nghiên cứu thiết lập bộ chuẩn kháng sinh phục vụ công tác kiểm nghiệm chất lượng thuốc

Bộ y tế viện kiểm nghiệm thuốc trung ơng báo cáo tổng kết đề tài kh&cn cấp nghiên cứu thiết lập chuẩn kháng sinh phục vụ công tác kiểm nghiệm chất lợng thuốc chủ nhiệm đề tài: ts Nguyễn văn tựu 7281 07/4/2009 Hà nội - 2008 B Y TẾ BÁO CÁO KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ĐỀ TÀI CẤP BỘ NGHIÊN CỨU THIẾT LẬP BỘ CHUẨN KHÁNG SINH PHỤC VỤ CÔNG TÁC KIỂM NGHIỆM CHẤT LƯỢNG THUỐC Chủ nhiệm đề tài: TS Nguyễn Văn Tựu Thư ký đề tài: ThS Nguyễn Thị Kim Thanh Cơ quan chủ trì đề tài: Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương Năm 2008 BỘ Y TẾ BÁO CÁO KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ĐỀ TÀI CẤP BỘ Tên đề tài: Nghiên cứu thiết lập chuẩn kháng sinh phục vụ công tác kiểm nghiệm chất lượng thuốc Chủ nhiệm đề tài: TS Nguyễn Văn Tựu Thư ký đề tài: ThS Nguyễn Thị Kim Thanh Cơ quan chủ trì đề tài: Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương Cấp quản lý: Bộ Y tế Thời gian thực hiện: từ tháng 11 năm 2006 đến tháng 11 năm 2008 Tổng kinh phí thực đề tài: 300 triệu đồng Trong đó: Kinh phí SNKH 300 triệu đồng Năm 2008 BÁO CÁO KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ĐỀ TÀI CẤP BỘ Tên đề tài: Nghiên cứu thiết lập chuẩn kháng sinh phục vụ công tác kiểm nghiệm chất lượng thuốc Chủ nhiệm đề tài: TS Nguyễn Văn Tựu Cơ quan chủ trì đề tài: Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương Cơ quan quản lý đề tài: Bộ Y tế Thư ký đề tài: ThS Nguyễn Thị Kim Thanh Danh sách người thực Nguyễn Thị Kim Thanh Thạc sĩ Viện Kiểm nghiệm thuốc TW Phạm Thị Duyên Thạc sĩ Viện Kiểm nghiệm thuốc TW Mai Thanh Hà Dược sĩ Viện Kiểm nghiệm thuốc TW Lê Thị Thu Thạc sĩ Viện Kiểm nghiệm thuốc TW Lê Quang Thảo Dược sĩ Viện Kiểm nghiệm thuốc TW Cao Ngọc Anh Dược sĩ Viện Kiểm nghiệm thuốc TW Viện Kiểm nghiệm thuốc TW Nguyễn Thị Quỳnh Dược sĩ Giang Nguyễn Đăng Lâm Thạc sĩ Phan Thị Thùy Chi Thạc sĩ Viện Kiểm nghiệm thuốc TW 10 Trần Thị Bích Vân Thạc sĩ Viện Kiểm nghiệm thuốc TW 11 Lê Thị Hường Hoa Thạc sĩ Viện Kiểm nghiệm thuốc TW Viện Kiểm nghiệm thuốc TW Các đề tài nhánh đề tài: (a) Chuyên đề 1: - Tên chuyên đề: Xây dựng quy trình phân tích thiết lập chất đối chiếu Azithromycin - Chủ nhiệm chuyên đề 1: DS Mai Thanh Hà (b) Chuyên đề 2: - Tên chuyên đề: Xây dựng quy trình phân tích thiết lập chất đối chiếu Cefadroxil - Chủ nhiệm chuyên đề 2: ThS Nguyễn Thị Kim Thanh (c) Chuyên đề 3: - Tên chuyên đề: Xây dựng quy trình phân tích thiết lập chất đối chiếu Cefradin - Chủ nhiệm chuyên đề 3: DS Cao Ngọc Anh (d) Chuyên đề 4: - Tên chuyên đề: Xây dựng