Hoàn thiện quy trình tổng hợp hydrogel composite sinh học trên cơ sở biphase calcium phosphate oxidized alginate gelatin ứng dụng làm vật liệu thay thế tạm thời và hỗ trợ quá trình tái tạo xương

ỦY BAN NHÂN DÂN TP.HCM SỞ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ BÁO CÁO NGHIỆM THU (Đã chỉnh sửa theo góp ý Hội đồng nghiệm thu) HỒN THIỆN QUY TRÌNH TỔNG HỢP HYDROGEL COMPOSITE SINH HỌC TRÊN CƠ SỞ BIPHASE CALCIUM PHOSPHATE-OXIDIZED ALGINATE, GELATIN ỨNG DỤNG LÀM VẬT LIỆU THAY THẾ TẠM THỜI VÀ HỖ TRỢ QUÁ TRÌNH TÁI TẠO XƯƠNG THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH THÁNG 07/ 2016 i TÓM TẮT NỘI DUNG NGHIÊN CỨU Vật liệu y sinh đƣợc nghiên cứu mạnh mẽ để đáp ứng nhu cầu thay phận thể, cấy ghép mô, xƣơng ngƣời, hứa hẹn cho việc chữa trị tái tạo mô quan bị bị tổn thƣơng chấn thƣơng, bệnh tật lão hóa Trong năm gần đây, ngƣời đạt đƣợc tiến đáng kể việc cấy ghép nội tạng, phẫu thuật tái tạo sử dụng mô nhân tạo để điều trị, cấy ghép quan nội tạng mô xƣơng Trong đề tài này, chúng tơi hồn thiện quy trình tổng hợp hydrogel composite sinh học sở biphase calcium phosphate-oxidized alginate, gelatin ứng dụng làm vật liệu thay tạm thời hỗ trợ trình tái tạo xƣơng Nội dung nghiên cứu:  Nghiên cứu tổng hợp hydrogel composite sinh học sở biphase calcium phosphate-oxidized alginate, gelatin:  Tổng hợp oxidized-alginate từ sodium alginate: Oxidized- alginate 35% < độ oxi hóa < 40%  Tổng hợp hạt nano biphase calcium phosphate (BCP): Kích thƣớc trung bình hạt nano BCP < 100 nm  Tổng hợp vật liệu hydrogel composite sinh học sở biphase calcium phosphate (BCP)-oxidized- alginate, gelatin (thành phần TCP: HAp nhƣ sau 2:8,4:6, 8:2)  Khảo sát khống hóa phân hủy vật liệu:  Vật liệu có khả khống hóa ngày  Thời gian phân hủy vật liệu > 28 ngày  Đánh giá tƣơng hợp sinh học vật liệu: Vật liệu tƣơng hợp sinh học: cell viability > 90%  Đánh giá phát triển tế bào gốc thỏ vật liệu: Tế bào phát triển vật liệu tăng theo thời gian  Thử nghiệm cấy ghép vật liệu hydrogel composite sinh học sở biphase calcium phosphate (BCP)-oxidized alginate, gelatin thỏ  Đánh giá phát triển xƣơng ii Những điểm cần hoàn thiện quy trình tổng hợp hydrogel composite sinh học biphase calcium phosphate-oxidized alginate, gelatin đề tài thực hiện:  Tăng tính tƣơng hợp sinh học vật liệu: cell viability> 90%  Thay đổi thành phần BCP (HAp:TCP) tỉ lệ khối lƣợng polyme/BCP: Đánh giá khả khoáng hóa vật liệu, tối ƣu hóa thành phần nhằm tìm vật liệu có độ khống hóa cao Ngồi cần khảo sát khả phát triển tế bào gốc thỏ vật liệu cấy ghép vật liệu xƣơng thỏ Đánh giá phát triển xƣơng sau cấy ghép vật liệu composite vào xƣơng đùi thỏ dựa kết phân tích micro-CT tỉ lệ thể tích xƣơng/thể tích mơ, diện tích xƣơng bề mặt/thể tích xƣơng kết phân tích mô học Sau phẫu thuật tháng, kết phân tích micro-CT mẫu xƣơng cho thấy xƣơng đƣợc hình thành vùng phẫu thuật, hydrogel composite xƣơng hình thành với diện tích bề mặt xƣơng/thể tích xƣơng mật độ xƣơng bề mặt cao hydrogel mẫu đối chứng Kết phân tích micro-CT mẫu xƣơng sau phẫu thuật tháng cho thấy tỉ lệ thể tích xƣơng/thể tích mơ tỉ lệ diện tích bề mặt xƣơng/thể tích