Nghiên cứu quy trình phát hiện streptococcus agalactiae bằng kỹ thuật real time pcr trên phụ nữ thai sản

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH ∞0∞ NGUYỄN THỊ THANH THẢO NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH PHÁT HIỆN STREPTOCOCCUS AGALACTIAE BẰNG KỸ THUẬT REAL-TIME PCR TRÊN PHỤ NỮ THAI SẢN Tai Lieu Chat Luong LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC TP HỒ CHÍ MINH, NĂM 2021 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH ∞0∞ NGUYỄN THỊ THANH THẢO NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH PHÁT HIỆN STREPTOCOCCUS AGALACTIAE BẰNG KỸ THUẬT REAL-TIME PCR TRÊN PHỤ NỮ THAI SẢN Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số chuyên ngành: 42 02 01 LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hướng dẫn : TS LƯƠNG THỊ MỸ NGÂN TP HỒ CHÍ MINH, NĂM 2021 TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA C NG NGH INH HỌC CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨAVI T NAM Độc lập – Tự – Hạnh phúc GIẤY XÁC NHẬN Tôi tên : u nT T n T sin : 27/11/1987 C u ên n àn : Côn n Tôi đồn ý un sin : u n sin M i viên : 1884202010005 ấp t àn văn t ơn tin k ó luận tốt nghi p hợp l b n quyền cho T vi n trườn đại h c Mở T àn p ố Hồ C í Min T vi n trườn đại h c Mở T àn p ố Hồ C í Min kết nối t àn văn t ơn tin k ó luận tốt nghi p t ôn tin k c Sở Khoa h Cơn n T àn p ố Hồ C í Min Ký tên (Ghi rõ họ tên) thống LỜI CAM ĐOAN Tôi cam đoan luận văn “Nghiên cứu quy trình phát Streptococcus agalactiae kỹ thuật real-time PCR phụ nữ thai sản” nghiên cứu tơi Ngoại trừ tài liệu tham khảo trích dẫn luận văn này, tơi cam đoan toàn phần hay phần nhỏ luận văn chưa công bố sử dụng để nhận cấp nơi khác Không có sản phẩm/nghiên cứu người khác sử dụng luận văn mà khơng trích dẫn theo quy định Luận văn chưa nộp để nhận cấp trường đại học sở đào tạo khác TP Hồ Chí Minh, năm 2021 Nguyễn Thị Thanh Thảo i LỜI CẢM ƠN Trong sống khó có sự thành công mà không gắn liền với sự động viên, hỗ trợ, giúp đỡ dù nhiều hay ít, dù gián tiếp hay trực tiếp người xung quanh Suốt thời gian học tập đã nhận nhiều sự quan tâm, giúp đỡ quý thầy cô, gia đình bạn bè Tôi xin gửi lời biết ơn sâu sắc đến quý thầy cô Khoa Sau đại học - ngành Công nghệ sinh học, trường Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh đã giảng dạy, truyền đạt kiến thức bản, nền tảng nâng cao giúp tơi làm sở hồn thành cho đề tài “NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH PHÁT HIỆN STREPTOCOCCUS AGALACTIAE BẰNG KỸ THUẬT REAL-TIME PCR TRÊN PHỤ NỮ THAI SẢN” Trước hết, lời xin gửi tới Cô TS Lương Thị Mỹ Ngân Người đã trực tiếp chỉ dẫn, động viên, góp ý, củng cố kiến thức chia sẻ kinh nghiệm quý báu giúp tơi hồn thành luận văn lời biết ơn chân thành Bên cạnh đó, gửi lời cảm ơn sâu sắc đến em Nguyễn Thị Trúc Phương tất thành viên Phòng R&D công ty TBR (59 đường số 26, phường Bình Trị Đơng B, quận Bình Tân, TP.HCM) đã tạo điều kiện tốt nhất, thuận lợi về trang thiết bị phương pháp thực để tơi hồn thành đề tài Song song đó, chân thành cảm ơn đến Trung tâm xét nghiệm chẩn đoán Y khoa Hanhphuclab đã nhiệt tình hỗ trợ nguồn mẫu thực tế Và sau cùng, lời cảm ơn sâu sắc xin gửi đến gia đình tôi, đã bên cạnh, động viên, cổ vũ tinh thần suốt trình học làm đề tài Với tất sự chân thành sâu sắc nhất, xin chúc cho tất người tràn đầy sức khỏe, hạnh phúc thành cơng sống Ngồi ra, điều kiện thời gian cũng kinh nghiệm còn hạn chế tôi, luận văn khó tránh khỏi thiếu sót Tôi kính mong nhận sự chỉ dạy, đóng góp ý kiến quý Thầy Cô để bổ sung, cải thiện nâng cao kiến thức mình Xin chân thành cảm ơn ii TÓM TẮT Nhiễm trùng huyết sơ sinh (NTHSS) nguyên nhân phổ biến thứ ba gây tử vong trẻ sơ sinh với tỷ lệ 11 – 19% ảnh hưởng đến khoảng triệu trẻ em toàn thế giới (Kim et al., 2020, Molloy et al., 2020) Bệnh dẫn đến nhiều triệu chứng nguy hiểm viêm phổi, nhiễm trùng huyết, viêm màng não nên