quy trình phân tích thiết lập chất đối chiếu Cefuroxim axetil - Chủ nhiệm chuyên đề 4: ThS Nguyễn Thị Kim Thanh (e) Chuyên đề 5: - Tên chun đề: Xây dựng quy trình phân tích thiết lập chất đối chiếu Cefuroxim natri - Chủ nhiệm chuyên đề 5: DS Lê Quang Thảo (f) Chuyên đề 6: - Tên chuyên đề: Xây dựng quy trình đánh giá thiết lập chất đối chiếu Clarithromycin - Chủ nhiệm chuyên đề 6: ThS Lê Thị Thu (g) Chuyên đề 7: - Tên chuyên đề: Xây dựng quy trình đánh giá thiết lập chất đối chiếu Norfloxacin - Chủ nhiệm chuyên đề 7: ThS Phạm Thị Duyên (h) Chuyên đề 8: - Tên chuyên đề: Xây dựng quy trình đánh giá thiết lập chất đối chiếu Tobramycin - Chủ nhiệm chuyên đề 8: DS Nguyễn Thị Quỳnh Giang Thời gian thực đề tài: Tháng 11 năm 2006 đến tháng 11 năm 2008 LỜI NÓI ĐẦU Các hoạt chất thuộc kháng sinh có 50 loại với dạng chế phẩm biệt dược khác sản xuất nhập vào Việt Nam, chiếm khoảng 30% tổng số mặt hàng lưu hành thị trường Nhu cầu chất đối chiếu kháng sinh thuộc hệ phục vụ cho công tác kiểm nghiệm Dược phẩm nước ngày tăng số lượng chủng loại Để mua nguyên liệu có chất lượng cao chất chuẩn gốc để liên kết chuẩn vấn đề khó khăn nhiều đơn vị Nghiên cứu thiết lập chuẩn kháng sinh nhằm đáp ứng kịp thời nhu cầu đơn vị kiểm nghiệm sản xuất toàn quốc vấn đề cần giải Chúng xin chân thành cám ơn lãnh đạo Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương tạo điều kiện khoa/ phịng có liên quan tham gia hợp tác đánh giá giúp chúng tơi hồn thành đề tài quy định Bảng thích ký hiệu viết tắt ARS : Chất đối chiếu khu vực ASEAN ANOVA : Phân tích phương sai BP : Dược điển Anh BQ : Bảo quản CRS : Chất đối chiếu hóa học C18 : Cột sắc ký nhồi tiểu phân Silica gel có bề mặt silan hóa với nhóm octadecyl C6 : Cột sắc ký nhồi tiểu phân Silica gel có bề mặt silan hóa với nhóm Hexyl EP : Dược điển Châu Âu EPRS : Chất đối chiếu theo Dược điển Châu Âu 10 F : Trắc nghiệm F (phân phối Fisher) 11 Ftn : F thực nghiệm 12 Ftc : F tiêu chuẩn 13 GC : Phương pháp sắc ký khí 14 IR : Phổ hồng ngoại 15 ICRS : Chất đối chiếu theo Dược điển quốc tế 16 HPLC : Phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao 17 HL : Hàm lượng 18 k’ : Hệ số dung lượng 19 m : Lượng cân 20 N : Số đĩa lý thuyết 21 n : Số lần thực nghiệm 22 NLBĐ : Nguyên liệu ban đầu 23 p : Số phòng thử nghiệm tham gia 24 PTN : Phòng thử nghiệm 25 R : Độ phân giải hai pic sắc ký đồ 26 RH : Độ ẩm tương đối 27 RSD : Độ lệch chuẩn tương đối 28 Rr : Thời gian lưu tương đối 29 RP18 : Cột sắc ký pha đảo nhồi tiều phân Silica gel có bề mặt silan hóa với nhóm octadecyl 30 S : Độ lệch chuẩn 31 Sc : Phương sai chung 32 SKS : Số kiểm soát 33 