Phân lập và tuyển chọn các chủng nấm mốc Aspergillus Spp. sinh tổng hợp enzyme invertase

Mục tiêu nghiên cứu của đề tài Phân lập và tuyển chọn các chủng nấm mốc Aspergillus Spp. sinh tổng hợp enzyme invertase nhằm mục đích phân lập, tuyển chọn các chủng nấm mốc Aspergillus spp. có khả năng sinh enzyme invertase và khảo sát một số đặc tính của enzyme này.

PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN CÁC CHỦNG NẤM MỐC ASPERGILLUS SPP SINH TỔNG HỢP ENZYME INVERTASE Phạm Thùy Trang1, Nguyễn Thị Thu1, Nguyễn Đức Thái1, Thái Thị Hà Phương1, Đặng Quang Cảnh1 ABSTRACT Invertase (β-fructofuranosidase E.C.3.2.1.26) catalyzes the hydrolysis of sucrose to glucose and fructose so it is mainly used in the food industry This study was conducted to isolate and screen fungal strains Aspergillus spp which have invertase activity and study some biochemical characterization of invertase enzyme From different samples, we isolated 16 fungal strains which have the ability synthesis invertase enzyme with O1, L1.2 expressing highest activity Strains O1 and L1.2 produced high levels of invertase enzyme under optimized culture conditions at an optimum temperature 35oC, pH 6,5 with ure as nitrogen source and sucrose as carbon source Enzyme invertase of strain O1 exhibited optimum at temperature 50oC, pH 5,5; strain L1.2 exhibited optimum at temperature 40 oC, pH This research showed that the activity of this enzyme increases as additional Mn2+ Key word: Invertase enzyme, Aspergillus spp., , enzyme activity, TÓM TẮT Invertase (β-fructofuranosidase E.C.3.2.1.26) enzyme có khả xúc tác phản ứng thủy phân sucrose thành glucose fructose nên ứng dụng nhiều công nghiệp thực phẩm Nghiên cứu nhằm mục đích tuyển chọn chủng nấm mốc Aspergillus spp có khả sinh enzyme invertase khảo sát số đặc tính enzyme Từ nguồn mẫu khác chúng tơi phân lập 16 chủng có khả tổng hợp enzyme invertase chủng O1, L1.2 biểu hoạt tính invertase cao Hai chủng O1 L1.2 có khả sinh tổng hợp enzyme tốt 35oC pH 6,5 với nguồn nitrogen urea chủng L1.2 NaNO3 chủng O1, nguồn carbon sucrose chủng L1.2 với O1 fructose Enzyme invertase chủng O1 hoạt động tối ưu 50oC, pH 5,5; chủng L1.2 enzyme hoạt động tốt 40oC, pH Kết nghiên cứu cho thấy hoạt tính enzyme tăng lên bổ sung Mn2+ Từ khóa: Enzyme invertase, Aspergillus spp., hoạt tính enzyme, ĐẶT VẤN ĐỀ Invertase (EC3.2.1.26) enzyme thuộc họ GH 32 glycoside hydrolase (Alberto et al 2004), cịn biết đến với tên gọi khác như: β-fructofuranosidase, saccharase, glucosucrase, sucrase, β –fructosidase Invertase có khả xúc tác phản ứng thủy phân sucrose thành glucose fructose (tỉ lệ 1:1) gọi đường nghịch đảo Invertase sử dụng rộng rãi công nghiệp thực phẩm đặc biệt ngành sản xuất bánh kẹo nước giải khát đường nghịch đảo kết tinh so với đường sucrose Ngồi ra, invertase cịn ứng dụng sản xuất đường fructooligosaccharide (FOS) – loại đường có chức làm giảm cholesterol, phospholipid triglycerides máu, làm giảm huyết áp tâm trương (Nguyen et al, 2005) Invertase enzyme thu nhận từ nhiều nguồn khác thực vật, vi khuẩn, nấm men Saccharomyces số vi nấm Aspergillus niger (Rubio Navarro, 2006) Tuy nhiên nghiên cứu nước chủng Aspergillus sinh tổng hợp invertase cịn hạnchế nên chúng tơi thực nghiên cứu nhằm Học viện Nông nghiệp Việt Nam 505 mục đích phân lập, tuyển chọn chủng nấm