trẻ dễ tử vong mang di chứng suốt đời thần kinh phát triển, suy giảm vận động (Shah et al., 2008, Stoll et al., 2004) Vi khuẩn Streptococcus agalactiae – liên cầu khuẩn nhóm B (GBS – Group B Streptococcus) xác định tác nhân truyền nhiễm hàng đầu gây NTHSS giai đoạn sớm Việc tầm soát GBS tiêm kháng sinh dự phòng phụ nữ mang thai giúp giảm tỷ lệ NTHSS hữu hiệu Phương pháp truyền thống dùng để phát GBS sử dụng nuôi cấy đĩa thạch máu Phương pháp cần môi trường chọn lọc phức tạp, tốn thời gian (36 – 72 h), công sức độ nhạy thấp Do đó, nghiên cứu thực nhằm tối ưu hóa phản ứng real-time PCR, với cặp mồi mẫu dò thiết kế nhằm phát gen đặc hiệu cfb GBS, phát GBS nhanh xác phương pháp truyền thống Các thí nghiệm tối ưu hóa thực chủng GBS ATCC 13813 Độ đặc hiệu quy trình tối ưu kiểm tra DNA chủng Staphylococcus aureus ATCC 25923, Gardnerella vaginalis Chlamydia trachomatis Ngồi ra, quy trình tối ưu thử nghiệm 30 mẫu dịch phết âm đạo-trực tràng phụ nữ mang thai giai đoạn 35-37 tuần Kết quả, quy trình real-time PCR tối ưu đặc hiệu với chủng GBS, có độ nhạy 50 sao/phản ứng, độ xác 99,94%, hiệu khuếch đại EA% = 94,5% Trong số 30 mẫu thử nghiệm, 10 mẫu (tỷ lệ 33,3%) phát có diện GBS real-time PCR, nuôi cấy truyền thống chỉ phát mẫu (tỷ lệ 26,7%) có GBS Như vậy, quy trình real-time PCR nhận diện GBS đã tối ưu cho kết nhận diện tốt thời gian nhanh so với phương pháp nuôi cấy truyền thống Tuy iii nhiên, cần tiến hành thử nghiệm số lượng mẫu lớn để ghi nhận số liệu xác về khả nhận diện GBS real-time PCR Từ đó đưa kiến nghị sử dụng realtime PCR tầm soát GBS phụ nữ mang thai xét nghiệm thường quy iv SUMMARY Neonatal sepsis (NS) is the third most common cause of infant mortality at 11 19% and affects approximately million children worldwide NS can lead to many dangerous symptoms such as pneumonia, sepsis, meningitis, so children can die easily or carry lifelong sequelae such as neurodevelopmental impairment, impaired mobility due to of neonatal sepsis Streptococcus agalactiae – Group B Streptococcus bacteria (GBS) is the major contagious cause of early onset sepsis in newborns Screening and intrapartrum antibiotic prophylaxis for GBS in pregnant women could effectively reduce the rate of NS Conventional method for GBS identification currently is culturing on the blood plate medium This method requires the complex selection medium, time consuming (36 – 72 h), labor intensive, and low sensitivity Therefore, this study is aimed to optimize parameters for a real-time PCR reaction, with primers and a probe designed to detect GBS-specific cfb gene, able to detect GBS faster and more accurately than culture method The optimized experiments were carried out on the strain S agalactiae ATCC 13813 The specificity of the optimized procedure was tested on DNA samples of Staphylococcus aureus ATCC 25923, Gardnerella vaginalis and Chlamydia trachomatis In addition, the optimized reaction was tested on 30 vaginal-rectal samples from pregnant women between 35 – 37 weeks gestation As a result, the optimized procedure was specific to GBS with the sensitivity of 50 copies/reaction, the accuracy of 99.94%, and amplification efficiency (EA%) of 94.5% GBS was detected in ten samples among the 30 vaginal-rectal samples (rate 33.3%) by the real-time PCR, while only eight samples (rate 26.7%) were found to be positive in the conventional plate method This indicates that the optimized procedure of real-time PCR for GBS identification is more sensitive and faster than the conventional culture v method In order to be applied in diagnostic practice, the procedure needs to be tested with a larger sample size vi Scanned by TapScanner Scanned by TapScanner Scanned by TapScanner Scanned by TapScanner Scanned by TapScanner Scanned by TapScanner Scanned by TapScanner Scanned by TapScanner Scanned by TapScanner Scanned by TapScanner