t : Trắc nghiệm t (phân phối Student) 34 ttn : t thực nghiệm 35 ttc : t tiêu chuẩn 36 T : Hệ số đối xứng 37 TLC : Phương pháp sắc ký lớp mỏng 38 USP : Dược điển Mỹ 39 USPRS : Chất đối chiếu theo Dược điển Mỹ 40 UV - VIS : Phương pháp đo quang phổ tử ngoại khả kiến 41 X : Giá trị trung bình 42 γ : Bậc tự 43 WHO : Tổ chức Y tế giới 44 WS : Chuẩn làm việc 45 Z - Score : Nói lên độ lệch giá trị riêng với giá trị trung bình phịng thử nghiệm MỤC LỤC Trang Lời nói đầu Phần A –Tóm tắt kết bật đề tài 1 Kết bật đề tài (a) Đóng góp đề tài (b) Kết cụ thể (c) Hiệu đào tạo (d) Hiệu kinh tế Áp dụng vào thực tiễn sản xuất đời sống xã hội 3 Đánh giá thực đề tài đối chiếu với đề cương nghiên cứu phê duyệt (a) Tiến độ (b) Thực mục tiêu nghiên cứu (c) Các sản phẩm tạo so với dự kiến đề cương (d) Đánh giá việc sử dụng kinh phí 4 Các ý kiến đề xuất Phần B Nội dung báo cáo chi tiết kết nghiên cứu đề tài cấp Bộ Đặt vấn đề 1.1 Tính cấp thiết cần nghiên cứu đề tài 1.2 Giả thiết nghiên cứu đề tài 1.3 Mục tiêu nghiên cứu Tổng quan đề tài nghiên cứu 2.1 Tình hình nghiên cứu ngồi nước liên quan đến đề tài 2.1.1 Giới thiệu 2.1.2 Hướng dẫn chung thiết lập chất đối chiếu WHO 10 2.1.3 Hướng dẫn chung thiết lập chất đối chiếu ASEAN 15 - Dung dịch đối chiếu (2): Hòa tan 4,0 mg norfloxacin tạp A chuẩn dung mơi pha mẫu pha lỗng thành ml với dung mơi Pha lỗng ml dung dịch thành ml với dung dịch thử (2) Cách tiến hành: Chấm riêng biệt lên mỏng µl dung dịch thử (1) dung dịch so sánh Triển khai sắc ký đến dung môi 18 cm Để khơ mỏng luồng khơng khí kiểm tra ánh sáng tử ngoại bước sóng 254 nm sau 365 nm Bất vết phụ sắc ký đồ dung dịch thử (1), ngồi vết chính, khơng đậm màu vết sắc ký đồ dung dịch đối chiếu (1) (0,2%) khơng có q vết tạp chất Phép thử có giá trị tỷ số giá trị Rf tạp A giá trị Rf Nofloxacin sắc ký đồ dung dịch đối chiếu (2) 1,2 3.4 Kim loại nặng: Không 15 ppm - Cân khoảng 2,0 g chế phẩm - Dùng ml dung dịch chì mẫu 10 phần triệu để chuẩn bị mẫu đối chiếu Tiến hành: - Chuẩn bị dung dịch mẫu thử: + Trộn 2,0 g chế phẩm thử với 0,5 g magnesi oxyd (TT) chén sứ Nung đỏ thẫm thu khối đồng màu trắng hay trắng xám nhạt Sau nung 800oC + Thêm lần, lần ml dung dịch acid hydrocloric N (TT) để hòa tan cắn, thêm 0,1 ml dung dịch phenolphtalein (CT), cho giọt dung dịch amoniac đậm đặc (TT) đến có màu hồng Làm nguội, thêm acid acetic băng (TT) đến màu dung dịch, thêm 0,5 ml Lọc cần, thêm nước vừa đủ 20 ml + Hút 12 ml dung dịch thu cho vào ống nghiệm, thêm ml dung dịch đệm acetat pH 3,5, lắc Thêm 1,2 ml dung dịch thioacetamid (TT), lắc để yên phút So sánh màu ống thử với màu ống mẫu chuẩn bị đồng