Đồ án tốt nghiệp bước đầu nghiên cứu thu nhận chitosanase từ aspergillus spp

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ TP HCM ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP u iệ il Tà BƯỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU THU NHẬN CHITOSANASE TỪ ASPERGILLUS SPP U H CÔNG NGHỆ SINH HỌC TE Ngành: CH Chuyên ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC Giảng viên hướng dẫn : TS NGÔ ĐẠI NGHIỆP Sinh viên thực MSSV: 0851110196 : PHẠM MINH SANG Lớp: 08DSH6 TP Hồ Chí Minh, 2012 Bước đầu nghiên cứu thu nhận Chitosanase từ Aspergillus spp MỤC LỤC DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT vi DANH MỤC CÁC BẢNG vii DANH MỤC CÁC HÌNH viii DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ ix DANH MỤC CÁC ĐỒ THỊ Error! Bookmark not defined DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ ix MỞ ĐẦU CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU Đại cương chitin chitosan .6 Tà 1.1 Lịch sử phát .6 1.1.2 Phân bố đặc điểm sinh hóa u iệ il 1.1.1 Phân bố 1.1.2.2 Đặc điểm sinh hóa .7 TE U H 1.1.2.1 Phương pháp thu nhận Chitosan oligomer từ Chitin 10 1.1.4 Ứng dụng Chitosan dẫn xuất thủy phân từ Chitosan 13 1.2 CH 1.1.3 Đại cương hệ enzyme Chitosanase 16 1.2.1 Định nghĩa .16 1.2.2 Nguồn gốc phân loại 16 1.2.3 Các đặc tính hệ enzyme chitosanase 19 1.2.3.1 Trọng lượng phân tử 19 1.2.3.2 Tính đặc hiệu chất 19 1.2.3.3 Đặc tính thủy phân 20 1.2.3.4 Đặc tính động học .21 i Bước đầu nghiên cứu thu nhận Chitosanase từ Aspergillus spp 1.2.3.5 Ảnh hưởng pH nhiệt độ lên hoạt động chitosanase 22 1.2.3.6 Chất hoạt hóa chất ức chế 24 1.2.4 Cảm ứng tổng hợp, tinh chế xác định hoạt tính chitosanase 24 1.2.4.1 Cảm ứng sinh tổng hợp chitosanase 24 1.2.4.2 Tinh chế chitosanase 25 1.2.4.3 Phương pháp xác định hoạt tính chitosanase 26 1.2.5 Ứng dụng chitosanase 26 1.2.6 Tình hình nghiên cứu chitosanase Thế giới Việt Nam 27 Tình hình nghiên cứu chitosanase giới 27 1.2.6.2 Tình hình nghiên cứu chitosanase Việt Nam 28 il Tà 1.3 1.2.6.1 Khái quát lên men bán rắn 29 iệ Định nghĩa lên men .29 1.3.2 Lên men bán rắn .29 1.3.3 So sánh lên men bán rắn với lên men chìm 30 CH TE U H 1.4 u 1.3.1 Khái quát Aspergillus spp 32 1.4.1 Giới thiệu Aspergillus spp .32 1.4.2 Đặc điểm sinh lý, sinh hóa Aspergillus spp .33 1.4.3 Một số ứng dụng Aspergillus spp .34 1.5 Khái quát nguồn nguyên liệu cám gạo vỏ trấu nước .35 1.5.1 Nguồn cám gạo nước 35 1.5.2 Nguồn vỏ trấu nước 36 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU - PHƯƠNG PHÁP 2.1 Vật liệu 38 2.1.1 Chủng giống 38 ii Bước đầu nghiên cứu thu nhận Chitosanase từ Aspergillus spp 2.1.2 Cơ chất cảm ứng .38 2.1.3 Cơ chất nuôi cấy 38 2.1.4 Hóa chất thiết bị 38 2.1.4.1 Hóa chất 38 2.1.4.2 Thiết bị .39 2.1.5 2.1.5.1 Môi trường giữ giống 39 2.1.5.2 Môi trường nhân giống .39 2.1.5.3 Môi trường kiểm tra hoạt tính enzyme 40 2.1.5.4 Môi trường lên men bán rắn .41 il Tà 2.2 Môi trường .39 Phương pháp 41 iệ Phương pháp xác định độ ẩm nguyên liệu 41 2.2.2 Phương pháp xác định trực tiếp số lượng bào tử 42 u 2.2.1 TE U H Cấy nhân sinh khối 42 2.2.2.2 Xác định số lượng bào tử phương pháp đếm buồng đếm CH 2.2.2.1 hồng cầu …………………………………………………………………… 42 2.2.3 Phương pháp cấy điểm môi trường thạch đĩa chọn chủng nấm mốc có hoạt tính chitosanase cao .43 2.2.3.1 Nguyên tắc 43 2.2.3.2 Tiến hành 43 2.2.4 Phương pháp khuếch tán thạch đĩa .44 2.2.5 Phương pháp mơ tả hình thái vi sinh vật .44 2.2.5.1 Quan sát đại thể 44 2.2.5.2 Quan sát vi thể 44 