPT\HIEN\160903\LAP LAI GEL 2016-09-03\004-0301.D) *DAD1 A, Sig=335,4 Ref=off (D:\HOAPT\HIEN\160903\LAP LAI GEL 2016-09-03\005-0401.D) *DAD1 A, Sig=335,4 Ref=off (D:\HOAPT\HIEN\160903\LAP LAI GEL 2016-09-03\006-0501.D) mAU 120 100 80 60 40 20 0 10 15 20 25 30 35 40 Hình 3.26 Sắc ký đồ mẫu thử gel LPS – DCC Bảng 3.48 Kết xác định độ lặp lại gel LPS – DCC Khối lượng TR Diện tích pic Hàm lượng hoạt chất Stt cân gel (g) (phút) (mAU*s) gel (µg/g) 2,0168 19,495 804,0 24,12 2,0079 19,682 784,0 23,62 2,0096 19,597 786,1 23,66 2,0056 19,616 809,7 24,42 2,0038 19,721 805,9 24,33 2,0111 19,691 810,7 24,39 Trung bình 19,634 800,07 24,09 SD 0,08 11,90 0,36 RSD (%) 0,42 1,49 1,51 Nhận xét: Giá trị RSD (%) kết định lượng hàm lượng hoạt chất có mẫu ≤ 2,0% Vậy quy trình định lượng A7G gel LPS – DCC đạt yêu cầu độ lặp lại Độ xác trung gian 75 Hai kiểm nghiệm viên, người chuẩn bị mẫu thử ngày khác Tiến hành sắc ký mẫu thử gel LPS – DCC, mẫu lần Kết minh họa Hình 3.27 Bảng 3.49 Bảng 3.49 Kết xác định độ xác trung gian gel LPS – DCC Người phân tích 1: DS Thu Hiền Người phân tích 2: DS Thu Vân Ngày phân tích: 03 – 08 – 2016 Ngày phân tích: 05 – 09 – 2016 Hệ thống HPLC: 1260 Infinity Hệ thống HPLC: 1260 Infinity Khối lượng TR Hàm lượng Khối lượng TR Hàm lượng STT cân gel (g) (phút) (µg/g) cân gel (g) (phút) (µg/g) 2,0168 19,495 24,12 2,0016 19,185 24,18 2,0079 19,682 23,62 2,0034 19,165 23,88 2,0096 19,597 23,66 2,0049 19,168 23,45 2,0056 19,616 24,42 2,0073 19,148 23,58 2,0038 19,721 24,33 2,0114 19,123 24,28 2,0111 19,691 24,39 2,0094 19,077 24,20 Trung bình: 24,09 (µg/g) Trung bình: 23,93 (µg/g) RSD: 1,51% RSD: 1,47% Kết người phân tích Trung bình: 24,01 (µg/g) RSD: 1,46% mAU 40 30 20 b 10 a 0 10 15 20 25 30 35 40 Hình 3.27 (a) Sắc ký đồ mẫu thử gel LPS – DCC người phân tích chuẩn bị, (b) Sắc ký đồ mẫu thử LPS – DCC người phân tích chuẩn bị Nhận xét: Giá trị RSD (%) kết định lượng người phân tích hai người phân tích ≤ 2,0% => Vậy quy trình định lượng A7G đạt yêu cầu độ xác trung gian Độ Tiến hành sắc ký mẫu tự tạo – gel Kết minh họa Hình 3.28 Bảng 3.50 Bảng 3.50 Kết xác định độ gel LPS – DCC Lượng hoạt chất Diện tích pic Lượng hoạt chất Tỷ lệ Mẫu STT thêm vào (mg) (mAU*s) tìm lại (mg) thu hồi (%) 4,00 661,9 4,00 100,07 80% Mẫu 4,00 659,1 3,99 99,64 4,00 660,4 3,99 99,84 Lượng hoạt chất thêm vào (mg) 5,00 5,00 835,8 5,06 101,09 5,00 834,9 5,05 100,98 STT 100% 120% Trung bình 99,85 RSD (%) 0,21 Diện tích pic Lượng hoạt chất Tỷ lệ (mAU*s) tìm lại (mg) thu hồi (%) 831,9 5,03 100,61 Trung bình RSD (%) 5,99 100,89 0,24 99,73 6,00 989,5 6,00 991,9 6,00 99,97 6,00 999,1 6,04 100,70 Trung bình RSD (%) 100,13 0,50 *DAD1 A, Sig=335,4 Ref=off (D:\HOAPT\HIEN\160903\DO DUNG GEL 2016-09-03\001-0101.D) *DAD1 A, Sig=335,4 Ref=off (D:\HOAPT\HIEN\160903\DO DUNG GEL 2016-09-03\004-0401.D) *DAD1 A, Sig=335,4 