thời điều kiện - Chuẩn bị dung dịch màu đối chiếu: + Lấy ml dung dịch chì mẫu 10 phần triệu Pb, cho vào chén nung sứ, trộn với 0,5 g magnesi oxyd (TT) Làm khô hỗn hợp tủ sấy 100oC 105oC, nung mô tả PL 42 + Thêm lần, lần ml dung dịch acid hydrocloric N (TT) để hòa tan cắn, thêm 0,1 ml dung dịch phenolphtalein (CT), cho giọt dung dịch amoniac đậm đặc (TT) đến có màu hồng Làm nguội, thêm acid acetic băng (TT) đến màu dung dịch, thêm 0,5 ml Lọc cần, thêm nước vừa đủ 20 ml + Hút 10 ml dung dịch thu từ xử lý dung dịch ion chì mẫu ml dung dịch thu từ xử lý chế phẩm thử để làm phản ứng chuẩn bị dung dịch màu chuẩn - Yêu cầu: Màu ống thử không đậm màu ống đối chiếu 3.5 Mất khối lượng làm khô: Không 1,0% Xác định 1,000 g chế phẩm, sấy chân không 100 - 105°C 3.6 Định lượng: Norfloxacin phải chứa từ 99,0 đến 101,0% C16H18FN3O3, tính theo chế phẩm làm khơ a Chuẩn độ đo thế: Hịa tan 0,240 g chế phẩm 80 ml acid acetic khan Chuẩn độ dung dịch acid percloric 0,1M, xác định điểm kết thúc phương pháp chuẩn độ đo điện ml dung dịch acid percloric 0,1M tương ứng với 31,93 mg C16H18FN3O3 b Phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao: Các dung dịch phải tránh ánh sáng Điều kiện sắc ký: - Cột: RP 18, 250 x mm, – 10 μm, - Duy trì nhiệt độ cột: 40 ± 1,0°C - Pha động: Hỗn hợp dung dịch acid phosphoric (1:1000) acetonitril (850 : 150) Có thể điều chỉnh cần - Detector: 275 nm - Tốc độ dịng: ml/phút - Thể tích tiêm: 10 μl - Dung dịch chuẩn: Hòa tan 25 mg norfloxacin chuẩn pha động pha loãng thành 25,0 ml với dung mơi, trộn Pha lỗng 5,0 ml dung dịch với pha động vừa đủ 50,0 ml, trộn - Dung dịch thử: Chuẩn bị giống dung dịch chuẩn thay 25 mg norfloxacin mẫu thử PL 43 - Ổn định cột: Cột phải ổn định với dung dịch natri dihydrophosphat 0,01M điều chỉnh pH 4,0 acid phosphoric, tốc độ dòng 0,5 ml/ phút Sau cân cột với pha động với tốc độ ml/phút 30 phút trước tiêm mẫu - Cách tiến hành: Tiêm xen kẽ dung dịch chuẩn dung dịch thử, ghi lại sắc ký đồ - Yêu cầu: Thời gian lưu norfloxacin khoảng phút, hiệu lực cột (được xác định từ pic norfloxacin) khơng 1500 đĩa lý thuyết, hệ số đối xứng pic norfloxacin không lớn 2,0 độ lệch chuẩn tương đối lần tiêm nhắc lại dung dịch chuẩn khơng q 2,0% - Tính hàm lượng phần trăm C16H18FN3O3 chế phẩm dựa vào diện tích pic dung dịch thử, dung dịch chuẩn hàm lượng C16H18FN3O3 norfloxacin chuẩn công bố Thuốc thử: 4.1 Chất chuẩn gốc: - Norfloxacin CRS - Norfloxacin tạp A CRS 4.2 Cột sắc ký: - RP 18, 250 x mm, – 10 µm 4.3 Thuốc thử dung môi: - Acetonitril (TT) - Acid acetic khan (TT) - Acid glacial acetic (TT) - Acid phosphoric (TT) - Bản mỏng silicagel GF254 - Dung dịch acid phosphoric (1:1000) - Acid percloric 0,1M - Cloroform (TT) - Diethylamin (TT) - Dung dịch chì mẫu 10 ppm - Hỗn dịch đối chiếu II: Gồm 10,0 ml hỗn dịch đục chuẩn 90,0 ml nước PL 44 + Hỗn dịch đục chuẩn: Hịa lỗng 15,0 ml hỗn dịch đục gốc thành 1000,0 ml với nước Sử dụng vòng 24 sau pha + Hỗn dịch đục gốc: Hòa tan 2,5 g hexamethylenetetramine 25,0 ml nước, thêm 25,0 ml dung dịch hydrazin sulphat 1,0% kl/tt Trộn đều, để yên 24 giờ, hạn sử dụng tháng - Pha dung dịch màu chuẩn N7 (chuẩn bị trước dùng): Trộn 2,5 ml dung dịch gốc màu nâu với 97,5 ml dung dịch acid hydrocloric 1% (kl/tt) - Pha dung dịch gốc màu nâu: Trộn hỗn hợp 30 ml dung dịch màu vàng, 30 ml dung dịch màu đỏ, 24 ml dung dịch màu xanh, 16 ml dung dịch acid với hydrocloric 1% (kl/tt) - Dung mơi A: 25 ml acid hydrocloric (TT) hồ tan vào 975 ml nước cất - Dung dịch màu vàng: Hoà tan 46 g sắt (III) clorid (TT) dung môi A cho vừa đủ 1000 ml Chuẩn độ điều chỉnh dung mơi A để có dung dịch chứa 45 mg FeCl3 6H2O ml Bảo quản tránh ánh sáng - Dung dịch màu đỏ: Hoà tan 60 g cobalt (II) clorid (TT) dung môi A cho vừa đủ 1000 ml Chuẩn độ, điều chỉnh dung mơi A để có dung dịch chứa 59,5 mg CoCl2 6H2O ml - Dung dịch màu xanh: Hoà tan 63 g đồng (II) sulfat (TT) dung môi A cho vừa đủ 1000 ml Chuẩn độ, điều chỉnh dung mơi A để có dung dịch chứa 62,4 mg CuSO4 5H2O ml - Dung dịch natri hydroxyd 4g/l (TT) - Methanol (TT) - Methylen clorid - Natri dihydro phosphat 0,01M - Toluen (TT) - Nước cất (TT) Kiểm tra định kỳ: Kiểm tra lại chất lượng chất đối chiếu Norfloxacin theo tiêu chuẩn sau: - Tạp chất liên quan: TLC - Giảm khối lượng sấy khô - Định lượng: HPLC - Chu kỳ: 24 tháng PL 45 Đánh giá sơ bộ: Các tiêu chuẩn đánh giá sơ nguyên liệu Norfloxacin bao gồm: - Định tính: Hồng ngoại - Tạp chất liên quan: TLC - Giảm khối lượng sấy khô - Định lượng: MTK HPLC Bảo quản: Chất đối chiếu Norfloxacin đóng lọ thủy tinh màu nâu nút kín, tránh ánh sáng bảo quản nhiệt độ - 8ºC PL 46 PL 47 PL 48 Phụ lục 8: Quy trình phân tích chất đối chiếu Tobramycin Mục đích sử dụng: Chất đối chiếu Tobramycin dùng phép thử định tính phương pháp sắc ký lớp mỏng phép thử định lượng phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao Mô tả: Bột kết tinh trắng trắng ngà Rất dễ tan nước, khó tan cồn thực tế không tan ether Tiêu chuẩn: 3.1 Định tính: A HPLC: - Điều kiện sắc ký: Như phần định lượng - So sánh với chất chuẩn Tobramycin - Yêu cầu: Thời gian lưu pic sắc ký đồ thu từ dung dịch dẫn xuất mẫu thử phải có thời gian lưu tương ứng với pic sắc ký đồ thu từ dung dịch dẫn xuất mẫu chuẩn B Phương pháp sắc ký lớp