mốc Aspergillus spp có khả sinh enzyme invertase khảo sát số đặc tính enzyme VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu thí nghiệm Vật liệu phân lập nấm mốc: chủng nấm mốc phân lập từ nguồn vật liệu khác nhau: mẫu mục, lạc, gạo, tổ ong mốc, vỏ chanh lấy từ khu vực địa điểm khác nhau: Hà Nội, Nam Định 2.2 Phương pháp nghiên cứu Các chủng nấm mốc Aspergillus phân lập theo phương pháp Ulster (Bùi Xuân Đồng, Nguyễn Huy Văn, 2000) loại môi trường phân lập PDA Czapek-Dox Sau làm cách cấy truyền môi trường PDA Các chủng nấm mốc Aspergillus nuôi lắc môi trường Czapek-Dox lỏng pH 5.5 (Sigma- Mỹ), tốc độ lắc 150 rpm, nhiệt độ 35oC, mật độ tiếp giống 106 bào tử cho 100ml môi trường lên men Sau ngày nuôi cấy thu dịch nuôi đem li tâm 10000 rpm 4oC 20 phút Phần dịch lỏng thu sau li tâm đưa thử hoạt tính enzyme invertase Dựa vào nguyên lý enzyme invertase có khả thủy phân liên kết β-1,2 glucoside sucrose sản phẩm glucose fructose tỉ lệ 1:1 Hoạt tính tương đối enzyme invertase xác định phương pháp khuếch tán đĩa thạch: phương pháp sử dụng thuốc thử TTC 0.1% (2,3,5- triphenyl tetrazolium chloride NaOH 0,5M) Đường khử (glucose) sinh từ trình thủy phân sucrose enzyme invertase khử TTC thành triphenyformazon có màu hồng, lượng triphenyformazon tỉ lệ thuận với lượng đường khử sinh Giếng thạch đục môi trường chất sucrose 3% đệm natri acetate 50mM pH 5,0 Cho 100µl dịch enzyme thô vào vào giếng để qua đêm nhiệt độ phòng Thuốc thử TTC thêm vào cách phun lên mặt thạch ủ bóng tối 20 phút, rửa đệm acetate 0,1M pH 5,0 Enzyme invertase khuếch tán vào đĩa thạch sản phẩm thủy phân khẳng định xuất vòng đỏ quanh giếng Phương pháp so màu DNS: Ủ hỗn hợp phản ứng gồm 200µl enzyme thơ, 500µl dung dịch sucrose 5% 300µl đệm acetate 50mM pH 5,0 500C 30 phút (Bernfeld et al.,1955) 1ml DNS (3, 5-dinitrosalicylic acid) cho thêm vào hỗn hợp kết thúc phản ứng cách ngâm ống nghiệm bể nước sôi phút Sau làm lạnh nước tới nhiệt độ phòng dung dịch phản ứng dùng để xác định lượng đường khử glucose sinh cách đo OD540 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Phân lập tuyển chọn chủng vi sinh vật có khả sinh invertase Từ nguồn vật liệu mẫu phân lập 16 chủng nấm mốc có đặc điểm giống với Aspergillus có chủng khuẩn lạc có màu đen chủng khuẩn lạc có màu xanh rêu, vàng lục Các chủng nấm mốc làm nuôi lỏng lắc môi trường Czapek-Dox ngày 35oC với mật độ 106 bào tử/ 100ml môi trường Sau ngày nuôi thu dịch enzyme thô tiến hành xác định hoạt tính khuếch tán đĩa thạch với chất sucrose thuốc thử TTC 0.1% Kết trình bày bảng 506 Bảng Kết khả tổng hợp enzyme invertase 16 chủng nấm mốc môi trường Czapek-Dox Chủng O1 O2 O3 O4 L1 LB G2.2 G2.1 Đường kính vịng hoạt tính (mm) 23.67±0.47 9.00±0.82 10.67±0.47 14±0.82 14.33±0.47 9±0.82 21.33±0.47 14.33±0.94 Chủng G0.2 L1.1 L1.2 L1.3 L1.4 PL2.1 PL2.2 243 Đường kính vịng hoạt tính (mm) 18.33±0.47 12.67±0.47 22.33±0.47 6.00±0.82 13.67±0.47 13.67±0.94 12.67±0.47 4.33±0.47 Chúng nhận thấy chủng nấm mốc biểu khả thủy phân sucrose khác nhau, số 16 chủng nấm mốc tham gia khảo sát, có chủng biểu hoạt tính invertase mạnh O1 L1.2 với đường kính vịng phân giải sucrose tương ứng 23,67 mm 22,33mm 3.2 Ảnh hưởng số yếu tố đến khả tổng hợp invertase 3.2.1 Ảnh hưởng pH môi trường Các chủng Aspergillus nuôi môi trường Czapek-Dox lỏng với pH thay đổi từ – 10 