iii Bước đầu nghiên cứu thu nhận Chitosanase từ Aspergillus spp 2.2.6 Phương pháp nuôi cấy môi trường bán rắn 44 2.2.7 Phương pháp so màu với thuốc thử DNS (acid 3,5 – dinitrosalicylic) xác định hoạt tính chitosanase .45 2.2.7.1 Nguyên tắc 45 2.2.7.2 Tiến hành 45 2.2.8 Phương pháp Bradford – xác định hàm lượng protein .47 2.2.8.1 Nguyên tắc 47 2.2.8.2 Tiến hành 47 2.2.9 Phương pháp trích ly enzyme chitosanase .48 Tà 2.2.10 Phương pháp bố trí thí nghiệm xử lý thống kê 49 iệ il 2.2.10.1 Bố trí thí nghiệm 49 u 2.2.10.2 Xử lý thống kê 49 U H 2.2.11 Bố trí thí nghiệm .49 TE 2.2.11.1 Thí nghiệm khảo sát chọn chủng nấm mốc sinh tổng hợp chitosanase CH cao…………………………………………………………………………… 49 2.2.11.2 Thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng tỷ lệ chất cảm ứng 49 2.2.11.3 Thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng độ thống khí 50 2.2.11.4 Thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng độ ẩm môi trường 50 2.2.11.5 Thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng tỷ lệ cấy giống 50 2.2.11.6 Thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng thời gian nuôi cấy 51 2.2.11.7 Nuôi cấy thu enzyme chitosanase 51 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ - BIỆN LUẬN 3.1 Khả sinh tổng hợp chitosanase từ năm chủng nấm mốc khảo sát 52 3.1.1 Định tính khả sinh tổng hợp chitosanase .52 iv Bước đầu nghiên cứu thu nhận Chitosanase từ Aspergillus spp 3.1.2 3.2 Định lượng khả sinh tổng hợp chitosanase 53 Hình thái đại thể vi thể chủng O2 54 3.2.1 Hình thái đại thể .54 3.2.2 Hình thái vi thể 55 3.3 Ảnh hưởng nồng độ chất cảm ứng đến khả sinh tổng hợp chitosanase .55 3.4 Ảnh hưởng độ thống khí đến khả sinh tổng hợp chitosanase 58 3.5 Ảnh hưởng độ ẩm môi trường đến khả sinh tổng hợp chitosanase .61 Ảnh hưởng tỷ lệ cấy giống đến khả sinh tổng hợp chitosanase 64 3.7 Ảnh hưởng thời gian nuôi cấy đến khả sinh tổng hợp iệ il Tà 3.6 chitosanase .67 u Kết lên men bán rắn thu nhận enzyme 70 U H 3.8 TE CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN - KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận .71 CH 4.2 Kiến nghị 71 TÀI LIỆU THAM KHẢO 72 PHỤ LỤC v Bước đầu nghiên cứu thu nhận Chitosanase từ Aspergillus spp DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT CMC Carboxy Methyl Cellulose GlcN Glucosamine GlcNAc N – acetyl glucosamine kDa Kilo Dalton O1 Aspergillus oryzae – O2 Aspergillus oryzae – N1 Aspergillus niger – N3 Aspergillus niger – N7 Aspergillus niger – NADH Nicotinamide adenine dinucleotide Liquid state fermentation iệ Solid state fermentation u SSF Potato Glucose Agar il LSF Tà PGA CH TE U H vi Bước đầu nghiên cứu thu nhận Chitosanase từ Aspergillus spp DANH MỤC CÁC BẢNG 1.4 1.5 10 11 12 1.6 1.7 1.8 1.9 2.1 2.2 2.3 13 2.4 14 3.1 15 3.2 16 3.3 17 3.4 18 3.5 19 3.6 20 3.7 21 3.8 22 3.9 23 3.10 24 3.11 25 3.12 26 3.13 CH 1.3 TE U 1.2 H u 1.1 iệ Nội dung Trang Các phương pháp hóa học sử dụng để tạo 10 oligomer chitosan Các chitosanase Họ 46 thuộc enzyme thủy phân liên 17 kết glycoside Trọng lượng phân tử chitosanase thu nhận từ loài khác 18 Đặc điểm thủy phân số chitosanase vi sinh vật 20 Hằng số Michaelis Vmax chitosanase số loài 20 tiêu biểu Giá trị pH tối ưu số chitosanase 22 Nhiệt độ tối ưu số chitosanase 23 So sánh trình lên men lỏng rắn 30 Thành phần xơ giá trị dinh dưỡng nguyên liệu 35 Các bước tiến hành dựng đường chuẩn glucosamine 36 bước tiến hành xác định hoạt tính mẫu thí nghiệm 37 Các bước tiến hành dựng đường chuẩn