Ref=off (D:\HOAPT\HIEN\160903\DO DUNG GEL 2016-09-03\007-0701.D) mAU 50 40 30 20 c 10 b a 0 10 15 20 25 30 35 40 Hình 3.28 (a) Sắc ký đồ mẫu tự tạo – gel thêm chuẩn 80%, (b) sắc ký đồ mẫu tự tạo – gel thêm chuẩn 100%, (c) sắc ký đồ mẫu tự tạo – gel thêm chuẩn 120% 77 Nhận xét: độ hồi phục nằm khoảng 98,0% đến 102,0% giá trị RSD ≤ 2,0% Vậy quy trình định lượng A7G gel LPS – DCC đạt yêu cầu độ Nhận xét chung: kết thẩm định cho thấy quy trình định lượng A7G gel LPS – DCC phương pháp HPLC với đầu dò PDA đạt tất yêu cầu độ chọn lọc, tính tuyến tính – khoảng xác định, độ xác độ theo qui định Sổ tay hướng dẫn đăng ký thuốc, phụ lục 8., Quyết định Cục trưởng Cục Quản lý Dược, Bộ Y tế số 07/QĐ-QLD ngày 11 tháng 01 năm 2013 Kết định lượng mẫu gel LPS-DCC trình bày Bảng 3.51 Bảng 3.51 Kết định lượng mẫu gel LPS – DCC Mẫu Diện tích (mAU*s) Nồng độ (µg/ml) Mẫu chuẩn 826,8 Mẫu thử 809.7 24.48 Mẫu thử 805.9 24.37 Trung bình 24,43 RSD (%) 0,33 Thử giới hạn nhiễm khuẩn Thử nghiệm đếm tổng số vi khuẩn hiếu khí thực theo phương pháp đĩa thạch chất thử có khả hịa tan tốt tạo thành dung dịch đục Chất thử pha loãng dung dịch nước muối sinh lý 0,9% tỷ lệ 1/10 Kết quả: khơng có khuẩn lạc mọc đĩa có độ pha lỗng 1/10 (Hình 3.29.) Kết luận: chất thử có 10 vi khuẩn 1ml Hình 3.29 Kết thử nghiệm đếm tổng số vi khuẩn hiếu khí với nồng độ pha lỗng chất thử 1/10 Thử nghiệm tìm vi khuẩn gây bệnh - Tìm Staphylococcus aureus Pseudomonas aeruginosa Cho 1g chế phẩm vào 100ml môi trường TSB, ủ 37oC 18 - 72 Kiểm tra vi khuẩn mọc môi trường Kết quả: khơng có vi khuẩn mọc sau 72 (Hình 3.30.) Hình 3.30 Kết thử nghiệm tìm Staphylococcus aureus Pseudomonas aeruginosa môi trường nuôi cấy sau 72 Tìm Enterobacteria Đồng chất thử môi trường LB để phục hồi vi khuẩn mà không làm tăng số lượng vi khuẩn, ủ 37oC Chuyển lượng đồng tương đương 1g chất thử vào 100ml môi trường lỏng Enterobacteria Mossel, ủ 37 oC 18 - 72 Cấy lên đĩa thạch Violet-Red, ủ 37 oC 18 - 48 Kiểm tra vi khuẩn mọc môi trường Kết quả: khơng có vi khuẩn mọc sau 48 (Hình 3.31.) Hình 3.31 Kết thử nghiệm tìm Enterobacteria Thử nghiệm đếm tổng số nấm mốc, nấm men Dùng phương pháp đĩa thạch Sử dụng thạch Sabouraud, ủ nhiệt độ 20 – 25 ºC, theo dõi ngày Kết quả: khơng có nấm mọc sau ngày (Hình 3.32.) Hình 3.32 Kết thử nghiệm đếm tổng số nấm mốc, nấm men Kết luận: gel liposome DCC đạt tiêu thử giới hạn nhiễm khuẩn theo DĐVN IV phụ lục 13.6 Giới hạn Arsen, Chì Kết quả: Chì (0,04 ppm) Arsen (0,02 ppm) nằm giới hạn cho phép Kết luận: Gel liposome DCC đạt giới hạn kim loại nặng Kích ứng da Bảng 3.52 trình bày kết đánh giá tính kích ứng da da thỏ Kết luận gel LPSDCC khơng gây kích ứng (theo thang đo đánh giá chuẩn gọi Kích ứng da không đáng kể) Bảng 3.52 Kết đánh giá tính kích ứng da da thỏ Phản ứng Điểm đánh giá 24h 48h 72h Sự tạo vẩy ban đỏ: Không ban đỏ 0 Gây phù nề: Khơng phù nề 0 Tổng số điểm kích ứng 0 Kế t quả ̣nh tı́nh khả kháng khuẩn Khả kháng khuẩ n đươ ̣c đinh ̣ tı́nh bằ ng phương pháp khuế ch tán tha ̣ch trình bày Bảng 3.53 Hình 3.33 79 Bảng 3.53 Định tính khả kháng khuẩn (đường kính vịng kháng khuẩn, mm) Chất E.coli Pseudo S faecalis S.aureus MRSA Gel liposome DCC 40 30 30 Ghi chú: “-“: khơng có hoạt tính kháng khuẩn Đường kính vịng kháng khuẩn bao gồm đường kính lỗ mm Hình 3.33 Kết định tính khả kháng khuẩn Nhận xét: Gel có khả kháng khuẩn E coli: Escherichia coli ATCC 25922 MSSA: Staphylococcus aureus ATCC 29213 MRSA: Staphylococcus aureus đề kháng methycilin (MRSA) ATCC 43300 Kết xác định MIC Kết xác định MIC mẫu gel liposome DCC trình bày Bảng 3.54 Hình 3.34 Bảng 3.54 MIC gel liposome DCC (µg/ml) MIC chủng E coli MSSA MRSA Chất thử Gel liposome DCC < 0,4883 1,9531 3,9063 Hình 3.34 MIC gel liposome DCC Ghi chú: E coli: Escherichia coli ATCC 25922 MSSA: Staphylococcus aureus ATCC 29213 MRSA: Staphylococcus aureus đề kháng methycilin (MRSA) ATCC 43300 Chứng: nước muối sinh lý 0,9% Đánh giá khả giữ ẩm gel LPS-DCC Bảng 3.55 trình bày kết giữ ẩm cho da gel LPS-DCC Kết cho thấy gel LPSDCC có khả giữ ẩm cho da Sau giờ, độ ẩm da cân với độ ẩm bình thường da người thử nghiệm Bảng 3.55 Kết đánh giá độ ẩm cho da 15 phút 30 phút 60 phút giờ Độ ẩm da có thoa gel LPS-DCC* 38-50 36-48 36-47 32-45 32-40 Độ ẩm da bình thường 32-37 32-37 32-37 32-37 32-37 *giá trị trung bình Đánh giá khả làm da gel LPS-DCC Bảng 3.56 trình bày kết làm da gel LPS-DCC Kết cho thấy gel LPSDCC có khả làm da việc rửa đơn nước Bảng 3.56 Kết đánh giá độ ẩm cho da Không Sạch rửa nước Sạch rửa rửa nước nước Số người lựa chọn *giá trị trung bình Đánh giá tính kháng viêm gel LPS-DCC Kết đánh giá tính kháng viêm gel LPS-DCC trình bày Hình 3.35 Theo kết thu được, gel LPS-DCC có tác động kháng viêm nhẹ, có hiệu làm giảm sưng phù chân chuột Tuy nhiên, so với kem đối chiếu có hàm lượng cao DCC, tinh dầu DCC cao với kết hợp dầu nghệ tác động kháng viêm gel LPSDCC chưa thật trội Hình 3.35 Kết đánh giá độ sưng phù chân chuột vào ngày thứ tư Dựa kết thu gel liposome DCC sơ xây dựng tiêu chuẩn tiêu trình bày Bảng 3.57 81 Bảng 3.57 Tiêu chuẩn chế phẩm gel liposome DCC STT Chỉ tiêu Yêu cầu Phương pháp thực Cảm quan Thể chất mềm, đồng nhất, Cảm quan không lẫn tạp chất Màu vàng, mùi đặc trưng pH 4.5-7 Lấy g gel hòa với ml nước cất, lọc qua màng lọc 0,45m để lấy dịch Đo pH dịch lọc Định tính -Tinh dầu (SKLM) -SKĐ mẫu thử có vết có màu Bằng phương pháp SKLM sắc, Rf tương ứng mẫu chuẩn tinh dầu cao -Cao flavonoid -Dương tính DCC Giới hạn nhiễm khuẩn Giới hạn Chì Giới hạn Arsen Kích ứng da -Tổng số vi khuẩn hiếu khí sống lại không 500 1g -Mẫu thử phải khơng có Enterobacteria, Pseudomonas, Staphyloccocus aureus, nấm mốc g Không 20 phần triệu Không phần triệu Kích