mỏng: - Bản mỏng: Silica gel GF 254 - Dung môi khai triển: Cloroform – amoniac đậm đặc – methanol (10: 20: 30) - Dung dịch thử : Hòa tan 20 mg chế phẩm nước đến vừa đủ ml - Dung dịch đối chiếu (a): Hòa tan 20 mg Tobramycin chuẩn nước đến vừa đủ ml - Dung dịch đối chiếu (b): Hòa tan mg Neomycin sulphate chuẩn mg Kanamycin sulphate chuẩn ml dung dịch đối chiếu (a) Cách tiến hành: Chấm riêng biệt lên mỏng μl dung dịch Triển khai sắc ký đến dung môi 15 cm Lấy mỏng để khơ ngồi khơng khí, phun hỗn hợp đồng thể tích dung dịch 1,3 – dihydroxynaphthalen g/l ethanol 96% dung dịch acid sulphuric 460 g/l, sau sấy 105oC phút Vết sắc ký đồ dung dịch thử phải giống vị trí, màu sắc kích thước với vết sắc ký đồ PL 49 dung dịch đối chiếu (a) Phép thử khơng có giá trị trừ sắc ký đồ dung dịch đối chiếu (b) xuất vết tách rõ ràng 3.2 pH: Hòa tan 1.0 g 10 ml nước loại CO2, pH dung dịch từ 9,0 đến 11,0 3.3 Cắn cịn lại sau nung: Khơng q 0,3% - Nung chén sứ 8000C ± 250C 30 phút, để nguội bình hút ẩm cân để xác định khối lượng bì - Cân xác khoảng 1,0 g nguyên liệu, đốt đến chuyển thành tro hóa hoàn toàn - Làm ẩm ml acid nitric giọt acid sulfuric, tiếp tục đốt đến khơng cịn khói trắng bay lên - Nung 8000C ± 250C đến thành tro hoàn toàn - Để nguội bình hút ẩm, cân để tính phần trăm cắn lại sau nung 3.4 - Kim loại nặng: Khơng vượt q 30 ppm Dung dịch chuẩn: Hút xác 4,0 ml dung dịch chì chuẩn 10 ppm cho vào ống so màu thể tích 50 ml, pha loãng với nước cất thành 25 ml dung dịch, điều chỉnh pH khoảng 3,0 đến 4,0 dung dịch acid acetic 1N amoni hydroxid 6N (dùng giấy thị màu để xác định khoảng pH), pha loãng với nước cất để thu 40 ml dung dịch - Dung dịch thử: Cân xác 1,3 g mẫu thử cho vào chén nung sứ, làm ẩm lượng vừa đủ acid sulfuric, làm bốc tới khô Thêm vào chén nung ml dung dịch acid nitric giọt acid sulfuric, đốt đến khơng cịn khói trắng bay lên Nung 500 – 600 0C đến thành tro hoàn toàn Để nguội, thêm vào ml dung dịch acid hydrocloric 6N, đậy nắp, đun cách thủy 15 phút sau mở nắp để bốc tới khô Làm ẩm cắn giọt acid hydrocloric thêm vào 10 ml nước nóng, đun cách thủy phút cho thêm vào chén giọt dung dịch amoni hydroxid 6N đến cho phản ứng kiềm với giấy quỳ, pha loãng với nước thành 25 ml dung dịch Điều chỉnh pH khoảng 3,0 đến 4,0 dung dịch acid acetic 1N (dùng giấy thị màu để xác định khoảng pH) Lọc cần, rửa chén giấy lọc 10 ml nước cất Kết hợp dịch lọc, rửa cho vào ống so màu thể tích 50 ml, pha lỗng với nước thành 40 ml, lắc PL 50 - Cho vào ống so màu đựng dung dịch chuẩn thử lần lượt: ml dung dịch đệm acetat pH 3,5 1,2 ml dung dịch thuốc thử thioacetamid – glycerin base pha