albumine 38 Các nghiệm thức khảo sát nồng độ chất cảm ứng lên khả 39 sinh tổng hợp Chitosanase) Đường kính vành khuyên phân giải chitosan theo phương 42 pháp cấy điểm chủng O1, O2, N1, N3, N7 Bán kính vịng thủy phân hoạt tính chitosanase 43 chủng nấm mốc sau 24 nuôi cấy Ảnh hưởng nồng độ chất cảm ứng đến khả sinh 46 tổng hợp chitosanase Ảnh hưởng nồng độ chất cảm ứng đến hàm lượng 47 protein Ảnh hưởng độ thoáng khí đến khả sinh tổng hợp 49 chitosanase Ảnh hưởng độ thống khí đến hàm lượng protein 50 Ảnh hưởng độ ẩm môi trường đến khả sinh tổng 51 hợp chitosanase Ảnh hưởng độ ẩm môi trường đến hàm lượng protein 53 Ảnh hưởng tỷ lệ cấy giống đến khả sinh tổng hợp 54 chitosanase Ảnh hưởng tỷ lệ cấy giống đến hàm lượng protein 56 Ảnh hưởng thời gian nuôi cấy đến khả sinh tổng 57 hợp chitosanase Ảnh hưởng thời gian nuôi cấy đến hàm lượng protein 58 Điều kiện tối ưu lên men bán rắn thu nhận chitosanase với 60 chủng O2 il Bảng Tà TT vii Bước đầu nghiên cứu thu nhận Chitosanase từ Aspergillus spp DANH MỤC CÁC HÌNH TT u iệ il CH TE U H 10 11 12 Tà Nội dung Hình Trang 1.1 Công thức cấu tạo chitin 1.2 Công thức cấu tạo chitosan 1.3 Công thức biểu diễn cơng thức xác chitosan Cơ chế xúc tác chitosanase phản ứng phân cắt 1.4 chitosan Đặc điểm trình lên men bán rắn (SSF) (Moo – Young cộng sự, 1983) – xếp hạt chất rắn ẩm 1.5 30 pha khí liên tục hệ thống SSF với hệ nấm sợi (bên trái) sinh vật đơn bào (bên phải) Hình thái đại thể chủng O2, mặt khuẩn lạc (bên trái) 3.1 54 mặt khuẩn lạc Khuẩn ty (trái) cuống sinh bào tử (phải) chủng O2 3.2 chưa nhuộm - ảnh quan sát ghi nhận vật kính 55 40 Khuẩn ty (trái) cuống sinh bào tử (phải) chủng O2 3.3 nhuộm Methylene Blue - ảnh quan sát ghi nhận 55 vật kính 40 PL1 Khuẩn lạc đường kính vành khuyên phân giải PL2 Bình nhân giống chủng O2 mơi trường lúa PL3 Đường chuẩn D - glucosamine PL4 Đường chuẩn Albumine viii Bước đầu nghiên cứu thu nhận Chitosanase từ Aspergillus spp DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ 3.2 3.3 3.4 3.5 3.6 3.7 3.8 3.9 10 3.10 11 3.11 u 3.1 iệ Nội dung Trang Bán kính vịng thủy phân hoạt tính chitosanase 53 chủng nấm mốc sau 24 nuôi cấy Ảnh hưởng nồng độ chất cảm ứng đến khả 56 sinh tổng hợp chitosanase Ảnh hưởng nồng độ chất cảm ứng đến hàm lượng 58 protein Ảnh hưởng độ thống khí đến khả sinh tổng 59 hợp chitosanase Ảnh hưởng độ thống khí đến hàm lượng protein 60 Ảnh hưởng độ ẩm môi trường đến khả sinh 61 tổng hợp chitosanase Ảnh hưởng độ ẩm môi trường đến hàm lượng protein 63 Ảnh hưởng tỷ lệ cấy giống đến khả sinh tổng 65 hợp chitosanase Ảnh hưởng tỷ lệ cấy giống đến hàm lượng protein 66 Ảnh hưởng thời gian nuôi cấy đến khả sinh 68 tổng hợp chitosanase Ảnh hưởng thời gian nuôi cấy đến hàm lượng protein 69 il Biểu đồ Tà TT H Sơ đồ 1.1 Nội dung Trang Quy trình thủy phân chitosan để thu nhận oligomer 12 (Tokutake cộng sự, 1986) CH TT TE U DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ ix Bước đầu nghiên cứu thu nhận Chitosanase từ Aspergillus spp làm giảm nhanh độ ẩm môi trường gây ảnh hưởng đến trình sinh tổng hợp chitosanase Bảng 3.10: Ảnh hưởng tỷ lệ cấy giống đến hàm lượng protein Tỷ lệ cấy giống (ml) Hoạt tính enzyme (UI/g) 0,5 1,5 2,5 0,1158 ± 0,0133 0,1521 ± 0,0133 0,1949 ± 0,0196 0,2772 ± 0,0129 0,2673 ± 0,0173 0,2124 ± 0,0211 0.1527 0.1725 0.1638 0.1747 0.1238 0.0937 iệ il Hàm lượng Protein (mg/g) u 1.5 Tỷ lệ cấy giống (ml) 2.5 CH TE 0.5 U H 0.2 0.18 0.16 0.14 0.12 0.1 0.08 0.06 0.04 0.02 Hàm lượng Protein (mg/g) 0,0937 ± 0,0118 