xƣơng hydrogel composite cao hydrogel mẫu đối chứng nhƣng tỉ lệ diện tích bề mặt xƣơng/thể tích xƣơng mẫu hydrogel thấp mẫu đối chứng Các mẫu tháng có tỉ lệ thể tích xƣơng/thể tích mơ cao không đáng kể so với mẫu tháng nhƣng diện tích bề mặt xƣơng/thể tích xƣơng mẫu tháng giảm so với mẫu tháng Nhuộm mô học kỹ thuật nhuộm thƣờng quy H&E để khảo sát cấu trúc mơ xƣơng, hình thái, thành phần khác mô xƣơng, đánh giá phát triển tế bào khối xƣơng ghép vật liệu cho thấy sau tháng tháng tất mẫu xƣơng hình, tế bào xƣơng tế bào mạch máu phát triển iii SUMMARY OF RESEARCH CONTENT Biomaterial has been studied to fulfill the demand of replacement of body’s parts and transplantation of tissues, which is the promising material for treatment and regeneration of defected and dysfunctional tissues and organs due to trauma, aging, or disease Recently, people have achieved remarkable advances in viscera transplantation, renewal surgery, and using artificial tissue to implant the innards’ body and bone tissue The results of this study may be helpful in further experiments in biomedical applications as well as bone regeneration in specific Base on this research, new approaches for many kinds of bone treatment might be developed and improved Research content: ─ Synthesis of hydrogel composite based on oxidized alginate-gelatin and BCP:  Synthesis of oxidized alginate from sodium alginate: the degree of oxidation is between 35% and 40%  Synthesis of BCP has average particle size smaller than 100nm  Synthesis of hydrogel composite based on oxidized alginate-gelatin and BCP with BCP components TCP: HAp are 2:8; 4:6; and 8:2 ─ Evaluation of biomineralization and biodegradation of hydrogel composite  Hydrogel composite have positive effect on apaptite formation after days being soaked in SBF solution  Degradation time of hydrogel composite more than weeks ─ The bio-compatibility of hydrogel composite base on cell cytotoxicity with the cell viability > 90% ─ Evaluation of the development of rabit stem cells: cells on the materials increase over time ─ Implantation of hydrogel composite into rabbit femur for months ─ Evalution of bone quality after 4, months by micro-CT ─ The stain discloses abundant structural information, with specific functional implications iv MỤC LỤC PHẦN MỞ ĐẦU CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Thành phần cấu tạo xƣơng 1.2 Vật liệu dùng cấy ghép tái tạo xƣơng 1.3 Hydrogel 1.4 Hydrogel composite 1.5 Biphasic calcium phosphate 1.6 Polymer sinh học 11 1.7 Ứng dụng hydrogel composite cấy ghép tái tạo xƣơng 13 CHƢƠNG 2: NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 2.1 Hóa chất, nguyên vật liệu 20 2.2 Thiết bị dụng cụ 20 2.3 Phƣơng pháp thực nghiệm 21 2.4 Xử lý thống kê số liệu thí nghiệm 25 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Nội dung 1: Nghiên cứu tổng hợp hydrogel composite sinh học sở biphase calcium phosphate-oxidized alginate, gelatin 26 Nội dung 1.1 Tổng hợp oxidized-alginate từ sodium alginate 26 Nội dung 1.2 Tổng hợp hạt nano biphase calcium phosphate (BCP) 28 Nội dung 1.3: Tổng hợp vật liệu hydrogel composite