Sau ngày nuôi, dịch nuôi ly tâm thử hoạt tính phân giải sucrose pH mơi trường ảnh hưởng tới khả sinh trưởng tổng hợp enzyme invertase chủng nấm mốc Aspergillus Các chủng Aspergillus có khả sinh trưởng tổng hợp enzyme invertae dải pH rộng từ 3-9, vùng pH từ – 6.5 thích hợp Đối với hai chủng nấm mốc pH tốt để tổng hợp invertase 6.5 (hình 1) Hình Ảnh hưởng pH môi trường đến khả tổng hợp invertase 3.2.2 Ảnh hưởng nhiệt độ Các chủng nấm mốc Aspergillus nuôi môi trường Czapek – Dox lỏng với pH 6.5 nhiệt độ: 25, 30, 35, 40, 45oC Sau nuôi ngày thu dịch ni đem ly tâm để thử hoạt tính phân giải sucrose chủng Các chủng Aspergillus có khả tổng hợp invertase dải nhiệt độ từ 25 - 40oC, chủng O1 L1.2 có khả tổng hợp enzyme cao 35oC Kết phù hợp với kết nghiên cứu 507 Madhanasundareswari cộng (2015) nghiên cứu sản xuất tối ưu hóa điều kiện phát triển chủng nấm mốc sinh enzyme invertase Tại nhiệt độ 45oC hai chủng khơng cịn khả tổng hợp invertase Hình Ảnh hưởng nhiệt độ nuôi cấy đến khả tổng hợp invertase chủng Aspergillus 3.2.3 Ảnh hưởng nguồn carbon Enzyme invertase enzyme cảm ứng muốn tổng hợp enzyme cảm ứng cần có điều kiện: có gen tương ứng nhiễm sắc thể tế bào, có đầy đủ chất tương ứng để xây dựng phần tử enzyme, có lượng cần thiết cho tổng hợp phải có chất cảm ứng Nếu khơng có chất cảm ứng có đủ điều kiện tổng hợp enzyme Tổng hợp enzyme chịu ảnh hưởng lớn loại đường sử dụng nguồn carbon chất cảm ứng sinh enzyme (Ottoni et al., 2012) Các loại đường khác glucose, frucose, sucrose raffinose với nồng độ 1% lựa chọn để thu invertase theo mô tả Uma et al., (2010) Chủng L1.2 sản xuất invertase nhiều mơi trường có đường sucrose nguồn carbon Kết phù hợp với kết nghiên cứu Uma et al., (2010) nghiên cứu sản xuất, tinh khả sát đặc tính enzyme invertase từ Aspergillus flavus kết Ottoni et al (2012) nghiên cứu tối ưu hóa điều kiện sản xuất invertase từ Aspergillus oryzea (hình 3) Trong với chủng O1 nguồn carbon tốt lại fructose nhiên với nguồn carbon sucrose đường kính vịng hoạt tính tương đương chủng L1.2 Hình Ảnh hưởng nguồn carbon khác tới khả tổng hợp enzyme invertase Hình Ảnh hưởng nguồn nitrogen tới khả tổng hợp invertase 508 3.2.4 Ảnh hưởng nguồn nitrogen Nguồn nitrogen nguồn carbon hai yếu tố ảnh hưởng đến tăng trưởng tế bào sản xuất enzyme chủng vi sinh vật (Wen-Chang Chen, Chihsien Liu., 1996) Hai chủng O1 L1.2 nuôi lắc môi trường Czapek-Dox lỏng pH 6.5, nhiệt độ 35oC, 180 vòng/phút, nguồn carbon sucrose thay nguồn nitrogen nguồn nitrogen khác nhau: urea, NaNO3, pepton cao nấm men Các nguồn nitrogen khảo nghiệm ảnh hưởng tới tổng hợp enzyme invertase chủng O1 L1.2 (hình 4) Urea NaNO3 nguồn nitrogen tốt cho tổng hợp enzyme invertase chủng Aspergillus thí nghiệm, cao nấm nem lại cho kết tổng hợp invertase ngoại bào thấp sinh khối nấm tăng trưởng mạnh Kết phù hợp với nghiên cứu Ottoni et al 2012 nghiên cứu tối ưu hóa điều kiện sản xuất invertase từ Aspergillus oryzea Ngược lại Wang Zhou (2006) cho thấy urea hạn chế hoạt động sản xuất invertase tăng trưởng sinh khối chủng Aspergillus sp.JN19 cao nấm men chọn làm nguồn nitrogen tốt Mặt khác, urea dùng để cải thiện sản lượng invertase sản xuất từ Saccharomyces cerevisiae (Ikram Sikander 2007), Rajoka Yasmeen (2005) thấy NaNO3 nguồn nitrogen nghèo cho tổng hợp β -fructofuranosidase A.niger 3.3 Một số yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính invertase 3.3.1 Ảnh hưởng pH đệm Enzyme invertase chủng Aspergillus tổng hợp có giải pH hoạt động rộng (Nguyen Q D et al, 2005) Chủng O1 hoạt động mạnh pH 5.5 Kết phù hợp với nghiên cứu Nguyen.Q.D cộng (2005) tiến hành tinh khả sát số thuộc tính of β-fructofuranosidase từ Aspergillus niger IMI303386 Trong chủng L1.2 hoạt động mạnh pH (hình 5) Hình Ảnh hưởng pH đệm đến phân giải sucrose enzyme invertase Hình Ảnh hưởng nhiệt độ lên hoạt tính invertase 3.3.2 Ảnh hưởng nhiệt độ Nhiệt độ ảnh hưởng tới cấu trúc hoạt động enzyme, biết nhiệt độ hoạt động tối ưu enzyme yêu cầu cần thiết Dịch chiết enzyme thô chủng O1 L1.2 xử lí nhiệt độ từ 30oC đến 80oC kiểm tra hoạt tính phương pháp khuếch tán đĩa thạch Kết (hình 6) cho thấy với nhiệt độ tối ưu cho hoạt tính enzyme invertase thô chủng O1 L1.2 tương ứng 50oC 40oC Sanjay Sugunan (2006) 509 cho enzyme hoạt động tối ưu 50oC, pH 5,0 Một số tác giả khác cho invertases hoạt động tối ưu phạm vi nhiệt độ rộng 35-75°C tùy thuộc vào nguồn gốc chúng thời gian ủ (Kern et al.,1992) Nguyen et al., 2005 báo cáo nhiệt độ tối ưu invertase từ A niger 50°C Giá trị nhiệt độ tối ưu invertase cao báo cáo nhiều tác giả (Rubio et al.,2002; Guimaraes et al.,2007; Hussain et al.,2009) giá trị thấp (30°C) báo cáo (Rashad et al.,2006) 3.3.3 Ảnh hưởng số ion kim loại Các ion kim loại (nồng độ mM) thêm vào hỗn hợp phản ứng cách riêng biệt Sự thủy phân enzyme đo so sánh với mẫu đối chứng khơng có ion kim loại (Rahul Kumar Balakrishnan Kesavapillai., 2012) Kết cho thấy ion kim loại có ảnh hưởng mạnh tới hoạt tính invertase, hoạt tính biểu mạnh thêm vào ion Mn2+, Na+, hay Sn2+ có tác động đến hoạt tính invertase Khi bổ sung ion Na+ hoạt tính invertase từ chủng O1 giảm đáng kể so với bổ sung ion Cu2+, Ca2+ Ion Zn2+ gây ức chế hoạt tính inertase từ hai chủng Các nghiên cứu khác cho thấy ion kim loại tác động khác tới hoạt tính invertase sản xuất từ nguồn khác Shankar, Thangamathi, Rama, Sivakumar (2014) cho kết enzyme invertase từ chủng nấm men Saccharomyces cerevisiae MK hoạt động tối ưu có Ca2+, bị ức chế mạnh K+ Rahul Kumar Balakrishnan Kesavapillai (2012) cho thấy enzyme tăng hoạt tính với ion Fe3+ , Mn2+ , ion Cu2+ ức chế hoạt tính enzyme Hình Ảnh hưởng ion kim loại lên hoạt tính enzyme invertase KẾT LUẬN Từ nguồn mẫu thu thập từ nhiều địa điểm khác chúng tơi phân lập 16 chủng có hoạt tính enzyme invertase, chủng O1 L1.2 có hoạt tính cao Điều kiện mơi trường thích hợp cho khả sinh tổng hợp enzyme invertase cao chủng xác định: Nguồn carbon nitrogen tốt với chủng L1.2 O1 tương ứng : sucrose NaNO3, fructose urea; pH nhiệt độ thích hợp cho hai chủng sinh trưởng, phát triển 6,5; 350 C Hoạt tính enzyme invertase biểu tốt nhiệt độ 40oC- 50oC pH 5,5- Ion Mg2+ tăng hoạt tính thủy phân enzyme invertase TÀI LIỆU THAM KHẢO Alberto, F., C Bignon, G Sulzenbacher, B Henrissat and M Czjzek, 2004 The three dimensional structure of invertase (β-fructosidase) from Thermotoga maritime reveals a bimodular arrangement and an evolutionary relationship between retaining and inverting glycosidases Journal of Biological Chemistry, 279:18903-18910 510 Bernfeld, P., S.P Colowick and N.O Kaplan, 1955 Amylases a and β, pp Method in Enzymol Vol I, Academic Press Inc., New York, pp: 149-158 Guimaraes LHS, Terenzi