loãng với nước thành 50 ml, lắc đều, để yên phút Quan sát trắng, nhìn từ xuống - Yêu cầu: Màu dung dịch thử không đậm màu dung dịch chuẩn 3.5 - Hàm lượng nước (KF): Không 8,0 %; Dung môi: Methanol khan (Merck) - Thuốc thử: Karl Fischer (Merck) 3.6 Cân xác khoảng 0,300 g mẫu thử Tạp chất liên quan (TLC): - Bản mỏng: Silica gel GF 254 - Dung môi khai triển: Dung dịch NaCl 29,2% kl/tt – ethanol 96o – Nước (50: 30: 20) - Dung dịch thử: Cân xác khoảng 0,050 g mẫu thử, thêm ml nước, chỉnh pH 5,5 ± 0,4 dung dịch acid sulfuric 1N, pha loãng với nước đến vừa đủ 10 ml - Dung dịch so sánh: Pha loãng 1,0 ml dung dịch thử thành 100,0 ml với nước - Thể tích chấm: μl - Khai triển: 15 cm - Phát vết: Để mỏng khơ ngồi khơng khí, sấy 110oC/ 30 phút, phun mỏng cịn nóng với dung dịch natri hypoclorid lỗng Để khơ mỏng ngồi khơng khí đến phần mỏng nơi khơng chấm sắc ký có màu xanh nhạt với dung dịch hồ tinh bột có kali iodid, phun mỏng với dung dịch hồ tinh bột có kali iodid - Yêu cầu: Các vết phụ trừ vết thu từ sắc ký đồ dung dịch thử không đậm vết sắc ký đồ dung dịch so sánh (0,1 %) 3.7 Định lượng (HPLC): Nguyên liệu Tobramycin phải có hàm lượng khơng 900 μg C18H37N5O9, tính theo chế phẩm khan Điều kiện sắc ký: - Cột : RP18 (octadecylsilyl silicagel), μm, 25 cm x mm - Detector: 365 nm - Tốc độ dòng: 1,2 ml/phút PL 51 - Thể tích tiêm: 20 μl - Pha động: Hòa tan 2,0 g tris (hydroxymethyl) aminomethan khoảng 800 ml nước, thêm 20 ml dung dịch acid sulfuric 1N, pha loãng với acetonitril để thu 2000 ml dung dịch, trộn đều, lọc + Thuốc thử 2,4-dinitrofluorobenzen: Pha dung dịch 2,4-dinitrofluorobenzen 10 mg/ml ethanol 96% (bảo quản dung dịch tủ lạnh dùng ngày) + Thuốc thử tris (hydroxymethyl) aminomethan: Pha dung dịch tris (hydroxymethyl) aminomethan gốc nước có nồng độ 15 mg/ml (bảo quản tủ lạnh dùng tháng) Chuyển 40,0 ml dung dịch gốc vào bình định mức 200 ml, thêm dimethyl sulfoxid, vừa thêm vừa lắc, vừa đủ đến vạch (Dung dịch dùng giờ, bảo quản nước đá 10oC dùng giờ) - Dung dịch đối chiếu: Cân xác khoảng 0,055 g Tobramycin CRS cho vào bình định mức 50 ml, thêm ml dung dịch acid sulfuric 1N, thêm nước đến vạch, lắc Pha loãng 10,0 ml dung dịch với nước để thu 50,0 ml dung dịch (nồng độ khoảng 0,22 mg Tobramycin CRS ml) - Dung dịch thử: Cân xác khoảng 0,055 g mẫu thử tiến hành tương tự dung dịch đối chiếu - Tạo dung dịch dẫn xuất (chú ý: đun tất dung dịch thời gian nhiệt độ dẫn, đặt dung dịch vào nồi cách thủy đạt nhiệt độ 60 o C lấy lúc) Hút riêng rẽ 4,0 ml dung dịch đối chiếu, dung dịch thử nước cất vào bình định mức 50 ml Thêm vào bình 10 ml thuốc thử 2,4-dinitrofluorobenzen 