sinh học sở biphase calcium phosphate (BCP)-oxidized- alginate, gelatin 33 Nội dung 2: Vô trùng vật liệu 37 Nội dung 3: Khảo sát khống hóa phân hủy vật liệu 37 Nội dung 4: Đánh giá tƣơng hợp sinh học vật liệu 46 Nội dung 5: Đánh giá phát triển tế bào gốc thỏ vật liệu 47 Nội dung 6: Thử nghiệm cấy ghép vật liệu hydrogel composite sinh học sở biphase calcium phosphate (BCP)-oxidized alginate, gelatin thỏ 48 Nội dung 8: Đánh giá phát triển xƣơng tế bào 52 Nội dung 8.1 : Đánh giá phát triển xƣơng phƣơng pháp micro-CT 52 v Nội dung 8.2: Đánh giá phát triển tế bào xƣơng vivo phƣơng pháp nhuộm mô học (H&E) 55 vi DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT BCP Biphasic calcium phosphate Proton Nuclear Magnetic Resonance H-NMR -TCP Bêta-tricalcium phosphate Da Dalton FDA Food and Drug Administration ASTM American Society for Testing and Materials ECM Extra cellulose matrix MWCO Molecular weight cut-off SPSS Statistical Product and Services Solutions vii DANH MỤC HÌNH VÀ ĐỒ THỊ Hình 1.1: Ảnh minh họa tƣơng tác hydrogel sở chitosan oxi hóa với collagen mơ 13 Hình 3.1: Phổ 1H NMR sodium alginate 26 Hình 3.2: Phổ 1H NMR alginate oxi hóa với độ oxi hóa khác 27 Hình 3.3 Giản đồ XRD HAp β-TCP với tỉ lệ Ca/P=1,48 28 Hình 3.4 Giản đồ XRD HAp β-TCP với tỉ lệ Ca/P=1,53 29 Hình 3.5 Giản đồ XRD HAp β-TCP với tỉ lệ Ca/P=1,67 29 Hình 3.6: Phổ FTIR HAp β-TCP với tỉ lệ Ca/P=1,53: (a) pH=7, (b) pH=9 (c) pH=11 31 Hình 3.7: Hình ảnh SEM HAp tổng hợp theo phƣơng pháp kết tủa khơng sử dụng sóng siêu âm với tỉ lệ mol Ca/P= 1,67; pH=8 (h-1) pH=9 (i-1) 32 Hình 3.8: Hình ảnh SEM, TEM HAp β-TCP tổng hợp theo phƣơng pháp kết tủa kết hợp sóng siêu âm với tỉ lệ mol Ca/P =1,53 pH khác (7; 9; 11) 33 Hình 3.9: Ảnh SEM hydrogel composite alginate oxi hóa-gelatin/BCP 33 Hình 3.10: Giản đồ XRD hydrogel alginate oxi hóa hydrogel composite alginate oxi hóa-gelatin/BCP 35 Hình 3.11: Phổ FTIR cuả gelatin, alginate oxi hóa, hydrogel alginate oxi hóa-gelatin hydrogel composite alginate oxi hóa-gelatin/BCP 36 Hình 3.12: Ảnh SEM EDS hydrogel composite alginate oxi hóa-gelatin/BCP (77%HAp: 23% β-TCP) sau tuần ngâm dung dịch SBF 37 Hình 3.13: Ảnh SEM EDS hydrogel composite alginate oxi hóa-gelatin/BCP (66%HAp:34% β-TCP) sau tuần ngâm dung dịch SBF 38 Hình 3.14: Ảnh SEM EDS hydrogel composite alginate oxi hóa-gelatin/BCP (21% HAp:79% β-TCP) sau tuần ngâm dung dịch SBF 38 Hình 3.15: Giản đồ XRD hydrogel alginate oxi hóa-gelatin hydrogel composite alginate oxi hóa-gelatin/BCP (66%HAp: 34% β-TCP) sau ngâm dung dịch SBF ngày 39 Hình 3.16: Phổ FTIR hydrogel composite alginate oxi hóa-gelatin/BCP (66%HAp: 34% β-TCP) trƣớc sau ngâm dung dịch SBF ngày 40 viii Hình 3.17: Đồ thị % khối lƣợng giảm cấp hydrogel alginate oxi hóa-gelatin hydrogel composite alginate oxi hóa-gelatin/BCP 41 Hình 3.18: Hàm lƣợng Ca dung dịch SBF ngâm hydrogel composite alginate oxi hóa-gelatin/BCP 43 Hình 3.19: Hàm lƣợng P dung dịch SBF ngâm hydrogel composite alginate oxi hóa-gelatin/BCP 44 Hình 3.20: Đồ thị khảo sát độc tính tế bào hydrogel alginate oxi hóa-gelatin hydrogel composite alginate oxi hóa-gelatin/BCP 46 