0,1238 ± 0,0120 0,1527 ± 0,0328 0,1638 ± 0,0120 0,1725 ± 0,0147 0,1745 ± 0,0116 Tà Hàm lượng Protein (mg/g) STT Biểu đồ 3.9: Ảnh hưởng tỷ lệ cấy giống đến hàm lượng protein Từ Đồ thị 3.4 biểu diễn mức độ ảnh hưởng tỷ lệ cấy giống đến hàm lượng protein, sơ nhận thấy hàm lượng protein tuyến tính tăng theo tỷ lệ cấy giống từ 0,5 – 1,5 ml với tốc độ tăng trung bình 0,03 đơn vị hàm lượng Bắt đầu từ tỷ lệ cấy giống – ml hàm lượng protein cho thấy biểu tăng lên, nhiên đơn vị tăng lên khơng đáng kể Phân tích độ chênh lệch đơn vị hàm lượng protein tỷ lệ cấy giống ml tỷ lệ cấy giống 2,5 ml hai đơn vị hàm lượng trung bình khoảng 0,0085 đơn vị hàm lượng protein, so sánh tỷ lệ cấy giống 2,5 ml với tỷ lệ cấy giống ml gần đơn vị hàm lượng tăng không đáng kể vào khoảng 0,0022 đơn vị hàm lượng protein Điều lý giải việc sử dụng tỷ lệ giống cao nội quần thể nấm lúc xuất ức chế lẫn nhau, việc làm chậm lại 66 Bước đầu nghiên cứu thu nhận Chitosanase từ Aspergillus spp trình phát triển đơn vị khuẩn lạc, làm giảm diện tích tiếp xúc nấm với môi trường, hệ kéo theo làm giảm hiệu suất thủy phân chất cảm ứng làm giảm trình sinh tổng hợp chitosanase, nhiên đồ thị cho thấy mức độ tăng lên hàm lượng protein Điều giải thích hàm lượng protein kiểm tra được, ngồi protein – enzyme cịn có thành phần protein phi enzyme Kết thúc thí nghiệm này, tỷ lệ cấy giống ml tỷ lệ chọn làm điều kiện tối ưu cho sinh tổng hợp chitosanase chủng O2 tỷ lệ cố định với yếu tố tối ưu khác thí nghiệm kiểm tra ảnh hưởng thời gian lên men đến khả sinh tổng hợp chitosanase 3.7 Ảnh hưởng thời gian nuôi cấy đến khả sinh tổng hợp Tà chitosanase Bảng 3.11 3.12 u iệ il Tiến hành thí nghiệm nêu mục 2.2.11.6, kết ghi nhận Hoạt tính enzyme (UI/g) 0,0492 ± 0,005 0,0861 ± 0,0087 0,2866 ± 0,0102 0,6001 ± 0,02239 1,1132 ± 0,0242 0,6172 ± 0,0167 0,2178 ± 0,0221 0,1688 ± 0,0172 0,1319 ± 0,0166 CH Thời gian (giờ) 16 24 32 40 48 56 64 72 TE STT U chitosanase H Bảng 3.11: Ảnh hưởng thời gian nuôi cấy đến khả sinh tổng hợp 67 Bước đầu nghiên cứu thu nhận Chitosanase từ Aspergillus spp Hoạt tính (UI/g canh trường) 1.2 1.1132 0.8 0.6172 0.6001 0.6 0.4 0.2 0.2866 0.0492 0.0861 16 0.2178 0.1688 0.1319 64 72 24 32 40 48 Thời gian (giờ) 56 Biểu đồ 3.10: Ảnh hưởng thời gian nuôi cấy đến khả sinh tổng hợp chitosanase Tà Bảng 3.12: Ảnh hưởng thời gian nuôi cấy đến hàm lượng protein Thời gian (giờ) 16 24 32 40 48 56 64 72 Hàm lượng Protein (mg/g) u iệ il STT CH TE U H 68 0,0039 ± 0,0034 0,0213 ± 0,0034 0,1604 ± 0,0091 0,1599 ± 0,0120 0,1743 ± 0,0145 0,1843 ± 0,0088 0,1167 ± 0,0087 0,056 ± 0,0148 0,0463 ± 0,0064 Bước đầu nghiên cứu thu nhận Chitosanase từ Aspergillus spp 0.2 0.1743 Hàm lượng Protein (mg/g) 0.18 0.1604 0.16 0.1843 0.1599 0.14 0.1167 0.12 0.1 0.08 0.056 0.06 0.04 0.02 0.0463 0.0213 0.0039 16 24 32 40 48 Thời gian (giờ) 56 64 72 Đồ thị 3.11: Ảnh hưởng thời gian nuôi cấy đến hàm lượng protein Tà * Nhận xét: trình sinh trưởng nấm mốc có mối quan hệ mật thiết với il trình sinh tổng hợp sinh chất mơi trường, việc xác nhận thời điểm thu u iệ nhận sinh chất điều quan trọng Trong thí nghiệm này, từ đường đồ thị biểu H diễn hàm lượng protein nhận thấy mối tương quan hàm lượng protein U sinh động học tăng trưởng chủng O2 Đồ thị thể rõ trình phát TE triển nấm mơi trường theo pha: thời gian từ – 16 pha thích CH nghi, 16 – 24 pha tăng trưởng, 32 – 48 pha ổn định cuối pha suy tàn sau 48 Kết cho thấy hoạt tính enzyme thu cao 1,1132 (UI/g) lên men 40 giờ, kết hoàn toàn phù hợp với