Chọn lọc và nhân giống in vitro loài nưa konjac bản địa có hàm lượng glucomannan cao

ỦY BAN NHÂN DÂN TP.HCM SỞ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ BÁO CÁO NGHIỆM THU (Đã chỉnh sửa theo ý kiến Hội đồng nghiệm thu) ĐỀ TÀI: CHỌN LỌC VÀ NHÂN GIỐNG IN VITRO LOÀI NƯA KONJAC BẢN ĐỊA CÓ HÀM LƯỢNG GLUCOMANNAN CAO CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI: BÙI ĐÌNH THẠCH THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH THÁNG 07/ 2016 ỦY BAN NHÂN DÂN TP.HCM SỞ KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ BÁO CÁO NGHIỆM THU (Đã chỉnh sửa theo ý kiến Hội đồng nghiệm thu) ĐỀ TÀI: CHỌN LỌC VÀ NHÂN GIỐNG IN VITRO LOÀI NƯA KONJAC BẢN ĐỊA CÓ HÀM LƯỢNG GLUCOMANNAN CAO TÊN CHỦ NHIỆM ĐỀ TÀI (Ký tên) BÙI ĐÌNH THẠCH CƠ QUAN QUẢN LÝ CƠ QUAN CHỦ TRÌ (Ký tên/đóng dấu xác nhận) (Ký tên/đóng dấu xác nhận) THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH THÁNG 07/ 2016 MỤC LỤC TÓM TẮT i DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT iii DANH MỤC HÌNH iv DANH MỤC BẢNG vi BÁO CÁO NGHIỆM THU ĐẶT VẤN ĐỀ CHƢƠNG TỔNG QUAN 1.1.Cây nƣa 1.1.1 Phân loại 1.1.2 Đặc điểm phân bố 1.1.3 Đặc điểm thực vật 1.1.4 Tăng trƣởng phát triển 1.1.5 Nhân giống 1.1.6 Tr ng tr t 1.1.7 Thành phần hóa h c 13 1.1.8 Công dụng 15 1.2.Sinh tổng hợp glucomannan thực vật 16 1.3.Các yếu tố ảnh hƣởng đến phát sinh hình thái in vitro thực vật 18 1.3.1 Ảnh hƣởng môi trƣờng nuôi cấy 18 1.3.2.Ảnh hƣởng mẫu nuôi cấy 20 1.3.3.Ảnh hƣởng điều kiện nuôi cấy 23 1.3.4.Ảnh hƣởng chất điều hòa sinh trƣởng 23 1.4.Một số kết nghiên cứu liên quan đến chi Amorphophallus 25 1.4.1 Nghiên cứu nƣớc 25 1.4.2 Nghiên cứu nƣớc 26 CHƢƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 28 2.1 Vật liệu 28 2.2 Phƣơng pháp 28 2.2.1 Thu thập số loài nƣa địa 28 2.2.1.1 Phƣơng pháp kế thừa 28 2.2.1.2 Phƣơng pháp nghiên cứu thực địa 28 2.2.1.3 Phƣơng pháp nghiên cứu phịng thí nghiệm 29 2.2.1.4 Xây dựng vƣờn ƣơm giống gốc 29 2.2.2 Nuôi cấy mô 29 2.2.2.1 Tạo ngu n mẫu vô trùng 29 2.2.2.2 Tạo mô sẹo từ mẫu vô trùng 30 2.2.2.3 Tạo ch i từ mô sẹo 32 2.2.2.4 Phát triển hoàn chỉnh từ ch i 33 2.2.2.5.Đƣa vƣờn ƣơm 34 2.2.3.Phân tích thành phần glucomannan 36 2.2.4.Tr ng thử nghiệm 39 2.2.5.Xử lý số liệu 40 CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 41 3.1 Thu thập số loài nƣa địa 41 3.2 Xây dựng vƣờn ƣơm giống gốc 49 3.3 Nhân giống in vitro 50 3.3.1.Tạo mẫu vô trùng 50 3.3.2.Tạo mô sẹo từ củ 52 3.3.3.Tạo ch i từ mô sẹo 56 3.3.4 Phát triển từ ch i in vitro 58 3.3.5.Đƣa vƣờn ƣơm 60 3.4 Tr ng thử nghiệm 65 CHƢƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGH 71 4.1 Kết luận 71 4.2 Kiến nghị 71 TÀI LIỆU THAM KHẢO TÓM TẮT NỘI DUNG NGHIÊN CỨU Thu thập, ch n l c lồi nƣa có hàm lƣợng glucomannan cao phân bố Việt Nam xây dựng qui trình nhân giống in vitro loài Nƣa đƣợc ch n l c nhằm tạo ngu n giống phục vụ sản xuất mục tiêu đƣợc đặt Qua thu thập, loài nƣa từ vùng khác (Bình Thuận, Hà Giang Cao Bằng) đƣợc ghi nhận xây dựng đƣợc vƣờn ƣơm giống gốc cho loài thu thập đƣợc: Amorphophallus coaetaneus S.Y Liu & S.J Wei, 1986; Amorphophallus corrugatus N.E Brown, 1912 Kew Bull 269; Amorphophallus konjac K Koch; Amorphophallus paeoniifolius (Dennst.) Nicolson, 1977; Amorphophallus opertus Sử dụng phƣơng pháp đo quang phổ để xác định hàm lƣợng glucomannan từ loài thu thập ch n đƣợc loài Amorphophallus konjac K Koch để nhân giống in vitro Sử dụng HgCl2 0,3 % thời gian khử trùng 30 phút để tạo mẫu cũ vô trùng, mãnh cũ vô trùng đƣợc kích thích tạo sẹo mơi trƣờng MS có bổ sung mg/L 2,4-D; 0,1 mg/L IBA mg/L BA (83,33% mẫu mơ sẹo có khả ăng tạo ch ); ch i đƣợc tạo từ mô sẹo môi trƣờng MS bổ sung mg/L BA IBA 0,3 mg/L (5,57 ch i/mẫu chiều cao ch i đạt 12,50 cm); ch i phát triển thành hồn chỉnh tối ƣu mơi trƣờng MS có bổ sung 0,1 mg/L IBA Cây nhân giống nuôi cấy in vitro đƣợc đƣa vƣờn ƣơm với chất đất: tro trấu: sơ dừa = 2:0,5:0,5 đạt giá phần trăm sống cao (93,00%) Sau nuôi cấy vƣờn ƣơm tuần, đƣợc tr ng điều kiện tự nhiên cho thấy thời gian tr ng chế độ dinh dƣỡng có ảnh hƣởng lên khả sinh trƣởng tích lũy hàm lƣợng lƣợng glucomannan I SUMMARY OF RESEARCH CONTENT Collect and determination of Amorphophallus species distributed in Vietnam have a high content of glucomannan and build process culture in vitro from selected species were purposed Through collecting, Amorphophallus species from different regions (Binh Thuan, Ha Giang and Cao Bang) were recorded and built nurseries for native species collected: Amorphophallus coaetaneus S.Y Liu & S.J Wei, 1986; Amorphophallus corrugatus N.E Brown, 1912 Kew Bull 269; Amorphophallus konjac K Koch; Amorphophallus paeoniifolius (Dennst.) Nicolson, 1977; Amorphophallus opertus Using spectroscopic measurements to determine the concentration of glucomannan and Amorphophallus konjac K Koch species were collected for in vitro culture Using 0.3% HgCl2 sterilized with 30 minutes to create a sterile corms, the corms sterile were cultured in MS medium supplemented with mg/L 2,4-D; 0.1 mg/L IBA and mg/L BA to create callus (83.33% ); shoots are created from callus on MS medium supplemented mg/L BA and IBA 0.3 mg/L (5.57 shoots/sample and height of shoots: 12.50 cm); buds were cultured in MS medium supplemented with 0.1 mg/L IBA to grow completion plants Amorphophallus konjac propagated by in vitro culture were growned in glasshouse with the soil: rice husk ash: coir = 2: 0.5: 0.5 attained the highest percentage of living plants (93.00%) After weeks of culture glasshouse, the plants were growned in natural conditions showed that planting time and fertilize had affect the growth and accumulation of glucomannan content II DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT VIẾT TẮT THUẬT NGỮ TIẾNG VIẾT UDP-glucose Uridine diphosphate glucose