Hình 3.21: Sự bám dính phát triển tế bào gốc từ tủy xƣơng thỏ hydrogel alginate oxi hóa-gelatin hydrogel composite alginate oxi hóa-gelatin/BCP 47 Hình 3.22: Ảnh phẫu thuật xƣơng đùi thỏ 48 Hình 3.23: Kết phân tích micro-CT mẫu xƣơng sau tháng phẫu thuật 52 Hình 3.24: Ảnh nhuộm tiêu H&E xƣơng đùi thỏ 55 Phụ lục 1: Đƣờng chuẩn HAp p1 Phụ lục 2: Đƣờng chuẩn β-TCP p2 Phụ lục 3: Vô trùng vật liệu p3 Phụ lục 4: Xử lý số liệu % khối lƣợng giảm cấp hydrogel alginate oxi hóagelatin hydrogel composite alginate oxi hóa-gelatin/BCP (77%HAp: 23% βTCP) p4 Phụ lục 5: Xử lý số liệu % khối lƣợng giảm cấp hydrogel alginate oxi hóagelatin hydrogel composite alginate oxi hóa-gelatin/BCP (66%HAp: 34% βTCP) p6 Phụ lục 6: Xử lý số liệu % khối lƣợng giảm cấp hydrogel alginate oxi hóagelatin hydrogel composite alginate oxi hóa-gelatin/BCP (21% HAp: 79% βTCP) p8 Phụ lục 7: Xử lý số liệu hàm lƣợng ion calcium dung dịch SBF ngâm hydrogel alginate oxi hóa-gelatin hydrogel composite alginate oxi hóagelatin/BCP (77%HAp: 23% β-TCP) p10 ix Phụ lục 8: Xử lý số liệu hàm lƣợng ion calcium dung dịch SBF ngâm hydrogel alginate oxi hóa-gelatin hydrogel composite alginate oxi hóagelatin/BCP (66%HAp: 34% β-TCP) p12 Phụ lục 9: Xử lý số liệu hàm lƣợng ion calcium dung dịch SBF ngâm hydrogel alginate oxi hóa-gelatin hydrogel composite alginate oxi hóagelatin/BCP (21% HAp: 79% β-TCP) p14 Phụ lục 10: Xử lý số liệu hàm lƣợng ion phosphate dung dịch SBF ngâm hydrogel alginate oxi hóa-gelatin hydrogel composite alginate oxi hóagelatin/BCP (77%HAp: 23% β-TCP) p16 Phụ lục 11: Xử lý số liệu hàm lƣợng ion phosphate dung dịch SBF ngâm hydrogel alginate oxi hóa-gelatin hydrogel composite alginate oxi hóagelatin/BCP (66%HAp: 34% β-TCP) p18 Phụ lục 12: Xử lý số liệu hàm lƣợng ion phosphate dung dịch SBF ngâm hydrogel alginate oxi hóa-gelatin hydrogel composite alginate oxi hóagelatin/BCP (21% HAp: 79% β-TCP) p20 Phụ lục 13: Xử lý số liệu tỉ lệ thể tích xƣơng/thể tích mơ xƣơng p22 Phụ lục 14: Xử lý số liệu tỉ lệ diện tích bề mặt xƣơng/thể tích xƣơng p24 x Nội dung 6: Thử nghiệm cấy ghép vật liệu hydrogel composite sinh học sở biphase calcium phosphate (BCP)-oxidized alginate, gelatin thỏ Ảnh phẫu thuật xương đùi thỏ 37 Nội dung 7: Chăm sóc theo dõi thỏ 4, tháng sau phẫu thuật 20 thỏ phân 20 chuồng ni có kích thước 60x80x80 cm, chuồng ni đặt cách 80cm để dễ vệ sinh đồng thời tránh nhiễm lạnh cho thỏ Dưới chuồng đặt máng nhựa để hứng phân nước tiểu để đảm bào vệ sinh cho thỏ Thức ăn thỏ: cám viên rau lang Thỏ nuôi ổn định tuần trước phẫu thuật Số thỏ phẫu thuật 18, chia thành nghiệm thức thí nghiệm: nghiệm thức tháng nghiệm thức tháng Trong nghiệm thức thí nghiệm chia thành lô: đối chứng, hydrogel, hydrogel composite, lơ thỏ thỏ cịn lại không phẫu thuật dùng để kiểm chứng với mẫu phẫu thuật 38 Nội dung 8: Đánh giá phát triển xương tế bào Nội dung 8.1 Đánh giá phát triển xương phương pháp micro computed tomography micro-CT Ảnh micro-CT xương sau phẫu thuật tháng 39 Ảnh micro-CT xương sau phẫu thuật tháng 40 Kết phân tích tỉ lệ thể tích xương/ thể tích mơ phương pháp micro-CT mẫu xương sau tháng phẫu thuật; p