động học tăng trưởng chủng O2 Thực tế quan sát mật độ phủ nấm chất màu sắc bào tử cho thấy tương thích với kết thu Trong khoảng thời gian từ – 16 giờ, bào tử bắt đầu nẩy mầm, khối chất xuất đốm tơ trắng nhỏ đầy khắp môi trường Từ 16 – 32 khoảng thời gian tơ trắng lan đầy khắp khối chất môi trường Thời gian từ 32 lên men thời gian nấm mốc bắt đầu sinh bào tử, số điểm môi trường xuất đốm nhỏ vàng cuống bào tử đính bắt đầu tạo bào tử Đến 40 lên men thời điểm mốc bào tử khắp khối môi trường, bào tử lúc có màu vàng hoa cau, kể từ thời điểm 69 Bước đầu nghiên cứu thu nhận Chitosanase từ Aspergillus spp trở đi, bào tử tiếp tục chuyển màu trình già đi, bào tử chuyển thành màu xanh lục tiếp tục lên men đến 48 rõ tiếp tục lên men Đối với trình lên men tổng hợp sinh chất từ nấm mốc Aspergillus oryzae protease, amylase, pectinase… thời điểm thu nhận tốt thời điểm mà mốc chớm tạo bào tử vàng hoa cau khắp môi trường Điều cho thấy thời gian lên men 40 để thu nhận chitosanase chủng O2 hoàn toàn phù hợp 3.8 Kết lên men bán rắn thu nhận enzyme Trên sở kết thu được, điều kiện tối ưu để lên men bán rắn thu nhận chitosanase chủng Asp oryzae – tổng hợp Bảng 3.8 Bảng 3.13: Điều kiện tối ưu lên men bán rắn thu nhận chitosanase với chủng O2 40 Độ thống khí – trấu (%) 15 iệ il Tà Nồng độ chất cảm ứng – chitosan (%) TE U Tỷ lệ cấy giống (ml) 40 H Thời gian nuôi cấy (giờ) 60 u Độ ẩm (%) Mật độ bào tử 4,6 106/ml dịch huyền phù bào tử CH Tiến hành nuôi cấy với điều kiện tối ưu, sau thời gian nuôi cấy tiến hành trích ly enzyme, ly tâm thu phần dịch chứa protein – enzyme xác định hoạt tính với hàm lượng protein có dịch Dịch enzyme thu có hoạt tính trung bình 1,11 (UI/g) hàm lượng protein 0,17 (mg/g), hoạt độ riêng 6,5294 (UI/mg protein) 70 Bước đầu nghiên cứu thu nhận Chitosanase từ Aspergillus spp 4.1 Kết luận Trên sở kết nghiên cứu thu được, người thực đề tài đến số kết luận: Chủng giống nấm Aspergillus oryzae – tơ có dạng bơng, cịn non khuẩn lạc có màu trắng, tiếp tục phát triển, khuẩn lạc chuyển thành vàng hoa cau Khuẩn lạc mọc lan khắp mặt thạch theo hình trịn khơng tiết sắc tố vào mơi trường Chủng giống nấm Aspergillus oryzae – nghiên cứu có khả sinh tổng hợp chitosanase có hoạt tính 0,1632 (UI/g) Điều kiện ni cấy tối ưu cho mẫu giống nấm Aspergillus oryzae – tỷ lệ cám gạo : trấu : chitosan = 45 : 15 : 40 (tính theo % khối lượng), độ ẩm 60%, Tà tỷ lệ cấy giống ml dịch huyền phù bào tử có mật độ 4,6 10 bào tử/ml, iệ il thời gian lên men 40 tính từ thời điểm bắt đầu cấy giống Với điều kiện ni cấy này, enzyme thu có hoạt tính trung bình 1,11 TE U H 4.2 Kiến nghị u (UI/g) Do thời gian thực đề tài có hạn, người thực đề tài đạt CH số kết Vì vậy, người thực đề tài xin đề nghị cần nghiên cứu thêm số vấn đề sau: Thực tủa phân đoạn enzyme thu tiến hành nuôi cấy điều kiện tối ưu nêu loại dung môi tủa khác nhằm chọn phân xuất tủa tối ưu với dung môi chọn dung môi ưu việt Cần tiến hành nghiên cứu việc cải thiện giống nhằm tăng cao khả sinh tổng hợp chitosanase Xác định điều kiện hoạt động tối ưu cho enzyme chitosanase hoạt động như: thời gian phản ứng, nhiệt độ phản ứng, pH thích hợp cho phản ứng, tỷ lệ enzyme – chất… 71 Bước đầu nghiên cứu thu nhận Chitosanase từ Aspergillus spp Tài Liệu Tham Khảo Tài Liệu Tiếng Việt [1] Phạm Lê Dũng, Trịnh Bình, Lại Thu Hiền cộng (1997), Vật liệu sinh học từ chitin, Viện Hóa học – Viện Công nghệ sinh học, Trung tâm Khoa học Cơng nghệ Quốc gia Hà Nội [2] Trần Cảnh Đình, Nguyễn Lan Anh, Vũ Thị Quyên (2012), Nghiên cứu tuyển chọn chủng giống vi sinh vật có khả sinh enzyme chitosanase để sản xuất glucosamine, Bản tin Viện nghiên cứu hải sản – Bộ Nông nghiệp phát triển Nông thôn, số 23 (1/2012) [3] Đinh Minh Hiệp (2001), Nghiên cứu đặc tính enzyme chitinase thu nhận từ nấm mật Coprinus fimentarius số ứng dụng, Luận văn thạc sĩ Tà sinh học, Đại học Quốc gia Thành Phố Hồ Chí Minh – Trường Đại học Khoa iệ il Học Tự Nhiên, Thành phố Hồ Chí Minh H Khoa học, 4, 34 u [4] Châu Văn Minh (1996), Sử dụng chitosan làm chất bảo quản tươi, Tạp chí TE U [5] Trần Thạnh Phong (2004), Khảo sát khả sinh tổng hợp enzyme cellulase từ Tricoderma reesei Aspergilllus niger môi trường lên men bán rắn, CH Luận văn thạc sĩ khoa học sinh học, Trường Đại học Khoa Học Tự Nhiên – Đại Học Quốc Gia Thành phố Hồ Chí Minh [6] Đỗ Hữu Phước (2004), Đặc san khoa học kỹ thuật chăn nuôi, số [7] Bùi Thanh Trung (2011), Sản xuất chitin – chitosan từ vỏ tôm ứng dụng làm màng bảo quản cà chua, Đồ án tốt nghiệp, Trường đại học Kỹ Thuật Cơng Nghệ Thành phố Hồ Chí Minh, Thành phố Hồ Chí Minh [8] Đỗ Anh Tuấn (2004), Nghiên cứu ảnh hưởng pH lên cấu trúc phân tử enzyme chitosanase từ vi khuẩn Bacillus circulans MH – K1, Luận văn thạc sĩ sinh học, Đại học Quốc gia Thành Phố Hồ Chí Minh – Trường Đại học Khoa Học Tự Nhiên, Thành phố Hồ Chí Minh [9] Lâm Ngọc Tuyết (2004), Biểu xác định số đặc tính chitosanase tái tổ hợp từ vi khuẩn Bacillus circulans MH – K1, Luận văn thạc sĩ sinh học, 72 Bước đầu nghiên cứu thu nhận Chitosanase từ Aspergillus spp Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh – Đại học Khoa Học Tự Nhiên, Thành phố Hồ Chí Minh Tài liệu tiếng Anh [10] Akikazu Ando, Kayo N., Miyoko Y., Hirofumi S., Yasuo K., Hajime H., Minuro Y., Takaaki F (1992), Primary structure of chitosanase produced by Bacillus circulans MH – K1, J Gen Appl Microbiol, 38, 135 – 144 [11] Akira Ohtakara, Masato I., Masaru M (1988), Action of microbiol chitinase on chitosan with different degrees of deacetylation, Agric Biol Chem., 52 (12), 3181 – 3182 [12] Alonso M J., Sanchez A (2003), The potential of chitosan in ocular drug delivery, J Pharm Pharmacol., 55 (11), 145 – 163 Tà [13] Aruchami M., Gowri N., Sundara – Rajuhu G (1986), Chitin in nature and iệ il technology, Edited by R A A Muzzarelli, C Jeuniaux, G W Gooday, Plenum Press, Newyork, 263 – 265 u H [14] Boucher I., Dupuy A., Vidal P., Neugebauer W A and Brzezinski R (1992), TE U Purification and characterization of chitosanase from Streptomyces N 174, App Microbiol Biotechnol, 38, 188 – 193 CH [15] Chen A S., Taguchi T., Sakai K., Kikuchi K., Wang M W., Miwa I (2003), Antioxidant activities of chitobiose and chitotriose, Biol Pharm Bull., 26 (9), 13, 26 – 30 [16] Chitosanase assay (1986), Chiang Mai University, Thailand [17] Cuero R G., Osuji G (1991), Chitosanase bioinduction by two strains of Bacillus sp and chitosan in peanut: an effective biocontrol of pathogenic and toxigenic fungi, Meded Fac Landbouwwet, Rijksuniv Gent., 56, 1415 – 1425 [18] Daris B., Eveleigh D E (1984), Chitosanase: occurrence, production and immobilization in chitin chitosan and related enzyme, ed J D ZiKakis, Academic Press, FL, 164 – 179 [19] Domard A., Rinaudo M (1984), Gel permeation chromatography of cationic polymer on cationic porous silicagels, Polym Commun., 25, 55 – 58 73 Bước đầu nghiên cứu thu nhận Chitosanase từ Aspergillus spp [20] Domardd A., Cartier N (1989), Glucosamin oligomers: Reparation and