10 ml thuốc thử tris (hydroxymethyl) aminomethan, lắc đều, đậy nút, đun cách thủy nhiệt độ 60 ± oC vòng 50 ± phút Lấy để yên 10 phút, thêm acetonitril đến gần đủ, để nguội đến nhiệt độ phòng thêm acetonitril vừa đủ đến vạch, thu dung dịch dẫn xuất Tobramycin CRS, thử mẫu trắng - Dung dịch xác định độ phân giải (chuẩn bị trước dùng): Pha dung dịch p-naphtholbenzein acetonitril có nồng độ 0,24 mg/ml Hút 2,0 ml dung dịch vào bình định mức 10 ml, thêm dung dịch dẫn xuất Tobramycin CRS đến vạch PL 52 - Quy định: Thời gian lưu tương đối p-naphtholbenzein Tobramycin 0,6, độ phân giải (R) p-naphtholbenzein Tobramycin phải lớn 4,0 Độ lệch chuẩn tương đối lần tiêm dung dịch dẫn xuất Tobramycin CRS phải nhỏ 2,0 % - Tiến hành: Tiêm dung dịch dẫn xuất mẫu trắng, Tobramycin CRS thử Tính hàm lượng % Tobramycin C18H37N5O9 mẫu thử theo chất khan dựa theo hàm lượng mẫu chuẩn công bố Thuốc thử: 4.1 Chất chuẩn gốc: - Tobramycin CRS - Neomycin sulfate CRS - Kanamycin sulfate CRS 4.2 Cột sắc ký: - RP18, μm, 25 cm x mm 4.3 Thuốc thử dung môi: - Acetonitril - Amoniac đặc - Acid acetic 1N - Amoni hydroxid 6N - Acid sulphuric R - Cloroform R - 2,4-dinitrofluorobenzen - Dung dịch acid sulfuric 1N - Dung dịch chì chuẩn 100 ppm - Dung dịch thị hồ tinh bột có KI: + Dung dịch thị hồ tinh bột: Nghiền g tinh bột cối với ml nước thành hỗn hợp đồng vừa đổ vừa khuấy vào 100 ml nước sôi Đun sôi tiếp – phút thu chất lỏng đục, để nguội + Hòa tan 0,5 g KI vào 100 ml thị hồ tinh bột pha Dung dịch dùng 24 h - Dung dịch natri hypoclorid PL 53 - Dung dịch đệm acetat pH 3,5: Hòa tan 25,0 g amoni acetat 25 ml nước cất, thêm ml dung dịch acid nitric pha lỗng với nước để thu lít dung dịch - Dung dịch thuốc thử thioacetamid – glycerin base: Hút ml hỗn hợp gồm 15 ml NaOH 1M ml nước, 20 ml glycerol 85% vào 0,2 ml dung dịch thioacetamid 4,0% kl/tt, đun cách thủy khoảng 20 giây, để nguội, sử dụng - Dung dịch 1,3 – dihydroxynaphthalen g/l ethanol 96% - Dung dịch acid sulphuric 460 g/l - Ethanol 96o - Kali iodid - Methyl ethyl ceton R - Methanol khan - p-naphtholbenzein R - Nước cất R - Tris (hydroxymethyl) aminomethan R - Thuốc thử Karl Fischer Kiểm tra định kỳ: Kiểm tra độ lại chất lượng chất đối chiếu Tobramycin theo theo tiêu chuẩn sau: - Tạp chất liên quan: TLC - Hàm lượng nước: KF - Định lượng: HPLC - Chu kỳ 24 tháng Đánh giá sơ bộ: Các tiêu chuẩn đánh giá sơ nguyên liệu Tobramycin bao gồm: - Định tính: TLC - Tạp chất liên quan: TLC - Hàm lượng nước: KF - Định lượng: HPLC Bảo quản: Chất đối chiếu Tobramycin đóng lọ thuỷ tinh nâu nút kín, tránh ánh sáng bảo quản nhiệt độ 20C – 80C PL 54 PL 55 PL 56