ứng khơng đáng kể Theo phương pháp pha lỗng gel với mơi trường 1/10, ủ cấy lên đĩa thạch Theo tài liệu ACM THA 05 Theo TCVN 6972-2001 3.4 NÂNG CẤP CỠ BÀO CHẾ KG GEL LIPOSOME DƯƠNG CAM CÚC Do thiết bị sử dụng tạo liposome IKA T25 có khả tải đến 2L, cỡ lô 2kg gel cần 480g hệ liposomes, khơng cần thay đổi thiết bị cách điều chế Công thức điều chế 2kg gel LPS-DCC từ cao tinh dầu DCC sau: Công thức điều chế 500g LPS-DCC Công thức điều chế 2kg gel LPS-DCC Phosphilipon 90G 7,7g LPS- DCC 480g Cholestrol 1,9 g Poloxamer 40 320g Cao DCC 9,6 ml PEG 400 200g Tween 80 2,4 g Natri benzoat 10g Cồn tuyệt đối 48 ml Nước cất vừa đủ 2000g Đệm pH 4,5 480 ml Tinh dầu DCC 960 µl Mơ tả qui trình bào chế: Điều chế LPS-DCC: - Cho 9,6 ml cao DCC vào 480 ml đệm pH 4,5 hịa tan sẵn 2,4g Tween 80, đun nóng đến 51°C cốc có mỏ 1000 ml (1) - Cân 7,7g P90G 1,9g Cholesterol, cho vào cốc có mỏ 50 ml, thêm 48 ml ethanol tuyệt đối vào, đun nóng đến 51°C Thêm 960 µl tinh dầu DCC, đun nóng đến 51°C (2) - Đổ (2) vào (1), tiến hành đồng hóa máy Ultra turax IKA T25 với tốc độ đánh 15000 vòng/phút 15 phút, lưu ý đặt vị trí đầu đánh đồng hóa cách đáy cốc khoảng cm - Khuấy từ nhẹ hỗn hợp để bay cồn nhiệt độ 51 °C - Ủ nhiệt 45 oC, khuấy từ 30 phút - Đóng chai, dán nhãn, bảo quản 2-8 oC trước tiến hành điều chế gel LPS-DCC Điều chế gel LPS-DCC: - Cho 320g poloxamer 407 vào 990 ml nước cất, khuấy từ nhẹ nhàng 2-8°C đến poloxamer 407 tan hoàn toàn - Cho 10g natri benzoat vào dung dịch poloxamer 407 trên, khuấy nhẹ nhàng máy khuấy đũa đến tan hồn tồn, trì nhiệt độ 2-8°C - Cho 200g PEG 400 vào dung dịch trên, khuấy nhẹ để trộn đều, giữ nhiệt độ 2-8°C - Cho 480g LPS-DCC vào dung dịch trên, tiến hành khuấy trộn nhẹ nhàng 15 phút, giữ nhiệt độ 2-8°C - Phân liều vào chai thủy tinh nhỏ màu nâu, để yên nhiệt độ hỗn hợp tăng đến nhiệt độ phòng, tượng gel hóa xảy Để đánh giá tính ổn định lặp lại công thức, điều chế lô qui mô kg gel điều chế đánh giá so với lô nghiên cứu (Bảng 3.58.) Bảng 3.58 Đánh giá lô gel LPS-DCC so với lô nghiên cứu Lô 2K1 Lô 2K2 Lô 2K3 Lô nghiên cứu qui mơ phịng thí nghiệm Cảm quan Gel mờ, Gel mờ Gel mờ Gel mờ màu vàng ánh màu vàng ánh màu vàng ánh màu vàng ánh xanh có mùi xanh có mùi xanh có mùi xanh có mùi thơm đặc trưng thơm đặc trưng thơm đặc trưng thơm đặc trưng pH 5,7 5,73 5,64 5,57 Độ dàn mỏng 16,67 16,23 16,54 16,71 (cm2) Độ đồng Đạt Đạt Đạt Đạt Định tính cao Đạt Đạt Đạt Đạt DCC Định tính tinh Đạt Đạt Đạt Đạt dầu DCC Định lượng cao 24,43 24,37 24,32 24,67 DCC (g/ml) 83 3.5 ĐÁNH GIÁ ĐỘ ỔN ĐỊNH CỦA GEL LIPOSOME DƯƠNG CAM CÚC TRONG ĐIỀU KIỆN THỰC Thông tin lô nghiên cứu đánh giá độ ổn định gel LPS-DCC điều kiện thực: - Ngày bào chế: 2/10/2015 - Ký hiệu lô nghiên cứu: 2K1, 2K2 2K3 - Cỡ lô bào chế: 2kg - Qui cách đóng gói: lọ thủy tinh màu nâu 30g, đóng đầy lọ - Điều kiện bảo quản: điều kiện thực (