characterization, Int J Biol Macromol., 11, 297 – 302 [21] Dumas – Gaudot E., Grenier J., Furlan V., and Asselin A (1992), Chitinase, Chitosan and β – 1,3 glucanase activities in Allium and Pisum roots colonized by Glomus species, Plant Sci, 84, 17 – 24 [22] Edward M M., Arthur F M., Stephen R E., Ryszard N., Jon D R (1996), X – ray structure of anti – fungal chitosanase from Streptomyces N 174, Nature Structure Biology, (2), 155 – 162 [23] El Quaktaoui S., Asselin A (1992), Diversity of chitosanase activity in cucumber, Plant Science, 85, 33 – 41 [24] Fenton D M., Everleigh D E (1981), Purification and mode of action of a Tà chitosanase from Penicillium islandicum, J Gen Microbiol., 126, 151 – 165 iệ il [25] Fukamizo T., Ohkawa T., Tkeda Y., Goto S (1994), Specificity of chitosanase from Bacillus pumilus, Biochem Biophys: Acta, 1205, 183 – 188 u H [26] Grenier J., Benhamous N., Asselin A (1991), Colloidal gold – complexed TE U chitosanase a new probe for ultra structure localization of chitosan in fungi, J Gen Microbiol., 137, 2007 – 2010 CH [27] Hedges A R., Wolfe S (1974), Extracallular enzyme from Myxobacter AL – that exhibits both β – 1, – glucanase and chitosanase activities, J Bacteriol, 120, 844 – 853 [28] Ho – Geun Yoon, Hee – Yun K., Young – Hee L., Hye – Kyung K., Dong – Hoon S., Bum – Shik H., Hong – Yon Cho (2000), Thermostable chitosanase from Bacillus sp strain CK4: cloning and expression of the gene and characterization of the enzyme, Applied and Environmental Microbiology, 66 (9),3727 – 3734 [29] Horowitz ST, Roseman S., Blumental HJ (1975), The preparation of glucosamine oligosaccharide, Separation J Am Chem Soc.,79, 5046 – 5049 74 Bước đầu nghiên cứu thu nhận Chitosanase từ Aspergillus spp [30] Hugo Trembley, Josse B., Ryszard B (2000), A common molecular signature unifies the chitosanase belonging to families 46 and 80 of glycoside hydrolase, Can J Mcribiol, 46, 952 – 955 [31] Jun – ichi Saito, Akiko Kita, Yoshiki Higuchi, Yoshiho Nagata, Akikazu Ando, Kunio Miki (1999), Crystal structure of chitosanase from Bacillus circulans MH – K1 at 1,6 Å Resolution and Its Subtrate Recognition Mechanism, J Biol Chem., 30818 – 30825 [32] Machida M., Gomi K (2010), Aspergillus Molecular Biology and Genomics An Over view ISBN: 978 – – 904455 – 53 – [33] Majeti N V., Ravi Kumar (2000), A review of chitin and chitosan applications, Reactive & Functional Polymers, 46, – 27 Tà [34] Maurice Raimbault (1988), General and microbiological aspects of solid 3458, Vol 1, No u iệ il subtrate fermentation, EJB Electronic Journal of Biotechnology ISSN: 0717 – H [35] Mihara S (1961), Change in glucosamines in content of Chlorella cells during TE U the course of their life cycle, Plant Cell Physiol, 2, 15 – 29 [36] Minoru Yabuki, Akika Uchiyama, Kukino Suzuki, Akikazu Ando, Takaaki CH Fujii (1988), Purification and properties of chitosanase from Bacillus circulans MH – K1, J Gen Appl Microbiol., 34, 255 – 270 [37] Monaghan R L D E., Tewari R P (1973), Chitosanase a novel enzyme, Nature New Biol, 245, 78 – 80 [38] Nagai T., Sawayanagi Y., Nambu N (1984), Application of chitin and chitosan to pharmacential preparations, In chitin, chitosan and Related enzymes (J Zikakis Ed.), Academic Press, New York, 21 – 39 [39] Nelson P E., Toussoun T A & Cook R J (1981), Fusarium: deseases, biology and taxonomy, Penn State Univ Press, University Part, PA, 142 – 146 [40] Ohtakara A., Ogata H., Takenomi Y & Mitsutomi M (1984), Purification and characterisation of chitosanase from Streptomyces griceus In chitin, chitosan 75 Bước đầu nghiên cứu thu nhận Chitosanase từ Aspergillus spp and Related Enzyme, ed J P Zikakis Academic Press, Orlando, FL, 147 – 159 [41] Okajima S., A Ando, H Shimoyama, T Fujii (1994), Purification and characterization of an extracellular chitosanase produced by Amycolatopsis sp CsO J Ferment, Bioeng., 77, 617 – 620 [42] Palapura S., Kohn J (1992), Trends indevelopment of bioresorbable polymers for medical applications, J Biomaterial Applications, 6, 216 – 250 [43] Reyes F., Lahoz R., Martinez M J., Alfonso C (1985), Chitosanase in autolysis of Mocor rouxii, Mycopathologia, 89, 181 – 187 [44] Rondle C J M & Morgan W T J (1995), The determination of glucosamin and galactosamine, Biochem J., 61, 586 – 589 Tà [45] Seino H., Tsukuda K., and Shimasue V (1991), Properties and action pattern 2432 u iệ il of a chitosanase from Bacilus sp PI – 7S, Agric Biol Chem., 55, 2421 – H [46] Shimosaka M., Kumehara M., Zhang X – Y, Nogawa M., Okazaki M (1996), TE U Cloning and cheraterization of a chitosanase gene from the plant pathogenic fungus Fusarium solani, Journal of Fermentation and Bioengineering, 82, 426 CH – 431 [47] Somashekar D., Richard Joseph (1995), Chitosanase properties and applications: A review, Bioresourse Technology, 55, 35 – 45 [48] Synowiecki J., Al – Khateeb N A (2003), Production, Properties, and some new applications of chitin and its derivatives, Crit Rev Food Sci Nutr., 43 (2), 71, 145 [49] Tanabe T., Morinaga K., Fukamizo T., Mitsutomi M (2003), Novel chitosanase from Streptomyces griceus HUT 6037 with transglucosylation activity, Biosci Biotechnol and Biochem., 67, 354 – 364 [50] Valérie Dodane, Vinod D Vilivalam (1998), Pharmaceutical applications of chitosan, PSTT, (6), 246 – 253 76 Bước đầu nghiên cứu thu nhận Chitosanase từ Aspergillus spp [51] Ward O P Qin, W M Dhanjoon, J Ye J (2005), Physiology and biotechnology of Aspergillus, Biotechnol, 49, 39 – 44 [52] Wei Gu, Tingting W., Jiang Z., Yunyu S., Haiyan Liu (2003), Molecular dynamics simulation of the unfolding of the human prion protein domain under low pH and high temperature conditions, Biophysical Chemistry, 104, 79 – 94 [53] William J Hennen, Ph D (1996), Chitosan, Woodlan Publishing Inc [54] Yoshihiro S., Saburo M (1995), Application of chitin and chitosan for biomaterials, Biotechnol and Gene Eng Rev., Vol 13, 383 – 420 [55] Zhao Q., Agger M P., Fitzpatrick M., Anderson J M., Hilter A., Stockes K., Urbanski P (1990), Cellular interactions with biomaterials: invivo cracking of u iệ il 637 Tà pre – stressed Pelletthane 2363 – 80 Å, J Biomed and Material Res., 24, 621 – CH TE U H 77 Bước đầu nghiên cứu thu nhận Chitosanase từ Aspergillus spp PHỤ LỤC Phụ lục 1: Khuẩn lạc đường kính vành khuyên phân giải u iệ il Tà CH TE U H Bước đầu nghiên cứu thu nhận Chitosanase từ Aspergillus spp Phụ lục 2: Bình nhân giống môi trường lúa chủng O2 đục lỗ thạch u iệ il Tà Phụ lục 3: vòng thủy phân chitosan – kết kiểm tra định tính phương pháp CH TE U H Bước đầu nghiên cứu thu nhận Chitosanase từ Aspergillus spp Phụ lục 4: Đường chuẩn D – glucosamine 0.14 y = 0.2609x R² = 0.9948 0.12 ∆OD 0.1 0.08 0.06 0.04 0.02 0 0.1 0.2 0.3 0.4 Nồng độ D - glucosamine (mg/ml) 0.5 0.6 il Tà Phụ lục 5: Đường chuẩn Albumine 0.07 iệ u 0.06 U H 0.05 0.04 TE ∆OD y = 1.2473x R² = 0.9987 0.03 CH 0.02 0.01 0 0.01 0.02 0.03 0.04 Hàm lượng Protein (mg/ml) 0.05 0.06