GLC-1-P glucose-1-phosphate ADP-D-glucose adenosine diphosphate D-glucose GDP-D-mannose guanine diphosphate D-mannose B1 Thiamin B2 Ribofravin B3 Panthotenic B5 Nicotinic acid IBA Indoly Butyric Acid IAA Indoly Acetic Acid NAA α – Naptalen Acetic Acid 2,4 – D Dichlorphenoxy Acetic Acid BA – Benzyl Amino Purin MS Murashige and Skoog iii DANH MỤC HÌNH SỐ TÊN HÌNH ẢNH TRANG 1.1 Hình thái thân củ A konjac (Liu, 2004) 1.2 Sự thay đổi hình thái theo độ tuổi A konjac 1.3 Sự phân bố hoa đực hoa A konjac (Hetterscheid Ittenbach, 1996) 1.4 Sự phát triển A konjac qua giai đoạn khác 1.5 Con đƣờng sinh tổng hợp glucomannan tinh bột củ A 17 konjac 3.1 Amorphophallus coaetaneus 42 3.2 Amorphophallus corrugatus 43 3.3 Ch i loài Amorphophallus konjac 44 3.4 Cụm hoa Amorphophallus konjac 44 3.5 Cụm hoa loài Amorphophallus paeoniifolius 45 3.6 Ch i non loài Amorphophallus opertus 46 3.7 Cây loài Amorphophallus 46 3.8 Cụm hoa loài Amorphophallus opertus 47 3.9 Đ thị đƣờng chuẩn D-glucose 48 3.10 Một số loài Nƣa đƣợc lƣu trữ vƣờn ƣơm giống gốc 50 sau tháng tr ng 3.11 Mẫu vô trùng nuôi môi trƣờng MS 52 3.12 Mô sẹo đƣợc tạo từ mãnh củ nƣa 53 3.13 Khả hình thành phát triển ch i nƣa từ mô 57 sẹo iv 3.14 Ảnh hƣởng IBA lên khả tái sinh từ ch i in 58 vitro 3.15 Cây nƣa Amorphophallus konjac đƣợc tạo từ nuôi 59 cấy in vitro 3.16 Ảnh hƣởng chất tr ng đến khả thích nghi 62 phát triển nhân giống in vitro điểu kiện vƣờn ƣơm 3.17 Cây nƣa Konjac nuôi cấy in vitro đƣợc tr ng vƣờn 62 ƣơm (0 ngày tuổi) 3.18 Cây nƣa Konjac nuôi cấy in vitro đƣợc tr ng vƣờn 63 ƣơm (sau tháng tuổi) 3.19 Qui trình tổng thể ni cấy in vitro Nƣa 64 Amorphophallus konjac 3.20 Cây nƣa nuôi cấy mô sau tuần nuôi vƣờn ƣơm 66 3.21 Cây nƣa nuôi cấy in vitro tr ng sau tháng 66 3.22 Tr ng lƣợng củ sau tháng tr ng 66 3.23 Tr ng lƣợng củ sau tháng tr ng 66 3.24 Sự phát triển rễ củ Nƣa konjac tr ng tự 67 nhiên 3.25 Ch i đƣợc hình thành sau tr ng tháng tuổi 68 3.26 Cây nƣa nuôi cấy in vitro đƣợc tr ng tự nhiên 69 (tr ng xen vƣờn tiêu- Đắk nông) 3.27 Củ nƣa nuôi cấy in vitro sau tháng tr ng v 69 1 1.5 1.5 1.5 1.5 2 1.5 0.5 1.5 0.5 1 0.5 1.5 0.5 0.5 Non-est Non-est Non-est Non-est Non-est Non-est Non-est Non-est Non-est Non-est PHAN TRAM CAY SONG The GLM Procedure Class Level Information Class Levels KH DTS D1T1S1 D1T2S0 12 Values D1.5T.5S D1.5T0S1 D1.5T1.5 D1.5T1S D1T.5S1 D1T0S2 D1T1.5S D2T.5S.5 D2T0S1 D2T1S0 Number of Observations Read Number of Observations Used 36 36 PHAN TRAM CAY SONG The GLM Procedure Dependent Variable: Y Source DF Squares Model Error Corrected Total 11 24 35 2734.305556 193.333333 2927.638889 R-Square 0.933963 Source KH DTS Source KH DTS DF DF Coeff Var 3.671445 Type I SS 218.988889 2515.316667 Type III SS 0.000000 2515.316667 Sum of Mean Square 248.573232 8.055556 Root MSE 2.838231 Mean Square 109.494444 279.479630 Mean Square 279.479630 F Value Pr > F 30.86 F 0.0001 F