HF, Polizeli MLT, Jorge JA (2007) Enzyme MicrobTechnol 42:52-57 Hussain A, Rashid MH, Perveen R, Ashraf M (2009) Purification, kinetic and thermodynamic characterization of soluble acid invertase from sugarcane (Saccarumofficinarum) Plant PhysiolBiochem 47:188-194 Ikram-Ul-Haq, Sikander A., Kinetics of invertase production by Saccharomyces cerevisiae in batch culture Pak J Bot., 39,907-12(2007) Kern G, Schülke N, Schmid FX, Jaenicke R (1992) Stability, quaternary structure, and folding of internal, external, and core-glycosylated invertase from yeast Protein Sci 1:120-131 Nguyen QD, Rezessy-Szabo JM, Bhat MK, Hoschke A (2005) Purification and some properties of β-fructofuranosidase from Aspergillus niger IMI303386 Process Biochem 40:2461-2466 Ottoni C A.; R Cuervo-FernándezII; R M PiccoliI; R MoreiraI; B GuilarteMaresmaII; E Sabino da SilvaI; M F A RodriguesI; A E Maiorano Media optimization for β-Fructofuranosidase production by Aspergillus oryzae Braz J Chem Eng vol.29 no.1 São Paulo Jan./Mar 2012 Rahul Kumar and Balakrishnan Kesavapillai.(2012) Stimulation of extracellular invertase production from spent yeast when sugarcane pressmud used as substrate through solid state fermentation 10 Rajoka, M I., Yasmeen, A (2005) Improved productivity of β-fructofuranosidase by a derepressed mutant of Aspergillus niger from conventional and non-conventional substrates Word J Microbiol Biotechnol., 21,471-78 11 Rashad MM, Mahmoud AEE, Desouky MA, Nooman MU (2006) Purification and characterization of extra and intracellular β-fructofuranosidase from Saccharomyces cerevisiae growing on Eichhorniacrassipes leaf extract Deutsche Lebensmittel Rundschau 102:157-166 12 Rubio MC, Runco R, Navarro AR (2002) Invertase from a strain of Rhodotorula glutinis Phytochemistry 61:605-609 13 Sanjay G, Sugunan S (2006) Enhanced pH and thermal stabilities of invertase immobilized on montmorillonite K-10 Food Chem 94:573-579 14 Shankar T., P Thangamathi, R Rama, T Sivakumar (2014) Characterization of Invertase from Saccharomyces cerevisiae MK obtained from toddy sample 15 Uma C., D Gomathi, C Muthulakshmi and V.K Gopalakrishnan Production, Purification and Characterization of Invertase by Aspergillus flavus Using Fruit Peel Waste as Substrate Advances in Biological Research (1): 31-36, 2010 16 Wang, L M., Zhou, H M (2006) Isolation and identification of a novel Aspergillus japonicus JN19 producing β-fructofuranosidase and characterization of the enzyme J Food Biochem., 30,641-58 17 Wen-chang Chen and Chi-hsien Liu 1996 Production of P-fructofuranosidase by Aspergillus japonicus Enzyme and Microbial Technology 18:153-160, 1996 511 ... khả sinh trưởng tổng hợp enzyme invertase chủng nấm mốc Aspergillus Các chủng Aspergillus có khả sinh trưởng tổng hợp enzyme invertae dải pH rộng từ 3-9, vùng pH từ – 6.5 thích hợp Đối với hai chủng. .. QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Phân lập tuyển chọn chủng vi sinh vật có khả sinh invertase Từ nguồn vật liệu mẫu phân lập 16 chủng nấm mốc có đặc điểm giống với Aspergillus có chủng khuẩn lạc có màu đen chủng. .. đích phân lập, tuyển chọn chủng nấm mốc Aspergillus spp có khả sinh enzyme invertase khảo sát số đặc tính enzyme VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu thí nghiệm Vật liệu phân lập nấm mốc: